BR112020006004A2 - sistema, montagem e método de teste de diagnóstico - Google Patents

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Abstract

Um sistema de teste de diagnóstico incluindo: uma montagem de teste de diagnóstico e um aparelho de teste de diagnóstico para realizar um teste em uma amostra biológica ou ambiental; a montagem de teste de diagnóstico inclui: um reservatório de preparação de amostra para receber a amostra dentro de um fluído de preparação de amostra tal que um cotonete carreando a amostra possa ser usada para agitar o fluído de preparação e lavar o cotonete; um mecanismo de dispensa de amostra para inserção dentro do reservatório de preparação de amostra; um fechamento para vedar o reservatório de preparação de amostra; pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico acoplado ao reservatório de preparação de amostra e pelo menos uma vedação entre o reservatório de preparação de amostra e o reservatório de teste de diagnóstico para impedir o movimento de fluído entre os respectivos reservatórios; em que o mecanismo de dispensa de amostra é operável para romper a vedação para permitir que o fluído de amostra entre no reservatório de teste de diagnóstico do reservatório de preparação de amostra e dispensar uma quantidade predeterminada de fluído.

Description

1 / 77 SISTEMA, MONTAGEM E MÉTODO DE TESTE DE DIAGNÓSTICO
CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção se refere a um sistema e método de teste de diagnóstico para realizar testes de diagnóstico ou análise de amostras biológicas para ajudar no diagnóstico ambiental, agrícola, científico, veterinário ou médico com base na detecção da presença ou ausência de um ou mais análitos específicos em uma amostra e/ou determinar suas quantidades na amostra. O análito pode ser detectado usando métodos de amplificação de DNA molecular e detecção de marcadores genéticos específicos, por exemplo.
FUNDAMENTOS
[002] A amplificação de ácidos nucléicos é importante em muitos campos, incluindo testes médicos, biomédicos, ambientais, veterinários e de segurança alimentar. No geral, os ácidos nucléicos são amplificados por um de dois métodos: reação em cadeia da polimerase (PCR) ou amplificação isotérmica, ambas das quais são descritas abaixo. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
[003] Como descrito no Wikipedia1 em http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction:
[004] “A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica científica na biologia molecular para amplificar uma única ou umas poucas cópias de um pedaço de DNA através de diversas ordens de magnitude, gerando milhares a milhões de cópias de uma sequência de DNA particular.
[005] Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis, a PCR é agora uma técnica comum e frequentemente indispensável usada em laboratórios médicos e de pesquisa biológica para uma variedade de aplicações. Estas incluem a clonagem de DNA para o sequenciamento, filogenia ou análise 1 O texto da Wikipedia citado aqui é distribuído sob CC-BY-SA, vide http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3,0.
2 / 77 funcional com base em DNA de genes; os diagnósticos de doenças hereditárias; a identificação de perfis genéticos (usados nas ciências forenses e teste de paternidade); e a detecção e diagnóstico de doenças infecciosas. Em 1993, Mullis foi premiado com o Prêmio Nobel em Química junto com Michael Smith pelo seu trabalho sobre a PCR.
[006] O método conta com ciclagem térmica, consistindo de ciclos de aquecimento e resfriamento cíclicos da reação para a fusão de DNA e replicação enzimática do DNA. Iniciadores (fragmentos de DNA curtos) contendo sequências complementares para a região alvo juntos com uma DNA polimerase (depois da qual o método é denominado) são componentes chave para permitir a amplificação seletiva e repetida. Conforme a PCR progride, o DNA gerado é por si só usado como um padrão para a replicação, colocando em movimento uma reação em cadeia na qual o padrão de DNA é exponencialmente amplificado. A PCR pode ser extensivamente modificada para realizar um amplo arranjo de manipulações genéticas.
[007] Quase todas as aplicações de PCR utilizam uma DNA polimerase estável ao calor, tal como Taq polimerase, uma enzima originalmente isolada da bactéria Thermus aquaticus. Esta DNA polimerase enzimaticamente monta um novo filamento de DNA de blocos de construção de DNA, os nucleotídeos, pelo uso de DNA de filamento único como um padrão e oligonucleotídeos de DNA (também chamados de iniciadores de DNA), que são requeridos para o início da síntese de DNA. a vasta maioria dos métodos de PCR usam a ciclagem térmica, isto é, aquecimento e resfriamento alternados da amostra de PCR para uma série definida de etapas de temperatura. Estas etapas de ciclagem térmica são necessárias primeiro para separar fisicamente os dois filamentos em uma hélice dupla de DNA em uma temperatura alta em um processo chamado de fusão de DNA. Em uma temperatura mais baixa, cada filamento é depois usado como o padrão na síntese de DNA pela DNA polimerase para amplificar seletivamente o DNA
3 / 77 alvo. A seletividade da PCR resulta do uso de iniciadores que são complementares à região de DNA alvejada para amplificação sob condições de ciclagem térmica específicas. Princípios e procedimentos da PCR
[008] A PCR é usada para amplificar uma região específica de um filamento de DNA (o alvo de DNA). A maioria dos métodos de PCR tipicamente amplificam fragmentos de DNA de até ~10 quilopares de base (kb), embora algumas técnicas possibilitem a amplificação de fragmentos até 40 kb no tamanho.
[009] Uma configuração básica de PCR requer diversos componentes e reagentes. Estes componentes incluem: • DNA padrão que contém a região de DNA (alvo) a ser amplificada. • Dois iniciadores que são complementares para as extremidades 3’ (três plica) de cada um dos filamentos de sentido e antissentido do alvo de DNA. • Taq polimerase ou uma outra DNA polimerase com uma temperatura ótima em torno de 70°C. • Trifosfatos de desoxinucleosídeo (dNTPs; nucleotídeos contendo grupos de trifosfato), os blocos de construção a partir dos quais a DNA polimerase sintetiza um novo filamento de DNA.
[0010] • Solução tampão, provendo um ambiente químico adequado para a atividade e estabilidade ótimas da DNA polimerase.
[0011] • Cátions bivalentes, íons magnésio ou manganês; geralmente Mg2+ é usado, mas Mn2+ pode ser utilizado para a mutagênese de DNA mediada pela PCR, visto que a concentração de Mn2+ mais alta aumenta a taxa de erro durante a síntese de DNA. • Cátions monovalentes íons potássio.
[0012] A PCR é habitualmente realizada em um volume de reação de
4 / 77 10 a 200 μl em tubos de reação pequenos (volumes de 0,2 a 0,5 ml) em um ciclador térmico. O ciclador térmico aquece e resfria os tubos de reação para alcançar as temperaturas requeridas em cada etapa da reação (ver abaixo). Muitos cicladores térmicos modernos fazem uso do efeito Peltier, que permite tanto o aquecimento quanto o resfriamento do bloco segurando os tubos de PCR simplesmente pela reversão da corrente elétrica. Os tubos de reação de parede fina permitem condutividade térmica favorável para permitir quanto ao equilíbrio térmico rápido. A maioria dos cicladores térmicos têm tampas aquecidas para impedir a condensação no topo do tubo de reação. Termocicladores mais antigos carecendo de uma tampa aquecida requerem uma camada de óleo no topo da mistura de reação ou uma bola de cera dentro do tubo. Procedimento
[0013] Tipicamente, a PCR consiste em uma série de 20 a 40 mudanças de temperatura repetidas, chamadas de ciclos, com cada ciclo habitualmente consistindo de 2 a 3 etapas de temperatura separadas, usualmente três... A ciclagem é frequentemente precedida por uma única etapa de temperatura (chamada de retenção) em uma temperatura alta (>90°C) e seguida por uma retenção no final para a extensão do produto final ou armazenagem breve. As temperaturas usadas e a duração de tempo que elas são aplicadas em cada ciclo dependem de uma variedade de parâmetros. Estes incluem a enzima usada para a síntese de DNA, a concentração de íons bivalentes e dNTPs na reação e a temperatura de fusão (Tm) dos iniciadores.
[0014] Etapa de inicialização: Esta etapa consiste em aquecer a reação a uma temperatura de 94 a 96°C (ou 98°C se polimerases extremamente termoestáveis são usadas), que é mantida durante 1 a 9 minutos. Isto é requerido apenas para DNA polimerases que requeiram ativação térmica pela PCR de partida quente.
[0015] Etapa de desnaturação: Esta etapa é o primeiro evento de
5 / 77 ciclagem regular e consiste em aquecer a reação de 94 a 98°C durante 20 a 30 segundos. Isto causa a fusão do padrão de DNA pelo rompimento das ligações de hidrogênio entre bases complementares, produzindo Moléculas de DNA de filamento único.
[0016] Etapa de recozimento: A temperatura de reação é diminuída para 50 a 65°C durante 20 a 40 segundos permitindo recozimento dos iniciadores ao DNA de filamento único padrão. Tipicamente a temperatura de recozimento é de cerca de 3 a 5 graus Celsius abaixo da Tm dos iniciadores usados. Ligações de hidrogênio de DNA-DNA estáveis são apenas formadas quando a sequência de iniciador muito intimamente combina com a sequência padrão. A polimerase se liga ao híbrido de iniciador-padrão e inicia a síntese de DNA.
[0017] Etapa de extensão/alongamento: A temperatura nesta etapa depende da DNA polimerase usada; a Taq polimerase tem a sua temperatura de atividade ótima de 75 a 80°C e habitualmente uma temperatura de 72°C é usada com esta enzima. Nesta etapa a DNA polimerase sintetiza um novo filamento de DNA complementar ao filamento de DNA padrão pela adição de dNTPs que são complementares ao padrão na direção de 5’ para 3’, condensando o grupo de 5’-fosfato das dNTPs com o grupo 3’-hidroxila na extremidade do filamento de DNA nascente (extensão). O tempo de extensão depende tanto da DNA polimerase usada quanto do comprimento do fragmento de DNA a ser amplificado. Como uma regra geral, na sua temperatura ótima, a DNA polimerase polimerizará mil bases por minuto. Sob condições ótimas, isto é, se não houver limitações devido às limitações de substratos ou reagentes, em cada etapa de extensão, a quantidade de alvo de DNA é duplicada, levando à amplificação exponencial (geométrica) do fragmento de DNA específico.
[0018] Alongamento final: Esta etapa única é ocasionalmente realizada em uma temperatura de 70 a 74°C durante 5 a 15 minutos depois do
6 / 77 último ciclo de PCR para garantir que qualquer DNA de filamento único remanescente fosse totalmente prolongado.
[0019] Retenção final: Esta etapa de 4 a 15°C durante um tempo indefinido pode ser utilizada para a armazenagem de curta duração da reação. Estágios da PCR
[0020] O processo de PCR pode ser dividido em três estágios:
[0021] Amplificação exponencial: Em cada ciclo, a quantidade de produto é duplicada (assumindo eficiência de reação de 100%). A reação é muito sensível: apenas quantidades ínfimas de DNA precisam estar presentes.
[0022] Estágio de Nivelamento: A reação fica lenta conforme a DNA polimerase perde atividade e conforme o consumo de reagentes tais como dNTPs e iniciadores faz com que ela se torne limitante.
[0023] Platô: Mais nenhum produto acumula devido à exaustão de reagentes e enzima. Otimização de PCR
[0024] Na prática, a PCR pode falhar por várias razões, em parte devido à sua sensibilidade à contaminação causando amplificação de produtos de DNA espúrios. Por causa disto, várias técnicas e procedimentos foram desenvolvidos para otimizar as condições de PCR. A contaminação com DNA estranho é tratada com protocolos e procedimentos de laboratório que separam misturas de pré-PCR de contaminantes de DNA potenciais. Isto usualmente envolve a separação espacial de áreas de configuração de PCR das áreas para análise ou purificação de produtos de PCR, uso de utensílios plásticos descartáveis e limpeza completa da superfície de trabalho entre configurações de reação. As técnicas de planejamento de iniciador são importantes na melhora do rendimento do produto da PCR e na evitação da formação de produtos espúrios e o uso de componentes de tampão alternativos ou enzimas de polimerase pode ajudar com a amplificação de regiões longas ou de outro modo problemáticas de DNA. A adição de
7 / 77 reagentes, tais como formamida, em sistemas de tampão pode aumentar a especificidade e rendimento da PCR. Amplificação e quantificação de DNA
[0025] Porque a PCR amplifica as regiões de DNA que a mesma alveja, a PCR pode ser usada para analisar quantidades extremamente pequenas de amostra. Isto é frequentemente crítico para a análise forense, quando apenas uma quantidade traço de DNA está disponível como evidência. A PCR também pode ser usada na análise de DNA antigo que tenha dezenas de milhares de anos de idade. Estas técnicas com base na PCR foram usadas com êxito em animais, tais como um mamute com quarenta mil anos de idade e também em DNA humano, em aplicações variando da análise de múmias egípcias até a identificação de um czar russo.
[0026] Os métodos quantitativos de PCR permitem a estimativa da quantidade de uma dada sequência presente em uma amostra — uma técnica frequentemente aplicada para determinar quantitativamente níveis de expressão de gene. A PCR em tempo real é uma ferramenta estabelecida para a quantificação de DNA que mede o acúmulo de produto de DNA depois de cada rodada de amplificação da PCR. PCR no diagnóstico de doenças
[0027] A PCR permite diagnóstico precoce de doenças malignas tais como leucemia e linfomas, que é correntemente o mais desenvolvido na pesquisa de câncer e já está sendo usada rotineiramente. (Ver os estudos citados no artigo de estudo EUTOS For CML citado em http://www.eutos.org/content/molecular_monitoring/informação/pcr_testing/, especialmente as notas 10 a 13.) os ensaios de PCR podem ser realizados diretamente nas amostras de DNA genômico para detectar células malignas específicas de translocação em uma sensibilidade que é pelo menos 10.000 vezes mais alta do que aquela de outros métodos.
[0028] A PCR também permite a identificação de microrganismos
8 / 77 não cultiváveis ou de crescimento lento tais como micobactérias, bactérias anaeróbicas ou vírus a partir de ensaios de cultura de tecido e modelos de animal. A base para as aplicações da PCR em diagnósticos na microbiologia é a detecção de agentes infecciosos e a discriminação de cepas não patogênicas das patogênicas em virtude de genes específicos.
[0029] O DNA viral pode igualmente ser detectado pela PCR. Os iniciadores usados precisam ser específicos para as sequências alvejadas no DNA de um vírus e a PCR pode ser usada para análises de diagnóstico ou sequenciamento de DNA do genoma viral. A alta sensibilidade da PCR permite a detecção viral logo depois da infecção e mesmo antes do início da doença. Tal detecção precoce pode dar aos médicos uma precedência significante no tratamento. A quantidade de vírus (“carga viral”) em um paciente também pode ser quantificada pelas técnicas de quantificação de DNA com base na PCR (ver abaixo). Métodos de amplificação isotérmica
[0030] Como descrito na Wikipedia1 em http://en.wikipedia.org/wiki/Variants_of_PCR#Isotérmica_amplificação_mét odos:
[0031] “Alguns protocolos de amplificação de DNA foram desenvolvidos que podem ser usados alternativamente para a PCR: • Amplificação dependente de helicase é similar à PCR tradicional, mas usa uma temperatura constante ao invés da ciclagem através das etapas de desnaturação e recozimento/extensão. A DNA Helicase, uma enzima que desenrola o DNA, é usada no lugar da desnaturação térmica. • PAN-AC também usa condições isotérmicas para a amplificação e pode ser usada para analisar células vivas. • Reação de Amplificação por Enzima de Corte aludidas como NEAR, é isotérmica, replicando DNA em uma temperatura constante usando uma polimerase e enzima de corte.
9 / 77 • Amplificação pela Recombinase Polimerase (RPA). O método usa uma recombinase para especificamente emparelhar iniciadores com DNA de filamento duplo com base na homologia, direcionando assim a síntese de DNA de sequências de DNA definidas presentes na amostra. A presença da sequência alvo inicia a amplificação de DNA e nenhuma fusão térmica ou química de DNA são requeridas. A reação progride rapidamente e resulta na amplificação de DNA específica de apenas umas poucas cópias alvos para níveis detectáveis tipicamente dentro de 5 a 10 minutos. O sistema de reação inteiro é estável como uma formulação seca e não precisa de refrigeração. A RPA pode ser usada para substituir a PCR (Reação em cadeia da polimerase) em uma variedade de aplicações de laboratório e os usuários podem planejar os seus próprios ensaios. Detecção de alvos genéticos dentro de uma amostra de teste.
[0032] Depois da amplificação de DNA haverá um grande número de cópias das sequências genética alvo na solução de teste. Em um ensaio de teste de diagnóstico, marcadores específicos podem ser designados que ligar- se-ão às sequências alvo e uma vez ligados provêem um sinal ótico ou mudança óptica que podem ser detectados externamente em relação ao tubo de teste. Este sinal ótico pode ser uma mudança na cor e/ou opacidade da amostra como medida por uma mudança na absorção óptica da amostra nos comprimentos de onda óticos específicos. O sinal de saída também pode ser por via de saída de luz direta da amostra, onde o marcador, quando ativado pelo evento de ligação do alvo, deflagra a liberação de saída de luz de bioluminescência. A saída de detecção óptica também pode ser por uma mudança na fluorescência da solução, que pode ser de um sinal marcador de fluorescência. Neste caso, cada molécula marcadora é configurada com um extintor de florescência em proximidade imediata a um átomo de fluorescência ou arranjo de átomos. Esta molécula marcadora é configurada tal que quando a mesma seletivamente se liga a uma sequência de DNA alvo
10 / 77 na solução de teste, o extintor e o fluoróforo são separados e um sinal de fluorescência forte pode ser depois detectado pela ação do fluoróforo. Neste arranjo, a intensidade de florescência global da solução alvo é indicativa da quantidade relativa de material genérico alvo na solução de teste. Este sinal pode ser depois usado para formar a base de um teste de diagnóstico para determinar a presença ou ausência e a quantidade relativa do material alvo na amostra sob teste. Canal de Controle e Multiplexação.
[0033] Dentro de um único poço de teste, é possível ter diversos marcadores diferentes presentes que proverão uma saída óptica com base na ligação de diversas sequências de DNA genética alvo diferentes. Neste caso diversos sensores diferentes são usados ou um sensor com mais do que uma saída seletiva é usada. Por exemplo, em um sistema de dois canais, dois marcadores de fluorescência diferentes podem ser utilizados e estes serão detectados por dois sensores de fluorescência diferentes configurados para detectar emissões nas respectivas faixas de frequência específicas para os respectivos marcadores de fluorescência para permitir que os canais sejam discriminados.
[0034] Este método pode ser usado para prover um canal de controle onde a química do ensaio de teste é configurada tal que o alvo de controle deva estar sempre presente se o processo de teste estiver andando corretamente. Neste caso, a saída do canal de controle é usada para confirmar se o processo de teste está sendo conduzido corretamente pelo sistema e para confirmar se os resultados de teste obtidos por outros canais medidos pelo sistema são válidos.
[0035] Este método pode ser também usado para testar mais do que uma sequência genética alvo dentro de cada poço de teste como um teste multiplexado.
[0036] Poços de teste múltiplos podem ser usados, com cada poço
11 / 77 executando química de amplificação diferentemente configurada e um conjunto diferente de marcadores alvos. Os canais de controle podem operar em um ou mais poços e abranger testes operados em outros poços no teste. Por este arranjo vários testes podem ser conduzidos em uma única amostra como um método diferente para multiplexação.
[0037] Os sistemas e aparelhos de teste de diagnóstico da técnica anterior, em particular instrumentos de amplificação e detecção de ácido nucléico, são tipicamente grandes, complexos e caros e requerem etapas de preparação de amostra que devem ser conduzidos independentemente do instrumento. Estas etapas de preparação tipicamente requerem um operador técnico treinado e este operador e o ambiente de preparação de teste podem ser expostos às amostras nocivas tais como fluidos corporais e agentes infecciosos e o processo está em risco de operações manuais incorretos, incluindo derramamentos e adições de reagente incorretas.
[0038] A amostra de teste resultante deve ser depois acuradamente subamostrada e transferida por uma etapa de transferência manual, tipicamente uma operação de pipetagem hábil. Este método requer um operador técnico treinado e vários tubos separados e dispositivos de transferência, todos dos quais serão contaminados pela amostra e devem ser corretamente manuseados e dispostos individualmente.
[0039] Nestes métodos da técnica anterior, a amostra de teste não é vedada do ambiente durante o processo de preparação de amostra e transferência para dentro dos tubos de teste no instrumento de teste. Esta exposição para a amostra pode apresentar risco dos agentes infecciosos para o usuário e outros e também pode contaminar o instrumento de teste e área de teste, resultando em resultados de diagnóstico incorretos em testes subsequentes.
[0040] É desejado prover um sistema e método de teste de diagnóstico que alivie uma ou mais dificuldades da técnica anterior ou que pelo menos
12 / 77 proveja uma alternativa útil.
SUMÁRIO
[0041] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, é provido um sistema de teste de diagnóstico, incluindo: uma montagem de teste de diagnóstico; e um aparelho de teste de diagnóstico para receber e interagir com a montagem de teste de diagnóstico para realizar um teste de diagnóstico em uma amostra biológica ou ambiental neste; em que a montagem de teste de diagnóstico inclui: um reservatório de preparação de amostra para receber a amostra biológica ou ambiental dentro de um fluido de preparação de amostra contido no reservatório de preparação de amostra para a preparação de um fluido de amostra disto, o reservatório de preparação de amostra inicialmente provendo um volume aberto livre de obstruções tal que um cotonete carreando a amostra biológica ou ambiental pode ser usado para agitar o fluido de preparação de amostra no reservatório de preparação de amostra e para lavar a amostra biológica ou ambiental do cotonete dentro do fluido de preparação de amostra; um mecanismo de dispensa de amostra para a inserção dentro do reservatório de preparação de amostra depois da recepção da amostra biológica ou ambiental neste; um fechamento para vedar o reservatório de preparação de amostra depois da recepção da amostra biológica ou ambiental e o mecanismo de dispensa de amostra neste; pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico acoplado ao reservatório de preparação de amostra; e pelo menos um selo entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para impedir movimento de fluido entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo
13 / 77 menos um reservatório de teste de diagnóstico; em que o mecanismo de dispensa de amostra é operável para romper o pelo menos um selo para permitir que o fluido de amostra entrasse no pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico do reservatório de preparação de amostra e dispensar um sub volume predeterminado do fluido de amostra do reservatório de preparação de amostra para dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para o teste de diagnóstico e detecção neste enquanto impede movimento de fluido adicional entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
[0042] Em algumas modalidades, o mecanismo de dispensa de amostra é fixado ao fechamento de modo que uma ação de aplicação do fechamento ao reservatório de preparação de amostra também afeta a inserção do mecanismo de dispensa de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra.
[0043] Em algumas modalidades, uma única ação por um usuário faz com que o mecanismo de dispensa de amostra rompa o pelo menos um selo e dispense o fluido de amostra do reservatório de preparação de amostra dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
[0044] Em algumas modalidades, a ação única pelo usuário é uma ação de rosqueamento prolongada aplicada ao fechamento em relação ao reservatório de preparação de amostra, em que a ação de rosqueamento causa a operação do mecanismo de dispensa de amostra e selos do reservatório de preparação de amostra.
[0045] Em algumas modalidades, o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para determinar a conclusão da operação do mecanismo de dispensa de amostra e, responsivo à determinação, para prosseguir com o teste de diagnóstico dos conteúdos do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
14 / 77
[0046] Em algumas modalidades, o fechamento inclui uma rosca e o aparelho de teste de diagnóstico inclui pelo menos um componente sensor configurado para determinar um grau de rotação e/ou progressão da rosca do fechamento e o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para induzir um usuário a concluir a operação de fechamento se o pelo menos um sensor componente determinasse que a operação de fechamento está incompleta; e automaticamente progride para um estágio seguinte do teste de diagnóstico se a operação de fechamento foi determinada como estando completa.
[0047] Em algumas modalidades, a montagem de teste de diagnóstico inclui um segundo fechamento que veda o fluido de preparação de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra antes do uso e que é removido para permitir que a amostra biológica ou ambiental seja adicionada ao fluido de preparação de amostra contido no reservatório de preparação de amostra.
[0048] Em algumas modalidades, o mecanismo de dispensa de amostra inclui: Uma câmara de dispensa que forma um segundo selo contra o pelo menos um selo para aprisionar o sub volume predeterminado do fluido de amostra dentro da câmara de dispensa; um membro de perfuração que rompe o pelo menos um selo pela formação de pelo menos uma abertura neste; e um mecanismo de êmbolo que forma um selo deslizante com uma superfície interna da câmara de dispensa, em que o selo deslizante é configurado para deslizar ao longo da superfície interna da câmara de dispensa para dispensar o sub volume predeterminado do fluido de amostra deste, através da pelo menos uma abertura e dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
[0049] Em algumas modalidades, a câmara de dispensa inclui uma superfície externa tendo recursos de localização de câmara mutualmente
15 / 77 espaçado estendendo-se desta e configurados para alinhar a câmara de dispensa centralmente do reservatório de preparação de amostra e permitir que o fluido de amostra flua entre os recursos de localização de câmara conforme o mecanismo de dispensa de amostra é inserido dentro do reservatório de preparação de amostra.
[0050] Em algumas modalidades, o mecanismo de dispensa de amostra é configurado de modo que uma única ação realizada por um usuário faz com que dois estágios de operação do mecanismo de dispensa de amostra, incluindo um primeiro estágio de operação que aprisiona o sub volume predeterminado do fluido de amostra dentro da câmara de dispensa e um segundo estágio de operação em que o fluido de amostra é dispensado da câmara de dispensa.
[0051] Em algumas modalidades, o mecanismo de dispensa de amostra inclui um componente de sequenciamento de força que é reconfigurado ou quebrado para permitir o segundo estágio de operação.
[0052] Em algumas modalidades, o componente de sequenciamento de força inclui um componente rompível que é configurado para romper para permitir que a operação do mecanismo de dispensa de amostra se processe do primeiro estágio de operação para o segundo estágio de operação.
[0053] Em algumas modalidades, o componente de sequenciamento de força inclui um espaçador colapsável ou triturável que aperta contra e faz com que a câmara de dispensa sele no primeiro estágio de operação e no segundo estágio de operação seja colapsado ou triturado para manter o selo, realizam a ação de perfuração e operam o êmbolo para dispensar o fluido de amostra da câmara de dispensa .
[0054] Em algumas modalidades, a câmara de dispensa é inicialmente configurada de modo que, conforme o mecanismo de dispensa de amostra seja inserido dentro do reservatório de preparação de amostra, o fluido de amostra é forçado fluir em torno do lado de fora da câmara de dispensa antes que o
16 / 77 mesmo possa fluir para dentro da câmara de dispensa, em que o fluido que flui em torno do lado de fora da câmara de dispensa é causado fluir através de um filtro ou material enchedor poroso que retém e/ou aprisiona partículas e fragmentos e/ou incorpora componentes biológicos ou químicos que se ligam aos componentes ou os capturam do fluido de amostra que de outro modo podem inibir ou interferir com o processo de teste de diagnóstico ou amplificação.
[0055] Em algumas modalidades, o reservatório de preparação de amostra inclui partículas magnéticas com o fluido de preparação de amostra, a superfície das partículas magnéticas sendo revestidas ou funcionalizadas para ligar com e capturar pelo menos uma espécie alvo predeterminada da amostra biológica ou ambiental quando as partículas magnéticas são misturadas dentro do fluido de amostra e o mecanismo de dispensa de amostra é configurado de modo que, conforme o mecanismo de dispensa de amostra é inserido dentro do reservatório de preparação de amostra, o fluido de amostra é forçado fluir através da câmara de dispensa e um ou mais imãs estão localizados em proximidade imediata à superfície interna da câmara de dispensa de modo que as partículas magnéticas contidas dentro do fluido de amostra e capturaram as espécies alvo sejam atraídas e mantidas contra a superfície interna da câmara de dispensa, tal que o mecanismo de êmbolo que forma um selo deslizante com a superfície interna da câmara de dispensa colete as partículas magnéticas mantidas contra a superfície interna e as dispense dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para prover uma concentração aumentada da pelo menos uma espécie alvo predeterminada no sub volume predeterminado das dispensas de fluido de amostra dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
[0056] Em algumas modalidades, pelo menos um do fechamento e do reservatório de preparação de amostra é configurado para impedir ou pelo menos inibir a remoção do fechamento do reservatório de preparação de
17 / 77 amostra de modo que os fluidos permaneçam vedados dentro da montagem de teste de diagnóstico.
[0057] Em algumas modalidades, o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico inclui pelo menos dois reservatórios de teste de diagnóstico.
[0058] Em algumas modalidades, os reservatórios de teste de diagnóstico contêm diferentes reagentes de teste de diagnóstico e/ou detecção selecionados para realizar os respectivos testes de diagnóstico diferentes e/ou para detectar as respectivas entidades alvos diferentes.
[0059] Em algumas modalidades, o reservatório de preparação de amostra contém reagentes para a preparação de amostra incluindo lise de célula e pelo menos um dos reservatórios de teste de diagnóstico é configurado para a amplificação de ácido nucléico e ligação de marcadores específicos para permitir uma saída óptica que possa ser medida pelo aparelho de teste de diagnóstico para determinar um resultado de teste de diagnóstico correspondente.
[0060] Em algumas modalidades, o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico inclui pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico que seja transparente para permitir que um resultado de teste correspondente seja observado visualmente como uma mudança na emissão e/ou absorção em um ou mais comprimentos de onda específicos e/ou turbidez dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico correspondente.
[0061] Em algumas modalidades, pelo menos um do pelo menos um dos reservatórios de teste de diagnóstico é transparente e o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para determinar um resultado de teste no pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico pela detecção ou medição de uma mudança na emissão e/ou absorção em um ou mais comprimentos de onda dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico, em que o aparelho de teste de diagnóstico é opcionalmente configurado para iluminar o
18 / 77 pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para realçar ou produzir a detecção ou medição.
[0062] Em algumas modalidades, o aparelho de teste de diagnóstico e a montagem de teste de diagnóstico incluem os respectivos recursos de alinhamento e suporte configurados para o engrenamento mútuo para garantir que a montagem de teste de diagnóstico seja recebida em um alinhamento predeterminado com respeito ao aparelho de teste de diagnóstico e para manter o alinhamento quando o fechamento é aplicado ao reservatório de preparação de amostra depois da recepção da amostra biológica ou ambiental e o mecanismo de dispensa de amostra neste.
[0063] Em algumas modalidades, o aparelho de teste de diagnóstico inclui um ou mais componentes configurados para aplicar uma mudança e/ou mover o campo magnético em relação à montagem de teste de diagnóstico para causar movimentos correspondentes de partículas magnéticas dentro do pelo menos um do reservatório de preparação de amostra e do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico e causando deste modo a mistura da amostra e fluido de preparação de amostra neste.
[0064] Em algumas modalidades, o aparelho de teste de diagnóstico e a montagem de teste de diagnóstico são configurados para permitir que o aparelho de teste de diagnóstico controle independentemente as temperaturas do reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
[0065] Em algumas modalidades, o aparelho de teste de diagnóstico inclui um ou mais sensores de imagem configurados para gerar dados de imagem representando uma ou mais imagens de pelo menos uma porção da montagem de teste de diagnóstico, em que as imagens representam pelo menos um de: (i) distribuição de fluido dentro de pelo menos um do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico e do reservatório de preparação
19 / 77 de amostra e o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para processar os dados de imagem para monitorar a dispensa do fluido de amostra e para prosseguir para um estágio seguinte de teste de diagnóstico se o monitoramento tiver determinado que a dispensa está completa; e (ii) um volume de fluido contido dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico e o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para processar os dados de imagem para permitir a compensação das tolerâncias de volume no fluido dispensado para permitir a determinação do resultado de teste melhorado.
[0066] Em algumas modalidades, o aparelho de teste de diagnóstico inclui um ou mais sensores óticos montados em um estágio de tradução sob o controle de um controlador do aparelho de teste de diagnóstico de modo que os sensores óticos possam medir a absorção óptica ou emissão ou fluorescência de um ou mais reservatórios de teste de diagnóstico selecionados da montagem de teste de diagnóstico.
[0067] Em algumas modalidades, o aparelho de teste de diagnóstico inclui pelo menos uma fonte de emissão de ultra violeta (UV) para desnaturar amostras contidas dentro da montagem de teste de diagnóstico seguindo um teste de diagnóstico para inibir a contaminação no evento de fluido de amostra escapar da montagem de teste de diagnóstico.
[0068] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, é provido um método de teste de diagnóstico, incluindo as etapas de: colocar uma montagem de teste de diagnóstico dentro de uma porta de recepção de um aparelho de teste de diagnóstico configurado para realizar um teste de diagnóstico em uma amostra biológica ou ambiental neste; adicionar a amostra biológica ou ambiental dentro de um fluido de preparação de amostra contido em um reservatório de preparação de amostra da montagem de teste de diagnóstico para a preparação de um fluido
20 / 77 de amostra neste; depois da etapa de adição, inserir um mecanismo de dispensa de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra e aplicar um fechamento a isso; operar o mecanismo de dispensa de amostra para romper o pelo menos um selo entre o reservatório de preparação de amostra e pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico do aparelho de teste de diagnóstico para permitir que fluido de amostra entre no pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico a partir do reservatório de preparação de amostra e para dispensar um sub volume predeterminado do fluido de amostra do reservatório de preparação de amostra dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para teste de diagnóstico e detecção neste enquanto impede movimento de fluido adicional entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
[0069] Em algumas modalidades, o mecanismo de dispensa de amostra é fixado ao fechamento de modo que a aplicação do fechamento ao reservatório de preparação de amostra também efetua a inserção do mecanismo de dispensa de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra.
[0070] Em algumas modalidades, uma única ação por um usuário causa a operação do mecanismo de dispensa de amostra, a ação única sendo uma ação de rosqueamento prolongada aplicada ao fechamento em relação ao reservatório de preparação de amostra, em que a ação de rosqueamento causa a operação do mecanismo de dispensa de amostra e veda o reservatório de preparação de amostra.
[0071] Também é aqui descrito um instrumento ou aparelho de teste de diagnóstico, incluindo: - um alojamento de instrumento com uma porta de acesso para
21 / 77 aceitar uma montagem de cartucho plástico. - Um sensor ou comutador para detectar a inserção ou presença do cartucho inserido dentro do aparelho. - componentes eletrônicos controladores e componentes eletrônicos internos associados, microprocessadores e memória para rodar um programa de software e salvar dados para rechamada e uso futuros. - Conectores de interface elétrica para conexão de interfaces periféricas conectadas com USB, serial ou Eternet e dispositivos de memória externa. - software incorporado para prover funções para o processamento de sequência do instrumento, do cartucho e adquirir medições de teste de diagnóstico para determinação de interpretação de resultados de teste. - um bloco de aquecimento da câmara de amostra com temperatura controlada para prover aquecimento e controle de temperatura da seção superior da câmara de amostra da montagem de cartucho. - um bloco aquecedor controlado na temperatura para prover aquecimento e controle de temperatura dos poços de teste de amplificação específica de contato superior em um cartucho inserido onde este bloco pode aplicar temperaturas controladas incluindo a ciclagem de temperatura para fluidos dentro dos poços de cartucho. - Sensores para detectar e prover medição das características de absorção óptica, fluorescência ou bioluminescência dos reagentes e fluido adicionado de reações de amostra dentro dos poços de teste durante o curso da execução do teste e na conclusão do teste.
[0072] O aparelho instrumental pode incorporar um ou mais sensores óticos onde estes sensores podem ser digitalizados juntos em uma fileira de poços de teste para permitir que um grande número de medições sejam registradas para cada poço de teste usando um ou mais sensores diferentes.
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[0073] Opcionalmente, o controlador do instrumento pode estar localizado remotamente do corpo físico do aparelho tal como em um servidor remoto e manejar e controlar a operação do aparelho em uma rede de comunicação tal como a internet.
[0074] Opcionalmente um ou mais dos sensores é um sensor de fluorescência coaxial onde emissões oticamente filtradas de um diodo emissor de luz ou iluminação de laser de uma faixa de comprimento de onda seletiva é emitida das lentes de sensor. Esta iluminação causa a excitação óptica da amostra no poço de teste e a mesma lente também captura a emissão de fluorescência da amostra em um comprimento de onda mudado diferente. Esta emissão de fluorescência de amostra é medida e forma uma medição usada na determinação do resultado do teste de diagnóstico.
[0075] Opcionalmente, um ou mais dos sensores detectarão fluorescência na amostra contida dentro de cada poço de teste usando uma fonte de iluminação de excitação separada para excitar oticamente a amostra de teste e um sensor separado para medir a emissão de fluorescência resultante.
[0076] Opcionalmente, um ou mais dos sensores usam reflectância ou transmissão de faixas de comprimento de onda de iluminação óptica específicas para medir a reflectância ou absorção ópticas dentro da amostra de teste contida dentro de cada poço de teste.
[0077] Opcionalmente, um ou mais dos sensores medem a emissão de luz da amostra de teste, onde esta emissão é causada pela luminescência ou bioluminescência dentro da amostra de teste.
[0078] Opcionalmente, os sensores são digitalizados em velocidade constante passando todos os poços e um grande número de medições adquiridas. O processamento subsequente deste conjunto de dados de medições determina os valores de medição para designar a cada poço de teste. Esta análise considera características tais como a posição relativa ou o tempo
23 / 77 de aquisição de cada medição e picos locais com uma curva interpolada abrangendo as medições adquiridas.
[0079] Opcionalmente, o aparelho instrumental incorpora uma ou mais fontes de luz ultravioleta, onde esta iluminação ultravioleta pode ser ligada ou desligada pelo controlador do instrumento.
[0080] Opcionalmente, o aparelho instrumental incorpora um ou mais alvos de referência dentro do campo de visão dos sensores de fluorescência ou de absorção óptica. Cartucho
[0081] O cartucho de teste de diagnóstico inclui um ou mais reservatórios de teste de diagnóstico também aqui aludidos por conveniência como ‘tubos de teste’ acoplado imediato com uma parede de separação a um reservatório de preparação de amostra dentro do cartucho. O reservatório de preparação de amostra é totalmente vedado dos tubos de teste acoplados e é tipicamente suprido preenchido com um volume de fluido de preparação de amostra e um fechamento removível.
[0082] No uso, o cartucho de teste é sustentado e aquecido dentro do aparelho de teste e o fechamento removível é removido para adicionar uma amostra. A amostra pode ser qualquer amostra biológica ou química para a qual um teste de diagnóstico e reagentes químicos de exibição de teste adequados são incorporados dentro do(s) tubo(s) de teste acoplado(s).
[0083] O cartucho de teste é suprido com uma tampa adicional com um mecanismo de dispensa fixado. Esta tampa adicional incorpora um mecanismo de dispensa e é adaptado depois que a tampa inicial foi removida e a amostra adicionada. Conforme a tampa adicional e o mecanismo de dispensa são inseridos e a tampa é fechada por uma ação tal como rosqueando-a, o mecanismo de dispensa perfura a base da câmara de amostra e dispensa um volume medido de fluido de amostra preparado dentro de um ou mais tubos de teste. Esta tampa depois fecha e veda a amostra dentro da
24 / 77 montagem de cartucho
[0084] Alternativamente, a primeira tampa, uma vez removida, pode ter o mecanismo de dispensa adaptado a ela, em uma operação separada, para formar a tampa adicional com um mecanismo de dispensa incluído pronto para ser readaptado para operar uma função de dispensa e fechar o cartucho.
[0085] Opcionalmente, depois que a amostra é adicionada, o próprio mecanismo de dispensa é diretamente inserido e depois uma tampa é ajustada e a ação de fechamento desta tampa, tal como rosqueando a tampa fechada, opera o mecanismo de dispensa e fecha o cartucho. Operação do Cartucho - um cartucho de teste com um fechamento ou tampa removíveis para permitir a adição de uma amostra de teste, onde o cartucho incorpora um reservatório de preparação de amostra contendo um fluido de preparação de amostra tal como uma solução tampão ou de lise para ajudar com a preparação da amostra e pode incluir separação de material de DNA alvo de dentro das células de amostra. A seção de reservatório de fluido de preparação de amostra do cartucho é um volume fechado para confiavelmente reter a solução de preparação de amostra até um tempo que tal como um sub volume seja dispensado através das perfurações na parede de outro modo vedada entre o reservatório e os tubos de teste acoplados.
[0086] - Um instrumento de teste que sustenta um bloco metálico ou de outro modo termicamente condutivo em contato com o(s) reservatório(s) de teste de diagnóstico, uma temperatura controlada sob controle eletrônico usando um único ou grande número de sensores de temperatura de retroalimentação montados no bloco. Este bloco aquecido é configurado para aquecer e controlar a temperatura dos conteúdos fluidos do(s) reservatório(s) de teste de diagnóstico através da parede plástica do poço para os propósitos de obtenção de uma reação química ou enzimática da amostra no material dentro da amostra para expor o DNA alvo. Opcionalmente, um bloco metálico
25 / 77 ou de outro modo termicamente condutivo está em contato com os volumes de fluido do cartucho provê uma temperatura controlada sob controle eletrônico usando um único ou grande número de sensores de temperatura de retroalimentação montados no bloco. Este bloco é configurado para aquecer os fluidos de teste internos através das paredes de cartucho a uma temperatura conhecida para os propósitos de preparação de amostra e lise de célula antes de fluir para dentro dos poços de teste.
[0087] Opcionalmente, os sensores de temperatura podem incluir um ou mais sensores de temperatura de não contato de emissão de infravermelho, onde estes sensores são configurados para ler a temperatura do bloco ou a temperatura real do fluido nos poços de teste de reação.
[0088] - Um bloco metálico ou de outro modo termicamente condutivo em contato com um reservatório de teste de diagnóstico ou ‘poço de teste’ ou opcionalmente uma pluralidade de poços de teste provê uma temperatura controlada sob controle eletrônico usando um único ou grande número de sensores de temperatura de retroalimentação montados no bloco. Este bloco aquecido é configurado para aquecer e controlar a temperatura dos conteúdos fluidos dos poços de teste através das paredes de poço plásticas para o propósito de obtenção de uma reação de test incluindo amplificação de DNA isotérmica ou de ácido nucléico pela PCR. Iluminação UV
[0089] A iluminação ultravioleta é usada para descontaminar e desnaturar os conteúdos do cartucho de teste incluindo os conteúdos dos poços de teste na conclusão de um teste.
[0090] Opcionalmente, a iluminação ultravioleta é usada para desnaturar e decompor produtos genéticos de ácido nucléico, incluindo os produtos de amplificação de ácido nucléico dentro de cada poço de teste, na conclusão do teste. Esta desnaturação e decomposição de material de DNA genético pela iluminação ultravioleta para impedir qualquer contaminação do
26 / 77 sistema ou seu ambiente pelos amplicons se o cartucho fosse subsequentemente danificado ou vazasse e para impedir este material de ser inadvertidamente introduzido dentro de um teste subsequente e causar um resultado de teste errôneo.
[0091] Opcionalmente, a iluminação ultravioleta é realizada junto com os sensores de detecção em um carro que possa mecanicamente varrer ao longo de uma pluralidade de poços de teste. Este arranjo permite que uma única finte de ultravioleta focalizada ilumine cada poço por sua vez durante uma digitalização de descontaminação controlada.
[0092] Opcionalmente, a fonte de ultravioleta é composta de um ou mais diodos emissores de luz ultravioleta. Medição Óptica
[0093] Opcionalmente, um conjunto de sensores de medição óptica pode visualizar os conteúdos do poço de teste através de uma janela óptica ou porta no poço de teste e seu bloco aquecedor circundante para produzir medições de absorção óptica, florescência ou bioluminescência.
[0094] Opcionalmente, os sensores óticos são montados sobre carros que podem ser movidos linearmente ao longo dos poços de teste para varrer e prover uma medição óptica para cada poço em um conjunto de poços.
[0095] Opcionalmente, a digitalização linear é realizada pelo carro em uma velocidade constante e a leitura de pico ou uma média de leituras associadas com cada poço de teste é designada como a leitura óptica para este poço.
[0096] Opcionalmente, o carro se move em um arranjo de deslizamento linear que pode ser acionado por um motor de passo para prover posição precisa e controle de movimento sob controle de software e interface elétrica para o controlador do instrumento.
[0097] Opcionalmente, um conjunto de amostras de referência é montado dentro do instrumento tal que os sensores usados para adquirir
27 / 77 medições de poço também podem adquirir medições das amostras de referência.
[0098] Opcionalmente, um conjunto específico de medições de sensor adquiridas quando a medição das amostras de referência são salvas em um local de memória não volátil dentro do controlador do instrumento, tal que estas leituras salvas possam ser usadas no futuro para confirmar que as leituras subsequentes estão dentro de uma dada faixa de tolerância das leituras salvas para cada respectivo sensor e amostra de referência.
[0099] Opcionalmente, a capacidade para comparar as leituras de sensor dos materiais de referência montados dentro do instrumento contra as leituras previamente salvas para a mesma amostra para os propósitos do controlador do instrumento realizar um auto teste do instrumento. Sensor de Imageamento e Análise de Imagem
[00100] Opcionalmente, marcas de código ou um código de barras ou um código bidimensional, tal como um código QR é provido na superfície da montagem de cartucho.
[00101] Opcionalmente, as marcas de código são impressas pela marcação a laser, descoloração a laser ou gravação a laser sobre uma superfície plástica do cartucho.
[00102] Opcionalmente, o sensor de imagem ou câmera incorporado dentro do instrumento em combinação com a iluminação incorporada dentro do instrumento adquire uma imagem de um código impresso sobre o cartucho e através de um processo de análise de imagem no software, extrai a informação codificada.
[00103] Opcionalmente, a informação codificada dentro do código impresso inclui um ou mais dos seguintes dados: a identificação do teste, detalhes da sequência de teste e temperaturas a serem aplicadas para conduzir o cartucho, um número de série único do cartucho, o número do lote de fabricação para o cartucho, parâmetros de calibração específicos do lote, a
28 / 77 data de fabricação do cartucho e uma data de validade depois da qual o cartucho não deve ser usado.
[00104] Opcionalmente, o sensor de imagem é usado para confirmar a progressão de sequência e liberação e fluxo corretos dos reagentes de teste dentro do cartucho tal que a integridade do teste possa ser confirmada pelo software e usada para melhorar a confiabilidade e segurança do resultado de teste. O sensor de imagem é usado pelo controlador para observar fluidos internos e as peças de mecanismo dentro do cartucho e calcular uma interpretação de controle através do uso de software de análise de imagem dentro do controlador do aparelho.
[00105] Opcionalmente o sensor de imagem confirma a operação e posição do mecanismo de dispensa para confirmar operação incompleta ou correta e completa do cartucho e alertar o usuário para concluir a operação ou na conclusão, automaticamente progredir para a etapa seguinte no processo do aparelho para adquirir o resultado de teste final.
[00106] Opcionalmente, o reagente líquido é colorido por um corante visual e a saída de teste é um sinal fluorescente, tal que a cor do reagente não interfira com a saída de teste, mas esta cor possa ser usada para rastrear visualmente o fluxo e os níveis dispensados dentro do cartucho.
[00107] Opcionalmente, o sensor de imagem dentro do instrumento captura imagens do reagente colorido dentro de seções transparentes do cartucho e confirma na análise de imagem do software que exigências de fluxo particulares operaram corretamente.
[00108] Opcionalmente, os dados de imagem adquiridos pelo sensor de imagem e na análise de imagem subsequente são usados pelo controlador do software para determinar os níveis do fluido de amostra dispensado em cada um dos tubos de teste e usa este nível para determinar que o processo de dispensa do fluido de amostra foi corretamente concluído. O controlador de software dentro do instrumento também pode usar o nível do fluido dentro
29 / 77 dos tubos de teste para compensar o resultado de teste quanto às tolerâncias na operação de dispensa. Dentro do software, o nível do fluido com cada câmara de teste é convertido para um volume usando-se um modelo matemático do tubo ou usando-se uma tabela de consulta. O volume de fluido dispensado pode influenciar a concentração dos reagentes de teste dentro dos reservatórios de teste de diagnóstico uma vez que eles dissolveram dentro do fluido dispensado. Medindo-se o volume do fluido de amostra dispensado, a concentração de reagentes dentro de cada tube de teste é calculada. Este impacto de resultado de teste pode ser determinado a partir de uma série de experimentos previamente conduzidos ou a partir de um modelo das reações de teste, o efeito da concentração de reagente de teste sobre o resultado do teste e a interpretação das medições de série de tempo do teste para interpretar o resultado podem ser ajustados ou compensados dentro do software do aparelho.
[00109] Opcionalmente, detalhes das etapas de progresso do teste de diagnóstico confirmadas pelos sensores do aparelho incluindo o sensor de imagem e análise de imagem são incluídos dentro dos registros eletrônicos associados ou do registro impresso para o teste prover esta informação para o revisor do resultado de teste subsequente e melhorar a confiança e evidência da operação correta do teste.
[00110] Opcionalmente, o cartucho incorpora os reagentes químicos e biológicos requeridos para a preparação de amostra e amplificação de ácido nucléico, ligação de sequência genética e saída óptica usando métodos isotérmicos de amplificação de ácido nucléico.
[00111] Opcionalmente, o cartucho incorpora os reagentes químicos e biológicos requeridos para a preparação da amostra e amplificação de ácido nucléico e detecção de sequência genética usando a reação em cadeia da polimerase, PCR, métodos de amplificação de ácido nucléico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
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[00112] Algumas modalidades da presente invenção são descritas a seguir, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos, nos quais: a Figura 1 é uma ilustração de uma montagem de teste de diagnóstico ou cartucho de acordo com uma modalidade da presente invenção, com tampa de envio ajustada; a Figura 2 é uma vista lateral transversal do cartucho da Figura 1; a Figura 3 mostra o cartucho com a tampa de envio removido e um cotonete sendo inserido dentro do volume aberto de um reservatório de preparação de amostra do cartucho para depositar material de amostra neste; a Figura 4 mostra uma montagem de tampa de dispensa incluindo uma tampa e um mecanismo de dispensa junto para ser inserido dentro do reservatório de preparação de amostra; a Figura 5 é uma vista lateral transversal da montagem de tampa durante a inserção dentro do reservatório de preparação de amostra; a Figura 6 é uma vista lateral transversal mostrando um inserto de dispensa do mecanismo de dispensa depois de entrar em contanto com uma base interna do reservatório de preparação de amostra para formar um selo com a mesma conforme um usuário aplica uma ação de rosquear à tampa; a Figura 7 mostra uma forma alternativa de dispensar a montagem de tampa em que um mecanismo de dispensa inclui um espaçador colapsável para prover sequenciamento de força e garantir que o inserto de dispensa forme um selo com a base interna do reservatório de preparação de amostra; a Figura 8 é uma vista explodida da montagem da tampa de dispensa da Figura 7; a Figura 9 é uma vista lateral transversal mostrando uma vareta de dispensa do mecanismo de dispensa depois que a tampa de rosca foi
31 / 77 totalmente ajustada pelo usuário, causando perfuração de selos entre o reservatório de preparação de amostra e um reservatório de teste de diagnóstico do cartucho e a dispensa de fluido de amostra do reservatório de preparação de amostra dentro do reservatório de teste de diagnóstico; a Figura 10 é uma vista externa do cartucho depois de totalmente ajustar a montagem de tampa como para a Figura 9; a Figura 11 mostra um sistema de teste de diagnóstico com o cartucho no lugar, alinhado e sustentado em um instrumento de teste de diagnóstico; a Figura 12 é uma vista explodida do instrumento da Figura 11, mostrando componentes do instrumento, incluindo um alojamento, módulo de exibição eletrônico, núcleo de interface de cartucho com módulos aquecedores superior e inferior e sensores de detecção e uma montagem base com controlador eletrônico integrado; a Figura 13 mostra o núcleo de interface de cartucho do instrumento com módulos aquecedores superior e inferior e sensores de detecção montados sobre placas de circuito interno boards e placas estruturais; a Figura 14 mostra um único cartucho de reservatório de teste dentro dos blocos aquecedores superior e inferior do instrumento, com outros componentes do instrumento não mostrado; a Figura 15 é uma vista transversal dos componentes mostrados na Figura 14; as Figuras 16 e 17 mostram o cartucho de reservatório de teste único e a relação do reservatório de teste de diagnóstico com os sensores óticos montados dentro do instrumento, com muitos outros componentes do instrumento não mostrado; os cones de óptica focal que representam o campo de excitação coaxial e a coleta de luz para e das lentes de saída do sensor para o exemplo de detecção de fluorescência são incluídos para ilustrar a aquisição
32 / 77 de medições ópticas do reservatório de teste; a Figura 18 mostra uma modalidade de um cartucho tendo dois reservatórios de teste de diagnóstico; a Figura 19 é uma vista lateral transversal do cartucho de reservatório de teste duplo da Figura 18; a Figura 20 mostra o cartucho das Figuras 18 e 19 com a sua tampa de envio removida e um cotonete sendo inserido dentro do volume aberto de um reservatório de preparação de amostra do cartucho de reservatório de teste duplo para depositar material de amostra neste; a Figura 21 mostra uma montagem de tampa incluindo uma tampa e uma modalidade de um mecanismo de dispensa de reservatório de teste duplo junto para ser inserido dentro do reservatório de preparação de amostra do cartucho de reservatório de teste duplo; a Figura 22 mostra o mecanismo de dispensa de reservatório de teste duplo com seu inserto de dispensa separado do seu bastão de dispensa; as Figuras 23 a 25 são vistas laterais transversais do cartucho de reservatório de teste duplo com seu mecanismo de dispensa respectivamente: (i) parcialmente inserido, (ii) adicionalmente inserido de modo que o seu inserto de dispensa tenha assentado contra a base do cartucho mas antes da perfuração e dispensa e (iii) totalmente inserido de modo que as ações de perfuração e dispensa tenham sido completadas; a Figura 26 é uma vista externa do cartucho de reservatório de teste duplo depois de totalmente engatando a sua montagem de tampa como para a Figura 25; a Figura 27 é um desenho de uma modalidade do instrumento configurado para operação com o cartucho de reservatório de teste duplo e com o cartucho de reservatório de teste duplo no lugar neste; a Figura 28 é um desenho do núcleo interno do instrumento da
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Figura 27; as Figuras 29 e 30 mostram o cartucho de reservatório de teste duplo e a relação dos seus reservatórios de teste de diagnóstico com os sensores óticos montados dentro do instrumento do reservatório de teste duplo, com muitos outros componentes do instrumento não mostrado; os cones de óptica focal que representam o campo de excitação coaxial e coleta de luz para e a partir das lentes de saída dos sensores para o exemplo de detecção de fluorescência são incluídos para ilustrar a aquisição de medições ópticas dos reservatórios de teste; para permitir as leituras dos dois reservatórios de teste, os sensores são montados sobre uma placa móvel, onde os mancais lineares e o motor de passo que controla o movimento de digitalização dos sensores são mostrados na vista final na Figura 29; os sensores são montados sobre a placa que é por si só montada sobre mancais lineares e fixada a um parafuso de avanço acionado por motor, permitindo que o instrumento adquire medições ópticas de cada sensor para cada um dos dois reservatórios de teste de diagnóstico no cartucho; as Figuras 31 e 32 são desenhos mostrando as vistas externa e transversal, respectivamente, dos dois blocos aquecedores que circundam o reservatório de cartucho de teste de diagnóstico duplo depois que o mesmo foi inserido dentro do reservatório de instrumento de teste de diagnóstico duplo; um bloco aquecedor superior provê controle de temperatura do reservatório de preparação de amostra do cartucho, enquanto um bloco inferior provê controle de temperatura dos dois reservatórios de teste; o bloco inferior incorpora uma porta óptica para permitir que a aquisição de medições ópticas dos conteúdos dos reservatórios de teste enquanto eles estão sob controle de temperatura ou ciclagem de temperatura; o bloco aquecedor inferior incorpora uma porta óptica para permitir que a detecção da excitação óptica e fluorescência dos conteúdos dos reservatórios de teste fosse realizada através da porta enquanto os conteúdos dos reservatórios de teste são mantidos em
34 / 77 uma temperatura ou perfil de temperatura controlados; a Figura 33 é um diagrama de bloco de um sistema de controle do instrumento; a Figura 34 é um diagrama de fluxo de um fluxo de trabalho do instrumento; a Figura 35 é um gráfico de uma curva de amplificação típica capturada como uma sequência de medições em tempo real durante a amplificação pela PCT dentro de um reservatório de teste; a Figura 36 é um desenho que ilustra fluxo de fluido direto e em torno do inserto dispensador das Figuras 4 a 9, induzindo a mistura conforme o mecanismo de dispensa é pressionado dentro do cartucho; a Figura 37 é um desenho do inserto de dispensa na isolação; a Figura 38 é uma vista lateral transversal que ilustra uma modalidade alternativa de um inserto de dispensa em que a base do furo do inserto é vedado e a amostra e o fluido de reagente da amostra podem fluir apenas através de uma região de desvio externo do inserto conforme o mesmo é pressionado dentro do cartucho e depois flui de volta para dentro do topo do furo de inserto; a região de desvio pode incluir um filtro ou um material poroso ou enchedores para remover ou aprisionar quaisquer partículas dentro do fluido de amostra e impedir estes de entrar no(s) reservatórios(s) de teste; e a Figura 39 é uma vista lateral transversal que ilustra uma modalidade alternativa adicional de um inserto de dispensa em que o fluido de amostra pode apenas fluir através de um furo interno do inserto conforme a montagem é pressionada dentro do cartucho; o fluido de amostra não pode desviar o cilindro de inserto visto que esta região está bloqueada e o inserto inclui um imã em torno do furo para coletar e concentrar DNA e RNA capturados na superfície de pérolas magnéticas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00113] As modalidades da presente invenção incluem um sistema de
35 / 77 teste de diagnóstico, incluindo um aparelho de teste de diagnóstico (aludido como ‘instrumento’) e uma montagem de teste de diagnóstico (também aqui aludida por conveniência de referência como um ‘cartucho’) para o uso com o instrumento de teste de diagnóstico para realizar um teste de diagnóstico em uma amostra biológica ou ambiental. Como aqui descrito, o cartucho e instrumento são fáceis para um usuário operar sem requerer as facilidades de um laboratório de teste geral.
[00114] Nas modalidades descritas, a montagem de teste de diagnóstico é provida na forma de um cartucho de teste de diagnóstico descartável que é produzido antes de um teste de diagnóstico e já incorpora todos os componentes químicos precursores (isto é, reagentes) para rodar um conjunto específico de um ou mais testes de diagnóstico. A montagem/cartucho de teste de diagnóstico é configurada(o) de modo que a(o) mesma(o) possa ser manuseado com segurança sem contaminação do ambiente ou causar contaminação do usuário ou do ambiente com os materiais de teste ou causar interferência com estes componentes químicos ou de outro modo afetando as operações subsequentes do cartucho, que requerem interações com o instrumento de teste de diagnóstico.
[00115] Detalhes do cartucho e do instrumento de teste de diagnóstico de acordo com algumas modalidades da presente invenção são descritos abaixo. Pré-carregando-se a preparação de amostra específica, os reagentes de amplificação e marcador dentro do cartucho, o sistema de teste de diagnóstico pode ser configurado para rodar um conjunto predeterminado específico de um ou mais testes de diagnóstico e provê pelo menos uma indicação do(s) resultado(s) de teste para um usuário. Versões diferentes do cartucho com a mesma configuração física, mas reagentes de carga diferentes podem ser produzidas para abranger uma ampla faixa de tipos de teste e aplicações de diagnóstico. Em algumas modalidades, o instrumento pode automaticamente determinar o tipo de teste de diagnóstico a ser realizado a partir de um
36 / 77 identificador do cartucho (visual ou de outro modo), realizar o(s) teste(s) de diagnóstico determinado(s) e, na conclusão do(s) teste(s) de diagnóstico, prover o(s) resultado(s) de teste de diagnóstico para o usuário exibindo o mesmo/os mesmos na interface do usuário exibindo e/ou provendo o mesmo/os mesmos na forma de um ou mais registros eletrônicos ou outra forma de dados eletrônicos por intermédio de qualquer uma de várias interfaces de comunicação do instrumento.
[00116] Para ajudar com a remoção do fechamento, aquecimento, adição de amostra, preparação de amostra, dispensa de amostra, fechamento de cartucho e medição de resultado de teste, o cartucho é sustentado pelo, alinhado com, aquecido pelo e medido pelo aparelho/instrumento de teste de diagnóstico. Em algumas modalidades, o instrumento inclui regiões aquecedoras separadas para controle de temperatura independente dos reservatórios de preparação de amostra e de teste de diagnóstico dentro do cartucho. Em uma sequência de teste típica, o cartucho com fluido de preparação de amostra contido é inserido dentro do instrumento e o instrumento detecta a presença do cartucho e começa a aquecer o fluido de preparação de amostra. Quando o fluido de preparação de amostra atingiu a temperatura desejada, o instrumento então lembra o usuário para adicionar a amostra biológica ou ambiental a ser analisada. O aquecimento do fluido de preparação de amostra pode ser útil para ajudar com preparação de amostra rápida e eficiente, mas não seria necessário para alguns tipos de amostra.
[00117] Um usuário do sistema de teste de diagnóstico que desejar conduzir um teste de diagnóstico em uma amostra biológica ou ambiental introduz a amostra dentro do cartucho. Com seu fechamento removido, nesta etapa o cartucho provê um volume aberto que é livre de obstruções, pelo qual é intencionado que um cotonete carreando a amostra biológica ou ambiental possa ser facilmente usado para agitar o fluido de preparação de amostra no reservatório de preparação de amostra e lavar a amostra biológica ou
37 / 77 ambiental do cotonete dentro do fluido de preparação de amostra sem encontrar obstruções que impediriam esta etapa. Entretanto, embora isto caracterize o volume aberto dentro do cartucho, estará evidente para aqueles versados na técnica que não sew faz necessário que um cotonete seja usado de forma alguma, e amostras em qualquer forma adequada podem ser adicionadas ao fluido de preparação de amostra por qualquer meio adequado.
[00118] No caso de amostras biológicas, a etapa de adicionar a amostra ao fluido de preparação de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra inicia um processo biológico e químico específico de diluição de amostra e lise de célula para preparar o material de amostra, incluindo o seu ácido nucléico incluído de RNA ou DNA, para teste. Entretanto, o sistema não é limitado aos testes biológicos e pode, por exemplo, ser usado para detectar a presença ou medir as quantidades de elementos traços em qualquer tipo de amostra. Outros tipos adequados de testes de diagnóstico estarão evidentes para aqueles versados na técnica tendo em conta esta descrição.
[00119] Subsequentemente ou quando alertado pelo instrumento, o usuário então aplica um fechamento ao reservatório de preparação de amostra e a ação de operar o fechamento não apenas veda a amostra e fluido de preparação de amostra dentro do cartucho, mas também atua um mecanismo de dispensa dentro do reservatório de preparação de amostra para liberar uma subamostra de volume predeterminado dentro de um ou mais reservatórios de teste de diagnóstico dentro do cartucho.
[00120] O instrumento depois controla a temperatura do um ou mais reservatórios de teste de diagnóstico e o fluido de amostra e reagentes contidos dentro dele(s). Este controle de temperatura pode ser para manter uma temperatura fixa ou para seguir um perfil predeterminado de temperatura variando com o tempo, por exemplo ou no caso de uma reação de PCR, submetida à ciclagem térmica com aquecimento e resfriamento entre temperaturas fixas diferentes. Em qualquer caso, uma série de ciclos ou uma
38 / 77 série de tempos de medições ópticas dos conteúdos dos tubos de teste é adquirida pelo instrumento. O instrumento pode processar estas medições para determinar um resultado de teste que pode depois ser exibido ou de outro modo provido como uma saída para um usuário.
[00121] O cartucho protege os reagentes no transporte e armazenagem antes da execução de um teste e sustenta o processo de teste enquanto o teste de diagnóstico está em andamento. Os reagentes de teste, produtos de amplificação genética e contaminantes são retidos dentro do cartucho o tempo todo, incluindo na conclusão do teste. O cartucho vedado pode ser removido para descarte na conclusão de um teste e o instrumento é protegido de fluidos e contaminação o tempo todo.
[00122] Depois que a amostra biológica é adicionada e depois vedada dentro do cartucho, o usuário está protegido dos riscos biológicos ou químicos da amostra durante o processo de teste subsequente e depois o cartucho é removido para descarte.
[00123] Como mostrado nas Figuras 1 e 2, uma montagem ou ‘cartucho’ de teste de diagnóstico inclui um reservatório ou câmara de amostra 1, pelo menos um reservatório ou câmara de teste (também aqui aludido como o reservatório ou câmara de amplificação) 3 e pelo menos um selo entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para impedir movimento de fluido entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico. Nas modalidades descritas, o reservatório ou câmara de amostra 1 está na forma de um corpo de cartucho cilíndrico 1 e o reservatório ou câmara de amplificação 3 está na forma de um tubo de amplificação acoplado ao corpo do cartucho por um anel ou grampo de segurança 4 e um selo elastomérico 5. O componente elastomérico 5 provê um selo entre o tubo de amplificação 3 e o corpo moldado do cartucho 1 tal que os conteúdos do tubo de amplificação 3 não serão influenciados pela contaminação ambiental
39 / 77 antes do uso e não pode escapar durante e depois do uso. Outros arranjos e configurações de acoplamento e vedação estarão evidentes para aqueles versados na técnica tendo em conta esta descrição e podem ser usados em outras modalidades.
[00124] O cartucho é mostrado nas Figuras 1 e 2 na sua configuração de envio antes do uso, em que o reservatório ou câmara de amostra 1 é vedado com uma tampa de transporte 2 e é parcialmente cheio com um fluido ou reagente de preparação de amostra 11 e o tubo de amplificação 3 é parcialmente cheio com reagentes de amplificação de ácido nucléico e sonda de detecção associada 12. Estes reagentes 11, 12 podem estar na forma líquida, gel, seca ou liofilizada.
[00125] Tipicamente, o reagente de amostra 11 estará em uma forma líquida e proverá a solução aquosa para diluir e expor o DNA ou RNA da amostra de teste dentro da solução e prover o fluido para dissolver ou recolocar em suspensão os reagentes liofilizados ou secos uma vez que um pouco do fluido de reagente de amostra 11 é adicionado ao tubo de amplificação 3. Os reagentes de amplificação podem ser secos ou liofilizados ou em uma forma de gel ou líquida que melhor atenda à preparação, carga, armazenagem e transporte.
[00126] O fluido de preparação de amostra 11 e os reagentes de amplificação e detecção 12 são carregados e vedados dentro do cartucho no momento de fabricação antes do uso.
[00127] Na configuração de envio antes do uso, como mostrado nas Figuras 1 e 2, a tampa 2 tem um comprimento mais curto tal que a sua borda inferior 8 não entre em contato com as câmaras de travamento moldadas 9 no corpo do cartucho. Esta configuração da tampa de envio 2 permite que a mesma sele os reagentes líquidos de preparação de amostra 11 dentro do corpo do cartucho 1, mas para a tampa 2 seja removível pelo usuário para iniciar um teste.
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[00128] O corpo do cartucho 1 tem recursos de alinhamento 10 que se alinham e engatem com fendas de acasalamento no instrumento para impedir a rotação do cartucho quando o mesmo está no lugar no instrumento. Este recurso anti-rotação permite que o usuário remova facilmente a tampa de envio e posteriormente ajuste uma tampa de teste, tudo em uma única operação manual.
[00129] O corpo do cartucho 1 contém o fluido de preparação de amostra 11 visto que o mesmo inclui um selo na sua base no local 7, tal que com a tampa 2 ajustada, a mesma forma um recipiente ou reservatório vedado sem nenhuma comunicação fluida com o reservatório ou tubo de teste 3.
[00130] Como mostrado na Figura 2, na modalidade descrita o tubo de amplificação 3 é ajustado dentro de um recesso moldado sobre a base do corpo do cartucho 1 e é vedado com um selo elastomérico 5 e retido pelo anel de retenção 4 que é fixado no lugar pelos recursos de trava, ajuste por atrito ou pelo uso de adesivo ou solda plástica. Em algumas modalidades, o tubo de amplificação 3 também incorpora um selo de membrana adicional sobre o seu topo, tal como uma membrana plástica soldada ou membrana de folha metálica vedada por calor. Este selo adicional no topo do tubo de amplificação 3 é usado para reter os reagentes de amplificação 12 antes da montagem no cartucho e facilita o carregamento e vedação do tubo de amplificação em uma operação de fabricação separada e subsequente montagem no corpo do cartucho 1. Este selo também provê proteção adicional dos conteúdos do tubo de amplificação contra a difusão de umidade através da parede da câmara de reagente de amostra superior do cartucho.
[00131] Em algumas modalidades, o tubo de amplificação 3 é suprido em embalagem separada e é apenas preso com grampo ou rosqueado no lugar no corpo do cartucho 1 exatamente antes de iniciar o teste.
[00132] Para rodar um teste, o cartucho é inserido dentro do instrumento tal que o corpo do cartucho 1 seja sustentado e os recursos anti-
41 / 77 rotação 10 são engatados com o instrumento.
[00133] A Figura 11 mostra o cartucho no lugar dentro do corpo do instrumento 30 e travado no lugar por uma cobertura deslizante acionado por mola 36 que desliza sobre e em torno de um colar de retenção 13 do cartucho.
[00134] Nesta configuração, a tampa de envio 2 é exposta e disponível ao usuário e é removida para iniciar o teste.
[00135] O cartucho é retido e aquecido dentro do instrumento durante as seguintes funções de teste, mas apenas o cartucho é mostrado na Figuras 3 até a 9 para ajudar na ilustração e explicação das funções do cartucho.
[00136] A Figura 3 mostra o cartucho com a tampa de envio 2 removida antes do começo de um teste. O usuário é alertado pelas funções de software e a exibição para o usuário no instrumento para remover a tampa 2 e adicionar a amostra a ser testada. Este alerta pode seguir um estágio de aquecimento da câmara de amostra 1 para elevar a temperatura do fluido de preparação de amostra 11 antes da adição da amostra.
[00137] A amostra pode ser uma de muitos tipos e pode ser incluída dentro do fluido de preparação de amostra 11, por quaisquer métodos adequados, incluindo mas não limitados à adição com pipeta ou adição de gotícula de uma amostra de fluido, adição de uma pequena amostra de tecido ou uma amostra de fluido corporal ou ambiental, veterinária, alimentar ou agrícola. Visto que o teste usa a amplificação de ácido nucléico, o mesmo pode ser muito sensível e apenas uma quantidade pequena de material de amostra é requerida para ser eficaz no teste.
[00138] A Figura 3 mostra um cotonete de coleta de amostra 15 sendo introduzido no cartucho aberto. No caso de um cotonete de coleta de amostra 15 sendo usado, o mesmo é introduzido dentro da câmara de amostra 1 por um usuário e lavado no fluido de preparação de amostra 11. O fluido de preparação de amostra 11 é configurado para lavar o material de amostra do cotonete 15 e pode conter sais, fluido de diluição ou detergentes que separam
42 / 77 as células e causam a lise de paredes celulares para expor componentes de ácido nucléico do material de amostra, incluindo material alvo de DNA ou RNA, dentro da solução da câmara de amostra de modo que o mesmo será adequado para a amplificação de ácido nucléico subsequente.
[00139] Outros métodos de coleta de amostra ou tipos de amostra podem ser aplicados ao cartucho de teste como alternativas para um cotonete
15. Estes métodos de coleta de amostra e adição de amostra podem incluir, mas não são limitados a: (i) uso de pipeta e adição de um fluido de amostra; (ii) uso de uma gotícula de sangue integral diretamente de uma picada no dedo; e (iii) uso de uma almofada ou membrana absorventes para coletar uma amostra fluida tal como sangue integral e adicioná-la ao líquido de lavagem de condicionamento de amostra 11.
[00140] Seguinte à adição da amostra, o visor do instrumento, sob o controle do software do instrumento, alerta o usuário para esperar durante um período de tempo para permitir que a preparação da amostra e o processo de lise de célula tenham tempo suficiente para serem eficazes.
[00141] Uma vez que o período de tempo de preparação de amostra tenha sido concluído, o usuário é alertado para inserir a montagem de tampa de dispensa. Esta montagem de tampa de dispensa é mostrada na Figura 4 como consistindo de uma tampa 20 fixada a um mecanismo de dispensa de amostra, o último incluindo uma vareta de dispensa 21 e um inserto de dispensa 22.
[00142] Na modalidade descrita, a montagem de tampa de dispensa é suprida totalmente montada em uma embalagem protetiva e é removida e inserida pelo usuário, mas este não precisa ser o caso em outras modalidades. Por exemplo, em algumas modalidades o mecanismo de dispensa de amostra pode ser fixado à tampa de transporte 2 removida pelo usuário de modo a
43 / 77 formar a montagem de tampa e em algumas outras modalidades o mecanismo de dispensa pode ser disposto dentro do reservatório de preparação de amostra e uma tampa (a tampa de transporte 2 removida ou uma tampa diferente) acoplada ao mecanismo de dispensa pela ação de aplicar a tampa ao reservatório de preparação de amostra 1.
[00143] Em qualquer caso, o mecanismo de dispensa de amostra é operável para quebrar ou de outro modo romper ou abrir o pelo menos um selo para permitir que fluido de amostra entre no pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico 3 a partir do reservatório de preparação de amostra 1 e para dispensar um sub volume predeterminado do fluido de amostra a partir do reservatório de preparação de amostra para dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico 3 para o teste de diagnóstico e detecção neste enquanto impede movimento de fluido adicional entre o reservatório de preparação de amostra 1 e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico 3.
[00144] Na modalidade descrita, como mostrado na Figura 4, o inserto de dispensa 22 é montado a uma extremidade da vareta de dispensa 21. A vareta de dispensa 21 incorpora uma flange 42 que constitui um êmbolo ou pistão uma vez que a mesma seja inserida dentro de um furo cilíndrico ou ‘cilindro’ do inserto de dispensa 22. Em algumas modalidades, o pistão forma um selo deslizante pelo ajuste estreito com o furo cilíndrico, mas em outras modalidades incorpora um selo elastomérico para melhorar a vedação. Na modalidade mostrada na Figura 5, um anel “O” 24 é usado para melhorar a vedação para o pistão conforme ele desliza dentro do furo cilíndrico do inserto de dispensa 22.
[00145] Como mostrado na Figura 4, o inserto de dispensa 22 incorpora aberturas na forma de fendas 23 na sua seção superior. Estas fendas 23 são dispostas tais que, na configuração inicial do pistão da vareta de dispensa conforme a montagem é inserida dentro do cartucho, o anel o interno
44 / 77 é posicionado acima da base das fendas 23 e as fendas 23 se estendem para fora do diâmetro externo do inserto 22 tal que o fluido possa fluir tanto passando pelo lado de fora do furo cilíndrico do inserto 22 quanto também através do seu furo cilíndrico conforme o inserto 22 é prensado ainda mais dentro do reservatório de preparação de amostra. Esta configuração impede a formação de pressão e ajuda a mistura do fluido de amostra durante a inserção. Outras formas adequadas das aberturas e configurações estarão evidentes para aqueles versados na técnica, tais como furos ou ranhuras, por exemplo, para alcançar esta função, onde o inserto 22 não forma um selo com a parede interna do reservatório de preparação de amostra e assim pode ser facilmente movido através do fluido de amostra retido dentro do reservatório de preparação de amostra 1. O diâmetro externo e a forma do inserto de dispensa 22 permitem que o mesmo seja posicionado e alinhado centralmente dentro do reservatório de preparação de amostra 1 conforme é pressionado, também para se mover facilmente para baixo dentro do reservatório de preparação de amostra conforme o mesmo é inserido (isto é, sem resistência significante do fluido de amostra). Isto permite que a base do inserto de dispensa 22 seja acuradamente alinhada com um recesso de acoplamento 54 na base do reservatório de preparação de amostra 1.
[00146] A Figura 5 mostra o mecanismo de dispensa inserido a meio caminho dentro do reservatório de preparação de amostra 1. A vareta de dispensa 21 inclui um flange de pistão 42 com um anel “O” vedando 24 e também uma ponta de perfuração de selo 26 na extremidade da vareta de dispensa 21.
[00147] Uma vez que a montagem de dispensa esteja suficientemente inserida, as roscas internas 28 na tampa 20 engrenam com a rosca externa 29 no corpo do cartucho.
[00148] Uma vez que estas roscas 28, 29 estejam mutuamente engrenadas, o usuário é alertado para e pode progressivamente rosquear a
45 / 77 tampa 20 fechada. A ação de rosquear a tampa 20 fechada provê uma vantagem mecânica que facilita o deslocamento da montagem de dispensa através do reservatório de preparação de amostra 1 para engatar os componentes internos, perfurar os selos na base do reservatório de preparação de amostra 1 e dispensar um volume de sub amostra de fluido de amostra do reservatório de preparação de amostra 1 dentro do reservatório de teste de diagnóstico 3.
[00149] A Figura 6 mostra o inserto de dispensa 22 depois o mesmo fez contato com a base do corpo do cartucho 1. Nesta posição, o inserto de dispensa 22 é retido na vareta de dispensa 21 em um tal modo que alguma força adicional é requerida antes que a vareta de dispensa 21 possa se mover ainda mais para dentro do furo do inserto de dispensa 22. Esta força adicional permite que a base do inserto de dispensa 22 seja pressionado sob atrito ou fechado no lugar em um recurso de acoplamento ou superfície no recesso 52 na base do reservatório de preparação de amostra 1, formando um selo de fluido com ele. Em algumas modalidades, um selo elastomérico pequeno é incluído no inserto de dispensa ou no tubo de amostra para ajudar na formação deste selo. Entretanto, na modalidade mais simples, a forma moldada por injeção da base do inserto de dispensa 22 e o recurso de acoplamento no reservatório de preparação de amostra são suficientes para formar um selo de fluido sob a força de compressão aplicada conforme estas partes entram em contato mútuo. A Figura 6 mostra um detentor formado por uma ranhura circular 25 na vareta de dispensa 21 e um anel anular correspondente no inserto de dispensa 22. Este detentor provê a força de ruptura inicial para travar e vedar o inserto de dispensa no lugar na base do reservatório de preparação de amostra antes da conclusão da operação de dispensa uma vez que a resistência do detentor é superada e a vareta de dispensa 21 começa a deslocar através do inserto de dispensa 22 sob a ação rotacional continuada da tampa de rosca 20. Outros arranjos para prover a
46 / 77 força de vedação do inserto de dispensa estão disponíveis e estarão evidentes para aqueles versados na técnica tendo em conta esta descrição.
[00150] A Figura 7 mostra uma construção alternativa da tampa dispensadora e o mecanismo de dispensa. Nesta modalidade, o inserto 22 é ajustado na vareta de dispensa 21 com um componente espaçador colapsável ou triturável 91 preso entre o inserto de dispensa e um recurso de acoplamento 92 estendendo-se a partir da vareta de dispensa. A Figura 8 mostra esta mesma montagem de tampa de dispensa em uma vista de peças explodidas.
[00151] Conforme a montagem de tampa de dispensa é pressionada dentro do cartucho pela ação de rosquear a tampa, o inserto de dispensa faz contato com a câmara de amostra na base do cartucho. O espaçador colapsável 91 permite que a ação de rosquear aplique uma força de acoplamento na ação de vedação em que a base do furo cilíndrico do inserto de dispensa é pressionado para dentro do recurso de acoplamento na base do cartucho.
[00152] Conforme a ação de rosquear a tampa aplica força adicional e deslocamento, o espaçador 91 é configurado para colapsar em uma maneira controlada para pressionar o inserto de dispensa no lugar e depois permitir que o êmbolo com anel “O” na vareta de dispensa 21 para entrar na seção de furo tubular do mecanismo de dispensa.
[00153] Nos arranjos acima, depois que o inserto de dispensa é mantido ou travado no lugar, o êmbolo do anel “O” na vareta de dispensa 21 é causado entrar na seção tubular do mecanismo de dispensa e formar um pistão e cilindro ou seringa.
[00154] Conforme o êmbolo com anel “O” aprisiona um volume de fluido dentro do tubo de dispensa, a ponta de perfuração 26 da vareta de dispensa 21 perfura a seção plástica no cartucho na base do tubo no inserto de dispensa 22. Esta ação de perfuração perfura um furo através da seção plástica
47 / 77 e também através da membrana de folha metálica ou plástica no topo do tubo de amplificação 3. O deslocamento continuado do êmbolo depois dispensa o volume de fluido aprisionado dentro do tubo de amplificação 3.
[00155] O fluido aprisionado nesta seção cilíndrica é um volume fixo e predeterminado do fluido de amostra que é dispensado através da perfuração na base da câmara de amostra dentro do tubo de amplificação 3 montado abaixo.
[00156] A ação de dispensa força o volume fixo de fluido de amostra para dentro do tubo de amplificação e os conteúdos do tubo são pressurizados pela adição do fluido dispensado. Esta pressurização modesta do tubo de amplificação 3 é adequada para a maioria das aplicações de teste e não interfere com os produtos químicos típicos, testes de imunoensaio ou com a PCR ou amplificação isotérmica. Entretanto, como uma alternativa para a pressurização do tubo de amplificação 3, em algumas modalidades a vareta de dispensa 21 mostrada na Figura 6 é oca e inclui uma abertura 27 (não mostrada) da ponta de perfuração 26 para um canal interno 22 dentro da vareta de dispensa 21. O canal interno 22 da vareta de dispensa 21 está em comunicação com o ar no topo do fluido da câmara de amostra 1. Esta abertura equaliza a pressão entre o volume de ar no topo do tubo de amplificação 3 com a pressão de ar acima do fluido de amostra no reservatório de preparação de amostra 1. Este arranjo de abertura é vantajoso em algumas aplicações porque o mesmo reduz o risco de que os amplicons do tubo possam vazar para dentro do ambiente ajudado pela pressão interna. Modalidade de Cartucho de Tubo Múltiplo
[00157] Os testes de amplificação dentro de um único tubo de amplificação 3 podem ser multiplexados em que mais do que uma sequência alvo de DNA ou RNA e um canal de controle pode ser detectado dentro de um único tubo de amplificação 3. Onde o sistema usa fluorescência como o método de detecção, os diferentes alvos podem ser detectados com sondas que
48 / 77 emitem nos comprimentos de onda de florescência diferentes, aludidos na técnica como canais de detecção. No instrumento aqui descrito, dois canais de detecção são incluídos. Usando o cartucho de tubo único descrito acima e um instrumento de detecção de dois canais aqui descritos, o sistema pode prover a detecção de dois alvos de DNA ou RNA diferentes. Se alvos adicionais são requeridos ser multiplexados para dentro do teste de diagnóstico único da mesma amostra, tubos de amplificação adicionais podem ser providos em outras modalidades. Deste modo, alvos e canais de controle adicionais podem ser incluídos enquanto usando o mesmo número de sensores detecção no instrumento. Por exemplo, no caso de uma modalidade com dois canais de sensor do instrumento e dois tubos de amplificação, o sistema é capaz de 4 canais independentes de detecção de DNA ou RNA de uma única amostra que é preparada e dispensada do corpo do cartucho para dentro dos dois tubos de amplificação.
[00158] A Figura 18 mostra uma montagem de cartucho de dois tubos de acordo com uma modalidade da presente invenção. Os tubos de amplificação podem ser tubos separados conectados ao corpo do cartucho; entretanto, no exemplo mostrado na Figura 18, um componente de tubo plástico moldado 103 incorpora duas cavidades internas que são equivalentes a dois tubos de amplificação independentes conectados ao corpo do cartucho
101.
[00159] A Figura 18 mostra o cartucho na sua configuração de envio antes do início do teste, onde a tampa de envio 102 não entra em contato com os recursos de trava moldados 109 e a tampa 102 pode ser removida pelo usuário no começo de um teste.
[00160] A Figura 19 mostra o mesmo cartucho na seção transversal, onde o componente de tubo 103 incorpora dois tubos de amplificação interna 107 e 108. Estes tubos carregam os reagentes precursores requeridos para a amplificação de DNA ou RNA e sondas de detecção, tipicamente na forma
49 / 77 seca ou liofilizada. Os reagentes incorporados dentro de cada tubo 107, 108 podem ser diferentes para conduzir testes diferentes da mesma amostra ou podem ser reagentes idênticos para prover uma confirmação de teste de adição duplicado. O componente de tubo 103 é preso no lugar dentro de um recurso de recesso de acoplamento 104 na base do corpo do cartucho 101. Um selo elastomérico 105 é aprisionado entre a base do corpo do cartucho moldado e a montagem de tubo e forma um selo para impedir vazamento entre os tubos de amplificação 107, 108 e o ambiente.
[00161] O corpo do cartucho contém um reagente de preparação de amostra 111, tipicamente em uma forma líquida e tipicamente adicionado durante a fabricação. É uma opção suprir o reagente de amostra 111 em recipientes separados de uma ou mais partes e adicionar estes ao cartucho antes do teste quando a tampa é removida. O cartucho opera em uma maneira similar àquela descrita acima para a modalidade de tubo de amplificação único, onde o líquido de preparação de amostra 111 forma uma solução aquosa para expor e carrear o DNA ou RNA da amostra uma vez que a mesma é adicionada e recolocar em suspensão ou dissolver os reagentes de amplificação nos tubos 107, 108 na base do cartucho uma vez que um sub volume do fluido de diluição de amostra é adicionado pela ação de dispensa para dentro dos tubos de dose 107, 108.
[00162] Para conduzir um teste, o cartucho é inserido dentro da porta do instrumento para sustentar e iniciar o aquecimento dos fluidos de reagente de amostra 111. Este aquecimento pode ajudar, acelerar ou permitir o processo de preparação de amostra, incluindo a lise de célula. O cartucho é sustentado e operado dentro do instrumento, mas para os propósitos de ilustração, os componentes de instrumento não são mostrados nos desenhos do cartucho mostrado nas Figuras 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26.
[00163] A Figura 27 mostra o cartucho totalmente inserido dentro do instrumento com a tampa de dispensa 120 disponível para o usuário operar o
50 / 77 cartucho pela remoção da tampa de envio, adição da amostra, aplicação e fechamento rosqueado da tampa de dispensa 120.
[00164] A Figura 20 mostra o cartucho de dois tubos no início do teste com a tampa removida e com um cotonete 115, sendo usado para adicionar material de amostra pela lavagem do cotonete 115, no fluido de reagente de amostra 111 contido dentro do corpo do cartucho 101.
[00165] A Figura 21 mostra a tampa 120 e o mecanismo de dispensa na posição a ser inserida pelo usuário dentro do corpo do cartucho 101. A montagem nesta vista é composta dos seguintes componentes visíveis: a tampa de dispensa 120, a vareta de dispensa 121 e o inserto de dispensa 122.
[00166] A Figura 22 mostra a montagem de dispensa em uma vista desmontada. Na sua seção de topo, o cartucho de dois tubos é circular na seção transversal para permitir que a tampa de rosca se ajuste; entretanto na sua seção inferior, o cartucho tem lados achatados. O inserto de dispensa 122 é um ajuste folgado na seção transversal circular superior do cartucho, mas é um ajuste deslizante apertado na porção de seção transversal achatada do cartucho. Este ajuste deslizante apertado é usado para guiar o inserto de dispensa 122 no lugar tal que o mesmo se alinhe com o recurso de acoplamento na base do cartucho e os dois furos cilíndricos se alinham com os pontos de perfuração que permitem que o fluido de amostra saia do corpo do cartucho 101 para dentro dos dois tubos de amplificação 103. A transição da seção transversal circular para achatada é gradual com uma torcedura na sua forma tal que a mesma gire naturalmente e guie o inserto de dispensa 122 no alinhamento conforme a montagem de dispensa é inserida. Esta transição de circular para achatada na forma do corpo do cartucho 101 é mostrada na Figura 18 na seção corporal entre o recurso de localização de tampa 13 e o recurso de trava de tampa 109.
[00167] A montagem de dispensa é mostrada em uma vista de montagem explodida na Figura 22. A vareta de dispensa 121 é presa dentro da
51 / 77 tampa 120 de modo que a mesma possa girar livremente para ajudar no alinhamento da montagem de dispensa 122 com a sua entrada para dentro da seção transversal achatada do cartucho conforme a montagem é inserida. A vareta de dispensa 121 tem duas projeções 305 e 306. Para cada uma destas projeções 305, 306, a sua seção inferior forma um pistão correspondente com um selo de anel O correspondente 303, 304 e abaixo de cada pistão se forma uma ponta afiada correspondente 307, 308.
[00168] Os pontos 307, 308 podem ser afiados na seção transversal para ajudar o fluxo de fluido passar os pontos 307, 308 durante a perfuração. Por exemplo, nas modalidades descritas, os pontos são no formato em V na seção transversal para permitir que cada um dos pontos 307, 308 desdobra um pequeno picotado triangular conforme eles perfuram a seção de material fino na base do cartucho para ajudar o fluxo de líquido dispensado a passar os pontos 307, 308.
[00169] Quando o inserto de dispensa 122 é montado sobre a vareta de dispensa 121, as pontas perfurantes 307, 308 das projeções da vareta de dispensa 305, 306 se projetam para dentro dos furos cilíndricos do inserto de dispensa 122, mas não enchem o seu volume. Estes furos são mostrados na seção transversal na Figura 23. A seção de inserto de dispensa tem uma superfície lisa 309, como mostrada nas Figuras 21 e 22, que se ajusta intimamente e desliza sobre e entre as projeções 305, 306 da vareta de dispensa 121. Quando ajustado, o inserto de dispensa 122 desliza para entrar em contato com a ponte pequena 310 na vareta de dispensa. O contato com a ponte pequena 310 impede movimento adicional no manuseio normal antes do uso e o ajuste da superfície lisa do inserto 122 na vareta 121 retém e alinha o inserto de dispensa 122 em uma maneira controlada e é um ajuste firme tal que o mesmo não saia com o manuseio normal.
[00170] A Figura 23 mostra em seção transversal o inserto de dispensa de dois tubos 122 parcialmente pressionado dentro da montagem de cartucho.
52 / 77 O inserto de dispensa 122 é um ajuste de superfície lisa na vareta 121 e é bloqueado de movimento adicional pela ponte pequena 310. O inserto de dispensa 122 incorpora os furos cilíndricos terminados em duas aberturas 301,
302.
[00171] A Figura 24 mostra em seção transversal as roscas internas da tampa de rosca 120 engatada com as roscas no corpo do cartucho quando o mecanismo de dispensa já progrediu dentro do cartucho para o ponto onde a base do inserto de dispensa 122 está apenas fazendo contato com a seção de material fino na base do corpo do cartucho 127. A base do inserto de dispensa 122 tem recursos que combinam e formam um encaixe de pressão com a base do corpo do cartucho, formando um selo de fluido em torno da base de cada um dos furos cilíndricos 301, 302. A ponte 310 na vareta de dispensa 121 permitiu que a vareta aplicasse força suficiente sobre o inserto de dispensa para assentá-lo firmemente dentro do recurso de vedação na base do corpo do cartucho. Uma vez que esta parte está assentada, progressão adicional das roscas da tampa causada pela rotação continuada da tampa 120 pelo usuário, quebra a pequena ponte de plástico 310 para permitir que as projeções de dispensa 305, 306 progridam ainda mais para dentro do inserto de dispensa
122.
[00172] Neste ponto, os pontos de perfuração 307, 308 começam a perfurar a seção de material fino na base do corpo do cartucho e os recursos de pistão ou seringa 303, 304 com selos de anel “O” progridem para vedar os topos dos dois furos cilíndricos 301, 302.
[00173] Com movimento adicional, conforme a tampa de rosca 120 é adicionalmente fechada pelo usuário, a projeção 310 curva-se ou quebra para permitir que os anéis O 303 e 304 nas projeções 305 e 306 vedem os topos dos cilindros de dispensa, para formar volumes fechados de fluido dentro dos respectivos furos de dispensa 301, 302. Conforme o usuário conclui a ação de fechamento da tampa, os pistão vedados com anel O são forçados pela ação
53 / 77 da tampa rosqueada engatada 120 e o inserto de dispensa 122 sendo pressionado dentro do corpo do cartucho 101 a se movimentar na distância completa através dos dois furos de inserto de dispensa 301, 302 para dispensar o fluido de amostra aprisionado dentro de cada um dos dois reservatórios de amplificação ou teste 103.
[00174] Nesta modalidade, o corpo do cartucho 101 tipicamente terá em torno de 1 a 3 mililitros de amostra e fluido de diluição de amostra 111 presentes e a ação de dispensa dispensará uma pequena quantidade deste fluido, na ordem em torno de 50 a 100 microlitros, dentro de cada um dos tubos de amplificação 103. Sem mudar para a forma desta modalidade, a escala das partes usadas pode ser variada para variar tanto o volume de diluição da amostra quanto os volumes dispensados dentro de cada um dos tubos de amplificação 103.
[00175] A Figura 25 mostra o cartucho na vista em seção transversal, na configuração totalmente dispensada. A tampa de dispensa 120 é mais longa que a tampa de envio e a sua borda inferior tem recursos de alinhamento ou anti-rotação 129 que travou sobre os recursos de came moldado 109 no corpo do cartucho 101. Isto impede a tampa 120 de ser facilmente removida e garante que a amostra de teste esteja totalmente vedada dentro do cartucho depois que tenha sido adicionado e a tampa de dispensa é ajustada. Esta função de travamento tem vantagens significantes para a segurança do operador e confiabilidade de teste e protege contra a contaminação de usuários e do sistema de teste durante o uso e na remoção, manuseio e descarte subsequentes da montagem de cartucho usada.
[00176] A Figura 26 mostra uma vista externa total do cartucho na configuração totalmente dispensada com a tampa de dispensa 120 totalmente localizada e travada no corpo do cartucho 101. A montagem da tampa de dispensa 120 tem recursos na sua forma para ajudar na rotação e manuseio, mas também inclui um recurso moldado único 129 que se projeta mais à
54 / 77 frente e/ou mais para baixo do que qualquer outro dos recursos da tampa 120. O instrumento incorpora um sensor que detecta a posição ou proximidade deste recurso 129. Esta saída de sensor é usada pelo controlador do instrumento e o seu software de controle para confirmar que a tampa 120 esteja totalmente fechada e girada em torno da posição totalmente fechada.
A Figura 28 mostra a relação entre o cartucho e o instrumento com a tampa de dispensa na posição totalmente fechada. na configuração totalmente fechada, a tampa 120 tem projeção 129 na proximidade do e detectado pelo sensor eletrônico 140 montado sobre uma placa de circuito 142. Na modalidade descrita, o sensor 140 é um sensor ótico tipo retro reflexivo que incorpora tanto um diodo emissor de luz infravermelha quanto um sensor ótico de emparelhamento.
Quando o recurso 129 é levado em proximidade imediata, a iluminação refletida do diodo emissor de luz é detectada pelo sensor de óptica próximo 140. Este sinal é usado pelo controlador do instrumento para confirmar que a tampa 120 está fechada.
Em um fluxo de trabalho de aplicação do instrumento típico, o usuário é alertado para ajustar e fechar a tampa de montagem de dispensa 120 até que o recurso de tampa totalmente fechado 129 seja detectado como descrito acima.
O teste de diagnóstico depois apenas avança para a amplificação, detecção e geração de um resultado de teste depois desta detecção.
Se depois de um tempo prolongado a tampa 120 não for detectada, isto pode opcionalmente ser considerado pelo instrumento constituir uma falha ou mão uso e uma mensagem de erro exibida na tela LCD do instrumento ou comunicado para uma ou mais das interfaces de dados.
Este arranjo tem a vantagem de que o teste apenas prosseguirá para gerar um resultado de diagnóstico se o cartucho for confirmado estar sendo usado corretamente dentro de um tempo razoável e a função de dispensa totalmente concluída.
Esta confirmação provê auto verificação pelo instrumento e melhora a confiança no resultado de teste final.
Testes outros que não o teste de amplificação de ácido nucléico.
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[00177] Os reagentes de teste contidos dentro do cartucho antes de testar podem ser configurados para outros tipos de teste não que necessariamente utilizam a amplificação de ácido nucléico. Por exemplo, a detecção de reação química direta pode ser usada em algumas modalidades para detectar a presença de elementos traços ou aditivos dentro de uma amostra. Opcionalmente, métodos de detecção de imunoensaio podem ser usados para ligar diretamente às proteínas específicas e prover a sua detecção dentro do material de amostra que foi diluído e dispensado dentro de um ou mais tubos de teste. Operação de cartucho manualmente operado, visualmente lida, não instrumentada
[00178] Em algumas aplicações, o cartucho pode ser usado manualmente sem um instrumento, onde o cartucho é mantido em uma mão e a primeira tampa removida com a outra mão, a amostra adicionada e a segunda tampa (de dispensa) ajustada e fechada com rosqueamento. Neste caso, onde os tubos de teste são visualmente transparentes, a dispensa de fluido dentro dos tubos de teste pode ser visualmente observada e uma mudança de cor ou turbidez observada com o tempo para prover uma leitura ou exibição de teste de diagnóstico. Esta abordagem usa as vantagens de operar com um cartucho totalmente vedado uma vez que a amostra é adicionada e internamente dispensando um volume medido de fluido de amostra diluído preparado dentro do tubo de teste sem o uso de etapas de transferência de fluido externas.
[00179] Opcionalmente, um suporte simples pode ser provido para sustentar o cartucho com o propósito de remover a primeira tampa, adicionar a amostra e encaixar e fechar a tampa de dispensa e seu mecanismo associado.
[00180] Opcionalmente, um bloco aquecedor simples pode ser provido para prover controle de temperatura da amostra e câmaras do tubo de teste da montagem de cartucho, mas o cartucho é manualmente retirado para observar
56 / 77 o resultado do teste visível em um ou mais tubos de teste acoplados. Instrumento
[00181] Como descrito acima, o cartucho pode ser operado dentro de um aparelho ou “instrumento” de teste de diagnóstico para conduzir um teste de diagnóstico. O instrumento de teste de diagnóstico 30 é mostrado nas Figuras 11 a 13 e inclui um fechamento ou alojamento rígido 31 e base 33, que podem ser construídos a partir de plástico moldado ou materiais de folha metálica. Dentro deste alojamento 31, um visor LCD sensível ao toque 32 é montado. O instrumento é operado selecionando-se controles sensíveis ao toque em uma interface do usuário (não mostrada) apresentado no visor do instrumento 32. Entretanto, em outras modalidades a interface do usuário pode ser implementado como controles físicos ou botões para implementar as funções correspondentes. Controlador do instrumento
[00182] Como mostrado na Figura 33, o instrumento 30 incorpora um controlador com base em microprocessador 201 configurado para executar processos de teste de diagnóstico que controlam o sequenciamento e operação das funções eletricamente do instrumento. Na modalidade descrita, o controlador do microprocessador 201 é configurado por via de um sistema operacional incorporado 203 e software incorporado 203 armazenado em memória não volátil 204 em comunicação com pelo menos um processador de interface de dados externos 206 e os atuadores, aquecedores, motores e sensores internos na interface de dados e controle 207 como será bem entendido por aqueles versados na técnica. Entretanto, estará evidente para aqueles versados na técnica que algumas ou todas das etapas dos processos de teste de diagnóstico realizados pelo aparelho ou instrumento de teste de diagnóstico 104 podem alternativamente ser implementadas em outras formas, tais como dados de configuração para uma matriz de porta de campo programável (FPGA) ou inteiramente na forma de hardware, tal como um
57 / 77 circuito integrado específico de aplicação (ASIC), por exemplo.
[00183] A memória não volátil 204 também armazena resultados de teste e calibrações de instrumento como dados armazenados em um ou mais arquivos de dados ou em uma base de dados e a informação e os dados armazenados na memória não volátil 204 são retidos, mesmo quando nenhuma energia é provida para o instrumento de teste de diagnóstico 30.
[00184] O instrumento 30 também inclui componentes adicionais externos ao controlador 201e em comunicação com o mesmo, incluem, um sensor de tampa 222, um sensor de cartucho 223 e um bloco aquecedor 216 cuja temperatura é controlada por um elemento aquecedor 220 e sensor de temperatura 218. Todos destes componentes são interfaceados para o controlador 201 por via de interfaces de comunicações e controle 208, por intermédio de um barramento compartilhado 207 e funções I/O de um sistema operacional 202.
[00185] A tabela abaixo lista cada componente com fabricante, número da peça e o numeral de referência da peça no diagrama de bloco da Figura 33. Numeral de Item Fabricante Número da Peça Referência da Figura 31 Microprocessador Microchip PIC32MX695F512L-80V/PT 201 RAM Dentro do Microcontrolador Como acima 205 SST25VF064C-80-4I-S3AE Memória FLASH (a mesma é EOL, será trocada Microchip 204 EEPROM por SST26VF064B-104I/SM na Placa MZ) Sensor de Detecção da Allegro MicroSystems, LLC, A3213ELHLT-T 222 Tampa sensor Hall: Sensor da Posição Inicial TT Electronics | Optek OPB829CZ 225 do Carro do Motor Technology, Inc Cartão SD Sandisk MicroSDHC 8GB 204 TMP275AIDGKT Sensor de temperatura Texas Instrument 218, 219 TMP102AIDRLR Sensor de Temp Sem Alternativo para Melexis Technologies MLX90615SSG-DAA Contato 218, 219 Resistor de Potência série Elemento Aquecedor Caddock Eletronics Inc. 220, 221 MP915 Módulo da Câmara OmniVision Ov5640 214 Módulo de leitura de Datalogic DSE0420 2D scan Module 215 código de barras
58 / 77 Módulo de Fluorescência Óptica Montagem customizada de A e B Axxin, 227, 228 instrumento Sensor de Medição Incorpora filtros de passagem Fotodiodo: S2387-33R da de faixa, espelho dicróico, Hamamatsu LED Golden Dragon da Osram e fotodiodo. Sensor de Detecção da Optek Technology, LED de Posição Inicial do interrupção óptica e OPB315WZ 223 Cartucho montagem de fotodiodo. Sensor de tampa fechada Osram SFH 9206 224 Ametek / Haydon Kerk - Não Motor de passo Captivo, Atuador Linear, 21F4AC-2.5 226 2,5V, NEMA 8 Função de tampa e detecção de tampa
[00186] O instrumento 30 mostrado na Figura 11 inclui uma cobertura ou tampa deslizante acionada por mola 36. Esta cobertura 36 pode ser recuada pelo usuário, tipicamente com o polegar de uma mão. Ao recuar a cobertura 36, uma porta no topo do instrumento é exposta que permite que o usuário insira o cartucho no início do teste. A ação de recuar a cobertura 36 ativa um comutador ou sensor elétricos internos tal que a aplicação de software executando no controlador do instrumento esteja ciente de que um teste está iniciando e proveja alertas e feedback adequados para o usuário. O cartucho como mostrado na Figura 1, para uma única inserção de tubo e na Figura 18 para uma modalidade de dois tubos incorpora um recurso moldado anular 13 no corpo do cartucho. Este recurso é encaixado pela tampa do instrumento 36 tal que a tampa 36 circunde e deslize sobre uma seção deste recurso 13 quando a tampa 36 fecha de volta contra o cartucho instalado. A superfície afunilada deste recurso moldado 13, no cartucho e a ação da tampa 36, deslizando sobre a mesma atua para reter o cartucho dentro do instrumento e prende o cartucho com alguma pressão para baixo tal que o cartucho esteja positivamente localizado e os tubos de amplificação 3, 107, 108 sejam mantidos em contato térmico imediato com o bloco aquecedor inferior.
[00187] Este arranjo com a cobertura deslizante acionada por mola 36 mostrada na Figura 11 permite que o cartucho seja retido com firmeza com a tampa 36 prensada contra o cartucho sob pressão de mola mas ainda permite
59 / 77 livre acesso pelo usuário à tampa do cartucho e seção de tampa rosqueada do cartucho para remover e ajustar as tampas requeridas para adicionar e processar uma amostra. O cartucho não pode ser fácil ou inadvertidamente retirado pelo usuário sem a ação intencional adicional de recuar a cobertura acionada por mola 36 para liberar o cartucho e depois retirar o cartucho.
[00188] Em outras implementações, a tampa 36 pode ser eletricamente atuada tal como pelo uso de um motor elétrico que aciona uma engrenagem de pinhão contra uma engrenagem de cremalheira interna na tampa 36, a tampa 36 deslizando dentro de guias lineares. No caso de uma tampa eletricamente atuada 36, a mesma é aberta e fechada sob o controle do controlador do instrumento 201 e software que responde aos comandos do usuário ou partes da sequência de teste onde o cartucho é inserido ou removido na conclusão de um teste. Detecção de Cartucho
[00189] Quando a tampa do instrumento 36 é aberta, o cartucho pode ser inserido para dentro da porta do instrumento. Uma vez inserido, o cartucho é detectado pelo controlador do instrumento 201. Isto permite que o instrumento proveja alertas para o usuário iniciar um teste e identificar o tipo de teste ou de cartucho requeridos. O instrumento 30 mostrado na Figura 11 inclui um comutador ou sensor incorporado dentro da porta do cartucho que provê detecção do cartucho uma vez que o mesmo foi inserido e está no lugar.
[00190] Em uma implementação, este sensor é formado por um diodo emissor de luz LED para formar um feixe estreito através da porta do cartucho e um sensor fotoelétrico associado que recebe e detecta o feixe. A presença de um cartucho inserido interrompe este feixe e permite que o instrumento e seu controlador e software detectem a presença do cartucho. Outros sensores adequados incluem aqueles que contam com a detecção de reflexão óptica a partir da superfície do cartucho ou o uso de um comutador que é ativado pela inserção do cartucho ou o uso de uma câmera e análise de
60 / 77 imagem associada no software para confirmar a presença ou ausência do cartucho. Identificação de Cartucho
[00191] O sistema de teste de diagnóstico pode ser configurado para processar diferentes tipos de teste, onde estes testes diferentes podem ter conteúdos de reagente diferentes, resultados de teste de diagnóstico alvos pretendidos diferentes e requerer condições de processamento de teste diferentes. Tipos de teste com cartucho diferentes podem ser identificados pelo usuário pela entrada na interface de usuário do instrumento ou pode ser identificado automaticamente pelo instrumento através da detecção de marcas ou rótulos identificáveis pela máquina na montagem de cartucho. Esta identificação de ingredientes pode incluir recursos tais como códigos de barra lineares ou códigos 2D (por exemplo, QR) impressos ou gravados sobre a superfície do cartucho ou aplicados sobre um rótulo impresso montado no corpo do cartucho ou na tampa de envio.
[00192] Tipicamente, cada código de cartucho identifica o tipo de cartucho e o processo e análise de teste de diagnóstico correspondentes a serem aplicados no processamento do cartucho. O mesmo também tipicamente permite que o instrumento leia o número de lote e a data de validade do cartucho particular. Estes dados podem ser usados para aplicar calibrações específicas de lote e para excluir cartuchos fora da validade de serem usados nos testes. Esta informação também é incluída como metadados nos dados de resultado de teste gerados pelo controlador 201 durante o teste de diagnóstico.
[00193] O instrumento pode incorporar um sensor de código de barras e sensor de imagem para permitir que o controlador incorporado 201 leia o tipo de cartucho e identifique o seu método de teste associado a partir de um código de barras montado sobre o corpo do cartucho ou tampa. Este código pode ser um código de barras linear, um tipo de código 2D tal como um
61 / 77 código QR ou Datamatrix ou um conjunto patenteado de marcações ou símbolos. Alternativamente, um sensor de imagem ou câmera integrados podem, pelo uso de análise de imagem dentro do controlador do instrumento 201, decodificar os conteúdos de um código de barras, código 2D ou marcas de identificação no cartucho ou sua tampa. Alternativamente, o usuário pode ser alertado a usar uma leitora de código de barras ou código 2D comercial manualmente operada conectada a uma das portas de comunicações externas no instrumento para adquirir os conteúdos de dados de um código aplicado ao corpo do cartucho ou à tampa do cartucho. Se o código está no topo de uma tampa de envio, o código pode ser lido facilmente depois que o cartucho é inserido e detectado dentro da porta do instrumento, antes da remoção da tampa. Alternativamente, o usuário pode ser alertado para introduzir a ID ou tipo do cartucho no campo de texto na interface do usuário ou selecionar o tipo de teste ou cartucho de uma lista suspensa na interface do usuário. Aquecimento do Reagente de Amostra antes da amplificação.
[00194] O instrumento incorpora duas zonas de controle de temperatura independentes que circunda e provê entrada de calor independente para a seção de reservatório de fluido de amostra do cartucho e para os tubos de teste ou amplificação 3, 107, 108. As zonas podem ser câmaras de ar aquecido ou aquecedores de bloco ou o instrumento pode usar um outro método de aquecer ou resfriar direta ou indiretamente os fluidos na região da câmara de amostra do cartucho e dentro dos tubos de teste separados 3, 107, 108.
[00195] A Figura 14 mostra uma configuração de instrumento das zonas de aquecimento para um cartucho com tubo de amplificação único. Neste exemplo, blocos de alumínio eletricamente aquecidos 61, 62 são usados para prover entrada de calor para dentro do cartucho 1 inserido. Os dois blocos 61, 62 são aquecidos e controlados separadamente e são suficientemente isolados dentro do instrumento, que podem operar em
62 / 77 temperaturas diferentes. O bloco superior 61 é eletricamente aquecido e controlado tal que a sua temperatura esteja sob o controle do controlador do instrumento 201. Os sensores de feedback são montados sobre o bloco de alumínio e o controle da temperatura do bloco de alumínio é usado pelo controlador do instrumento 201 para aquecer e prognosticar a temperatura comunicada aos fluidos dentro do cartucho. Em uma outra implementação, os sensores de temperatura são de um tipo sem contato tal como sensores de temperatura por emissão de infravermelho e eles são usados para medir diretamente a temperatura dos fluidos internos do cartucho visto que as paredes do cartucho são construídas de materiais com transmissão adequada nos comprimentos de onda necessários para empreender esta medição de temperatura interna direta.
[00196] Em uma aplicação típica, o aquecedor de amostra opera a partir de 40 graus Celsius a 95 graus Celsius, dependendo do tipo de amostra a ser processada e dos tipos de célula e lise de célula requeridos.
[00197] Em uma aplicação isotérmica de amplificação típica, o bloco aquecedor de amplificação 62 opera em uma temperatura fixa tal como 65 graus Celsius. Em uma aplicação de PCR típica, o bloco aquecedor de amplificação aquece e esfria em etapas entre as temperaturas ajustadas em uma faixa típica de 50 graus Celsius a 95 graus Celsius. O bloco aquecedor de amplificação 62 na Figura 14 incorpora um furo de porta 63. Este furo 63 permite a detecção óptica dos conteúdos do tubo para permitir a detecção tanto em tempo real quanto de ponto final e a determinação de um resultado de teste qualitativo ou um qualitativo.
[00198] A Figura 13 mostra a estrutura interna do instrumento e nesta vista a integração do bloco aquecedor de amostra superior 61 é mostrada. O bloco aquecedor de amostra 61 é montado sobre a sua placa de circuito de controle 50 tal que a porta do cartucho seja apresentada em uma superfície de topo do instrumento. Nesta vista, o bloco aquecedor 61 é circundado por uma
63 / 77 cobertura plástica isolante 51 para impedir perda excessiva de calor do bloco aquecedor 61 uma vez que o mesmo está na temperatura.
[00199] A implementação com dois tubos do instrumento tem o mesmo arranjo geral de zonas aquecedoras. Este arranjo de blocos de controle de temperatura que circunda seções do cartucho é mostrado na Figura 31, com o bloco aquecedor de amostra 61 e o bloco aquecedor de amplificação 62. Nesta implementação, o bloco aquecedor de amplificação 62 tem dois furos de porta 63 em cada lado do bloco 62 para cada um dos tubos de amplificação internos 107, 108. Estas portas 63 permitem que cada um dos sensores se mova para a posição e adquiram medições de teste de óptica de cada um dos tubos de amplificação durante o teste. A Figura 32 mostra a montagem de cartucho e os dois blocos aquecedores 61, 62 na seção transversal. Controle de temperatura ou ciclagem de temperatura.
[00200] O tubo de teste de amplificação 3 ou pluralidade de tubos de teste 107, 108 montados na base do cartucho entram em uma zona de aquecimento correspondente quando o cartucho é colocado dentro da porta do instrumento.
[00201] Este aquecimento é alcançado pela inserção dentro da zona de temperatura controlada, inclusive por meio do contato direto com ou proximidade imediata a um bloco de aquecimento e resfriamento de temperatura controlada 62.
[00202] Em uma implementação alternativa, uma cavidade de ar mantida em uma temperatura fixa pela recirculação dentro de uma cavidade que envolve os tubos de teste é usada para controlar a temperatura nos tubos de teste. Usando cada uma destas implementações de controle de temperatura, os poços de teste 3, 107, 108 são cada um mantidos em uma temperatura fixa para a amplificação de DNA isotérmica ou são ciclados entre temperaturas diferentes para a amplificação de DNA ou RNA tipo PCR. Câmara de Amostra e Mistura de Tubo de Teste
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[00203] Em alguns testes de diagnóstico, a mistura dos conteúdos do reservatório de preparação de amostra ou dos reservatórios de teste/amplificação é necessária para o teste funcionar corretamente ou para melhorar a confiabilidade ou precisão do teste. Para obter mistura, insertos magnético tal como pequenas bolas de aço ou ferrita podem ser incluídas no reservatório de preparação de amostra ou nos reservatórios de teste/amplificação 3, 107, 108 durante a carga de reagente do cartucho durante a sua fabricação inicial. Por via de exemplo, isto é mostrado na Figura 2 para um cartucho de amplificação única.
[00204] Na Figura 2, uma bola de aço 14 é incluída na seção de câmara de amostra do corpo do cartucho 1 e uma bola de aço 15 é incluída no tubo de teste de amplificação 3.
[00205] Dentro do instrumento, imãs permanentes são ajustados a um atuador ou ao carro de sensor móvel tal que, conforme o carro passa através de cada um dos poços de teste, um imã ajustado levanta alto as partículas 14, 15 e elas subsequentemente caem de volta para a base do poço sob gravidade depois que o carro tenha passado. Este movimento de bola dentro do fluido do tubo de amplificação induz uma ação de mistura de fluido.
[00206] Em uma implementação alternativa, imãs altos e baixos são ajustados para puxar as partículas ou bolas de mistura 14, 15 para posições alternadas em cada poço conforme o carro passa. Este movimento alternado ou recíproco da bola de mistura 14, 15 dentro de cada poço também induz mistura no fluido de poço. Este arranjo também tem a vantagem que o mesmo pode ser configurado para puxar as partículas ou bolas incluídas 14, 15 para uma posição preferida quando cada sensor está próximo do poço, tal que estas partículas 14, 15 não interfiram com as medições ópticas dos conteúdos do poço.
[00207] Um método similar de aplicar um campo magnético externo pelo movimento de um imã permanente ou pluralidade de imãs em
65 / 77 proximidade para induzir movimento das partículas magnéticas ou bolas de aço 14, 15 pode ser aplicado ao reservatório de preparação de amostra para induzir a mistura dentro do fluido de amostra. A mistura dentro do reservatório de preparação de amostra pode ser usada para misturar material de amostra introduzido com o fluido de preparação de amostra para diluir e preparar o material de amostra para amplificação. Esta mistura de preparação também pode melhorar a lise de célula e a extração e preparação do material de ácido nucléico do DNA ou RNA alvo dentro da amostra. Em uma alternativa para mover fisicamente um imã permanente, um ou mais eletroímãs podem ser ativados por uma corrente elétrica aplicada sob o controle do controlador do instrumento. Estes campos eletromagnéticos, magnéticos variáveis induzidos podem ser usados para causar movimento dos grânulos ou bolas de aço magnéticos 14, 15 dentro do reservatório de preparação de amostra 1 ou dos reservatórios/tubos de teste/amplificação para causar a mistura de fluido em cada uma destas zonas no cartucho. Detecção de enchimento de fluido, análise de imagem
[00208] Um ou mais sensores de imagem 214 incorporados dentro do instrumento podem capturar imagens digitais do cartucho e da progressão dos componentes de mecanismo de dispensa e do estado e progresso dos fluidos contidos dentro do cartucho. Estas imagens digitais são processadas pelo software de análise de imagem dentro do controlador do instrumento para prover saídas de controle e situação. A saída digital do um ou mais sensores de imagem 214 pode ser usada para confirmar a progressão de sequência e confirma a liberação e fluxo corretos de reagentes de teste dentro do cartucho tal que a integridade do teste possa ser confirmada pelo controlador 201 e usado para melhorar a confiabilidade e segurança do resultado de teste. O sensor de imagem 214 pode ser usado pelo controlador 201 para observar os fluidos internos e as partes do mecanismo dentro do cartucho e para calcular uma interpretação de controle através do uso de análise de imagem pelo
66 / 77 controlador do instrumento.
[00209] O sensor de imagem 214 pode confirmar a operação e posição do mecanismo de dispensa para confirmar a operação incompleta ou correta e completa do cartucho e alerta o usuário na conclusão ou automaticamente progride para a etapa seguinte no processo do aparelho para adquirir o resultado de teste final.
[00210] Os dados de imagem adquiridos pelo sensor de imagem 214 e na análise de imagem subsequente podem ser usados pelo controlador 201 para determinar os níveis do fluido de amostra dispensado em cada um dos tubos de teste 3, 107, 108 e usar este nível para determinar que a dispensa do fluido de amostra foi concluída corretamente. O nível do fluido dispensado dentro de cada um do um ou mais tubos de teste 3, 107, 108 dentro do cartucho pode ser usado para compensar o resultado de teste quanto a tolerâncias na operação de dispensa. O nível do fluido com cada tubo de teste pode ser convertido pelo controlador 201 para um volume pelo uso de um modelo matemático dos tubos 3, 107, 108 ou usando-se uma tabela de consulta. O volume de fluido dispensado pode influenciar a concentração dos regentes de teste dentro do fluido da câmara de teste uma vez que eles dissolveram dentro do fluido dispensado. Medindo-se o volume do fluido de amostra dispensado, a concentração de reagentes dentro de cada tubo de teste 3, 107, 108 pode ser calculada. A partir de uma série de experimentos anteriormente conduzidos ou a partir de um modelo das reações de teste, o efeito da concentração do reagente de teste sobre o resultado de teste e a interpretação das medições em série com o tempo do teste para interpretar os resultados pode ser conhecido e ajustado ou compensado dentro do aparelho.
[00211] O reagente de preparação de amostra fluídico armazenado no cartucho pode ser colorido com um corante. Se o teste de amplificação final é detectado usando fluorescência, os reagentes fluídicos tais como o tampão de lise de amostra armazenados na câmara de amostra do cartucho podem ter um
67 / 77 corante colorido, não fluorescentes adicionado. Este corante pode ser usado pelo sensor de imagem 214 para converter em imagem ou contrastar de forma visualmente colorida o fluxo de fluido dentro dos tubos de teste 3, 107, 108 do cartucho para confirmar a ação de dispensa e confirmar o volume de dispensa. A adição de um corante colorido ao fluido melhora o contraste nas imagens resultantes, mas não afeta adversamente a excitação e emissão de fluorescência a partir dos conteúdos do tubo. Como um uso alternativo da abordagem, a análise de imagem de uma imagem do fluido dispensado em um ou mais dos tubos de teste acoplados 3, 107, 108 pode ser usada para medir o volume dentro do tubo 3, 107, 108 e esta medição pode ser usada para compensar o cálculo do resultado de teste para o volume de amplificação. Esta compensação pode ser de significância particular para um resultado de teste quantitativo onde a concentração de reagentes no tubo de teste 3, 107, 108 pode influenciar as medições e resposta de reação. Sensores de Instrumento.
[00212] A Figura 16 mostra o arranjo dos sensores óticos dentro do instrumento.
[00213] Dois sensores óticos independentes 80 e 82 são mostrados. O cone focal ótico 81 de um sensor 80 é mostrado esquematicamente, assim como o cone focal ótico 83 do outro sensor 82. Isto é mostrado em maiores detalhes com o mesmo número de item na Figura 17. A Figura 17 mostra como os cones focais do sensor ótico 81 e 83 podem cada um excitar e adquirir sinais de fluorescência óptica a partir do tubo de amplificação 3. Nestas figuras, o bloco aquecedor de amplificação 62 não é mostrado, para fins de clareza; entretanto, no instrumento completamente montado, estas medições ópticas são adquiridas através das portas no lado do bloco aquecedor 62 que circunda o tubo de amplificação 3.
[00214] A Figura 16 mostra os sensores óticos montados na placa 52 que podem se movimentar linearmente sobre os trilhos e blocos de mancal
68 / 77 lineares 71 e 72, onde estes trilhos e blocos são mostrados na transversal nesta vista. O motor de posicionamento 70 provê a capacidade para o controlador do instrumento 201 para posicionar com precisão os sensores com respeito ao tubo 3 para adquirir medições que representam as emissões de sonda de detecção de DNA ou RNA dentro do tubo 3.
[00215] No caso de cartucho de tubo de amplificação único, os sensores podem ser posicionados tanto em linha com o tubo 3 quanto em um arranjo fixo tal que os mancais, trilhos lineares 71 e 72 e o motor de posicionamento 70 não são requeridos. Entretanto, o uso do arranjo de movimento linear e motor de posicionamento permite que os sensores também sejam movidos para locais de referência de auto teste e estacionar os sensores fora da localização de tubo quando não usados, o que pode ter vantagens em algumas aplicações. Regiões de Referência Interna.
[00216] O instrumento pode ser configurado com uma ou mais regiões de referência óptica dentro do campo de vista dos sensores de detecção ou dentro da trajetória de varredura destes sensores. Estas regiões de referência podem ser configuradas pelo seu material ou propriedades de cobrimento superficial para ter uma reflectância, absorção ou fluorescência óptica conhecida adequada como um teste de referência do modo de detecção pretendido dos sensores. Estas regiões podem incluir um fundo de referência evidente com uma reflexividade, absorção ou fluorescência estáveis conhecidas. Por exemplo, no caso de sensores de detecção de fluorescência, as regiões de referência podem ser componentes plásticos localizados com aditivos inorgânicos ou orgânicos para sintonizar a sua resposta à fluorescência para ser uma dentro de uma faixa de teste adequada para os sensores. AutoTeste confirmação de calibração.
[00217] A inclusão de regiões de referência ou locais de referência
69 / 77 dentro do instrumento permite que o instrumento confirme a operação e exatidão da sua calibração de imageamento dentro de uma função de auto teste. Alternativamente, o instrumento pode alertar o usuário para inserir um cartucho de teste com saída óptica conhecida ou resposta dos locais de tubo de teste, onde o cartucho é o cartucho de referência configurado para o propósito de permitir que o instrumento conduza um auto teste ou uma função de calibração. Esta capacidade provê confiabilidade e segurança de usuário melhoradas no uso do sistema com o potencial para ter uma leitura incorreta ou resultado de teste falso. Leituras de teste.
[00218] Enquanto a amplificação está em execução, leituras de teste são recolhidas pelos sensores óticos. Estes sensores são configurados para ter uma trajetória óptica que incorpora os conteúdos dos tubos de teste de amplificação através de furos, portas ou janelas ópticas 63 no bloco aquecedor de amplificação mais baixo 62 e seções oticamente transparentes correspondentes nos tubos de teste. Onde a detecção é requerida em um ou mais tubos de amplificação 3, 107, 108 e também nas regiões de auto teste de referência, uma abordagem de varredura é usada para mover os sensores através destes pontos de detecção múltiplos e prover medições em cada ponto de interesse para o teste de diagnóstico. Estas medições podem usar absorção óptica, emissão de florescência ou emissão de bioluminescência para detectar marcadores de sequência biológica ou genética específicos nos tubos de teste 3, 107, 108.
[00219] O arranjo de medição é mostrado na Figura 16 para o cartucho no formato de amplificação único e nas Figuras 29 e 30 para a configuração de tubo de amplificação múltiplo. Na Figura 30, os sensores óticos 61, 62 são montados sobre um carro 53. O carro 53 é montado nos trilhos lineares 71 e 72, tal que cada um dos sensores possa passar em cada um dos locais de detecção óptica requeridos.
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[00220] O carro móvel 53 é fixado a um parafuso de avanço e este parafuso passa através de uma porca montada dentro de um motor de posicionamento de eixo oco. Neste exemplo, o motor de posicionamento 70 é um motor de passo sob o controle de componentes eletrônicos e do controlador 201. Outros arranjos para prover controle posicional do carro para prover digitalização óptica estarão evidentes para aqueles versados na técnica, incluindo motores lineares, uma correia de transmissão ou um arranjo de engrenagem de coroa e pinhão.
[00221] Este arranjo pode mover os sensores 61 e 62 tal que eles sucessivamente se alinhem com cada tubo de teste no cartucho 101. Este movimento de digitalização pode ser usado para adquirir medições para cada sensor em cada localização de poço de teste. Este processo de digitalização pode incluir uma sequência de movimentos por meio dos quais cada sensor é posicionado e parado em linha com cada poço de teste por sua vez. Em cada posição, um conjunto de medições de teste é empreendido. Na conclusão de um conjunto de movimentos e medições, o carro é movido de volta para a sua posição de partida e o processo de digitalização repetido.
[00222] Um arranjo de digitalização de sensor alternativo é mover o carro em uma velocidade constante de modo que o carro e os sensores que ele carreia sejam movidos através da janela de sensoriamento de cada um dos poços de teste em uma velocidade constante. Uma série contínua de medições são depois adquiridas durante este movimento de digitalização de velocidade constante.
[00223] Este sinal é composto de muitas medições e uma vez que estas tenham sido adquiridas, o controlador 201 pode localizar os picos que correspondam com cada poço de teste 107, 108. Estes picos ou pontos máximos correspondem com o sinal óptico do poço e são uma medição similar àquela que teria sido adquirida se o sensor fosse acuradamente parado em cada localização de poço com o sensor alinhado com a janela óptica 63
71 / 77 através do bloco aquecedor 62 e poço de teste 3, 107, 108. A vantagem do método de aquisição em movimento, sem parar para adquirir medições em cada localização de poço, é que o carro não precisa parar para cada medição e, portanto, o tempo global de digitalização e a taxa de repetição de medição para cada poço de teste pode ser muito melhorado. Isto depois permite uma taxa de amostragem de medição mais alta para cada poço de teste.
[00224] Em muitas aplicações, o resultado de teste é determinado pelas dinâmicas das reações no poço de teste 3, 107, 108 e em tais aplicações uma série de medições precisam ser adquiridas em uma taxa de amostra adequada enquanto o teste está em execução para ter os dados necessários para a análise e determinação subsequente do resultado do teste. A Figura 33 mostra uma curva de amplificação típica medida em tempo real como uma sequência de medições adquiridas durante a amplificação a partir de emissões de detecção de dentro do tubo de amplificação 3, 107, 108. A forma e amplitude da curva, incluindo o seu nível final, o gradiente durante a sua elevação e o tempo depois início que o gradiente da curva ocorre pode ser usado para determinar um resultado de teste pelo instrumento. O resultado de teste pode ser qualitativo tal como positivo se o ácido nucléico alvo for detectado e negativo não for ou pode ser quantitativo e expresso como um nível tal como partes por milhão ou por exemplo como a porcentagem do DNA dentro do DNA do material de amostra. Métodos de medição alternativos
[00225] Embora a descrição acima se refira às medições ópticas do poço de teste para determinar um resultado de teste, é reconhecido que sensores com métodos de medição alternativos possam operar no mesmo aparelho de teste de diagnóstico/instrumento e com o cartucho de teste de diagnósticos aqui descritos. Estes sensores podem usar as propriedades magnéticas, elétricas, atômicas ou físicas dos fluidos de teste para adquirir medições adequadas para determinar um resultado de teste.
72 / 77 Desnaturação por UV
[00226] O sistema de teste de diagnóstico também pode incorporar uma fonte de iluminação ultravioleta (UV) montada dentro da montagem do instrumento e operada sob o controle do controlador do instrumento 201 tal que a mesma possa ser ligada e desligada quando requerido. Esta fonte de luz pode ser um globo de UV ou um diodo emissor de luz (LED) UV adequados e pode incluir componentes ópticos tais como lentes para focar a UV dentro de uma região que seja apropriada para iluminar os conteúdos do tubo de amplificação com luz UV.
[00227] Esta iluminação pode ser uma fonte de iluminação fixa maior para iluminar a totalidade do(s) tubo(s) de amplificação 3, 107, 108 e o volume do cartucho como um todo, ou pode alternativamente ser implementada como uma fonte de luz localizada dentro do carro de digitalização para desnaturar os conteúdos amplificados dos poços de teste conforme o arranjo de digitalização passa pelos poços de teste 3, 107, 108. Em qualquer caso, esta iluminação UV é controlada tal que, na conclusão de um teste e antes do usuário ser alertado para remover o cartucho, a mesma pode ser ligada para desnaturar e esterilizar os conteúdos dos tubos de amplificação e cartucho, em particular para desnaturar qualquer material genético de ácido nucléico.
[00228] Este LED ultravioleta também pode incluir ópticas de focalização para focalizar a luz UV sobre cada poço de teste 3, 107, 108 (e durante a digitalização se digitalização é usada). O carro pode ser digitalizado como um movimento contínuo ou pode mover e parar em cada poço 3, 107,
108. Em cada método, iluminação UV de alta intensidade é aplicada a cada poço de teste em sequência. O nível de iluminação UV e a duração da exposição são configurados pelo controlador para garantir que os conteúdos de amplicon genético de DNA de cada poço sejam completamente desnaturados e não sofrerão outra amplificação no evento de que os conteúdos
73 / 77 do poço de teste fossem para ser liberados e introduzidos em um outro teste.
[00229] Esta desnaturação dos conteúdos do poço de teste também pode ser alcançada ou realçada operando-se o aquecedor do poço de teste em uma temperatura elevada tal como 100ºC durante um período de tempo suficiente para que o material genético nos poços de teste 3, 107, 108 fossem decompostos e desnaturados dentro da solução do poço de teste. A combinação de aumentar a temperatura dos poços de teste 3, 107, 108 usando o bloco aquecedor 62 sob controle do instrumento e aplicando iluminação UV pode ser usada para aumentar a eficiência da decomposição e destruição do material genético de ácido nucléico dentro de cada poço de teste 3, 107, 108.
[00230] Esta função tem a vantagem de que o risco de que os amplicons contidos dentro dos tubos de amplificação escapem para dentro do ambiente circundante do instrumento. Estes amplicons podem contaminar a adição de amostra de testes futuros e causar resultados falso positivos. Entretanto, a proteção primária contra a liberação de amplicons é o projeto vedado do cartucho tal que os amplicons são retidos dentro dos tubos de amplificação 3, 107, 108 na conclusão do teste. Entretanto, destruir os amplicons ou reduzir enormemente o seu número pelo uso de calor ou iluminação UV na conclusão do teste pode reduzir ainda mais este risco nos casos em que os selos do cartucho estejam comprometidos ou um cartucho usado seja danificado após sua remoção do instrumento. Funções Opcionais de Inserto de Dispensa de Fluido.
[00231] Conforme o inserto de dispensa é inserido dentro do corpo do cartucho 1, o fluido de amostra flui em torno do mesmo e através do furo de dispensa cilíndrico de extremidade aberta, como mostrado na Figura 36. A Figura 37 mostra o inserto de dispensa em uma vista isométrica. O inserto de dispensa 22 tem aletas com trajetórias de fluido passando pelo lado de fora do furo cilíndrico e também ranhuras para baixo apenas em uma porção do seu comprimento. Consequentemente, o fluido de amostra que entrou no furo
74 / 77 cilíndrico pode sair através das ranhuras quando o êmbolo de vedação não está totalmente pressionado para dentro da porção sólida ou ‘não raiada’ do inserto de dispensa 22. A Figura 36 mostra linhas de fluxo de fluido típicas. Esta descrição se aplica igualmente ao caso do inserto de dispensa em cartuchos de tubo de teste múltiplos tais como o inserto de dois tubos 122 mostrado na Figura 22. Função de Filtro
[00232] A Figura 38 mostra uma modalidade alternativa do inserto de dispensa 22 que permite que um filtro 322 seja incluído de modo que partículas ou inclusões no fluido de amostra possam ser removidas do fluido de amostra que entra na câmara de dispensa e é subsequentemente dispensado para dentro do reservatório ou tubo de teste acoplado. Nesta modalidade, o inserto de dispensa 22 tem a sua entrada pelo lado inferior ao furo cilíndrico 320 fechado por uma membrana 321. Conforme o inserto de dispensa 22 é pressionado dentro da montagem de cartucho depois que a amostra foi adicionada, todo do fluido de amostra deslocado deve fluir em torno do lado de fora do furo cilíndrico fechado 320 através das trajetórias de fluido providas. Dentro destas trajetórias de fluido, um ou mais componentes de filtração 322 são incluídos, como mostrado pelo sombreado na Figura 38. Estes filtros 322 podem ser um material tipo fibra tal como fibra de vidro comprimida ou uma espuma porosa ou material plástico poroso. O um ou mais componentes de filtração 322 podem ser um disco anular único de material ou várias partes menores colocadas dentro de cada uma das trajetórias de fluido disponíveis.
[00233] Os componentes de filtração 322 fisicamente capturam e contêm partículas ou material que de outro modo contaminariam o fluido de amostra a ser dispensado para dentro do reservatório de teste. Os componentes de filtração 322 também podem incorporar componentes biológicos ou químicos que se ligam aos componentes ou os capturam do
75 / 77 fluido de amostra que pode de outro modo inibir ou interferir com o processo de teste ou amplificação. O fluido que passou pelos componentes de filtração 322 encherão depois o furo de dispensa cilíndrico central 320 a partir do topo através das fendas dispensadoras conforme a peça é submergida no fluido de amostra. Este fluido de amostra filtrado está depois disponível dentro do furo dispensador 320 para vedação e dispensa subsequentes através das perfurações dentro do tubo de teste fixado. Concentração de Ácido Nucléico em Grânulos Magnéticos
[00234] A Figura 39 mostra uma configuração alternativa do inserto de dispensa 22 que permite que uma função de concentração de grânulo magnético seja efetuada dentro da montagem de cartucho. Nesta modalidade, o inserto de dispensa 22 não tem nenhuma trajetória de fluido passando pelo lado de fora do furo cilíndrico 320 e todo do fluido de amostra deslocado é feito fluir através do furo cilíndrico 320 conforme o inserto de dispensa 22 é inserido dentro do cartucho. Nesta modalidade, o fluido de preparação de amostra contém partículas magnéticas ou estas partículas podem ser adicionadas como um processo da etapa de teste. A superfície das partículas é revestida ou funcionalizada para ligar com e capturar pelo menos uma espécie alvo de interesse no material de amostra misturado dentro ou em solução dentro do fluido de amostra. Por exemplo, uma aplicação típica é ligar os materiais de ácido nucléico, DNA ou RNA sobre a cobertura superficial funcionalizada das partículas magnéticas conforme estas partículas se misturam dentro do fluido de amostra contido no volume de amostra 6 do cartucho 1. As partículas magnéticas podem ser muito pequenas, tipicamente dentro da faixa de 0,5 micrômetros a 10 micrômetros. Estas partículas magnéticas se misturam livremente e permanecem em suspensão dentro do fluido de amostra, ligando-se com e capturando moléculas alvo nas suas coberturas superficiais.
[00235] O inserto de dispensa ou câmara de dispensa são configurados
76 / 77 para terem um selo deslizante com a superfície interna do cartucho onde uma seção sólida do inserto 322 bloqueia a passagem de fluxo de fluido para o lado de fora do cilindro central, tal que todo do fluido na câmara de amostra seja forçado fluir através do furo cilíndrico central 320. As linhas de fluxo na Figura 39 mostram a trajetória de fluido típica. Nesta modalidade, o componente de inserto de dispensa incorpora um ou mais imãs permanentes 331 capturados dentro do plástico moldado do componente e localizado próximo à superfície interna do furo cilíndrico 320. Um arranjo típico é usar um imã anular 331 que circunde o lado de fora do furo 320, onde este imã 331 é introduzido dentro do processo de moldagem no momento que o inserto 22 é moldado por injeção e é capturado dentro da estrutura plástica da parte 22. Conforme o fluido de amostra flui através do cilindro de dispensa, em proximidade aos imãs internos 231, as partículas magnéticas são empurradas contra a parede lateral do cilindro de dispensa pelo campo magnético e retidas dentro do tubo de dispensa cilíndrico 320 junto com qualquer material de DNA ou RNA capturado.
[00236] Uma vez que o componente de dispensa foi pressionado dentro de um selo na base da câmara de amostra e os componentes de pistão engatam com e selam o topo da câmara, o componente de perfuração rompe através do material fino na base da câmara de amostra 1. Durante o processo de dispensa, os grânulos magnéticos magneticamente retidos contra as parede internas do cilindro são varridas do furo 320 pelo êmbolo vedado com anel O e são assim misturadas de volta dentro do fluido de amostra aprisionado dentro do cilindro de dispensa e todo deste fluido e grânulos magnéticos são dispensados para dentro do tubo de teste acoplado pelo movimento progressivo do pistão dentro do tubo de amplificação. Isto concentra o material de DNA ou RNA dentro do fluido de amostra e o libera dentro dos tubos de amplificação 107, 108. Isto tem a vantagem de concentrar e purificar o material de ácido nucléico de DNA ou RNA extraído da amostra resultando
77 / 77 em um teste de diagnóstico mais sensível e mais confiável. Os reagentes dentro do tubo de teste 3, 107, 108, uma vez eluídos pelo fluido de amostra adicionado, podem reagir com as moléculas seletivamente ligadas às partículas magnéticas. Os reagentes do tubo de teste podem conter sais ou produtos químicos ou um pH adequado para a liberação do material capturado da superfície das partículas magnéticas dentro dos tubos de teste 3, 107, 108 para ajudar com a reação e detecção destes componentes. Final do teste
[00237] Uma vez que um teste tenha sido concluído e o pós-tratamento com calor ou ultravioleta opcional tenha sido concluído, o controlador do instrumento 201 pode alertar o usuário na interface do usuário do visor de LCD do painel frontal, que o teste foi concluído e que o cartucho pode ser removido do instrumento.
[00238] A remoção do cartucho pode ser detectada pelo controlador do instrumento 201 usando feedback do sensor de detecção de cartucho 223 e o sensor de posição fechada da tampa 222. Uma vez que o cartucho é detectado como removido, o controlador do instrumento 201 pode completar auto teste e ajustar a sequência de controle para o início de um novo teste e alertar o usuário que o instrumento está pronto e para inserir um cartucho para rodar um teste.
[00239] As modalidades aqui descritas são providas apenas por via de exemplo não limitante e muitas modificações das modalidades descritas estarão evidentes para aqueles de experiência comum na técnica sem divergir do escopo da invenção.
[00240] A referência neste relatório descritivo a qualquer publicação anterior (ou informação derivada da mesma) ou a qualquer assunto que seja conhecido, não é e nem deve ser considerado como um reconhecimento ou admissão ou qualquer forma de sugestão que esta publicação anterior (ou informação derivado da mesma) ou assunto conhecido forme parte do conhecimento geral comum no campo de empenho ao qual este relatório descritivo se refere.

Claims (30)

1 / 10 REIVINDICAÇÕES
1. Sistema de teste de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que inclui: uma montagem de teste de diagnóstico; e um aparelho de teste de diagnóstico para receber e interagir com a montagem de teste de diagnóstico para realizar um teste de diagnóstico em uma amostra biológica ou ambiental nele; em que a montagem de teste de diagnóstico inclui: um reservatório de preparação de amostra para receber a amostra biológica ou ambiental dentro de um fluido de preparação de amostra contido no reservatório de preparação de amostra para a preparação de um fluido de amostra disso, o reservatório de preparação de amostra inicialmente provendo um volume aberto livre de obstruções tal que um cotonete carreando a amostra biológica ou ambiental possa ser usado para agitar o fluido de preparação de amostra no reservatório de preparação de amostra e lavar a amostra biológica ou ambiental do cotonete dentro do fluido de preparação de amostra; um mecanismo de dispensa de amostra para a inserção dentro do reservatório de preparação de amostra depois da recepção da amostra biológica ou ambiental nele; um fechamento para vedar o reservatório de preparação de amostra depois da recepção da amostra biológica ou ambiental e o mecanismo de dispensa de amostra nele; pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico acoplado ao reservatório de preparação de amostra; e pelo menos uma vedação entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para impedir movimento de fluido entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico;
2 / 10 em que o mecanismo de dispensa de amostra é operável para romper a pelo menos uma vedação para permitir que o fluido de amostra entre no pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico a partir do reservatório de preparação de amostra e dispensar um subvolume predeterminado do fluido de amostra a partir do reservatório de preparação de amostra para dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para teste e detecção de diagnóstico nele enquanto impede movimento de fluido adicional entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
2. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de dispensa de amostra é fixado ao fechamento de modo que um ato de aplicar o fechamento ao reservatório de preparação de amostra também efetua a inserção do mecanismo de dispensa de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra.
3. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma única ação por um usuário faz com que o mecanismo de dispensa de amostra rompa a pelo menos uma vedação e dispense o fluido de amostra do reservatório de preparação de amostra dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
4. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a ação única pelo usuário é uma ação de rosqueamento sustentada aplicada ao fechamento relativo ao reservatório de preparação de amostra, em que a ação de rosqueamento causa a operação do mecanismo de dispensa de amostra e veda o reservatório de preparação de amostra.
5. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o aparelho de
3 / 10 teste de diagnóstico é configurado para determinar a conclusão da operação do mecanismo de dispensa de amostra e, responsivo à determinação, para prosseguir com o teste de diagnóstico dos conteúdos do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
6. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o fechamento inclui uma rosca e o aparelho de teste de diagnóstico inclui pelo menos um componente sensor configurado para determinar um grau de rotação e/ou progressão de rosca do fechamento e o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para induzir um usuário para completar a operação de fechamento se o pelo menos um componente sensor determinou que a operação de fechamento está incompleta; e progredir automaticamente para um estado seguinte de teste de diagnóstico se a operação de fechamento foi determinada como estando completa.
7. Montagem de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que inclui um segundo fechamento que veda o fluido de preparação de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra antes do uso e que é removido para permitir que a amostra biológica ou ambiental seja adicionada ao fluido de preparação de amostra contido no reservatório de preparação de amostra.
8. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de dispensa de amostra inclui: uma câmara de dispensa que forma uma segunda vedação contra a pelo menos uma vedação para aprisionar o subvolume predeterminado do fluido de amostra dentro da câmara de dispensa; um membro de perfuração que rompe a pelo menos uma vedação pela formação de pelo menos uma abertura nele; e um mecanismo de êmbolo que forma uma vedação deslizante
4 / 10 com uma superfície interna da câmara de dispensa, em que a vedação deslizante é configurado para deslizar ao longo da superfície interna da câmara de dispensa para dispensar o subvolume predeterminado do fluido de amostra disso, através da pelo menos uma abertura e dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
9. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a câmara de dispensa inclui uma superfície externa tendo traços de localização de câmara mutuamente espaçados estendendo-se disso e configurados para alinhar a câmara de dispensa centralmente a partir do reservatório de preparação de amostra e permitir que fluido de amostra flua entre os traços de localização de câmara conforme o mecanismo de dispensa de amostra é inserido dentro do reservatório de preparação de amostra.
10. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de dispensa de amostra é configurado de modo que uma única ação realizada por um usuário faz com que dois estágios de operação do mecanismo de dispensa de amostra, incluindo um primeiro estágio de operação que aprisiona o subvolume predeterminado do fluido de amostra dentro da câmara de dispensa e um segundo estágio de operação em que o fluido de amostra é dispensado a partir da câmara de dispensa.
11. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de dispensa de amostra inclui um componente de sequenciamento de força que é reconfigurado ou quebrado para permitir o segundo estágio de operação.
12. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o componente de sequenciamento de força inclui um componente rompível que é configurado para romper para permitir que a operação do mecanismo de dispensa de
5 / 10 amostra prossiga do primeiro estágio de operação para o segundo estágio de operação.
13. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o componente de sequenciamento de força inclui um espaçador colapsável ou esmagável que pressiona contra e faz com que a câmara de dispensa vede no primeiro estágio de operação e no segundo estágio de operação é colapsado ou esmagado para manter a vedação, realizar a operação de perfuração e operar o êmbolo para dispensar o fluido de amostra a partir da câmara de dispensa.
14. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que a câmara de dispensa é inicialmente configurada de modo que, conforme o mecanismo de dispensa de amostra é inserido dentro do reservatório de preparação de amostra, o fluido de amostra é forçado para fluir em torno do lado de fora da câmara de dispensa antes que o mesmo possa fluir para dentro da câmara de dispensa, em que o fluido que flui em torno do lado de fora da câmara de dispensa é causado fluir através de um filtro ou material de enchimento poroso que retém e/ou aprisiona partículas e fragmento e/ou incorpora componentes biológicos ou químicos que se ligam a ou capturam componentes do fluido de amostra que possam de outro modo inibir ou interferir com o teste de diagnóstico ou processo de amplificação.
15. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que o reservatório de preparação de amostra inclui partículas magnéticas com o fluido de preparação de amostra, a superfície das partículas magnéticas sendo revestidas ou funcionalizadas para ligar com e capturar pelo menos uma espécie alvo predeterminada da amostra biológica ou ambiental quando as partículas magnéticas são misturadas dentro do fluido de amostra e o mecanismo de dispensa de amostra é configurado de modo que, conforme o
6 / 10 mecanismo de dispensa de amostra é inserido dentro do reservatório de preparação de amostra, o fluido de amostra é forçado a fluir através da câmara de dispensa e um ou mais imãs estão localizados em proximidade imediata com a superfície interna da câmara de dispensa de modo que as partículas magnéticas contidas dentro do fluido de amostra e tendo a espécie alvo capturada são atraídas para e mantidas contra a superfície interna da câmara de dispensa, tal que o mecanismo de êmbolo que forma uma vedação deslizante com a superfície interna da câmara de dispensa colete as partículas magnéticas mantidas contra a superfície interna e as dispense dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para prover uma concentração aumentada da pelo menos uma espécie alvo predeterminada no subvolume predeterminado do fluido de amostra dispensado dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
16. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um do fechamento e do reservatório de preparação de amostra é configurado para impedir ou pelo menos inibir a remoção do fechamento do reservatório de preparação de amostra de modo que os fluídos permaneçam vedados dentro da montagem de teste de diagnóstico.
17. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico inclui pelo menos dois reservatórios de teste de diagnóstico.
18. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o reservatório de teste de diagnósticos contém diferentes reagentes de teste de diagnóstico e/ou detecção selecionados para realizar os respectivos testes de diagnóstico diferentes e/ou para detectar as respectivas entidades alvos diferentes.
19. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer
7 / 10 uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o reservatório de preparação de amostra contém reagentes para a preparação de amostra incluindo lise celular e pelo menos um dos reservatórios de teste de diagnóstico é configurado para a amplificação de ácido nucléico e ligação de marcadores específicos para permitir uma saída óptica que pode ser medida pelo aparelho de teste de diagnóstico para determinar um resultado de teste de diagnóstico correspondente.
20. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico inclui pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico que é transparente para permitir que um resultado de teste correspondente seja observado visualmente como uma mudança na emissão e/ou absorção em um ou mais comprimentos de onda e/ou turbidez específicos dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico correspondente.
21. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que pelo menos um do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico é transparente e o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para determinar um resultado de teste no pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico pela detecção ou medição de uma mudança na emissão e/ou absorção em um ou mais comprimentos de onda dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico, em que o aparelho de teste de diagnóstico é opcionalmente configurado para iluminar o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para realçar ou produzir a detecção ou medição.
22. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o aparelho de teste de diagnóstico e a montagem de teste de diagnóstico incluem respectivos traços de alinhamento e suporte configurados para o engate mútuo para
8 / 10 garantir que a montagem de teste de diagnóstico seja recebido em um alinhamento predeterminado com respeito ao aparelho de teste de diagnóstico e manter o alinhamento quando o fechamento é aplicado ao reservatório de preparação de amostra depois da recepção da amostra biológica ou ambiental e o mecanismo de dispensa de amostra nele.
23. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o aparelho de teste de diagnóstico inclui um ou mais componentes configurados para aplicar um campo magnético variável e/ou móvel para a montagem de teste de diagnóstico para causar movimentos correspondentes das partículas magnéticas dentro do pelo menos um do reservatório de preparação de amostra e do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico e causar deste modo a mistura da amostra e fluido de preparação de amostra nele.
24. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o aparelho de teste de diagnóstico e a montagem de teste de diagnóstico são configurados para permitir que o aparelho de teste de diagnóstico controle independentemente as temperaturas do reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
25. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o aparelho de teste de diagnóstico inclui um ou mais sensores de imagem configurados para gerar os dados de imagem representando uma ou mais imagens de pelo menos uma porção da montagem de teste de diagnóstico, em que as imagens representam pelo menos um de: (i) distribuição de fluido dentro do pelo menos um do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico e do reservatório de preparação de amostra e o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para processar os dados de imagem para monitorar a dispensa do fluido de amostra e
9 / 10 prosseguir para um estado seguinte de teste de diagnóstico se o monitoramento determinou que a dispensa está completa; e (ii) um volume de fluido contido dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico e o aparelho de teste de diagnóstico é configurado para processar os dados de imagem para permitir a compensação quanto às tolerâncias de volume no fluido dispensado para permitir quanto à determinação do resultado de teste melhorado.
26. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o aparelho de teste de diagnóstico inclui um ou mais sensores ópticos montados para um estágio de translação sob o controle de um controlador do aparelho de teste de diagnóstico de modo que os sensores ópticos possam medir a absorção óptica ou emissão ou fluorescência de um ou mais reservatórios de teste de diagnósticos selecionados da montagem de teste de diagnóstico.
27. Sistema de teste de diagnóstico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o aparelho de teste de diagnóstico inclui pelo menos uma fonte de emissão de ultravioleta (UV) para desnaturar amostras contidas dentro da montagem de teste de diagnóstico seguindo um teste de diagnóstico para inibir a contaminação no evento de fluido de amostra escapar da montagem de teste de diagnóstico.
28. Método de teste de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que inclui as etapas de: colocar uma montagem de teste de diagnóstico dentro de um orifício de recepção de um aparelho de teste de diagnóstico configurado para realizar um teste de diagnóstico em uma amostra biológica ou ambiental nele; adicionar a amostra biológica ou ambiental dentro de um fluido de preparação de amostra contido em um reservatório de preparação de amostra da montagem de teste de diagnóstico para a preparação de um fluido de amostra nele;
10 / 10 depois da etapa de adição, inserir um mecanismo de dispensa de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra e aplicar um fechamento neste; operar o mecanismo de dispensa de amostra para romper pelo menos uma vedação entre o reservatório de preparação de amostra e pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico do aparelho de teste de diagnóstico para permitir que o fluido de amostra entre no pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico do reservatório de preparação de amostra e dispensar um subvolume predeterminado do fluido de amostra do reservatório de preparação de amostra dentro do pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico para teste e detecção de diagnóstico nele enquanto impede movimento de fluido adicional entre o reservatório de preparação de amostra e o pelo menos um reservatório de teste de diagnóstico.
29. Método de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o mecanismo de dispensa de amostra é fixado ao fechamento de modo que a aplicação do fechamento ao reservatório de preparação de amostra também efetua a inserção do mecanismo de dispensa de amostra dentro do reservatório de preparação de amostra.
30. Método de teste de diagnóstico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que uma única ação por um usuário causa a operação do mecanismo de dispensa de amostra, a ação única sendo uma ação de rosqueamento sustentado aplicada ao fechamento relativo ao reservatório de preparação de amostra, em que a ação de rosqueamento causa a operação do mecanismo de dispensa de amostra e veda o reservatório de preparação de amostra.
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