KR20220003138A - 샘플 내 타겟 핵산 검출 방법 - Google Patents

샘플 내 타겟 핵산 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 열적으로 서로 독립된 복수의 반응 영역을 포함하는 핵산 반응 검출 장치를 이용한 샘플 내 타겟 핵산 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 상이한 프로토콜에 의하여 수행되는 2 이상의 핵산 반응을 동시에 수행하고, 방출되는 광학신호를 독립적으로 측정하여 타겟 핵산을 검출할 수 있다.

Description

샘플 내 타겟 핵산 검출 방법
본 발명은 핵산 반응 검출 장치를 이용한 샘플 내 타겟 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2019년 6월 28일에 대한민국 특허청에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0078284호, 2019년 5월 31일에 대한민국 특허청에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0064472호 및 2019년 12월 6일에 대한민국 특허청에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0162094호의 우선권을 주장하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
중합효소 연쇄반응(PCR)으로 공지된 가장 많이 사용되는 핵산 증폭 반응은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).
전형적인 PCR 장치에서 반응용기를 열블록에 위치시키고, 열블록의 온도를 소정의 시퀀스에 따라 변화시켜 반응용기 내의 증폭반응을 일어나게 한다. DNA의 변성은 약 95℃에서 진행되고, 프라이머의 어닐링 및 연장은 95℃보다 낮은 온도인 55℃내지 75℃에서 진행된다. 이때 변성, 어닐링, 연장의 각 단계를 위한 온도 및 반응 시간은 각 샘플, 분석 대상 핵산 및 분석을 위하여 사용되는 프라이머, 프로브 등 올리고뉴클레오타이드의 서열 등에 따라 각각 다르게 설정하여야 한다.
실시간 PCR(Real time PCR)은 샘플에서 타겟 핵산을 실시간으로 검출하기 위한 PCR 기반 기술이다. 특정 타겟 핵산을 검출하기 위하여, PCR 반응 시 타겟 핵산의 양에 비례하여 검출 가능한 형광신호를 방출하는 신호발생수단을 이용한다. 검출 가능한 형광신호의 방출은, 예를 들어 이중 나선 DNA에 결합하면 형광신호를 방출하는 시약(intercalator)을 사용하거나, 형광신호체 및 이의 형광 방출을 억제하는 quencher 분자를 모두 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법이 있다. 타겟 핵산의 양에 비례하는 형광신호가 실시간 PCR을 통하여 각 사이클 마다 검출되며, 형광신호를 측정하여, 사이클 대비 검출되는 형광신호의 세기를 표시한 증폭곡선(amplification curve) 또는 증폭 프로파일 곡선(amplification profile curve)을 얻게 된다.
실시간 PCR 장치는 핵산 반응이 진행되는 동안 실시간으로 핵산 반응에 의한 신호를 측정할 수 있다. 실시간 PCR장치는 일반적으로 반응물에 광을 조사하고, 이로 인하여 발생하는 형광을 측정하는 방법으로 반응용기 내 핵산을 검출한다. 이를 위하여 실시간 PCR 장치는 샘플에 여기광을 조사하는 광원과 샘플로부터 방출광을 수신할 수 있는 검출기를 포함한다.
기존의 핵산 반응 검출 장치는 하나의 기기를 사용하여 복수의 샘플에 대한 핵산 반응을 분석할 수 있다., 그러나, 상기 샘플들은 모두 동일한 조건에서 반응이 진행되며, 동일한 시간에 동일한 파장의 광을 조사하도록 구성되어 있으므로, 복수의 샘플의 동일한 표지에 대한 동시 분석만이 가능하였다. 따라서 소량의 다양한 종류의 샘플을 분석하는 경우 샘플들을 종류별로 각각 분석해야 하므로, 전체적인 작업시간이 증가하고, 비용이 증가하는 문제가 있다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 하나의 기기에 열적으로 독립된 복수의 열블록을 장착하여 서로 다른 thermal protocol에 의하여 핵산 반응을 진행할 수 있는 장치가 개발되었다. 하지만, 기존에 개발된 열적으로 독립된 복수의 열블록을 포함하는 핵산 반응 검출 장치는 주로 실시간 광학적 측정 없이 단순히 핵산 증폭을 위한 장치이거나, 열적으로 독립된 열블록별로 서로 다른 thermal protocol에 의한 핵산 반응을 수행하지만, 상기 복수의 열블록을 하나의 광학 분석모듈로 분석하는 장치이다. 이러한 장치는 특히 열적으로 독립된 열블록에 각각 수용된 샘플로부터 동시에 서로 다른 파장영역의 광학신호를 측정할 수 없다. 따라서, 서로 상이한 thermal protocol에 의하여 진행되기 때문에 광학신호 측정 시기가 서로 독립적으로 결정되는 2 이상의 핵산 반응 분석을 이러한 장치를 이용하여 동시에 진행할 수 없다.
따라서, 단일 기기에서 서로 다른 핵산 반응을 동시에 수행하고, 광학적 분석도 독립적으로 실시간으로 이루어질 수 있는 장치의 개발 및 이를 이용한 핵산 검출 방법의 개발이 필요하다.
이러한 배경에서, 본 발명자들은 열적으로 독립된 2 이상의 반응영역을 포함하여, 상이한 프로토콜에 기초한 2 이상의 핵산 반응을 단일 장치에서 동시에 수행할 수 있는 PCR 장치를 위한 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 새로운 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈 및 컨트롤러를 포함하고, 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도는 서로 독립적인 프로토콜(protocol)에 따라 조절되는 핵산 반응 검출 장치의 제1반응영역에 제1샘플세트를 위치시키고, 제2반응영역에 제2샘플세트를 위치시켜 핵산 반응을 수행하고, 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 광학신호를 동기적으로 측정하며, 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호의 파장영역은 서로 상이하며, 상기 측정된 광학신호들을 분석하면, 각 샘플 세트에 포함된 샘플 내 타겟 핵산을 검출할 수 있음을 규명하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 샘플 내 타겟 핵산 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제1반응영역 내 샘플로부터 발생한 제1파장영역의 광학신호 및 제2반응영역 내 샘플로부터 발생한 상기 제1파장영역과 상이한 제2파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정할 수 있는 핵산 반응 검출 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 구현예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 샘플 내 타겟 핵산 검출 방법을 제공한다:
(a) 핵산 반응 검출 장치의 제1반응영역에 제1샘플세트를 위치시키고, 제2반응영역에 제2샘플세트를 위치시키고, 핵산반응을 수행하는 단계; 상기 핵산 반응 검출 장치는 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈 및 컨트롤러를 포함하고; 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도는 서로 독립적인 프로토콜(protocol)에 따라 조절되고; (b) 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 측정단계; 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터의 광학신호는 동기적으로 측정되며; 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호의 파장영역은 서로 상이하며; 및 (c) 측정된 광학신호들을 분석하여 제1샘플세트 및 제2샘플세트에 포함된 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈; 상기 샘플 반응 모듈 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈; 및 상기 샘플 반응 모듈 및 광학모듈에 전기적으로 연결된 1 이상의 컨트롤러를 포함하고; 상기 광학모듈은 제1반응영역 내 샘플로부터 제1파장영역의 광학신호 및 제2반응영역 내 샘플로부터 상기 제1파장영역과 상이한 제2파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정할 수 있도록 형성되고; 상기 컨트롤러는 제1반응영역 및 제2반응영역의 온도를 각각 독립적으로 조절하고, 제1반응영역 내 샘플의 광학신호 측정 및 제2반응영역 내 샘플의 광학신호 측정을 독립적으로 조절하도록 형성되는 핵산 반응 검출 장치를 제공한다.
본 발명의 방법 및 장치는 상이한 프로토콜에 의하여 수행되는 2 이상의 핵산 반응을 동시에 수행하고, 방출되는 광학신호를 독립적으로 측정하여 타겟 핵산을 검출할 수 있다. 따라서 소량의 다양한 종류의 샘플을 동시에 분석할 수 있으므로, 샘플 분석 시간 및 비용 측면에서 효과적이다.
광학모듈이 이동수단에 의하여 이동하면서 광학신호를 측정하는 경우, 측정에 오랜 시간이 소요되며, 개별 샘플 간 측정 시기가 달라지게 된다. 그러나, 본 발명의 장치 및 방법은 서로 다른 반응영역에서 핵산반응이 진행된 샘플 세트에 포함된 복수의 샘플에서 발생하는 서로 다른 파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정하는 것이 가능하므로 광학신호 측정을 순차적으로만 하여야 하는 분석장비에 비하여 정확하고 효율적인 타겟 핵산 검출이 가능하다.
본 발명의 방법 및 장치는 하나의 샘플에서 2 이상의 타겟 핵산을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 장치는 서로 다른 타겟 핵산을 검출하기 위한 2 이상의 샘플세트로부터 각각 멀티플렉스 타겟 핵산 검출이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 반응 검출 장치이다.
도 2는 반응영역별로 별개의 광원을 구비한 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 반응 검출 장치의 구조를 설명하기 위한 모식도이다.
도 3은 복수의 반응영역이 광원을 공유하는 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 반응 검출 장치의 구조를 설명하기 위한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 반응영역별로 별개의 광원을 구비하는 구조를 설명하기 위한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 2 이상의 반응영역이 광원을 공유하는 구조를 설명하기 위한 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 반응 검출 장치의 복수의 발광소자를 포함하는 광원을 이용하는 광학모듈 및 샘플 반응 모듈의 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 반응 검출 장치의 광경로를 표시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 컨트롤러가 핵산 반응 검출 장치의 다른 구성에 전기적으로 연결되는 구조를 표시한 것이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
I. 샘플 내 타겟 핵산 검출 방법
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 샘플 내 타겟 핵산 검출 방법을 제공한다:
(a) 핵산 반응 검출 장치의 제1반응영역에 제1샘플세트를 위치시키고, 제2반응영역에 제2샘플세트를 위치시키고, 핵산반응을 수행하는 단계; 상기 핵산 반응 검출 장치는 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈 및 컨트롤러를 포함하고; 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도는 서로 독립적인 프로토콜(protocol)에 따라 조절되고;
(b) 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 측정단계; 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터의 광학신호는 동기적으로 측정되며; 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호의 파장영역은 서로 상이하며; 및
(c) 측정된 광학신호들을 분석하여 제1샘플세트 및 제2샘플세트에 포함된 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 단계.
본 발명자들은 구역PCR 장치에서 사용될 수 있는 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 새로운 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈 및 컨트롤러를 포함하고, 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도는 서로 독립적인 프로토콜(protocol)에 따라 조절되는 핵산 반응 검출 장치의 제1반응영역에 제1샘플세트를 위치시키고, 제2반응영역에 제2샘플세트를 위치시켜 핵산 반응을 수행하고, 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 서로 파장영역이 서로 상이한 광학신호를 동기적으로 측정하고, 상기 측정된 광학신호들을 분석하면 각 샘플 세트에 포함된 샘플 내 타겟 핵산을 검출할 수 있음을 규명하였다.
상기 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a) : 핵산 반응
본 발명에 따르면, 핵산 반응 검출 장치의 제1반응영역에 제1샘플세트를 위치시키고, 제2반응영역에 제2샘플세트를 위치시키고, 핵산반응을 수행한다.
일 실시예에 따른 핵산 반응 검출 장치란 핵산 반응을 이용하여 타겟 핵산을 검출하는 장치를 말한다. 특히 상기 핵산 반응 검출 장치는 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈 및 컨트롤러를 포함하고; 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도는 서로 독립적인 프로토콜(protocol)에 따라 조절될 수 있는 장치이다. 핵산 반응 검출 장치에 관하여는 이하 Section II에서 상세히 설명한다.
본 명세서에서 용어 샘플은 생물학적 샘플 (예를 들어, 세포, 조직 및 생물학적 소스에서 나온 유체) 및 비생물학적 샘플 (예를 들어, 음식, 물 및 토양)을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액 (예를 들어 전혈, 혈장 및 혈청), 림프, 골수액, 타액, 객담(sputum), 스왑(swab), 흡인액(aspiration), 젖, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 기관지 세척액, 복수 및 양막액일 수 있다. 상기 샘플은 핵산 추출과정을 거칠 수 있다. 추출된 핵산이 RNA인 경우, 상기 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사 과정을 추가로 거칠 수 있다(Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)).
상기 핵산 반응은 샘플 내 특정 서열의 핵산의 존재여부 또는 그 양에 의존적으로 신호를 발생시키는 일련의 물리적, 화학적 반응을 의미한다. 상기 핵산 반응은 샘플 내 특정 서열의 핵산과 다른 핵산 또는 물질과의 결합, 상기 샘플 내 특정 서열의 핵산의 복제, 절단 또는 분해를 포함하는 반응일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 반응은 샘플 내 타겟 핵산의 존재/부존재 또는 양에 의존적으로 신호를 발생시킬 수 있는 반응인 신호-발생 반응일 수 있다. 이러한 신호-발생 반응은 PCR, 실시간 PCR, 마이크로어레이와 같은 유전적 분석 과정일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 반응은 PCR 또는 실시간 PCR일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호-발생 반응은 신호의 증폭 반응일 수 있다. 상기 증폭 반응은 신호를 증가 또는 감소 시키는 반응을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 증폭 반응은 신호-발생 수단을 이용한 타겟 핵산의 존재에 의존적인 신호의 증가(또는 증폭)을 의미한다. 상기 증폭 반응은 타겟 핵산의 증폭을 동반하거나 동반하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 반응은 타겟 핵산 분자의 증폭을 동반하거나 동반하지 않고 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 핵산 반응은 타겟 분석물질의 증폭을 동반하여 수행되는 신호 증폭 반응일 수 있다.
신호-발생 반응은 신호 변화를 동반한다. 본 명세서에서 용어 신호는 측정 가능한 아웃풋을 의미한다.
신호 변화는 타겟 핵산의 존재/부존재 또는 그 양을 정성적 또는 정량적으로 알려주는 지시자 역할을 한다. 이러한 지시자의 예시는 형광 세기, 발광 세기, 화학발광 세기, 생발광 세기, 인광세기를 포함한다. 가장 넓게 사용되는 지시자는 형광 세기이다. 상기 신호 변화는 신호의 증가뿐만 아니라 신호의 감소를 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서 신호는 광학신호(optical signal)을 말한다. 상기 광학신호(optical signal)는 발광(luminescence), 인광(phosphorescence), 화학발광(chemiluminescence), 형광(fluorescence), 편광형광(polarized fluorescence) 또는 다른 유색 신호(colored signal)일 수 있다.
상기 광학신호를 발생시키기 위하여 신호발생수단이 샘플에 포함될 수 있다. 다양한 신호발생수단이 알려져 있다. 신호발생수단은 표지 자체 또는 표지가 연결된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함한다. 상기 표지는 intercalating dye 처럼, 표지 화합물 자체가 다른 물질과의 결합되지 아니한 형태로 사용될 수 있다. 또는 단일 표지 또는 공여 분자 (donor molecule) 및 수용 분자 (acceptor molecule)을 포함하는 상호작용적인 이중 표지가 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 결합된 형태로 사용될 수 있다. 상기 신호발생수단은 신호를 발생시키기 위하여 핵산 절단 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함할 수 있다 (예를 들어, 5'핵산 절단 활성을 갖는 효소 또는 3' 핵산 절단 활성을 갖는 효소).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 신호발생수단에 사용되는 표지는 형광 표지, 보다 구체적으로 형광 단일표지 또는 공여 분자(donor molecule) 및 수용 분자(acceptor molecule)를 포함하는 상호작용적인 이중표지(예컨대, 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자 포함)를 포함할 수 있다. 상기 형광표지 또는 형광 리포터 분자는 이에 제한되지 아니하나, FAM™, TET™, VIC™, JOE™, HEX™, CY3, TAMRA™, ROX™, Texas Red, CY5, CY5.5 및 Quasar 705를 포함한다.
핵산 반응을 이용하여 타겟 핵산의 존재를 나타내는 광학적 신호를 발생시키는 다양한 방법이 알려져 있다. 대표적인 예는 다음을 포함한다: TaqMan™ 프로브 방법(미국특허 제5,210,015호), 분자 비콘 방법(Tyagi 등, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), 스콜피온(Scorpion) 방법(Whitcombe 등, Nature Biotechnology 17:804-807(1999)), 선라이즈(Sunrise 또는 Amplifluor) 방법(Nazarenko 등, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521(1997), 및 미국특허 제6,117,635호), 럭스(Lux) 방법(미국특허 제7,537,886호), CPT(Duck P, 등. Biotechniques, 9:142-148(1990)), LNA 방법 (미국특허 제6,977,295호), 플렉서(Plexor) 방법(Sherrill CB, 등, Journal of the American Chemical Society, 126:4550-4556(2004)), Hybeacons™ (D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363-374 및 미국특허 제7,348,141호), 이중표지된 자가-퀀칭된 프로브(Dual-labeled, self-quenched probe; 미국특허 제5,876,930호), 혼성화 프로브(Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148), PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 2012/096523), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(PCT/KR2013/012312) 및 CER 방법(WO 2011/037306).
일 실시예에 따른 핵산 반응 검출 장치는 특정 염기 서열을 갖는 핵산을 증폭하는 핵산 증폭 반응을 수행하는 장치일 수 있다. 타겟 핵산은 다양한 방법으로 증폭될 수 있다. 예를 들어, 타겟 핵산분자의 증폭을 위한 방법으로는 중합효소연쇄반응(the polymerase chain reaction (PCR)), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction (LCR)) (미국특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification (SDA)) (Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1):1-6 (1993)), 전사 매개 증폭(transcription-mediated amplification) (Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995)), 염기순서기반증폭(nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)) (Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991)), 롤링서클 증폭(rolling circle amplification, RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1):75-99 (1999); Hatch et al., Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999)) 및 Q-beta 레플리카제(Q-Beta Replicase) (Lizardi et al., BiolTechnology 6:1197 (1988)) 등이 있다.
특히, 일 실시예에 따른 핵산 반응 검출 장치는 온도의 변화를 수반하면서 핵산 증폭 반응을 수행하는 장치일 수 있다. 예를 들어, 특정 염기 서열을 갖는 DNA(deoxyribonucleic acid)를 증폭하기 위해 핵산 증폭 장치는 변성 단계(denaturing step), 어닐링 단계(annealing step), 연장 (혹은 증폭) 단계(extension step)를 포함할 수 있다.
일 실시예에 따른 핵산 반응 검출 장치는 온도의 변화를 수반하면서 타겟 핵산 증폭 반응 및 타겟 핵산의 존재에 의존적으로 광학적 신호를 발생시키는 반응을 수행하고 발생되는 광학적 신호를 검출하는 장치일 수 있다.
핵산 반응 검출 장치는 샘플 반응 모듈을 포함한다. 상기 샘플 반응 모듈은 분석 대상인 샘플을 수용하여 핵산 반응을 진행하게 하는 모듈이다. 상기 샘플 반응 모듈은 샘플 또는 샘플을 포함하는 반응용기를 수용하는 반응영역을 포함한다. 상기 샘플 반응 모듈에는 복수의 샘플이 수용될 수 있다. 본 발명의 샘플 반응 모듈은 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 샘플 반응 모듈은 제1반응영역 및 제2반응영역외에 추가적인 반응영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 샘플 반응 모듈은 제3반응영역 및 제4반응영역을 추가로 포함할 수 있다. 상기 반응영역들은 각각 열적으로 독립적으로 조절 될 수 있다. 반응영역들이 열적으로 독립적으로 조절된다는 것은 각 반응영역의 온도가 각각 개별적으로 조절될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 제1시간에 제1반응영역이 94℃를 유지하는 동안, 제2반응영역은 94℃에서 60℃로 냉각이 진행되거나, 60℃에서 75℃로 가열이 진행되거나, 특정 온도를 유지할 수 있는 것을 의미한다. 이로서, 상기 핵산 반응 검출 장치의 각 반응영역마다 별개의 핵산 반응을 수행할 수 있다. 상기 샘플 반응 모듈 내에 포함되는 반응영역의 수는 특별히 제한되지 아니하나, 2 내지 24개일 수 있다. 예를 들어, 샘플 반응 모듈 내의 반응영역의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24개 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 반응영역들은 열적으로 독립되어 있다. 다시 말하여, 하나의 반응영역에서 다른 반응영역으로 열이 이동하지 않는다. 예를 들어, 반응영역들 사이에는 단열물질 또는 에어 갭이 존재할 수 있다.
핵산 반응단계에서 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도는 서로 독립적인 프로토콜(protocol)에 따라 조절된다.
상기 프로토콜은 단위 작업(unit operation)을 수행하기 위한 일련의 지시(set of instructions)를 의미한다. 상기 단위 작업은 시간에 따른 온도 조절 작업(operation) 및 신호측정 작업을 포함하며, 상기 프로토콜은 프로토콜 내 다양한 단위작업들을 수행하는 순서 및 타이밍에 관한 정보를 포함한다.
본 발명의 방법은 제1샘플세트와 제2샘플세트를 각각 독립적인 프로토콜에 따라 반응시키는 것을 특징으로 한다. 샘플세트는 1 이상의 샘플을 포함하는 샘플의 집합이다. 하나의 샘플세트에 포함된 샘플들은 동일한 프로토콜에 따라 핵산 반응 및 검출을 수행한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 제1샘플세트는 복수의 샘플을 포함할 수 있다.
상기 제1샘플세트와 제2샘플세트는 서로 상이한 타겟 핵산을 검출하기 위한 샘플이다. 따라서, 상기 제1샘플세트와 제2샘플세트는 효율적인 핵산반응 및 검출을 위한 최적의 프로토콜이 서로 상이하다. 본 발명의 샘플 반응 모듈은 각 영역별로 온도를 독립적으로 제어할 수 있으며, 이를 통하여 제1샘플세트와 제2샘플세트를 각각 독립적인 프로토콜에 따라 반응시키는 것이 가능하다.
단계 (b) : 광학 신호 측정
측정단계에서는 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 광학신호를 측정한다. 광학 신호 측정은 샘플내 타겟 핵산의 존재 또는 그 양에 의존적으로 발생하는 광학신호(optical signal)를 측정하는 것을 말한다.
본 발명의 방법에서 상기 핵산 반응은 여러 번 반복되어 진행될 수 있다. 본 발명의 일 구현에에 따르면, 광학신호의 측정은 상기 복수의 핵산 반응이 모두 완료된 후 1회 진행될 수 있다. 택일적으로 본 발명의 일 구현에에 따르면, 상기 광학신호의 측정은 복수의 핵산반응들 사이에 수 회 진행될 수 있다. 바람직하게는 상기 광학신호의 측정은 상기 복수의 핵산반응마다 진행될 수 있다.
또한 제1샘플세트와 제2샘플세트가 서로 독립적인 프로토콜에 따라 핵산반응이 진행되므로, 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트에 대한 광학신호가 측정되는 시기는 서로 독립적으로 결정된다.
구체적으로 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 측정단계는 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또는 본 발명의 측정단계는 제1샘플세트 및 제2샘플세트 중 하나의 샘플세트에 대한 광학신호 측정 없이, 다른 하나의 샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 광학신호의 측정을 포함하는 본 발명의 측정단계는 일반적으로 상기 모든 측정을 포함한다. 또한 제1샘플세트와 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호의 파장영역은 서로 동일하거나, 상이할 수 있다.
열적으로 서로 독립된 열블록이 형성되어 있어 서로 다른 핵산 반응을 동시에 진행 할 수 있는 기존의 타겟 핵산 검출 장치는 실시간으로 광학적 측정을 할 수 있는 광학모듈이 포함되어 있지 않거나, 장치 내 열블록을 동일한 파장으로 동시에 측정하도록 되어 있다. 이러한 구조를 가지는 장치에서는 핵산 반응이 종료된 후 샘플을 수거하여 별도 분석을 진행하는 방법 또는 장치 내 핵산 반응이 진행중인 전체 샘플에 대하여 동일한 파장영역의 광학신호를 동시에 측정하는 방법만이 적용 가능하다. 이와 같은 측정방법은 단일 장치에서 서로 독립적인 프로토콜에 의하여 진행되는 서로 다른 핵산 반응을 실시간으로 분석하기에는 적절하지 않다.
본 발명의 타겟 핵산 검출 방법은 측정단계에 서로 상이한 파장영역인 제1샘플세트로부터 측정되는 광학신호와 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산 검출 방법은 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 광학신호를 동기적으로 측정하는 측정단계를 포함한다. 상기 제1샘플세트로부터 측정되는 광학신호와 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호는 파장영역이 서로 상이하다. 서로 다른 파장영역의 광학신호는 서로 상이한 표지에서 발생하는 광학신호를 의미한다. 따라서 본 발명의 타겟 핵산 검출 방법은 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 서로 상이한 표지를 동기적으로 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 동기적(synchronous) 측정이란 예를 들어, 2개의 반응영역에 대한 광학신호의 측정이 동일한 시간에 수행되는 것을 포함할 수 있다. 또한 상기 동기적 측정이란 예를 들어, 2개의 반응영역에 대한 광학신호의 측정 시기가 단순히 중첩되지 않을 뿐, 하나의 반응영역에 대한 광학신호의 측정이 수행된 후, 장치의 광원이나 필터 등 물리적 구성의 이동 없이 다른 하나의 반응영역에 대한 광학신호의 측정이 수행되는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 동기적(synchronous) 측정이란 예를 들어, 2개의 반응영역에 대한 광학신호의 측정 데이터가 분석과정에서 실질적으로 동일한 시기에 수득한 것으로 처리되는 것을 포함할 수 있다.
(i) 열적으로 서로 독립된 두 개의 반응영역 각각에 위치한 제1샘플세트 및 제2샘플세트를 독립적인 프로토콜에 따라 핵산 반응을 수행하며, (ii) 각 샘플세트로부터 광학신호를 측정하되, 서로 상이한 파장영역의 제1샘플세트로부터 측정되는 광학신호와 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계를 포함하는 본 발명의 타겟 핵산 검출 방법은 열적으로 서로 독립된 열블록이 형성되어 있으나, 광학모듈이 없거나, 장치 내 열블록에 수용되는 모든 샘플들을 동일한 파장으로 동시에 측정하도록 되어있는 기존의 핵산 반응 검출 장치에서는 수행하지 않는 새로운 방법이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 측정단계는 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 서로 다른 파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계 및 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트 중 어느 하나에 대한 광학신호 측정 없이, 다른 하나의 샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 단계를 포함하는 측정단계일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산 검출 방법의 상기 측정단계는 상기 제2샘플세트에 대한 광학신호 측정 없이, 제1샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산 검출 방법의 상기 측정단계는 상기 제1샘플세트에 대한 광학신호 측정 없이, 제2샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단일 장치에서 제1샘플세트와 제2샘플세트가 별개의 프로토콜에 의하여 실시간 PCR 반응을 진행하는 경우, 상기 두 샘플세트에 대한 광학신호의 측정 주기는 동일하지 않다. 이러한 경우, 상기 단일 장치는 상기 두 샘플세트에 대한 광학신호의 측정 주기에 따라, 어떤 사이클에서는 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 서로 다른 파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정하기도 하며, 어떤 사이클에서는 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트 중 어느 하나에 대한 광학신호 측정 없이, 다른 하나의 샘플세트로부터 광학신호를 측정하기도 한다.
상기 측정되는 광학신호의 파장영역은 사용되는 표지에서 발생하는 방출광(emission light)의 파장영역 전체 또는 일부를 포함하는 범위일 수 있다. 상기 측정되는 광학신호의 파장영역은 예를 들어 이에 제한되지 아니하나, FAM™, TET™, VIC™, JOE™, HEX™, CY3, TAMRA™, ROX™, Texas Red, CY5, CY5.5 및 Quasar 705으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지에서 발생하는 방출광의 파장영역 전체 또는 일부를 포함하는 범위일 수 있다.
한편 본 발명의 방법은 실시간 다중 핵산 검출 방법에 적용될 수 있다. 다중 핵산 검출이란 하나의 샘플에서 2 이상의 타겟 핵산을 구별하여 각각 실시간으로 검출하는 것을 의미한다. 광학적으로 실시간 다중 핵산 검출 assay를 하기 위해서는 하나의 샘플에서 각 타겟 핵산에 대응하는 2 이상의 서로 다른 파장영역의 광학 신호를 측정하는 단계가 필요하다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1샘플세트에 대한 광학신호 측정은 2개 이상의 서로 다른 파장영역의 광학신호를 순차적으로 측정하는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 서로 다른 파장영역의 수는 2 이상 또는 3 이상일 수 있으며, 7 이하 또는 6 이하일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1샘플세트는 복수의 샘플을 포함하며, 상기 제1반응영역에 위치한 제1샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 것은 상기 제1샘플세트에 포함되는 2이상의 샘플로부터 광학신호를 동시에 측정하는 것일 수 있다. 상기 제1샘플세트에 포함되는 샘플의 수는 특별히 제한되지 아니하나, 예를 들어, 1 또는 2 이상일 수 있으며, 1563, 1000, 800, 500, 400, 384, 100, 96 또는 32 이하일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2샘플세트는 복수의 샘플을 포함하며, 상기 제2반응영역에 위치한 제2샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 것은 상기 제2샘플세트에 포함되는 2이상의 샘플로부터 광학신호를 동시에 측정하는 것일 수 있다. 상기 제2샘플세트에 포함되는 샘플의 수는 특별히 제한되지 아니하나, 예를 들어, 1 또는 2 이상일 수 있으며, 1563, 1000, 800, 500, 400, 384, 100, 96 또는 32 이하일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 반응 검출 장치는 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학 신호의 측정은 상기 핵산 반응 검출 장치의 광학모듈에 의하여 이루어진다. 상기 광학모듈은 반응영역 내 샘플에 여기광을 조사(illuminate)할 수 있는 광원 및 반응영역 내 샘플로부터 수신된 방출광(emission light)을 감지(sensing) 할 수 있는 검출기(detector)를 포함한다. 상기 검출기는 CCD(Charge Coupled device), CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor field effect transistor) 또는 photodiode 등일 수 있다. 광원에서 조사되는 광은 여기광(excitation light)으로 표시될 수 있으며, 여기광에 의하여 여기된 표지가 방출하는 광은 방출광(emission light)으로 표시될 수 있다.
서로 상이한 파장영역의 제1샘플세트로부터 측정되는 광학신호와 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호를 동기적으로 측정하기 위하여는 제1샘플세트가 위치하는 제1반응영역 및 제2샘플세트가 위치하는 제2반응영역에 서로 다른 파장영역의 광이 동기적으로 조사 되어야 하며, 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 발생하는 방출광을 동기적으로 감지할 수 있어야 한다.
따라서, 상기 광학모듈의 광원은 제1샘플세트가 위치하는 제1반응영역 및 제2샘플세트가 위치하는 제2반응영역에 동기적으로 서로 다른 광을 조사할 수 있는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 광학모듈의 검출기는 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 발생하는 방출광을 동기적으로 감지할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈은 복수의 광원을 포함하며, 상기 복수의 광원 중 적어도 2개는 생산하는 여기광의 파장영역이 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 광학모듈은 제1광원 및 제2광원을 포함하며, 상기 제1광원과 제2광원이 조사하는 광의 파장영역은 서로 상이할 수 있다. 또는 상기 광학모듈은 제1광원 내지 제4광원을 포함하며, 상기 제1광원과 제2광원은 서로 조사하는 광의 파장영역이 상이할 수 있다. 또는 상기 광학모듈은 제1광원 내지 제4광원을 포함하며, 상기 제1광원 내지 제4광원이 조사하는 광의 파장영역은 서로 상이할 수 있다. 상기 광학모듈에 포함되는 복수의 광원의 수는 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 2 이상일 수 있으며, 100, 50, 40, 30, 20 또는 10개 이하일 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 반응 검출 장치의 광학모듈이 복수의 광원을 포함하며, 상기 복수의 광원 중 적어도 2개는 생산하는 여기광의 파장영역이 서로 상이하게 구성되면, 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 서로 다른 파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정하는 것이 가능하다.
한편 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈은 복수의 검출기를 포함하며, 상기 복수의 검출기는 각각 샘플 반응 모듈에서 고정된 그리고 기설정된 영역에 위치하는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지할 수 있다.
상기 검출기는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지한다. 상기 검출기는 CCD(Charge Coupled device), CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor field effect transistor) 또는 photodiode 등일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 검출기는 복수의 검출기 일 수 있다. 복수의 검출기를 사용하는 경우 각 검출기가 감지하는 샘플의 수가 감소하여 더욱 정확한 검출이 가능하다. 상기 검출기의 수는 특별히 제한되지 아니하나, 예를 들어, 2, 3, 4개 이상일 수 있으며, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 또는 6개 이하일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈은 독립적으로 조절되는 복수의 검출기를 포함하며, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 각각에는 상기 복수의 검출기 중 서로 상이한 1 이상의 검출기가 할당될 수 있다. 또한 제1샘플세트 및 제2샘플세트는 상기 할당된 서로 상이한 1 이상의 검출기에 의하여 광학신호가 측정될 수 있다.
상기 복수의 검출기는 각각 하나의 반응영역에서 발생하는 방출광을 감지할 수 있다. 또는, 본 발명의 방법에 있어서, 각 반응영역에는 1 이상의 검출기가 할당되며, 상기 2 이상의 검출기가 하나의 반응영역을 분할하여 방출광을 감지할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 반응 검출 장치가 열적으로 서로 독립된 2개의 반응영역을 포함하며, 4개의 검출기를 포함하는 경우, 제1, 제2검출기는 제1반응영역에 위치한 샘플에서 발생하는 방출광을 감지하며, 제3, 제4검출기는 제2반응영역에 위치한 샘플에서 발생하는 방출광을 감지할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 검출기는 각각 샘플 반응 모듈에서 고정된 그리고 기설정된 영역에 위치하는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지하는 검출기 일 수 있다. 상기 검출영역은 샘플 반응 모듈에 있어서, 하나의 검출기가 방출광을 검출하는 영역을 의미한다. 복수의 검출기가 각각 기설정된 검출영역에 위치하는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지한다는 것은 검출기 각각은 샘플 반응 모듈에서 검출하는 검출 영역이 미리 정해져 있는 것을 의미한다. 샘플 반응 모듈에서 동일한 검출영역에 위치한 샘플들은 동일한 검출기에 의하여 검출되며, 서로 상이한 검출영역에 위치한 샘플들은 서로 상이한 검출기에 의하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 제1검출기는 샘플 반응 모듈에서 고정된 일 영역인 제1검출영역에서 발생하는 방출광 만을 검출하고 다른 영역에서 발생하는 방출광은 검출하지 않을 수 있다.
상기 핵산 반응 검출 장치는 또한 컨트롤러를 포함한다. 상기 컨트롤러는 샘플 반응 모듈 및 광학모듈에 전기적으로 연결되어 있을 수 있다. 상기 컨트롤러는 제1반응영역 및 제2반응영역의 온도를 각각 독립적으로 조절하고, 제1반응영역 내 샘플의 광학신호 측정 및 제2반응영역 내 샘플의 광학신호 측정을 독립적으로 조절한다. 상기 컨트롤러는 1 이상의 컨트롤러 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컨트롤러는 다음의 단계 중 적어도 하나를 포함하는 동작을 수행하도록 상기 핵산 반응 검출 장치를 오퍼레이팅 하는 것을 특징한다:
(i) 다른 하나의 샘플세트에 대한 광학신호 측정 없이, 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트 중 어느 하나의 샘플세트에 대한 광학신호 측정하는 단계; 및 (ii) 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 서로 다른 파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계.
제1반응영역에 위치한 샘플과 제2반응영역에 위치한 샘플은 각각 독립적인 프로토콜에 의하여 반응이 진행되며, 제1반응영역 및 제2반응영역은 개별적으로 또는 동시에 광 검출 시점에 도달할 수 있다. 제1반응영역 및 제2반응영역 중 하나의 반응영역에 대하여만 광 검출 시점이 도달한 경우, 상기 컨트롤러는 다른 하나의 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정 없이, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 중 어느 하나의 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정하는 동작을 수행하도록 오퍼레이팅 한다. 또한, 제1반응영역 및 제2반응영역 모두에 대하여 광 검출 시점이 도달한 경우, 상기 컨트롤러는 상기 각 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정하는 동작을 수행하도록 오퍼레이팅 한다. 이때 제1반응영역과 제2반응영역에서 측정되는 광학신호의 파장영역은 서로 상이할 수 있다.
단계 (c) : 타겟 핵산 검출
본 발명에 따르면, 측정된 광학신호들을 분석하여 제1샘플세트 및 제2샘플세트에 포함된 샘플 내 타겟 핵산을 검출한다.
상기 타겟 핵산의 검출은 샘플로부터 측정된 광학신호들을 이용하여 샘플 내 타겟 핵산을 정량적 또는 정성적으로 검출하는 것을 의미한다. 상기 정량적 또는 정성적 검출은 샘플 내 타겟 핵산의 존재, 부존재 여부를 검출하는 것 또는 상기 검출은 샘플 내 타겟 핵산의 양을 검출하는 것일 수 있다.
상기 검출은 공지의 검출 방법에 의할 수 있다.
상기 검출은 예를 들어, 상기 측정된 광학신호 값이 미리 결정된 임계값 이상인 경우 샘플 내 상기 측정된 광학신호에 대응하는 타겟 핵산이 존재하는 것으로 결정하는 방법으로 수행될 수 있다. 또는 상기 검출은 핵산 반응이 반복될 때 마다 증가하는 형광신호의 변화량을 산출하여 이를 기준으로 타겟 핵산의 존재 여부를 결정하는 방법으로 수행될 수 있다. 또는 상기 검출은 농도를 알고 있는 다양한 농도의 타겟 핵산을 포함하는 기준 샘플을 이용하여 표준곡선을 수득하고, 각 샘플로부터 측정된 광학신호를 상기 표준곡선과 비교하여 각 샘플에 포함된 타겟 핵산의 초기 양을 계산하는 방법으로 수행될 수 있다. 또는 상기 검출은 핵산 반응이 반복될 때 마다 신호발생수단과 타겟 핵산간의 멜팅 분석을 통하여 수득한 광학신호들을 기초로 타겟 핵산을 검출하는 것일 수 있다.
II. 핵산 반응 검출 장치
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 핵산 반응 검출 장치를 제공한다.
도 1은 일 실시예에 따른 핵산 반응 검출 장치(10)이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 핵산 반응 검출 장치(10)는 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈(100), 상기 샘플 반응 모듈 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈(200), 및 상기 샘플 반응 모듈 및 광학모듈에 전기적으로 연결된 1 이상의 컨트롤러(300)를 포함한다. 본 발명의 핵산 반응 검출 장치는 또한 상기 광학모듈이 제1반응영역 내 샘플로부터 제1파장영역의 광학신호 및 제2반응영역 내 샘플로부터 상기 제1파장영역과 상이한 제2파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정할 수 있도록 형성된다. 상기 컨트롤러는 제1반응영역 및 제2반응영역의 온도를 각각 독립적으로 조절하고, 제1반응영역 내 샘플의 광학신호 측정 및 제2반응영역 내 샘플의 광학신호 측정을 독립적으로 조절하도록 형성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 반응 검출 장치(10)는 샘플 반응 모듈(100)을 포함한다. 상기 샘플 반응 모듈(100)은 분석 대상인 샘플을 수용하여 핵산 반응을 진행하게 하는 모듈이다.
도 2를 참조하면 상기 샘플 반응 모듈(100)은 제1반응영역(111)과 제2반응영역(112)을 포함한다. 각 반응영역은 서로 열적으로 독립되어 있다. 상기 제1반응영역과 제2반응영역 사이에는 열이 이동되지 않도록 단열물질 또는 에어 갭이 존재할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 샘플 반응 모듈(100)은 열적으로 서로 독립된 제1반응영역(111) 및 제2반응영역(112)을 포함한다. 상기 샘플 반응 모듈(100)은 반응영역(110) 및 열 전달모듈(120)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 샘플 반응 모듈(100)은 제1반응영역(111) 및 제2반응영역(112)이 각각 적어도 2 이상의 샘플을 수용할 수 있도록 형성될 수 있다. 이를 위하여, 상기 샘플 반응 모듈(100)은 샘플 또는 샘플을 포함하는 반응용기를 수용하는 반응영역(110)을 포함한다. 상기 반응영역(110)은 복수의 수용공간(115)을 포함할 수 있다. 상기 샘플을 수용하는 수용공간(115)은 반응용기를 수용하는 웰(well)일 수 있다. 상기 복수의 수용공간(115)을 이용하여 각 반응영역은 적어도 2 이상의 샘플을 수용할 수 있다. 상기 하나의 반응영역 내에 포함되는 수용공간(115)의 수는 특별히 제한되지 아니하나, 2 내지 96개, 2 내지 84개, 2 내지 72개, 2 내지 64개, 2 내지 56개, 2 내지 48개, 2 내지 40개 또는 2 내지 32개 일 수 있다. 상기 샘플 반응 모듈(100)은 수용되는 샘플의 온도를 조절하여 핵산 반응을 진행시킨다. 따라서 상기 반응영역(110)은 열 전도도가 우수한 금속 또는 금속 합금 소재로 제작될 수 있다. 반응 영역(110)은 일 예로 열블록일 수 있다. 열블록은 부피를 가지며, 열 전도도가 우수한 금속으로 형성된다. 열블록은 샘플을 수용할 수 있는 웰이 형성될 수 있다. 펠티어 소자와 같은 열전달 모듈이 열블록의 일면에 접촉하여 온도를 조절할 수 있다.
반응 영역(110)의 다른 일 예는 가열 플레이트이다. 가열 플레이트는 샘플을 수용하는 플레이트에 얇은 금속을 접촉시킨 형태이다. 얇은 금속에 전류를 흘려 플레이트를 가열하는 방식으로 작동될 수 있다.
반응 영역(110)의 또 다른 일 예는 하나 이상의 칩(chip) 또는 카트리지(cartridge)로 구성된다. 카트리지의 예는 유체 채널(flow channel)을 포함하는 유체 카트리지이다.
상기 샘플 반응 모듈(100)은 상기 반응영역(110)에 열을 공급하거나 상기 반응영역(110)으로부터 열을 흡수하는 열 전달 모듈(120)을 추가로 포함할 수 있다. 열 전달 모듈(120)은 상기 반응영역(110)을 둘 이상의 온도로 변환한다. 열 전달 모듈은 히팅과 쿨링이 모두 가능한 장치일 수 있다. 열 전달 모듈(120)은 열을 공급하는 열 공급 수단과 열을 흡수하는 열 흡수 수단을 별도로 구비할 수도 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 열 전달 모듈(120)은 반응영역(110)에 열 공급 및 열 흡수를 모두 할 수 있는 펠티어 소자로 반응영역(110)의 하단에 판 형태로 위치할 수 있다.
도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 핵산 반응 검출 장치는 제1반응영역과 제2반응영역이 각각 물리적으로 분리된 별개의 반응영역(110)일 수 있다. 또한 본 발명의 핵산 반응 검출 장치는 제1반응영역과 제2반응영역의 온도를 독립적으로 변화시키기 위하여 각각 물리적으로 분리된 별개의 열 전달 모듈(120)을 포함할 수 있다. 이로서 본 발명의 핵산 반응 검출 장치에서는 제1반응영역(111)과 제2반응영역(112)은 열적으로 서로 독립적으로 조절될 수 있다.
상기 반응영역들(111,112)은 각각 열적으로 독립적으로 조절 될 수 있다. 열적으로 독립적으로 조절된다는 것은 각 반응영역의 온도를 각각 조절할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 제1시간에 제1반응영역이 94℃를 유지하는 동안, 제2반응영역은 94℃에서 60℃로 냉각이 진행되거나, 60℃에서 75℃로 가열이 진행되거나, 특정 온도를 유지할 수 있는 것을 의미한다. 이로서, 상기 핵산 반응 검출 장치의 각 반응영역마다 별개의 핵산 반응을 수행할 수 있다. 상기 샘플 반응 모듈 내에 포함되는 반응영역의 수는 특별히 제한되지 아니하나, 2 내지 24개일 수 있다. 예를 들어, 상기 샘플 반응 모듈 내에 포함되는 반응영역의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24개 일 수 있다. 일 구현예에 따르면, 광 검출 장치는 반응 영역을 2개 이상, 4개 이상, 6개이상 또는 8개 이상 포함할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 광 검출 장치는 24개 이하, 20개 이하, 16개이하 또는 12개 이하의 반응 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 샘플 반응 모듈은 제1반응영역 및 제2반응영역외에 추가적인 반응영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 샘플 반응 모듈은 제3반응영역 및 제4반응영역을 추가로 포함할 수 있다. 상기 반응영역들은 각각 열적으로 독립적으로 조절 될 수 있다.
한편 본 발명의 샘플반응모듈(100)은 압력 리드(130)을 추가로 포함할 수 있다. 도 7을 참조하면, 압력 리드(130)는 반응영역(110) 상에 위치한 샘플을 포함하는 반응 용기들에 압력을 제공한다. 압력 리드(130)는 반응 용기들의 커버에 접촉하고, 반응 용기들의 커버를 눌러서 반응 용기들에 압력을 제공할 수 있다. 또한, 압력 리드(130)는 고온을 유지할 수 있다. 예를 들어, 압력 리드(130)는 105℃의 온도를 유지하는 열판(heat plate, 미도시)을 포함할 수 있다. 압력 리드(130)는 복수의 홀(131)들을 포함한다. 압력 리드(130)의 홀(131)들은 반응영역(110) 상에 위치한 샘플을 포함하는 반응 용기들과 대응되는 위치에 형성된다.
또한 도 1을 참조하면, 본 발명의 핵산 반응 검출 장치는 상기 샘플 반응 모듈 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈(200)을 포함한다.
상기 광학모듈(200)은 상기 샘플 반응 모듈(100) 내 샘플들에 여기광을 조사하고, 여기광에 의하여 방출되는 방출광을 감지하여 샘플 내 핵산반응을 검출한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈(200)은 반응영역 내 샘플에 여기광을 조사할 수 있는 광원(210) 및 반응영역 내 샘플로부터 수신된 방출광을 감지(sensing) 할 수 있는 검출기(220)를 포함할 수 있다.
상기 광원(210)은 반응영역 내 샘플에 여기광을 조사(illuminate)한다. 상기 여기광은 상기 광원(210)에서 발생하여 샘플 수용공간(115)에 위치하는 샘플에 도달하는 광을 말한다. 상기 여기광에 의하여 샘플 내 표지가 여기될 수 있다. 여기된 표지는 형광 등 광학신호를 방출할 수 있다. 광원(210)에서 조사되는 광은 여기광(excitation light)으로 표시될 수 있으며, 여기광에 의하여 여기된 표지가 방출하는 광은 방출광(emission light)으로 표시될 수 있다.
도 3을 참조하면, 상기 광원(210)은 복수의 광원일 수 있다. 이 경우 상기 광학모듈(200)은 제1광원(210a)이 제1반응영역(111)에 광을 조사할 때, 제2광원(210b)이 제2반응영역(112)에 제1광원(210a)과는 다른 파장영역의 광을 조사할 수 있도록 형성된다. 이 경우 광학모듈(200)은 제1반응영역(111) 내 샘플로부터 발생한 제1파장영역의 광학신호 및 제2반응영역(112) 내 샘플로부터 발생한 상기 제1파장영역과 상이한 제2파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 광원(210) 중 적어도 2개의 광원은 조사하는 여기광의 파장영역이 서로 상이한 것일 수 있다. 서로 파장영역이 상이한 여기광은 서로 다른 표지를 여기 시킬 수 있다. 여기된 표지는 광학신호인 방출광을 방출할 수 있으며, 서로 다른 표지는 서로 파장영역이 상이한 방출광을 방출한다. 예를 들어, 제1파장영역의 방출광은 제1표지를 여기 시키며, 제2파장영역의 방출광은 제2표지를 여기 시킬 수 있다. 광학모듈(200)에 포함되는 상기 광원(210)의 수는 특별히 제한되지 아니하며, 예를들어, 2 이상일 수 있으며, 100, 50, 40, 30, 20 또는 10개 이하일 수 있다.
본 발명의 광학모듈은(200)은 광원 휠(213)을 포함할 수 있다. 광원 횔(213)은 복수의 광원(210)을 수용한다. 광원 휠(213)이 광원(210)을 수용한다는 것은 광원(210)들이 광원 휠(213)에 부착되거나 고정되는 것을 의미할 수 있다. 광원 휠(213)은 모터 등과 같은 동력전달 장치에 연결되어 회전할 수 있으며, 이로서 필요에 따라 각 반응영역에 광을 조사하는 광원을 변경할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1반응영역(111)에 조사되는 여기광과 제2반응영역(112)에 조사되는 여기광의 파장영역은 각각 독립적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 도 2 및 도 4를 참조하면, 제1반응영역에 여기광을 조사하기 위하여 서로 다른 파장영역의 여기광을 조사할 수 있는 복수의 광원이 형성되고, 이와는 별도로 제2반응영역에 여기광을 조사하기 위하여 서로 다른 파장영역의 여기광을 조사할 수 있는 복수의 광원이 형성될 수 있다. 구체적으로 도 4A에서 보는 바와 같이, 본 발명의 샘플반응모듈(100)은 2개의 반응영역(111,112)을 포함할 수 있으며, 이때, 광학모듈(200)은 복수의 광원(210)을 각각 포함하는 2개의 광원휠(213)을 포함하여, 각 반응영역에 조사되는 여기광의 파장영역을 각각 독립적으로 결정할 수 있게 할 수 있다. 또 다른 예로, 도 4B에서 보는 바와 같이, 본 발명의 샘플반응모듈(100)은 4개의 반응영역(111, 112, 113, 114)을 포함할 수 있으며, 이때, 광학모듈은 4개의 반응영역을 위한 복수의 광원(210)을 각각 포함하는 4개의 광원휠(213)을 포함할 수 있다.
본 발명의 샘플반응모듈은 4개의 반응영역을 포함할 수 있으며, 이때, 광학모듈은 4개의 반응영역을 위한 복수의 광원을 각각 포함하는 4개의 광원휠을 포함할 수 있다.
한편 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1반응영역에 조사되는 여기광과 제2반응영역에 조사되는 여기광의 파장영역은 동기적(synchronizedly)으로 변화할 수 있다. 예를 들어, 도 5에서 보는 바와 같이, 서로 다른 파장영역의 여기광을 조사할 수 있는 복수의 광원이 광원 휠(213)과 같은 이동부재에 연결되어 2 이상의 반응영역에 각각 위치하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 광원 휠(213)이 서로 다른 파장영역의 광을 조사하는 2개의 광원을 포함하는 경우, 상기 광원들은 제1반응영역(111)과 제2반응영역(112)에 위치하고, 서로 위치를 교환할 수 있다(도 5A 참조). 또는 도 5B와 같이, 광원 휠(213)이 서로 다른 파장영역의 광을 조사하는 4개의 광원을 포함하며, 제1반응영역(111) 및 제2반응영역(112)에 서로 다른 파장영역의 광을 동기적으로 조사할 수 있다. 이러한 경우, 광원 휠(213)의 회전에 의해 제1반응영역(111)에 위치한 광원(210a)은 제2반응영역(112)의 위치로 이동하고, 제1반응영역(111)에는 새로운 광원(210c)이 위치할 수 있다.
또는 도 5C와 같이, 광원 휠(213)은 서로 다른 파장영역의 광을 조사하는 4개의 광원을 포함하며, 상기 4개의 광원은 각각 서로 상이한 반응영역(111, 112, 113, 114)에 위치하여 4개의 반응영역에 서로 다른 파장영역의 광을 동기적으로 조사할 수 있다. 이러한 경우, 광원 휠(213)의 회전에 의해 제1반응영역(111)에 위치한 광원(210a)은 제2반응영역(112)의 위치로 이동하고, 제2반응영역(112)에 위치한 광원(210b)은 제3반응영역(113)의 위치로 이동하고, 제3반응영역(113)에 위치한 광원(210c)은 제4반응영역(114)의 위치로 이동하고, 제4반응영역(114)에 위치한 광원(210d)은 제1반응영역(111)의 위치로 이동할 수 있다. 본 명세서에 이러한 위치 이동은 "순환적 이동"으로 표현할 수 있다. 이와 같은 구성은 반응영역의 개수에 대비하여 사용되는 광원의 수를 경제적으로 조절할 수 있다.
도 6을 참조하면, 상기 광원(210)은 발광소자(211)를 포함한다. 상기 발광소자(211)는 복수의 발광소자 일 수 있다. 상기 발광소자는 LED(light emitting diode)일 수 있다. 상기 발광소자는 광원(210)이 조사하고자 하는 파장영역의 광을 선택적으로 발생시키는 발광소자일 수 있다.
상기 광원(210)은 필터(212)를 포함할 수 있다. 상기 필터(212)는 광원(210)이 목적하는 파장영역의 광을 반응영역에 조사할 수 있도록 한다. 상기 필터는 상기 발광소자에서 발생하는 광 중에서 목적하는 파장영역의 광을 선택적으로 투과시키는 필터일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광원은 복수의 필터를 포함할 수 있으며, 반응영역 내 샘플에 사용된 표지의 종류에 따라 상기 필터가 교체되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈(200)은 복수의 광원을 포함하며, 상기 복수의 광원 중 적어도 2개의 광원은 생산하는 여기광의 파장영역이 서로 상이할 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 광학모듈(200)은 2 이상의 파장영역의 여기광을 선택적으로 조사할 수 있다. 상기 광학모듈(200)은 복수의 광원(210)을 포함할 수 있다. 또한 상기 광학모듈(200)은 서로 다른 파장영역의 광을 조사하는 2 이상의 광원(210)을 포함할 수 있다. 상기 광학모듈(200)은 상기 광원의 발광소자(211)를 광원별로 특정 파장영역의 광을 발생시키는 발광소자로 선택하여 구성할 수 있다. 또한 상기 광학모듈(200)은 각 광원의 필터(212)를 광원별로 서로 다른 파장영역의 광을 선택적으로 투과시키는 필터로 선택하여 구성할 수 있다. 상기 서로 다른 파장영역의 광을 조사하는 복수의 광원(210)은 광원 휠(213)에 고정되고, 상기 광원 휠(213)이 상기 광원 휠(213)이 각 반응영역(111, 112)에 서로 다른 파장영역의 광이 순차적으로 조사될 수 있도록 광원(210)을 이동시킬 수 있다. 이와 같은 구성에 의하여, 상기 광학모듈은 하나의 반응영역에 대하여 서로 다른 파장영역의 여기광을 선택적으로 조사할 수 있다. 이로서 본 발명의 장치는 하나의 샘플에서 서로 다른 표지에 의해 검출되는 복수의 타겟 핵산을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈은 동일 반응영역 내 복수의 샘플들에 여기광을 동시에 조사할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 광학모듈은 복수의 광원을 포함하며, 상기 복수의 광원 중 하나의 광원은 하나의 반응영역 내 복수의 샘플들에 여기광을 동시에 조사할 수 있다. 이로서 상기 광학모듈은 하나의 광원이 복수의 샘플에 여기광을 순차적으로 조사하면서 광학신호를 검출하는 것보다 신속하게 복수의 샘플로부터 광학신호를 검출할 수 있다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 광학모듈(200)은 검출기(220)를 포함한다. 상기 검출기는 광을 감지한다. 구체적으로 검출기는 샘플들로부터 발생한 방출광을 감지한다. 상기 검출기는 CCD(Charge Coupled device), CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor field effect transistor) 또는 photodiode 등일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 하나의 검출기가 전체 반응영역에서 발생하는 방출광을 모두 감지할 수 있다. 이 경우 상기 하나의 검출기는 복수의 반응영역에서 발생하는 서로 다른 파장영역의 방출광을 각각 구분하여 감지할 수 있도록 형성된다.
본 발명의 일 구현에에 따르면, 도 2에 도시된 바와 같이, 상기 광학모듈은 2 이상의 검출기(220a, 220b)를 포함할 수 있다. 이러한 경우 제1반응영역(111) 및 제2반응영역(112)에서 발생하는 광을 각각 독립적인 검출기를 이용하여 검출할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈은 독립적으로 조절되는 복수의 검출기를 포함하며, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 각각에는 상기 복수의 검출기 중 서로 상이한 1 이상의 검출기가 할당될 수 있다. 또한 제1샘플세트 및 제2샘플세트는 상기 할당된 서로 상이한 1 이상의 검출기에 의하여 광학신호가 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 하나의 반응영역에 2 이상의 검출기가 사용될 수 있다. 이 경우 상기 2 이상의 검출기가 하나의 반응영역을 분할하여 방출광을 감지할 수 있다.
상기 광학모듈은 제1반응영역 내 샘플로부터 제1파장영역의 광학신호 및 제2반응영역 내 샘플로부터 상기 제1파장영역과 상이한 제2파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정할 수 있도록 형성된다.
도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈은 복수의 검출기(220a, 220b)를 포함하며, 상기 복수의 검출기는 각각 샘플수용모듈에서 고정된(fixed) 그리고 기설정된(pre-determined) 검출영역(111, 112)에 위치하는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지하도록 형성된 것일 수 있다. 상기 방출광은 샘플에서 발생하여 검출기에 도달하는 광을 말한다. 구체적으로 상기 방출광은 샘플 내 표지와 같은 신호발생수단에 의하여 발생하는 광이다. 본 명세서에서 상기 방출광은 신호 또는 광학신호에 해당한다.
상기 광학모듈(200)은 복수의 검출기가 각각 기설정된 검출영역에 위치하는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지하도록 형성될 수 있다. 상기 검출영역은 샘플 반응 모듈에 있어서, 하나의 검출기가 방출광을 검출하는 영역을 의미한다. 복수의 검출기가 각각 기설정된 검출영역에 위치하는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지한다는 것은 검출기 각각은 샘플 반응 모듈에서 검출하는 검출 영역이 미리 정해져 있는 것을 의미한다. 샘플 반응 모듈에서 동일한 검출영역에 위치한 샘플들은 동일한 검출기에 의하여 검출되며, 서로 상이한 검출영역에 위치한 샘플들은 서로 상이한 검출기에 의하여 검출될 수 있다. 상기 각 검출기는 방출광을 감지하는 검출영역이 고정되어 있을 수 있다. 예를 들어 제1검출기는 샘플 반응 모듈에서 고정된 일 영역인 제1검출영역에서 발생하는 방출광 만을 검출하고 다른 영역에서 발생하는 방출광은 검출하지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 하나의 검출영역은 하나의 반응영역에 포함될 수 있다. 다시말해, 상기 검출영역은 2 이상의 반응영역에 걸쳐서 존재하지 않을 수 있다. 하나의 검출기가 2 이상의 반응영역에서 동기적으로 발생하는 광을 모두 측정하지 않고, 서로 상이한 반응영역에서 발생한 방출광은 서로 다른 검출기에 의하여 측정되는 것이 바람직하다. 예를 들어 제1검출기(220a)는 제1반응영역(111)에서 발생하는 방출광만을 검출하고, 제2반응영역(112)과 같은 다른 영역에서 발생하는 방출광은 검출하지 않도록 형성될 수 있다. 또한 제2검출기(220b)는 제2반응영역(112)에서 발생하는 방출광만을 검출하고, 제1반응영역(111)과 같은 다른 영역에서 발생하는 방출광은 검출하지 않도록 형성될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 하나의 반응영역에는 1 또는 2 이상의 검출영역이 포함될 수 있다. 반응영역의 모양과 크기, 및 검출방식에 따라 하나의 반응영역을 담당하는 검출기의 수가 결정될 수 있으며, 상기 검출기의 수는 1개 일수도 있으며, 2 이상일 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈(200)은 상기 검출기로 들어오는 방출광경로(emission light path)상(270)에 위치할 수 있는 필터(230)를 추가할 수 있다. 상기 필터는 방출광 중에서 측정 대상인 파장영역의 광을 선택적으로 투과시키는 필터일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 광학모듈은 복수의 필터(230)를 포함할 수 있으며, 측정하고자 하는 방출광의 파장에 따라 방출광경로(270)에 위치하는 필터가 교체될 수 있다. 상기 필터의 교체는 예를 들어 필터휠(235)에 복수의 필터(230)를 부착시킨 후 상기 필터휠(235)을 필요에 따라 회전시키는 방법으로 수행할 수 있다.
도 7를 참조하면 상기 광학모듈(200)은 빔스플리터(240)를 포함할 수 있다. 상기 빔스플리터(240)은 여기광(excitation light) 또는 방출광(emission light)을 일부 반사시켜 목적하는 광경로를 형성한다. 예를 들어, 도 7에서 보는 바와 같이, 광원(210)에서 발생한 여기광이 빔스플리터(240)를 투과하여 반응영역(110)의 샘플 수용공간(115)에 수용된 샘플에 도달하여 여기광경로(260)을 형성한다. 또한 샘플에서 발생한 방출광은 빔스플리터(240)에서 반사되어 검출기(220)에 도달하여 방출광경로(270)를 형성한다.
상기 광학모듈(200)은 차광수단(250)을 포함할 수 있다. 상기 차광수단(250)은 예를 들어, 제1반응영역(111)에 조사되는 여기광이 제2반응영역(112) 또는 다른 반응영역에 조사되지 않도록 형성될 수 있다. 또한 상기 차광수단(250)은 광원(210a)으로부터 제1반응영역(111)에 여기광이 조사될 때, 제1반응영역(111)에 상기 조사되는 여기광 외에 다른 광이 제1반응영역(111)에 조사되지 않도록 형성될 수 있다. 상기 차광수단(250)은 인접한 광원들 사이에 배치될 수 있다. 또는 차광수단(250)은 인접한 검출기들 사이에 배치될 수 있다. 일 구현예에서, 차광수단(250)은 사각형 또는 원형의 관 형상을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 차광수단(250)은 복수 개의 관들의 조합된 형상을 가질 수 있다.
도 8을 참조하면, 본 발명의 핵산 반응 검출 장치는 컨트롤러(300)를 포함한다. 상기 컨트롤러는 상기 샘플 반응 모듈(100) 및 광학모듈(200)에 전기적으로 연결된 1 이상의 컨트롤러이다. 상기 컨트롤러는 예를 들어, 컴퓨터, 마이크로프로세서 또는 프로그램이 가능한 논리 장치 일 수 있다.
상기 컨트롤러(300)는 제1반응영역(111) 및 제2반응영역(112)의 온도를 각각 독립적으로 조절한다. 구체적으로 제1반응영역의 열 전달모듈(120a)과 전기적으로 연결되어 제1반응영역(111)의 열 전달 모듈(120a)에 인가되는 전류의 방향과 세기를 조절하여 제1반응영역(111)의 온도를 조절한다. 또한 제2반응영역(112)의 열 전달모듈(120b)과 전기적으로 연결되어 상기 제1반응영역(111)의 온도 조절과 독립적으로 제2반응영역(112)의 열 전달 모듈(120b)에 인가되는 전류의 방향과 세기 및 시간을 조절하여 제2반응영역(112)의 온도를 조절한다. 상기 컨트롤러(300)는 제1반응영역에 위치한 제1샘플세트를 위한 프로토콜을 수신하고, 상기 제1샘플세트를 위한 프로토콜에 따라 제1반응영역(111)의 온도를 조절하고, 제2반응영역에 위치한 제2샘플세트를 위한 프로토콜을 수신하고, 상기 제2샘플세트를 위한 프로토콜에 따라 제2반응영역(112)의 온도를 조절한다.
또한 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컨트롤러(300)는 제1반응영역 내 샘플의 광학신호 측정 및 제2반응영역 내 샘플의 광학신호 측정을 독립적으로 조절하도록 형성된다. 구체적으로 상기 컨트롤러(300)는 제1반응영역 내 샘플로부터 광학신호를 발생시킬 수 있는 파장영역의 광을 제1반응영역에 조사할 수 있도록 제1광원(210a) 또는 제2광원(210b)을 소정의 위치로 이동시키도록 광원 휠(213)을 움직일 수 있다. 또한 상기 컨트롤러(300)는 예를 들어, 상기 광원(210a)가 샘플에 여기광(260a)을 조사할 수 있도록 상기 광원(210a)에 전류를 공급할 수 있다. 또한 상기 컨트롤러(300)는 상기 광원(210a)로부터 조사된 여기광(260a)에 의하여 샘플에서 발생하는 방출광(270a)을 검출기(220a)가 감지할 수 있도록, 상기 방출광(270a)를 선택적으로 투과시킬 수 있는 필터(230a)를 방출광경로(270a)상에 위치시키도록 필터 휠(235a)을 움직일 수 있으며, 검출기(220a)에 전류를 공급할 수 있다. 또한 상기 컨트롤러(300)는 제2반응영역 내 샘플로부터 광학신호를 측정하기 위하여서도, 상기 설명한 바와 같이, 광원 휠(213) 및 필터 휠(230b)을 움직이고, 광원(210b) 및 검출기(220b)에 전류를 공급할 수 있다.
상기 컨트롤러(300)는 위와 같은 각 반응영역에 대한 온도조절 및 광학신호 측정이 프로토콜에 정해진 순서에 따라 진행되도록 핵산반응장치의 샘플반응모듈(100) 및 광학모듈(200)을 오퍼레이팅 할 수 있다.
컨트롤러(300)는 각 샘플에 대한 프로토콜을 수신하고, 상기 수신된 프로토콜에 따라 샘플 반응 모듈의 각 반응영역의 온도를 독립적으로 조절할 수 있으며, 광학모듈의 각 반응영역에 대한 광학 신호 측정을 독립적으로 조절할 수 있다. 예를 들어 상기 컨트롤러는 제2반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정 없이 제1반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정만 선택적으로 진행하도록 장치를 오퍼레이팅 할 수 있다. 또는 상기 컨트롤러는 제1반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정 없이 제2반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정만 선택적으로 진행하도록 장치를 오퍼레이팅 할 수 있다. 또는 상기 컨트롤러는 제1반응영역 및 제2반응영역 내 샘플에 대하여 동기적으로 광학신호 측정을 진행하도록 장치를 오퍼레이팅 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컨트롤러는 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역에 대한 각각의 프로토콜을 수신하고; 상기 수신된 프로토콜에 따라 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도를 독립적으로 조절하며; 상기 수신된 모든 반응영역에 대한 프로토콜에 기초하여 다음의 단계 중 적어도 하나를 포함하는 동작을 수행하도록 상기 핵산 반응 검출 장치를 오퍼레이팅 할 수 있다:
(i) 다른 하나의 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정 없이, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 중 어느 하나의 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정하는 단계; 및 (ii) 상기 제1반응영역 내 샘플로부터 제1파장영역의 광학신호 및 제2반응영역 내 샘플로부터 상기 제1파장영역과 상이한 제2파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계.
제1반응영역에 위치한 샘플과 제2반응영역에 위치한 샘플은 각각 독립적인 프로토콜에 의하여 반응이 진행되며, 제1반응영역 및 제2반응영역은 개별적으로 또는 동시에 광 검출 시점에 도달할 수 있다. 제1반응영역 및 제2반응영역 중 하나의 반응영역에 대하여만 광 검출 시점이 도달한 경우, 상기 컨트롤러(300)는 다른 하나의 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정 없이, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 중 어느 하나의 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정하는 동작을 수행하도록 오퍼레이팅 한다. 또한, 제1반응영역 및 제2반응영역 모두에 대하여 광 검출 시점이 도달한 경우, 상기 컨트롤러(300)는 상기 각 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정하는 동작을 수행하도록 오퍼레이팅 한다. 이때 제1반응영역과 제2반응영역에서 측정되는 광학신호의 파장영역은 서로 상이할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컨트롤러는 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도가 서로 상이한 조건에서 제1반응영역 및 제2반응영역 중 어느 한 영역에 대하여 선택적으로 광학신호 측정을 수행할 수 있도록 샘플 반응 모듈 및 광학모듈을 조절하도록 형성될 수 있다. 예를 들어, 도 8을 참조하면, 상기 컨트롤러(300)는 제1반응영역에 대한 광원(260a), 필터 휠(230a) 및 검출기(220a)를 제어하여 제1반응영역에 대하여 광학신호의 측정하며, 동시에 제2반응영역(112)의 열 전달모듈(120)을 제어하여 제2반응영역에서 핵산 반응을 진행시킬 수 있다.
또한 컨트롤러는 하나의 샘플에서 복수의 타겟 핵산을 검출할 수 있도록 장치를 오퍼레이팅 할 수 있다. 구체적으로 하나의 반응영역에 대하여 2 이상의 서로 다른 파장영역의 광학신호를 순차적으로 측정하게 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컨트롤러는 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도가 서로 상이한 조건에서 제1반응영역 및 제2반응영역 중 어느 한 영역에 대하여 2개 이상의 서로 다른 파장영역의 광학신호를 순차적으로 측정할 수 있도록 샘플 반응 모듈 및 광학모듈을 조절하도록 형성될 수 있다.
일 구현예로, 도 8을 참조하면, 상기 컨트롤러는 제1시간에 제1광원(210a)을 제1반응영역(111)에 여기광을 조사할 수 있는 위치로 이동시키고, 제1광원(210a)이 여기광을 조사하도록 전류를 인가한다. 이어 필터 휠(235a) 구동을 통하여 제1광원(210a)의 여기광에 의하여 샘플에서 발생한 방출광을 측정할 수 있는 필터를 여기광경로(270a)에 위치시킨 후 검출기(220a)에 전류를 인가하여 제1반응영역(111)으로부터 광학신호를 측정한다. 상기 제1광원(210a)을 이용한 광학신호 측정이 끝난 후, 컨트롤러는 광원 휠(213) 구동을 통하여 제2시간에 제2광원(210b)을 제1반응영역(111)에 여기광을 조사할 수 있는 위치로 이동시키고, 제2광원(210b)이 여기광을 조사하도록 전류를 인가한다. 이어 필터 휠(235a) 구동을 통하여 제2광원(210b)의 여기광에 의하여 샘플에서 발생한 방출광을 측정할 수 있는 필터를 여기광경로(270a)에 위치시킨 후 검출기(220a)에 전류를 인가하여 제1반응영역(111)으로부터 광학신호를 측정한다. 상기 제1반응영역(111)에 대하여 상기 설명한 바와 같은 광학신호의 측정이 진행되는 동안, 상기 컨트롤러(300)는 제2반응영역(112)의 온도를 변화시켜 핵산 반응을 진행시킬 수 있다.
상기 설명한 바와 같은 컨트롤러(300)의 오퍼레이션에 의하여 본 발명의 핵산 반응 검출 장치(10)는 서로 다른 프로토콜에 따라 핵산 반응 및 복수의 타겟에 대한 광학신호 검출이 수행되는 복수의 샘플 세트에 대하여 각 샘플 세트마다 복수의 타겟을 각각 검출할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 다음의 단계를 포함하는 샘플 내 타겟 핵산 검출 방법:
    (a) 핵산 반응 검출 장치의 제1반응영역에 제1샘플세트를 위치시키고, 제2반응영역에 제2샘플세트를 위치시키고, 핵산반응을 수행하는 단계; 상기 핵산 반응 검출 장치는 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈 및 컨트롤러를 포함하고; 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도는 서로 독립적인 프로토콜(protocol)에 따라 조절되고;
    (b) 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 측정단계; 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터의 광학신호는 동기적으로 측정되며; 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 측정되는 광학신호의 파장영역은 서로 상이하며; 및
    (c) 측정된 광학신호들을 분석하여 제1샘플세트 및 제2샘플세트에 포함된 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 광학신호 측정단계는 (i) 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계; 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 동기적으로 측정된 광학신호의 파장영역은 서로 상이하며; 및 (ii) 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트 중 어느 하나에 대한 광학신호 측정 없이, 다른 하나의 샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1샘플세트에 대한 광학신호 측정은 2개 이상의 서로 다른 파장영역의 광학신호를 순차적으로 측정하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1샘플세트는 복수의 샘플을 포함하며, 상기 제1반응영역에 위치한 제1샘플세트로부터 광학신호를 측정하는 것은 상기 제1샘플세트에 포함되는 2 이상의 샘플로부터 광학신호를 동시에 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 컨트롤러는 다음의 단계 중 적어도 하나를 포함하는 동작을 수행하도록 상기 핵산 반응 검출 장치를 오퍼레이팅 하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 다른 하나의 샘플세트에 대한 광학신호 측정 없이, 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트 중 어느 하나의 샘플세트에 대한 광학신호 측정하는 단계; 및 (ii) 상기 제1샘플세트 및 제2샘플세트로부터 서로 다른 파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계.
  6. 제1항에 있어서, 상기 광학모듈은 복수의 광원을 포함하며, 상기 복수의 광원 중 적어도 2개는 서로 상이한 파장범위의 여기광을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 광학모듈은 복수의 검출기를 포함하며, 상기 복수의 검출기는 각각 샘플 반응 모듈에서 고정된 그리고 기설정된 영역에 위치하는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 광학모듈은 독립적으로 조절되는 복수의 검출기를 포함하며, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 각각에는 상기 복수의 검출기 중 서로 상이한 1 이상의 검출기가 할당되며; 제1샘플세트 및 제2샘플세트의 광학신호는 상기 할당된 서로 상이한 1 이상의 검출기에 의하여 각각 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 열적으로 서로 독립된 제1반응영역 및 제2반응영역을 포함하는 샘플 반응 모듈;
    상기 샘플 반응 모듈 내 샘플들의 핵산반응을 검출할 수 있는 광학모듈; 및
    상기 샘플 반응 모듈 및 광학모듈에 전기적으로 연결된 1 이상의 컨트롤러를 포함하고;
    상기 광학모듈은 제1반응영역 내 샘플로부터 제1파장영역의 광학신호 및 제2반응영역 내 샘플로부터 상기 제1파장영역과 상이한 제2파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정할 수 있도록 형성되고;
    상기 컨트롤러는 제1반응영역 및 제2반응영역의 온도를 각각 독립적으로 조절하고, 제1반응영역 내 샘플의 광학신호 측정 및 제2반응영역 내 샘플의 광학신호 측정을 독립적으로 조절하도록 형성되는 핵산 반응 검출 장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 컨트롤러는 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역에 대한 별개의 프로토콜을 수신하고; 상기 수신된 프로토콜에 따라 상기 제1반응영역과 상기 제2반응영역의 온도를 독립적으로 조절하며; 상기 수신된 모든 반응영역에 대한 프로토콜에 기초하여 다음의 단계 중 적어도 하나를 포함하는 동작을 수행하도록 상기 핵산 반응 검출 장치를 오퍼레이팅 하는 것을 특징으로 하는 장치:
    (i) 다른 하나의 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정 없이, 상기 제1반응영역 및 제2반응영역 중 어느 하나의 반응영역 내 샘플에 대한 광학신호 측정하는 단계; 및 (ii) 상기 제1반응영역 내 샘플로부터 제1파장영역의 광학신호 및 제2반응영역 내 샘플로부터 상기 제1파장영역과 상이한 제2파장영역의 광학신호를 동기적으로 측정하는 단계.
  11. 제9항에 있어서, 상기 광학모듈은 반응영역 내 샘플에 여기광을 조사할 수 있는 광원 및 반응영역 내 샘플로부터 수신된 방출광을 감지 할 수 있는 검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 제9항에 있어서, 상기 광학모듈은 복수의 검출기를 포함하며,상기 복수의 검출기는 각각 샘플 반응 모듈에서 고정된 그리고 기설정된 검출영역에 위치하는 샘플로부터 발생하는 방출광을 감지하는 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 제9항에 있어서, 상기 광학모듈은 동일 반응영역 내 복수의 샘플들에 여기광을 동시에 조사할 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제9항에 있어서, 상기 광학모듈은 복수의 광원을 포함하며, 상기 복수의 광원 중 적어도 2개의 광원은 서로 상이한 파장영역의 여기광을 생산하는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제9항에 있어서, 상기 샘플 반응 모듈은 제1반응영역 및 제2반응영역이 각각 적어도 2 이상의 샘플을 수용할 수 있도록 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
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