KR102129101B1 - 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 pcr 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실시간 PCR 장치에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 마이크로 PCR 칩을 사용하는 실시간 PCR 장치에서 단일시료를 PCR 칩에 형성된 다수의 시약챔버와 혼합채널에 분배하되, 하나의 시료챔버와 다수의 시약챔버를 다수의 혼합채널을 이용하여 밀폐하고 이들의 하단을 폐쇄하는 밀봉필름의 표면을 친수성을 갖도록 처리하여 하나의 시료챔버에 주입되는 시료가 다수의 혼합채널을 통해 다수의 시약챔버로 동시에 주입되어 각 시약챔버로 주입되는 시료 간의 시차가 거의 없도록 하고 밀폐된 다수의 혼합채널을 통해 시료를 분배함으로써 무동력으로 시료를 이송하여 장치의 구조를 단순하게 하고 단일시료에 대한 신뢰도가 향상되어 PCR 반응 후 다수의 혼합채널에서 발광하는 형광의 이미지를 분석하여 다중진단이 가능하도록 한 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치에 관한 것이다.

Description

단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치{Real-time polymerase Chain Reaction Apparatus for multiple diagnosis with single sample}

본 발명은 실시간 PCR 장치에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 마이크로 PCR 칩을 사용하는 실시간 PCR 장치에서 단일시료를 PCR 칩에 형성된 다수의 챔버와 채널에 분배하고 PCR 반응 후 다수의 채널에서 발광하는 형광의 이미지를 분석하여 다중진단이 가능하도록 한 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.

오늘날 바이러스 및 병원체 검출을 위해 주로 사용하는 방법은 분자진단 방법으로써 질병의 원인이 되는 박테리아, 바이러스 등의 핵산(DNA와 RNA 또는 이들의 변형체)을 검출하여 병의 원인 및 감염 여부를 검출하는 방법이다. 분자진단 방법은 크게 세 가지 단계로 구성되며 순서대로, 세포에서 순수한 DNA 또는 RNA를 얻기 위한 전처리 과정, 중합효소 연쇄반응(Polymerse chain reation, PCR)을 이용한 유전자 증폭 과정 및 이를 분석하는 과정이다. 즉, PCR 과정을 통해 목표 유전자를 수억 배 증폭시킬 수 있기 때문에 극미량의 목표물질에 대해서도 고감도 분석 및 특이성을 갖는 분석을 할 수 있다.

따라서 분자진단에 있어 PCR을 통한 목표 유전자의 증폭은 필수적이다. PCR은 효소 기반의 반응으로, 표적 DNA의 염기 서열 중 특정 구간을 반복적으로 증폭하여 수백만 가닥의 동일 유전 물질을 생성한다. 기존의 PCR은 상대적으로 많은 양의 값비싼 시약과 큰 PCR 장치(thermal cycler)가 필요하지만, 소형화된 마이크로 PCR 칩의 경우 적은 양의 시약이 들고 열전달이 빨라서 PCR 시간을 몇 시간에서 몇 십 분으로 크게 줄일 수 있다. 그뿐만 아니라 마이크로 디바이스 상에서 여러 요소기술의 통합이 가능하며 장비 구동을 위한 동력 소모가 적다. 소형화된 PCR 칩은 일회용 칩으로 개발됨으로써 교차오염 또는 생화학적 위험을 줄일 수 있다.

PCR(Polymerase Chain Reaction: 중합효소 연쇄반응)은 핵산을 포함하는 유전물질을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기서열을 갖는 부위를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기서열 부위를 갖는 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기술로서, 핵산의 특정영역을 시험관 내에서 대량으로 증폭할 수 있기 때문에 순수 분자생물학 분야 이외에도 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학뿐만 아니라 고고학이나 인류학에 이르는 다양한 분야로 그 활용범위를 넓혀가고 있다.

이러한 PCR 공정은 DNA 변성(Denaturation), 결합(Annealing) 및 신장(Extension) 단계로 이루어진다. DNA변성(Denaturation)는 94℃에서 15~30초간 열처리하여 두 가닥 DNA를 각각 한 가닥 DNA로 분리시킨다. 결합단계는 열처리 후 온도를 낮추면 2종류의 primer가 변성된 한 가닥 DNA의 상보적인 부분에 결합(annealing) 한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 어닐링 한다. 신장 단계는 4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서 DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭 단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로는 Thermus aquaticus(Taq) Polymerase를 사용할 경우 72℃에서 30초~10분간(증폭크기 약 10 kbp) 처리한다. Taq Polymerase에 의한 DNA 합성속도(약 60 nucleotides/sec, 70℃)를 고려하여 시간을 설정한다.

그리고 PCR 과정이 끝나면 목표 산물의 증폭 량을 분석한다. 예를 들어, 반응 생성물의 시료를 브롬화 에티듐을 포함하는 아가로스 젤을 이용하는 적당한 분자량 marker를 가진 전기영동(electrophoresis)에 적용한다. 이때 형성된 밴드는 자외선 투사법(transillumination)으로 가시화될 수 있다. 이와 같이, 전기영동을 이용하여 목표 유전자의 증폭을 확인할 수 있으나, 전기영동법은 PCR 후의 증폭 산물을 분석하여 증폭된 부분의 크기에 관한 정보만을 얻을 수 있고, 증폭 부위의 염기 서열에 대해 추측만이 가능하다. 또한, 2~3일 정도 소요되고 특이성에 관한 확신을 하기 위해 프로브 결합에 필요한 상동성 정도(stringency)를 여러 조건으로 조절하여야 하는 단점이 있다.

이러한 전기영동법의 단점을 보완하기 위해, PCR의 각 사이클에서 나오는 시그널(형광)을 분석하여 시료 내에 존재하는 증폭 산물의 농도를 계산하고, 특이적 프로브를 사용함으로써 신속하고 정확하게 PCR 결과를 얻기 위한 기술이 소위, 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR)이 개발 되었다. 실시간 PCR 공정은, PCR 반응에서 합성되는 DNA의 양을 형광 물질을 이용하여 실시간으로 모니터링하는 PCR법이다.

이러한 실시간 PCR에서 증폭 산물을 실시간으로 검출하기 위해서는 ⅰ) 어떠한 이중 가닥 DNA에라도 삽입되는 SYBR Green과 같은 비특이적 형광물질(intercalator type)을 사용하는 방법, 또는 ⅱ) 목표 유전자를 정량하기 위한 상보서열을 가진 탐침(probe)의 결합 이후에만 검출할 수 있는 형광 표지자로 표지된 올리고뉴클레오티드로 구성된 서열-특이적 DNA 탐침(probe type)을 사용하는 방법 등이 있다. 전자는 다중분석이 가능하나 융해온도(Tm) 값의 편차가 큰 경우에만 제한적으로 사용될 수 있고, 후자는 탐침으로 사용되는 형광염료를 달리할 경우 동시에 여러 표적 유전자에 대한 다중검출이 가능하다.

특히, 프로브 타입 형광물질은 탐침으로 사용되는 형광염료를 달리할 경우, 동시에 여러 표적 유전자에 대해 다중검출이 가능하다. 그러나 프로브 타입 형광물질을 사용하여 다중검출을 하기 위해서는 상이한 파장 대를 갖는 형광염료에 의해 표지된 여러 개의 프로브를 사용하여야 한다. 이와 같이 여러 개의 프로브를 사용할 경우, 프로브 간의 간섭이 발생하기 때문에 이를 방지하기 위한 프로브 디자인이 까다롭고 제작비용이 비싸다는 단점이 있다. 또한, 여러 형광염료에서 발광하는 형광을 구분하여 측정하기 위해서는 다수의 광원 모듈과 다수의 광검출 모듈이 구비되어야 하므로 PCR 장치의 구조가 복잡해지는 문제가 있다.

한편, 실시간 PCR 장치(thermal cycler)는 PCR 칩, PCR 칩을 가열 냉각하기 위한 히팅블록, 히팅블록의 온도를 제어하는 제어부, PCR 칩에 광을 조사하는 광원 및 PCR 칩에서 방사되는 형광을 수광하여 검출하는 광 검출부를 포함한다. 따라서 PCR 공정이 진행되는 동안에 PCR 칩에 구비된 다수의 혼합채널에서 발광하는 형광의 세기를 검출하여 목표 유전자의 증폭 여부 및 정도를 실시간으로 측정할 수 있다.

그러나 다중검출을 위해서 여러 종류의 형광염료(Reporter)를 사용하는 경우에는 여러 형광염료에서 발광하는 파장을 구분하여 측정하기 위해서 다수의 광원과 다수의 광 검출부가 구비되어야 한다. 이에 따라 종래의 실시간 PCR 장치는 다중검출을 위해서 장치의 구조가 복잡해지고 소형화가 어려워지는 문제가 있었다.

이에 따라 다중검출이 가능하면서도 단일파장의 광원에서 조사되는 여기 광에 반응하여 동일 파장 대의 형광을 발산하는 형광물질을 사용함으로써 실시간 PCR 장치의 구조를 단순하게 하여 소형화 및 경량화할 수 있는 실시간 PCR 장치의 개발이 요청되고 있다.

또한, PCR 칩을 이용하여 다중검출을 하기 위해서는 먼저 목표 유전자가 포함된 시료를 PCR 칩에 구비된 다수의 혼합채널에 균등하게 분주할 필요가 있는데, 종래에는 피펫이나 스포이트를 사용하여 각각의 혼합채널에 단일시료를 주입하기 때문에 시료를 분주하는 과정에서 시료에 서로 다른 시약이 묻거나 외기에 노출되어 그 특성이 변하는 경우가 있다. 이에 따라 각 혼합채널에 분주된 시료가 단일시료인지에 대한 신뢰성이 떨어지는 문제가 있다.

대한민국 등록특허 제10-1253455호(등록일: 2013년 04월 04일)

본 발명은 이러한 종래 기술의 문제를 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 주된 목적은 마이크로 PCR 칩을 사용하는 실시간 PCR 장치에서 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능하도록 하는 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적으로 PCR 칩에 구비된 다수의 챔버와 채널에 단일시료를 분배할 때 다른 시약이나 이물질이 주입되어 오염되지 않도록 하고 각 챔버와 채널로 이송되는 시료 간에 시간차를 없애고 밀폐된 채널을 통해 이송함으로써 단일시료에 대한 신뢰도를 향상시킬 수 있는 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 무동력으로 시료를 다수의 챔버와 채널로 이송할 수 있도록 하여 PCR 칩의 구조를 단순하게 할 수 있는 단일시료를 이용한 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 다수의 채널에서 발광하는 형광을 디지털 카메라로 촬영하여 획득한 이미지를 RGB 분석하고 이를 근거로 목표 유전자의 종류와 유무를 판단하여 다중진단이 가능하도록 함으로써 구조를 단순하게 하고 소형화 및 경량화할 수 있는 단일시료를 이용한 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치를 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치는,

하나의 시료챔버와 다수의 시약챔버 그리고 상기 하나의 시료챔버와 다수의 시약챔버를 연결하는 다수의 혼합채널이 형성된 일정한 두께의 투명한 기판과 상기 기판의 하면에 부착되는 밀봉필름으로 이루어진 PCR 칩과;

상기 PCR 칩이 안착되는 안착홈이 일정한 깊이로 형성된 가열냉각모듈과;

상기 안착홈의 바닥을 형성하는 히팅플레이트와;

상기 히팅플레이트의 하부에 설치되어 이를 가열하거나 냉각하는 열전소자와;

상기 열전소자의 하면에 부착되어 상기 열전소자에서 생기는 열 또는 냉기를 방출하는 방열판과;

상기 방열판의 하부에 설치되는 송풍기와;

상기 안착부에 안착되어 있는 상기 PCR 칩의 적어도 설치되어 상기 PCR 칩의 다수의 챔버나 채널에 광을 조사하는 광원과;

상기 PCR 칩의 상부에 설치되어 상기 PCR 칩의 각 챔버나 채널에서 방사되는 형광을 측정하는 카메라와;

상기 PCR 장치의 내부에 설치되는 제어부와;

상기 PCR 장치의 상면에 설치되고 상기 제어부와 전기적으로 연결되어 정보를 입력하거나 표시하는 디스플레이부를 포함하되,

상기 카메라는, 상기 광원에서 조사되는 빛과 반응하여 다양한 종류의 시약에서 발광하는 형광을 촬영하여 형광 이미지를 획득하고, 상기 제어부는 상기 카메라에서 획득한 형광 이미지를 RGB 분석하고 그 결과를 메모리에 저장되어 있는 정보와 비교하여 목표 유전자 또는 질병을 진단하는 것을 특징으로 한다.

상기 광원은 상기 PCR 칩의 일 측면에 설치되고 상기 다수의 시약챔버 쪽으로 광을 조사할 수 있도록 상기 다수의 시약챔버와 대응되게 설치된 다수의 LED를 포함한다.

상기 광원은 상기 PCR 칩의 양 측면에 설치되고 상기 다수의 혼합채널의 양 측면에서 다수의 혼합채널을 가로질러 통과하도록 설치된다.

상기 광원에 설치된 다수의 LED는 단일 파장대의 광을 조사하거나 서로 다른 파장대의 광을 조사한다.

상기 광원에 설치된 다수의 LED는 대응하는 각 시약챔버에 주입된 형광염료와 반응할 수 있도록 서로 다른 파장대의 광을 조사한다.

상기 가열냉각모듈은 전후로 슬라이드 가능하게 설치되고, 상기 안착홈의 후단에는 상기 가열냉각모듈의 전 후진에 따라 상하로 회동하여 상기 안착홈에 안착되어 있는 PCR 칩을 고정하기 위한 고정대가 설치된다.

본 발명에 있어서, 상기 PCR 칩은, 상기 기판의 일측에 기판을 관통하도록 형성되어 상부에 시료주입구가 형성되는 하나의 시료챔버와; 상기 기판의 타측 하면에 일정 깊이로 형성되는 다수의 시약챔버와; 상기 기판의 하면에 일정한 깊이로 형성되어 상기 하나의 시료챔버와 다수의 시약챔버를 연결하는 다수의 혼합채널과; 상기 시약챔버와 연통하도록 상기 기판의 상면에 일정한 깊이로 형성되는 시약주입구와; 상기 기판의 하면에 부착되어 하나의 시료챔버와, 다수의 시약챔버 및 혼합채널의 개방된 하부를 폐쇄하는 밀봉필름을 포함하되 상기 다수의 시약챔버에는 시약주입구를 통해 각각 시약이 주입되고, 상기 하나의 시료챔버에는 단일시료가 시료주입구를 통해 주입되며, 상기 밀봉필름은 친수성을 갖도록 코팅되어 상기 시료챔버에 단일시료를 주입하는 동시에 무동력으로 다수의 혼합채널을 통해 다수의 시약챔버로 단일시료가 이송되어 단일시료에 대한 신뢰도가 향상되는 것을 특징으로 한다.

상기 혼합채널은 상기 시약챔버의 지름과 유사한 지름을 갖는 혼합채널부와 상기 혼합채널부의 지름보다 작은 지름을 갖는 협소채널부를 포함하되, 상기 혼합채널부는 상기 시약챔버 쪽에 일정 길이로 형성되고, 상기 협소채널부는 상기 시료챔버 쪽에 일정 길이 형성되어 상기 혼합채널부와 연결되며, 상기 혼합채널부와 협소채널부 사이에는 단턱이 형성된다.

상기 밀봉필름의 표면은 친수성을 갖도록 친수성 처리될 수 있다.

상기 밀봉필름은 하나의 시료챔버, 다수의 시약챔버 및 다수의 혼합채널의 개방된 하면을 폐쇄하는 밀봉필름의 표면이 부분적으로 친수성을 갖도록 처리될 수 있다.

상기 시약주입구의 개방된 상단과 상기 시료챔버의 개방된 상단은 상기 기판의 상면에 부착되는 스티커를 이용하여 폐쇄된다.

상기 시약챔버에 주입된 시약은 시약챔버의 바닥(밀봉필름의 표면)에 고착된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 다중진단이 가능한 실시간 중합효소 연쇄반응장치는 단일시료를 사용하여 다중진단이 가능하고, 별도의 장치 없이도 시료를 신속하게 분배할 수 있어 현장에서 신속하고 편리하게 분자진단을 수행할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 디지털 카메라를 이용하여 형광 이미지를 분석하여 목표유전자를 판단하거나 질병을 진단할 수 있기 복잡한 구조의 광검출기를 생략하여 PCR 장치의 구조가 단순하고 소형화되어 현장에서 사용하거나 휴대하기가 편리하다는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 PCR 칩은 하나의 시료챔버가 다수의 혼합채널을 통해 다수의 시약챔버 연결돼있기 때문에 한 번의 시료주입시 다수의 혼합채널과 시약챔버로 신속하게 시료를 분주할 수 있기 때문에 각 시약챔버로 이송되는 시약 간에 시차가 거의 발생하지 않고 외기에 노출되지 않기 때문에 단일시료에 대한 신뢰성이 향상되어 다중진단이 가능하다는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 하나의 시료챔버와 다수의 시약챔버 및 혼합채널을 개방된 하단을 밀폐하는 밀봉비닐의 표면을 부분적으로 친수성을 갖도록 처리하여 무동력의 상기 시료챔버에 주입되는 시료를 다수의 혼합채널과 시약챔버로 신속하게 이송할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치의 일 예를 보여주는 사시도,
도 2는 본 발명에 따른 PCR 칩의 일 예를 보여주는 사시도,
도 2는 도 1에 도시된 본 발명에 따른 가열냉각모듈의 구조를 보여주는 단면도,
도 3은 도 2에 도시된 가열냉각모듈에 설치된 광원의 일 예를 보여주는 평면도,
도 4는 본 본 발명에 따른 PCR 칩의 사시도,
도 5는 도 4에 도시된 본 발명에 따른 PCR 칩의 평면도,
도 6은 도 4에 도시된 본 발명에 따른 PCR 칩의 단면도,
도 7 및 도 8은 도 1에 도시된 본 발명에 따른 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치의 작용을 보여주는 단면도,
도 9는 본 발명에 따른 광원의 다른 실시 예를 보여주는 평면도,
도 10 및 도 11은 본 발명에 따른 PCR 칩을 이용하여 시료를 분배하는 과정을 보여주는 측면도와 평면도이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술 되는 실시 예를 통해 설명될 것이다. 그러나 본 발명은 여기에서 설명되는 실시 예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 본 실시 예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여 제공되는 것이다. 또한, 본 발명의 실시 예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시 예에 대해 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.

-용어의 정의-

먼저, 본 특허 명세서에서 사용되는 용어를 정의한다.

본 특허 명세서에서 사용되는 용어 "PCR(polymerase chain reaction)" 또는 "중합효소 연쇄반응"은 열 안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드트리포스페이트 혼합물(dNTP mixture), Mg²⁺ 등의 2가 이온을 포함하는 반응 혼합물이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 특허 명세서에서는 "증폭 산물"이라고 지칭하였다.

본 특허 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 PCR 반응의 개시를 위해 사용되는 것으로, 주형 DNA에 상보적으로 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. PCR 반응을 위한 프라이머는 증폭되는 핵산분자의 유전자 코드 진행방향과 동일한 센스 가닥으로부터 선택되는 포워드 프라이머(또는 센스 프라이머) 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로부터 선택되는 리버스 프라이머(또는 안티센스 프라이머)의 쌍이 사용된다.

본 특허 명세서에서 사용되는 용어 "실시간 PCR 장치"는 특정 염기서열을 갖는 핵산을 증폭함과 아울러 PCR 산물의 발생 유무 및 정도를 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다. 또한, '다중진단'은 단일시료를 사용하여 다양한 핵산을 증폭하는 멀티플렉스 PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 여러 가지 질병을 한 번에 확인하거나 분석하기 위한 것이다.

본 특허 명세서에서 사용되는 용어 'PCR 공정'은, 특정 염기서열을 갖는 DNA(deoxyribonucleic acid)를 증폭하기 위해, 이중나선 DNA를 포함하는 시료 용액을 특정 온도, 예를 들어 약 95℃로 가열하여 이중나선 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리하는 DNA 변성단계(denaturing step), 시료 용액에 증폭하고자 하는 특정 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머를 제공하고, 분리된 단일 가닥 DNA와 함께 특정 온도, 예를 들어 55℃로 냉각하여 단일 가닥 DNA의 특정 염기서열에 프라이머를 결합시켜 부분적인 DNA-프라이머 복합체를 형성하는 어닐링단계(annealing step), 및 어닐링 단계 이후 시료 용액을 적정 온도, 예를 들어 72℃로 유지하여 DNA 중합효소(polymerase)에 의해 부분적인 DNA-프라이머 복합체의 프라이머를 기초로 이중나선 DNA를 형성하는 DNA 합성단계(extension step)를 수행하고, 3단계를 예를 들어, 20회 내지 40회로 반복함으로써 특정 염기서열을 갖는 DNA를 기하급수적으로 증폭할 수 있다. 이때, 경우에 따라, PCR 장치는 어닐링 단계와 합성단계를 동시에 수행할 수 있다.

본 특허 명세서에서 사용되는 용어 '시료'는 증폭하고자 하는 주형이 되는 유전물질 또는 이러한 유전물질이 포함된 생물학적 용액을 말한다. 그리고 '시약'은 형광염료, 프로브 등을 포함한다. 그리고 '마스터 혼합물'은 프라이머(Primer), DNA 중합효소(Taq polymerase or DNA polymerase), dNTP, 완충액(buffer solution), 염화마그네슘(MgCl₂) 등을 포함하는 혼합물을 말한다. 여기서, 주형이 되는 유전물질로는 보통 플라스미드 DNA, genomic DNA, cDNA, total RNA 등을 사용하고, 프라이머는 목표 유전자의 특정 부위 양끝에 결합할 수 있는 25~40bp 길이의 프라이머 한 쌍으로 이루어진다. 또한, DNA 중합효소는 90℃ 이상의 고온에서도 활성을 잃지 않는 효소를 사용한다. dNTP는 합성의 재료인 뉴크레오티드로서 dATP, dCTP, dGTP, dTTP로 구성된다. 또한, DNA 중합효소가 작용하고 dNTP와 프라이머가 결합하기 위하여 Mg²⁺가 필요하다. 완충액은 중합효소의 활성을 위해 필요하다.

이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명에 따른 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치(중합효소 연쇄반응장치)의 바람직한 실시 예에 대해 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치(1)의 일 예를 보여주는 사시도이고, 도 2는 도 1에 도시된 본 발명에 따른 가열냉각모듈의 구조를 보여주는 단면도이며, 도 3은 도 2에 도시된 가열냉각모듈에 설치된 광원의 일 예를 보여주는 평면도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명의 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치(1)(이하 '중합효소 연쇄반응장치 또는 PCR'이라 한다.)는, 크게 PCR 장치 본체(2)와, 상기 PCR 장치 본체(2)에 삽입될 수 있도록 이루어진 PCR 칩(5)을 포함한다.

상기 본체 케이스(4)의 전면에는 개구부(41)를 통해 전후방으로 슬라이드 가능하게 설치되는 가열냉각모듈(7)이 설치된다. 그리고 상기 PCR 장치 본체(2)의 상면에는 선택노브(8)와 디스프레이패널(9)이 구비된다.

상기 PCR 칩(5)은 냉각 가열 사이클을 통해서 목표 유전자를 대량으로 증폭하기 위한 것으로, 다수의 챔버와 혼합채널이 형성된 일정한 두께의 투명한 기판(51)과 상기 기판(51)의 하면에 부착되는 밀봉필름(52)으로 이루어진다.

구체적으로, 상기 가열냉각모듈(7)은 상기 개구부(41)를 통해 본체 케이스(4)의 내부에 삽입 가능하도록 사각블록 형태로 이루어진다. 그리고 그 상면에는 상기 PCR 칩(5)이 안착될 수 있도록 안착홈(71)이 일정한 깊이로 형성된다. 또한, 상기 안착홈(71)의 후단에는 가열냉각모듈(7)의 전 후진에 따라 상하로 회동하여 상기 안착홈(71)에 안착되어 있는 PCR 칩(5)을 고정하기 위한 고정대(32)가 설치된다.

도 2는 본 발명에 따른 가열냉각모듈(7)의 일 예를 보여주는 단면도이다. 도시된 바와 같이, 상기 가열냉각모듈(7)은 히팅부(73), 송풍팬(74) 및 광원(75)을 포함한다. 상기 히팅부(73)는 안착홈(71)에 안착되어 있는 PRC 칩(5)을 가열 냉각하기 위한 것으로, 상기 안착홈(71)의 바닥을 형성하는 히팅플레이트(731)와, 상기 히팅플레이트(731)의 하부에 설치되어 이를 가열하거나 냉각하는 열전소자(732)와, 상기 열전소자(732)의 하면에 부착되고 상기 송풍팬(74)에 의해 송풍되는 바람을 이용하여 열전소자(732)에서 생기는 열 또는 냉기를 방출하는 방열판(734)을 포함한다.

상기 히팅플레이트(731)은 열전달율이 우수한 소재로 이루어지고, 상기 PCR 칩(5)의 하면에 밀착될 수 있도록 평판으로 이루어진다. 상기 열전소자(732)는 외부로부터 인가되는 전류의 방향에 따라 가열되거나 냉각된다. 상기 열전소자(732)에서 발생하는 열기와 냉기는 히팅플레이트(731)를 통해서 PCR 칩(5)으로 전달된다. 이때, 상기 PCR 칩(5)의 하면에 부착된 밀봉필름(52)은 두께가 얇은 박막 필름으로 만들어지기 때문에 히팅플레이트(731)의 열이나 냉기를 신속하게 전달한다. 상기 방열판(734)은 열전도율이 우수한 소재로 이루어지고 하면에는 다수 개의 방열 핀이 하부로 돌출되게 형성되어 송풍팬(74)에 의해 송풍되는 바람을 이용하여 열전소자(732)에서 발생하는 열이나 냉기를 외부로 방출함으로써 열전소자(732)의 효율을 향상시킨다.

그리고 상기 안착홈(71)의 일 측면에는 광원(75)이 설치된다. 상기 광원(75)은 도 6에서 보는 바와 같이, 상기 안착홈(71)에 안착되어 있는 PCR 칩(5)의 일 측면에 광을 조사할 수 있도록 설치된 다수의 LED(751)와 이들이 설치된 인쇄회로기판(752)을 포함한다. 상기 다수의 LED(751)는 다수의 시약챔버(55) 쪽으로 광을 조사할 수 있도록 대응되게 형성된다. 또한, 상기 시약챔버(55)와 대응되도록 설치된 다수의 LED(751) 사이에는 보조 LED가 더 설치되어 면광을 조사할 수도 있다.

바람직하게 상기 다수의 LED(751)는 단일 파장대의 광을 조사하거나 서로 다른 파장대의 광을 조사할 수 있다. 또는 일부는 단일 파장대의 광을 조사하고 다른 일부는 서로 다른 파장대의 광을 조사할 수도 있다. 특히 서로 다른 파장대의 광을 조사하는 경우에는 대응하는 시약챔버(55)에 주입되는 형광염료의 반응특성을 고려하여 다중진단이 가능하도록 한다.

이어, 상기 기판(51)은 도 4에서 보는 바와 같이, 투명한 고분자 물질로 이루어진 사각 판 형상으로 이루어진다. 상기 기판(51)의 상면 양측에는 기판을 손으로 잡고 움직이기 용이하도록 두 개의 수직벽(511)이 돌출되게 형성된다. 그리고 상기 기판(51)의 일측에는 상기 기판(51)을 관통하도록 하나의 시료챔버(53)가 형성된다. 상기 시료챔버(53)는 기판(51)를 상하로 관통하여 이루어진다. 그리고 상기 시료챔버(53)의 개방된 상단은 시료를 주입하는 시료주입구(53a)의 역할을 한다. 그리고 상기 시료챔버(53)의 개방된 하부는 상기 밀봉필름(52)에 의해 폐쇄된다.

이어, 상기 기판(51)의 타측 하면에는 일정 깊이로 다수의 시약챔버(55)가 형성된다. 바람직하게 상기 시약챔버(55)는 원형으로 이루어지고 다수의 시약챔버(55)가 일렬로 배치된다. 그리고 상기 시약챔버(55)는 기판(51)의 하면에서 일정한 깊이로 형성되고 상면에는 상기 시약챔버(55)에 시약을 주입할 수 있도록 일정한 깊이로 시약주입구(55a)가 형성된다. 상기 시약주입구(55a)의 지름은 시약챔버(55)의 지름에 비해 작게 형성되어 상기 시약챔버(55)와 시약주입구(55a) 사이에는 단턱(55b)이 형성되게 된다. 그리고 상기 시약챔버(55)의 개방된 하부는 상기 기판(51)의 하면에 부착되는 밀봉필름(52)에 의해 폐쇄된다.

그리고 상기 기판(51)의 하면에는 하나의 시료챔버(53)와 다수의 시약챔버(55)를 연결하는 다수의 혼합채널(54)이 일정한 깊이로 형성된다. 도 6에서 보는 바와 같이, 상기 혼합채널(54)은 혼합채널부(541)와 협소채널부(542)로 이루어진다. 상기 혼합채널부(541)는 시약챔버(55) 쪽에 일정 길이로 형성되고 상기 협소채널부(542)는 시료챔버(53) 쪽에 일정 길이로 형성되어 상기 혼합채널부(541)와 만나도록 연장된다. 이때 상기 혼합채널부(541)는 시약챔버(55)와 유사한 폭과 높이를 갖고 상기 협소채널부(542)는 상기 혼합채널부(541)보다 작은 폭과 높이를 갖는다. 따라서 혼합채널부(541)와 협소채널부(542) 사이에는 일정한 폭과 높이의 단턱(543)이 형성된다.

그러므로 상기 시료챔버(53)로 공급되는 시료는 상기 협소채널부(542)와 혼합채널부(541)를 통해 시약챔버(55)로 이동할 수 있다. 그러나 상기 시약챔버(55) 내에 주입되는 시약이나 혼합물은 상기 협소채널부(542)로 인해 상기 시료챔버(53)로 역류하지 않게 된다. 즉, 상기 협소채널부(542)는 시약챔버(55)에서 시료챔버(53)로 시약이나 혼합물이 역류하는 것을 방지한다. 또한, 상기 시약주입구(55a)의 개방된 상부와 시료주입구(53)의 개방된 상단은 상기 기판(51)의 상면에 부착되는 스티커(57)에 의해 밀봉될 수 있다.

한편, 상기 밀봉필름(52)은 기판(51)의 하면에 부착되는 다수의 시약챔버(55)와 혼합채널(54) 그리고 하나의 시료챔버(53)의 개방된 하부를 폐쇄하는 역할을 한다. 또한, 상기 밀봉필름(52)은 박막 필름으로 이루어져 그 하부에 설치되는 히터부의 열이나 냉기를 신속하게 전달할 수 있도록 한다. 이를 위해 상기 밀봉필름(52)은 열전달효율이 우수한 금속으로 이루어지거나 나노 탄소나 탄소튜브를 포함하는 고분자물질로 이루어질 수 있다.

아울러, 상기 밀봉필름(52)은 시료챔버(53)에 주입된 시료를 무동력으로 다수의 혼합채널(54)을 통해 다수의 시약챔버(55)로 신속하게 이송하는 역할도 수행한다. 이를 위해 상기 밀봉필름(52)의 표면은 친수성을 갖도록 처리되어야 한다. 즉, 통상의 플라스틱제의 밀봉필름은 그 표면이 소수성을 띠거나 +전하로 대전 된 상태이기 때문에 -전하를 갖는 시료를 시료챔버(53)에 주입할 때 신속하게 이송되지 않거나 불균등하게 분배되는 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 종래에는 기판(51)을 경사지게 기울이거나 펌프 또는 원심력 등의 동력을 이용하여 시료를 이송하였으나 구조가 복잡해지는 문제가 있었다. 그러나 본 발명은 밀봉필름(52)은 화학적 처리, 자외선 조사, 플라즈마 처리 등의 방법으로 그 표면이 친수성을 갖도록 처리하여 무동력으로 시료를 이송할 수 있게 된다.

한편, 밀봉필름(52)은 진공플라즈마 처리를 이용하여 친수성을 갖도록 처리할 수 있으나 공기 중에 노출되면 친수성의 효과가 오래가지 못한다. 또한, 친수성 처리된 밀봉필름(52)은 접착제가 잘 붙지 않기 때문에 기판(51)의 하면에 밀봉필름(52)이 부착할 수 없는 문제가 있다. 이에 따라, 상기 밀봉필름(52)은 하나의 시료챔버, 다수의 시약챔버 및 다수의 혼합채널의 개방된 하면을 폐쇄하는 밀봉필름의 표면이 부분적으로 친수성 처리한다. 예를 들어, 본 발명의 PCR 칩(5)에서는, 상기 기판(51)의 하면에 밀봉필름(52)을 접착한 다음 진공플라즈마 처리를 한다. 그러면 상기 시료챔버(53)의 시료주입구(53a)와 다수의 시약주입구(55a)를 통해 플라즈마가 기판(51)의 하면에 부착된 밀봉필름(52)의 표면을 친수성으로 처리하게 된다. 즉, 상기 시료챔버(53), 다수의 시약챔버(55) 및 다수의 혼합채널(54)을 폐쇄하고 있는 밀봉필름의 표면만을 친수성으로 처리할 수 있다. 그리고 진공플라즈마 처리된 PCR 칩(5)은 알루미늄으로 이루어진 기밀봉투에 보관하여 유통함으로써 외기와 접촉하지 않도록 하여 친수성의 효과가 유지될 수 있도록 한다. 그러나 기판(51)이나 밀봉필름(52) 전체를 수용성 처리하는 것도 가능함은 물론이다.

그리고 상기 기판(51)의 하면에는 시료챔버(53), 다수의 시약챔버(55) 및 혼합채널(54)을 따라 일정한 높이로 돌출부(58)가 형성된다. 또한, 이들을 감싸도록 사각형으로 돌출부(59)도 형성된다. 이들 돌출부(58)(59)는 밀봉필름(52)과 기판(51) 사이의 접촉면적을 최소화하여 밀봉필름(52)을 쉽게 접착할 수 있게 한다. 또한, 상기 기판(51)의 상면에는 시료주입구(53a)와 다수의 시약주입구(55a)를 폐쇄하는 스티커(57)가 설치될 수 있다.

이와 같이, 상기 마이크로 칩(5)은 하나의 시료챔버(53)에 주입되는 단일시료가 밀봉필름(52)의 친수성으로 처리된 표면을 통해 다수의 시약챔버(55)에 신속하게 분주할 수 있다. 또한, 시료가 밀폐된 혼합채널(54)을 통해 분주되기 때문에 시료를 분주하는 과정에서 피펫이나 팁을 사용하지 않고 외기와도 접촉하지 않는다. 아울러, 각 혼합채널(54)에는 협소채널부(542)를 형성하여 각 시약챔버(55) 내의 시약이나 혼합물이 시료챔버(53)로 역류하는 것을 막기 때문에 서로 다른 시약이 혼합되는 것을 방지할 수 있어 다른 시약이나 이물질이 유입되지 않아서 단일시료에 대한 신뢰도가 높아진다.

한편, 상기 다수의 시약챔버(55)에는 시약주입구(55a)를 통해 시약이 주입된다. 예를 들어, 시약에는 형광염료나 프로브 등을 포함된다. 그리고 상기 시약챔버(55)에 주입된 시약은 동결 건조하여 시약챔버(55)의 바닥 즉, 밀봉필름(52)의 표면에 고착시킬 수 있다. 이때, 다수의 시약챔버(55)에 서로 다른 시약을 주입하는 작업은 정밀성이 요구되므로 실험실에서 전문가에 의해 이루어질 수 있다. 따라서 현장에서는 채취된 시료를 하나의 시료챔버(53)에 주입하는 것만으로 서로 다른 시약과 시료를 반응시킬 수 있게 된다.

바람직하게, 상기 하나의 시료챔버(53)에는 단일시료가 주입된다. 여기서 단일시료는 증폭하고자 하는 주형이 되는 유전물질이 포함된 하나의 생물학적 시료를 말한다. 또한, 상기 시료에는 프라이머(Primer), DNA 중합효소(Taq polymerase or DNA polymerase), dNTP, 완충액(buffer solution), 염화마그네슘(MgCl₂) 등을 포함하는 마스터 혼합물이 포함될 수 있다. 그리고 시료챔버(53)에 주입되는 시료는 친수성인 밀봉필름(52)의 표면을 따라 신속하게 이송될 수 있다. 즉, 상기 시료챔버(53)에 시료를 주입하면 주입과 동시에 다수의 혼합채널(54)을 통해 다수의 시약챔버(55)로 균등하게 분배된다.

그리고 상기 시약챔버(55)에는 서로 다른 시약이 주입된다. 상기 시약은 형광염료를 포함하는 것으로서 바람직하게 다수의 시약챔버(55)에는 서로 다른 형광염료. 프로브가 포함된다. 바람직하게 상기 다수의 시약챔버(55)에 주입된 시약은 별도의 동결 건조과정을 거쳐 시약챔버(55)의 바닥 즉, 밀봉필름(52)의 표면에 고착될 수 있다. 이와 같이, 다수의 시약챔버(55)에 여러 가지 시약을 주입하는 작업은 실험실에서 이루어지고, 현장에서는 하나의 시료챔버(53)에 시료를 주입하여 다수의 시약챔버(55)에 고착되어 있는 시료를 용해한 후 상기 PCR 칩(5)을 PCR 장치에 넣고 PCR 과정을 수행할 수 있다.

다시 도 1 및 도 2를 참조하면, 상기 가열냉각모듈(7)의 상면에는 안착홈(71)에 안착되어 있는 PCR 칩(5)을 눌러서 고정하는 고정대(32) 더 설치된다. 상기 고정대(32)는 PCR 칩(5)과 유사한 크기와 형태를 갖는 누름판(34)이 설치되되, 상기 누름판(34)에는 일정한 크기로 투시창(35)이 형성된다. 상기 투시창(35)은 PCR 기판(5)에 형성된 다수의 혼합채널(54)에 대응하게 형성되어 후술하는 카메라를 이용하여 다수의 혼합채널(54)에서 방사되는 형광을 촬영할 수 있도록 한다. 그리고 상기 고정대(32)의 하단에는 안착홈(71)의 후단에 결합하도록 힌지(36)가 설치된다. 이때 상기 힌지(36)에는 복원 스프링이 구비된다. 따라서 상기 가열냉각모듈(7)을 전후로 슬라이드 시키면 상기 고정대(32)는 본체 케이스(4)의 전면과 접촉하여 전후로 회동하게 된다. 아울러 상기 가열냉각모듈(7)의 측면에는 원활하게 슬라이드 하도록 레일(47)이 설치된다.

이어서, 도 7은 본 발명에 따른 PCR 장치 본체(2)의 내부구성을 보여주는 단면도이다. 도시된 바와 같이, 상기 본체 케이스(4)의 내부 공간에는 카메라(41)와 제어부(42)가 설치되고, 상기 본체 케이스(4)의 상면에는 디스플레이패널(8)이 상하로 회동 가능하게 설치된다. 그리고 상기 본체 케이스(4)의 내부에는 전원부(43)가 설치된다.

상기 카메라(41)는 광원(75)에서 조사되는 광과 반응하여 형광염료에서 발광하는 형광을 촬영한다. 상기 카메라(41)는 다수의 혼합채널(54)을 한꺼번에 촬영할 수 있도록 그 상부에 설치된다. 바람직하게 카메라(41)는 디지털카메라로서, CCD나 CMOS 등의 이미지 센서(image sensor)를 사용한다. 또한, 각종 렌즈와 필터가 사용될 수 있다. 따라서 상기 카메라(41)는 PCR 공정이 진행되는 동안 상기 다수의 혼합채널(54)에서 방사되는 형광을 일정한 시간 간격으로 촬영하여 이미지를 획득한다.

그리고 상기 제어부(42)는 열전소자(732), 송풍팬(74), 선택노브(8), 디스플레이패널(9) 등과 전기적으로 연결되어 장치 전반을 제어함과 아울러 카메라(41)와 전기적으로 연결되어 획득된 이미지를 분석한다. 이를 위해, 상기 제어부(42)는 마이크로프로세서와 메모리를 포함한다. 상기 마이크로프로세서는 카메라(41)에서 촬영된 이미지의 색상(RGB)을 분석한다. 이를 위해 상기 메모리에는 RGB 분석프로그램이 탑재된다. 상기 마이크로프로세서는 RGB 분석프로그램을 구동하여 각 혼합채널(34)에서 발광된 형광의 RGB를 분석하여 일정한 비율의 수치로 변환시킨다. 예를 들어, 'RGB(255,0,0)'은 초록색과 파란색이 0이기 때문에 빨간색으로 판단한다. 그리고 RGB(255, 100, 0)이라면 초록색이 조금 섞인 연한 빨간색으로 판단할 수 있다.

그리고 상기 메모리에는 광원(75)의 파장대에 대응하여 발광하는 형광의 색의 종류(RBG 비율)와 강도에 따라 다양한 종류의 목표 유전자나 질병이 테이블을 이용하여 저장되어 있다. 따라서 상기 마이크로프로세서는 각 시약챔버(55)에서 발광하는 색상(RBG 비율)과 테이블에 저장되어 있는 목표 유전자나 질병의 종류를 비교한다. 그리고 그 결과를 메모리에 저장한 후 디스플레이패널을 통해 표시한다.

한편, 도 8에서 보는 바와 같이, 상기 본체 케이스(4)의 내부에는 가열냉각모듈(7)이 전후로 슬라이드 가능하게 설치된다. 예를 들어, 상기 가열냉각모듈(7)이 전방으로 이동하여 본체 케이스(4)에서 분리되면, 상기 본체 케이스(4)의 후단에 형성된 전원커넥터(431)가 분리되어 가열냉각모듈(7)로 공급되는 전원이 끊어진다. 반대로 가열냉각모듈(7)이 후방으로 이동하여 본체 케이스(4) 내로 삽입되면, 상기 본체케이스(4)의 후단에 형성된 전원커넥터(431)가 결합하여 가열냉각모듈(7)로 전원이 공급되게 된다. 또한, 상기 가열냉각모듈(7)의 상면에는 스위치가 더 설치된다. 상기 스위치는 본체 케이스(4)와 접촉되어 켜지거나 꺼진다. 예를 들어, 상기 가열냉각모듈(7)이 전방으로 전진하면 스위치가 켜지고 후방으로 후퇴하면 본체 케이스(4)와 스위치가 접촉되어 켜지게 된다.

그리고 도 9는 상기 가열냉각모듈(7)에 설치되는 광원의 다른 실시 예를 보여주는 것으로서, 안착홈(71)의 양 측면에 각각 광원(75a)(75b)이 설치된다. 상기 두 개의 광원(75a)(75b)은 상기 안착홈(71)에 안착되어 있는 PCR 칩(5)의 다수의 혼합채널(54)을 가로질러 광을 조사할 수 있도록 설치된 다수의 LED(751)와 이들이 설치된 인쇄회로기판(752)을 포함한다. 다수의 LED(751)는 다수의 혼합채널(54)을 가로지르도록 대응되게 형성된다. 또한, 상기 다수의 LED(751) 사이에는 보조 LED가 더 설치되어 면광을 조사할 수도 있다. 바람직하게 상기 다수의 LED(751)는 단일 파장대의 광을 조사하거나 서로 다른 파장대의 광을 조사할 수 있다. 또는 일부는 단일 파장대의 광을 조사하고 다른 일부는 서로 다른 파장대의 광을 조사할 수도 있다. 특히 서로 다른 파장대의 광을 조사하는 경우에는 다수의 혼합채널(54)에 주입되는 형광염료의 반응특성을 고려하여 다중진단이 가능하도록 한다.

이하에서는 본 발명에 따른 PCR 칩을 이용하여 단일시료를 정량으로 분주하는 방법에 대해 설명한다.

도 10은 본 발명에 따른 PCR 칩을 이용하여 단일시료를 정량 분주하는 과정을 보여주는 단면도이고, 도 11은 본 발명에 따른 PCR 칩을 이용하여 단일시료를 정량 분주하는 과정을 보여주는 평면도이다.

먼저, 도 10a 및 도 11a는 본 발명에 따른 PCR 칩(5)의 일예를 보여준다. 본 발명의 PCR 칩(5)은 제조단계에서 알루미늄 봉투에 넣어 밀봉한 상태로 공급된다. 도시된 바와 같이, 하나의 시료챔버(53)와 다수의 시약챔버(55) 그리고 상기 시료챔버(53)와 다수의 시약챔버(55)를 연결하는 다수의 혼합채널(54)로 이루어진다.

이어 도 10b 및 도 10b는 다수의 시약챔버(55)에 피펫을 이용하여 시약(프라이머 및 PCR MIX)을 주입하는 모습을 보여준다. 바람직하게 여러 종류의 시약을 시약챔버(55)에 시약을 주입하는 단계는 시험실에서 전문가에 의해 실행되거나 자동화 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 그리고 시약이 주입된 PCR 칩(5)을 냉동건조에 넣어 냉동 건조해서 시약을 시약챔버(55)의 바닥에 고착시킨다. 이와 같이 시약을 바닥에 고착시키면 PCR 칩(5)을 이송하는 동안에 시약이 이동하거나 누출되는 것을 방지할 수 있다.

이어서 도 10c 및 도 11c는 상기 시료챔버(53)에 시료를 주입하는 모습을 보여준다. 시료를 시료챔버(53)에 주입하는 작업은 시료가 채취되는 현장에서 이루어진다. 피펫을 사용하여 시료를 시료챔버(53)에 주입하면, 도 10d 및 도 11d에서 보는 바와 같이, 주입된 시료는 즉시 다수의 혼합채널(54)을 통해 다수의 시약챔버(55)로 이송된다. 즉, 시료는 밀봉필름(52)의 친수성 처리된 표면을 따라 무동력으로 다수의 시약챔버(55)로 신속하게 이송된다. 그리고 시약챔버(55)로 이송된 시료는 고착된 시약을 녹여서 시약과 혼합된다. 그리고 시약과 시료가 혼합된 혼합액은 다수의 시약챔버(55)와 혼합채널(54)에 채워진다. 그러나 상기 혼합채널(54) 내의 혼합액은 협소채널부(642)로 인해서 시료챔버(53)로 역류하지 않는다. 그리고 상기 PCR 칩(5)의 상면에 스티커(57)를 부착하여 주입구를 밀봉한다.

이어 도 7 및 도 8에서 보는 바와 같이, 단일시료가 분주된 PCR 칩(5)은 가열냉각블록(7)의 상면에 형성된 안착홈(71)에 안착된다. 그리고 상기 가열냉각블록(7)을 본체 케이스(4)의 내부로 삽입하면, 상기 고정대(32)가 PCR 칩(5)의 상면을 가압하여 고정한다. 그리고 상기 히팅부(73)는 가열냉각 사이클을 반복하여 상기 다수의 시약챔버(55) 및 혼합채널(54) 내의 목표 유전자를 증폭한다. 그리고 PCR 과정에서 형광물질은 유전자와 결합하고 광원(75)에서 조사되는 빛과 반응하여 소정의 형광을 발광하게 된다. 그러면 상기 PCR 칩(5)의 상부에 설치된 카메라(41)는 다수의 혼합챔버(54)에서 발광하는 형광을 촬영하여 이미지를 획득한다. 이때 카메라(41)는 고정부(32)에 형성된 투시창(35)을 통해 형광을 측정할 수 있다. 상기 투시창(35)은 사각 형태로 이루어져 광원(75)에서 직접 조사되는 광을 차단한다. 바람직하게 상기 투시창(35)에는 다수의 혼합채널(34) 사이에 대응하도록 구획되는 다수의 차단벽이 설치될 수 있다. 상기 차단벽은 이웃하는 혼합챔버(34)에서 발광하는 형광에 의해 간섭이 일어나는 것을 방지한다.

이어, 상기 제어부(42)는 카메라(41)로부터 얻은 디지털 영상을 RGB 분석프로그램으로 분석하여 RGB를 일정한 수치의 비율로 나타낸다. 그리고 분석된 RGB의 비율은 광원의 파장대와 시약의 종류 등을 고려하여 목표 유전자 및 질병으로부터 예상되는 RGB 비율과 비교하여 목표 유전자 및 질병의 유무를 판단한다. 그 결과는 PCR 장치 본체(2)의 상면에 설치된 디스플레이패널(9)을 통해 외부로 표시될 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 단일시료를 이용하여 다중진단할 수 있다. 즉, 본 발명은 PCR 칩(6)의 다수의 시약챔버(55)에 서로 다른 형광염료를 주입시킨 후 각 시약챔버(55)에 단일시료 즉, 목표 유전자와 마스터 믹스가 포함된 시료를 주입하여 다수의 시약챔버(55)와 혼합채널(54)에 공급함으로써 다중진단이 가능하게 된다. 이때, 상기 광원(75)은 시약챔버(55)에 주입된 형광물질이 반응할 수 있는 파장대의 빛을 방사할 수 있도록 한다.

또한, 다수의 시약챔버(53)에 단일시료를 주입하여 다중진단을 하기 위해서는 각 시약챔버(55)로 공급되는 시료가 단일시료임을 보증할 수 있어야 한다. 즉, 다수의 시약챔버(55)로 공급되는 시료가 서로 다른 시약이 혼합되거나 이물질이 혼합되어 유전자 등이 변화가 있는 경우에는 단일시료에 대한 신뢰도가 떨어지게 된다. 예를 들어, 종래에는 단일시료를 여러 개의 피펫이나 피펫의 팁을 교환하면서 여러 개의 시약챔버에 주입하였다. 그러면 각 시약챔버(55)에 시료가 주입되는 시간이 다르고 시료를 다수의 시약챔버(55)에 주입 과정에서 외기에 노출되거나 피펫에 묻은 시약이 다른 시약챔버(55)로 들어갈 수 있기 때문에 단일시료에 대한 신뢰도가 떨어졌다.

그러나 본 발명에 따른 PCR 칩(5)은 하나의 시료챔버(53)가 다수의 혼합채널(54)을 통해 다수의 시약챔버(55)와 연결되어 있기 때문에 한 번의 시료주입시 다수의 혼합채널(54)과 시약챔버(55)로 시료가 분주되기 때문에 서로 다른 시약에 의해 오염될 염려가 없다. 또한, 상기 시료챔버(53)에 주입된 시료가 밀봉필름(52)의 친수성 표면을 통해 순간적으로 이송되기 각 시약챔버(55)로 공급되는 시료 간의 시차가 거의 발생하지 않고 밀폐된 혼합채널(54)을 통해 공급되기 때문에 외기의 이물질이 유입될 가능성이 거의 없게 된다. 따라서 본 발명의 PCR 칩(5)에 의하면 단일시료에 대한 신뢰성이 향상되어 다중진단이 가능하다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 다중진단이 가능한 실시간 중합효소 연쇄반응장치(1)는 광원의 종류에 따라서 단일 광원을 사용하여 다중진단하거나 여러 파장의 광원을 사용하여 다중진단하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 다양한 PCR 칩을 사용하여 단일시료를 사용하거나 여러 가지 시료를 사용하여 각종 질병을 진단할 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 PCR 칩(5)은 별도의 장치 없이도 시료를 균등하게 분배할 수 있어 현장에서 사용하기 편리하다. 또한, 본 발명은 디지털 카메라를 이용하여 디지털 영상을 얻고 그 색상을 분석하여 목표유전자를 판단하거나 질병을 진단하기 때문에 복잡한 구조의 광검출기를 생략하여 PCR 장치 본체의 구조가 단순하고 작아서 현장에서 사용하거나 휴대하기가 편리하다.

이상의 본 명세서와 도면에는 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 이상에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 오로지 특허청구범위에 기재된 청구항의 범주에 의하여 정의될 뿐이다.

1: 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치
2: PCR 장치 본체 4: 본체 케이스
5: PCR 칩 7: 가열냉각모듈
8: 선택노브 9: 디스프레이패널
51: 기판 52: 밀봉필름
53: 시료챔버 54: 혼합채널
55: 시약챔버 55: 시료주입구
57: 스티커 58,59: 돌출부
541: 혼합채널부 542: 협소채널부
543: 단턱 32: 고정대
71: 안착홈 73: 히팅부
74: 송풍팬 75: 광원
731: 히팅플레이트 732: 열전소자
734: 방열판

Claims (12)

1. PCR 칩과, 상기 PCR 칩이 안착되는 안착홈이 형성된 가열냉각모듈과, 상기 안착홈의 바닥을 형성하는 히팅플레이트와, 상기 히팅플레이트의 하부에 설치되는 열전소자와, 상기 열전소자의 하면에 부착되는 방열판과, 상기 방열판의 하부에 설치되는 송풍기와, 상기 안착홈에 안착된 상기 PCR 칩에 광을 조사하는 광원과, 상기 PCR 칩의 상부에 설치되어 상기 PCR 칩에서 방사되는 형광을 측정하는 카메라와, 이들을 제어하는 제어부 및 상기 상기 제어부와 전기적으로 연결되는 디스플레이부를 포함하는 PCR 장치에 있어서,
   상기 PCR 칩은, 기판의 일측에 기판을 관통하도록 형성되어 상부에 시료주입구가 형성되는 하나의 시료챔버와, 상기 기판의 타측 하면에 일정 깊이로 형성되는 다수의 시약챔버와, 상기 기판의 하면에 일정한 깊이로 형성되어 상기 하나의 시료챔버와 다수의 시약챔버를 연결하는 다수의 혼합채널과, 상기 시약챔버와 연통하도록 상기 기판의 상면에 일정한 깊이로 형성되는 시약주입구와, 상기 기판의 하면에 부착되어 하나의 시료챔버와, 다수의 시약챔버 및 혼합채널의 개방된 하부를 폐쇄하는 밀봉필름을 포함하고;
   상기 다수의 시약챔버에는 상기 시약주입구를 통해 각각 시약이 주입되고, 상기 하나의 시료챔버에는 단일시료가 상기 시료주입구를 통해 주입되며, 상기 기판의 하면에 부착되어 하나의 시료챔버와, 다수의 시약챔버 및 혼합채널의 개방된 하부를 폐쇄하는 상기 밀봉필름은 친수성 처리되어 상기 시료챔버에 단일시료를 주입하는 동시에 무동력으로 다수의 혼합채널을 통해 다수의 시약챔버로 단일시료가 이송되며, 상기 카메라는, 상기 광원에서 조사되는 빛과 반응하여 다양한 종류의 시약에서 발광하는 형광을 촬영하여 형광 이미지를 획득하고, 상기 제어부는 카메라에서 획득한 형광 이미지를 분석하고 그 결과를 메모리에 저장된 정보와 비교하여 목표 유전자 또는 질병을 진단하는 것을 특징으로 하는 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1 항에 있어서,
   상기 가열냉각모듈은 상기 PCR 장치의 전면에 형성된 개구부를 통해 전후로 슬라이드 가능하게 설치되고, 상기 안착홈의 후단에는 상기 가열냉각모듈의 전 후진에 따라 상하로 회동하여 상기 안착홈에 안착되어 있는 PCR 칩을 고정하기 위한 고정대가 설치되는 것을 특징으로 하는 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치
7. 삭제
8. 제1 항에 있어서,
   상기 혼합채널은 상기 시약챔버의 지름과 유사한 지름을 갖는 혼합채널부와 상기 혼합채널부의 지름보다 작은 지름을 갖는 협소채널부를 포함하되, 상기 혼합채널부는 상기 시약챔버 쪽에 일정 길이로 형성되고, 상기 협소채널부는 상기 시료챔버 쪽에 일정 길이 형성되어 상기 혼합채널부와 연결되며, 상기 혼합채널부와 협소채널부 사이에는 단턱이 형성되는 것을 특징으로 하는 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치.
9. 삭제
10. 제1 항에 있어서,
    상기 밀봉필름은 하나의 시료챔버, 다수의 시약챔버 및 다수의 혼합채널의 개방된 하면을 폐쇄하는 표면만 부분적으로 친수성 처리된 것을 특징으로 하는 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치.
11. 삭제
12. 제1 항에 있어서,
    상기 시약챔버에 주입된 시약은 시약챔버의 바닥(밀봉필름의 표면)에 고착되는 것을 특징으로 하는 단일시료를 이용하여 다중진단이 가능한 실시간 PCR 장치.

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