KR101253455B1 - 중합효소 연쇄반응 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미량의 생물학적 시료를 이용하여 핵산을 증폭하고 분석하기 위한 중합효소 연쇄반응장치에 관한 것으로, 판 형상의 투명기판과 필름 사이에 다수 개의 챔버를 형성하고 상기 투명기판의 일 측면에 광 조사기를 설치함으로써 상기 필름은 그 하부에 설치된 히터의 열을 상기 챔버에 수용된 시약으로 신속히 전달하고, 상기 투명기판은 상기 광 조사기에서 조사된 광을 챔버에 손실 없이 전달하고, 상기 챔버에 넓게 펴진 상태로 수용된 시료를 수평방향으로 관통하여 광 경로를 길게 함으로써 핵산 증폭의 시간을 단축할 뿐만 아니라 핵산 증폭의 결과를 현장에서 육안으로 확인할 수 있게 하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치에 관한 것이다.

Description

중합효소 연쇄반응 장치{Polymerase Chain Reaction Apparatus}

본 발명은 생물학적 시료를 이용하여 목표로 하는 핵산을 증폭하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 장치에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 핵산 증폭 과정을 신속하게 수행함과 아울러 그 결과를 바로 현장에서 직접 확인할 수 있는 중합효소 연쇄반응장치에 관한 것이다.

중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR) 기술은 DNA 또는 RNA의 특정영역을 반응기 안에서 대량으로 증폭하는 기술로서, 순수한 분자생물학 분야 이외에 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학, 나아가 고고학, 인류학에 이르는 분야까지 그 활용범위를 넓히고 있다.

통상 PCR은 3가지 반응단계로 진행되는데, 첫째는 변성(Denaturation) 단계로서, 이 단계에서는 이중가닥의 DNA를 90℃ 이상으로 처리하여 각각 한 가닥의 DNA로 분리시킨다. 그리고 둘째는 어닐링(Annealing) 단계로서, 이 단계에서는 2종류의 프라이머(primer)를 각각 상보적인 단일 가닥의 DNA에 결합시킨다. 이때 처리 온도는 보통 55~60℃이다. 셋째는 신장(Extension) 단계로서, 이 단계에서는 DNA 폴리머라제(polymerase)를 작동시켜 프라이머(primer)를 신장시키는 단계이다. 이때의 처리온도는 보통 70~75℃이다

이러한 PCR은 유전자와 중합효소, 단일염기, 중합시약 등 필요한 시약류를 핵산증폭 반응기에 투입한 후, 반응에 필요한 온도로 가열 및 냉각을 반복하여 이루어진다. 즉, PCR은 가열과 냉각이라는 온도변화를 반복하면서 이루어지는데, 통상 이러한 가열-냉각 사이클을 25~30회 반복한다.

따라서 PCR은 설정온도에 맞추어 온도가 신속히 상승 및 하강하도록 하는 것이 매우 중요하며, 이것은 PCR의 전체 시간을 단축하는 것과 밀접한 관련이 있다. 즉, PCR에서는 설정온도에 맞추어 온도단계를 순간적으로 이동하는 것이 요구되는데, 이는 설정온도로 변화하는 과정에서 시간지연이 발생하면 반응속도가 저하되어 전체 사이클링 시간(cycling time)이 길어지는 것은 물론이고, 불필요한 반응이 진행되어 부산물이 생성되기 때문이다. 특히, PCR의 시간을 단축하는 것은 신종플루, 광우병, 구제역 등과 같이 급속히 전염되는 전염병을 발병 현장에서 신속하게 진단할 수 있게 하여 조기 방역을 가능케 하는 중요한 역할을 한다.

그리고, PCR의 결과는 형광을 이용하여 분석한다. PCR 반응 과정을 실시간으로 모니터링하는 방법으로서, 여러 가지 방법이 알려져 있으며, 현재 대부분의 방법은 형광검출법을 사용한다. 상기 형광검출법은 PCR 반응으로 생성된 이중 나선의 DNA에 결합하여 형광이 증강되는 SYBR Green I 등의 염색시약(dye)를 이용하는 방법과 PCR에 사용되는 프라이머(primer) 이외에 두 프라이머 사이에 결합할 수 있는 DNA 시퀀스를 프로브로 사용하고, 상기 프로브의 양 끝에 형광단(fluorophore)과 발광억제단(quencher)를 결합시켜 DNA 합성에 사용되는 Taq 폴리머라제를 사용하고, 상기 Taq 폴리머라제의 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 이용하여 형광단과 발광억제단 사이가 끊어질 때 나오는 형광을 분석하는 TaqMan^(R)방법 등 다양한 방법이 소개되었다.

이를 위해서 중합효소 연쇄반응 장치는 특정 파장의 광을 조사하기 위한 광 조사기가 구비되어야 하고 반응기에는 충분한 양의 시료와 형광시약이 투입되어야 한다.

도 7은 종래 기술에 따른 PCR 장치의 일 예를 보여주는 개략도이다. 도시된 바와 같이, 종래 기술에 따른 PCR 장치(1)는, 히터(10)와, 상기 히터(10)의 상부에 설치되는 반응용기(20)와, 상기 반응용기(20)의 상부에 설치되어 반응용기(20)에 수용된 시료에 특정 파장의 광을 조사하는 광 조사기(30)와, 상기 반응용기(20)의 상부에 설치되어 상기 반응용기(20)에서 여기되는 형광을 증폭하는 광검출기(40)를 포함하여 이루어진다.

이러한 PCR 장치(1)는 반응용기(20)에 충분한 양의 시료 및 시약을 투입하고, 히터(10)를 이용하여 PCR 반응에 필요한 온도로 가열 및 냉각을 반복하여 목표로 하는 핵산을 증폭시킨 다음 상기 광 조사기(30)를 이용하여 특정 파장의 광을 반응용기(20)의 시료(S)에 조사하고, 조사된 광에 반응하여 발하여 형광을 상기 광검출기(40)를 통해서 분석함으로써 그 결과를 확인할 수 있었다.

그런데, 종래의 PCR 장치(1)는 반응용기(20)가 튜브형으로 이루어지므로 히터(10)의 열이 반응용기(20) 내부의 시료에 신속하게 전달되지 못하였다. 즉, 튜브형 반응용기(20)는 외벽이 두꺼울 뿐만 아니라 시료(S)와 히터(10)의 접촉 면적이 좁기 때문에 열전달이 신속하게 이루어지지 않는다. 따라서 종래에는 시료를 반응에 필요한 온도로 올리거나 내리는데 많은 시간이 소요되어 전체 PCR 시간이 길어지는 문제가 있었다.

또한, 종래의 PCR 장치(1)는 많은 양의 시료와 시약을 반응용기(20)에 투입하므로 그 결과를 분석하기 용이한 장점이 있으나 한 번에 많은 양의 시료 및 시약이 사용되므로 경제성이 떨어지는 문제가 있었다.

최근 이러한 문제를 해결하기 위해서 얇은 기판에 시료와 시약이 수용되는 챔버를 형성한 실리콘 칩 반응기가 개발되었다. 도 8에서 보는 바와 같이, 종래의 실리콘 칩 형태의 반응기(50)는 고가의 실리콘 기판(51)에 챔버(53)를 형성하고 그 상면에 필름(55)을 부착한 것이므로 가격이 비싸고 바닥면이 두꺼워 열전달이 빠르지 않다는 문제점을 여전히 가지고 있다.

또한, 쳄버(53)에 수용되는 시료 및 시약(S )이 미량 또는 극미량이므로 특정 파장의 광에 반응하여 여기되는 광량이 미약하여 형광을 관찰하기 위해서 복잡한 구조의 광학계(40)를 사용하여야 한다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 10-0794699 및 대한민국 공개특허 2008-0074252에는 반응기의 상부에 광 조사기와 광학계가 구비된 중합효소 연쇄반응 장치가 되어 있다. 그러나 종래의 중합효소 연쇄반응 장치는 구조가 복잡하고 가격이 상승하며 부피가 커서 휴대하기 불편한 문제점이 있었다.

본 발명은 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 주된 목적은 히터의 열을 반응시료에 신속히 전달하여 가열-냉각의 온도변화를 신속하게 수행함으로써 PCR 시간을 단축할 수 있는 중합효소 연쇄반응장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 미량 또는 극미량의 시약을 사용하면서도 핵산 증폭의 결과를 현장에서 신속하게 확인할 수 있는 중합효소 연쇄반응장치를 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 광 조사기에서 조사된 광의 경로를 길게 하고 조사 광의 산란을 최소화하여 시료에서 방사되는 형광을 육안으로 관찰할 수 있는 중합효소 연쇄반응장치를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 구조가 단순하고 소형이어서 휴대하여 현장에서 쉽게 사용할 수 있는 중합효소 연쇄반응장치를 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응장치는,

판 형상을 갖는 투명기판과 상기 투명기판의 하면에 형성된 다수 개의 챔버와 상기 투명기판의 하면에 부착되어 상기 챔버를 밀봉하는 필름으로 이루어진 반응기와;

상기 필름을 통해서, 상기 챔버에 수용된 시료에 열을 전달하도록 상기 필름의 하면이 밀착되도록 설치된 히터와;

상기 투명기판을 통해서, 상기 챔버에 수용된 시료에 특정 파장의 광을 조사하도록 상기 반응기의 일 측면에 설치된 광 조사기와;

상기 챔버에 수용된 시료에서 발하는 형광을 육안으로 관찰할 수 있도록 상기 반응기의 상부에 설치되고 상기 광 조사기에서 발광하는 광이 직접 전달되는 것을 차단함과 아울러 상기 챔버들에서 발하는 형광 사이의 간섭을 방지하도록 설치된 하나 이상의 격벽으로 이루어진 투시부를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 투명기판에는 상기 챔버에 시료를 주입할 수 있도록 관통 홀이 형성되고, 상기 투시기판의 상면에는 상기 관통 홀을 밀폐하도록 실링 커버가 구비되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 투명기판에 형성된 챔버는 높이에 비해 폭이 넓은 것을 특징으로 한다.

그리고 상기 투시부는 상기 반응기의 상면에 밀착되게 설치되어 상기 광 조사기에서 발광하는 광은 차단하고 상기 챔버에서 발하는 형광은 안내하는 다수 개의 격벽으로 이루어진다.

상기 격벽 사이에는 상기 챔버에서 발하는 형광을 안내하는 투시 통로가 형성되고 그 상단에는 투명 유리로 된 투시 창이 설치된다.

본 발명에 있어서, 상기 투명기판에는 상기 챔버에 시료를 주입할 수 있도록 다수 개의 관통 홀이 형성되고, 상기 투시기판의 상면에는 상기 관통 홀을 밀폐하도록 실링 커버가 구비된다.

상기 챔버는 상기 투명기판의 하면에 일정 깊이의 홈을 형성하여 이루어지고, 상기 챔버의 둘레에는 일정 깊이로 격리 홈을 형성되어 상기 챔버의 둘레 및 투명기판의 가장자리에 일정한 높이의 테두리가 형성되며, 상기 필름은 상기 테두리의 상면에 밀착되어 상기 챔버를 밀봉한다.

상기 투명기판은 사출성형이 가능한 소재로 이루어지고, 상기 챔버는 투명기판을 사출성형할 때 형성된다.

상기 투명기판은 사각 판 형태로 이루어지고 적어도 하나의 측면에는 일부 또는 전부에 수직면이 형성되어 상기 광 조사기에서 조사하는 광을 수광할 수 있도록 한다.

상기 필름은 열 전도성 및 내열성이 우수한 합성수지로 이루어진다.

상기 필름은 0.05mm ~ 0.2mm의 두께로 이루어진다.

상기 실링 커버는 얇은 플라스틱 판으로 이루어지고, 하면에는 관통 홀과의 밀착력을 높이기 위한 밀착 패드가 설치되며, 상기 실링 커버의 양측 면에는 상기 투명기판의 상면에 형성된 축 돌기의 구멍에 삽입되는 회동 축이 형성된 것을 특징으로 한다.

상기 투명기판의 가장자리에 형성된 상기 테두리에는 일부가 개방되어 상기 실링 커버의 후단에 형성된 결합 판이 긴밀하게 삽입되는 결합 홈이 형성된 것을 특징으로 한다.

상기 투시통로에는 상기 반응기에서 발하는 형광을 감지할 수 있는 형광감지센서가 설치될 수 있다.

본 발명의 PCR 장치에 따르면, 얇은 필름을 통해 히터의 열이 시료로 전달되므로 가열-냉각의 온도 변화를 신속하게 수행할 수 있어 전체 PCR 반응시간을 크게 단축할 수 있어 PCR 결과를 신속하게 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 반응기의 챔버에 수용된 시약이 측 방향으로 넓게 퍼지게 되고 광 조사기에서 조사되는 광이 넓게 퍼져 있는 시료를 투과하므로 조사 광의 경로가 길어져 미량 또는 극미량의 시료를 사용하여도 형광을 육안으로 관찰할 수 있어 현장에서 PCR 결과를 확인할 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 또한, 시료에서 발하는 형광을 육안으로 관찰할 수 있으므로 미량의 형광을 증폭하기 위한 복잡한 광학계를 생략할 수 있어 장치의 구조가 단순해지고 가격이 저렴해지면 소형화가 가능한 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 반응기는 사출성형을 통해서 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라 미량 또는 극미량의 시료와 시약을 사용하므로 유지관리비가 절약되는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응장치의 일 예를 보여주는 개략적인 사시도,
도 2는 도 1에 도시된 중합효소 연쇄반응장치의 분해 사시도,
도 3은 도 1에 도시된 중합효소 연쇄반응장치의 단면도,
도 4는 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응장치에 적용되는 반응기의 일 예를 보여주는 사시도,
도 5는 도 4에 도시된 반응기의 단면도,
도 6은 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응장치의 작용을 비교설명하기 위한 개략적인 구조도,
도 7은 종래 기술에 따른 중합효소 연쇄반응장치의 일 예를 보여주는 개념도,
도 8은 종래 기술에 따른 중합효소 연쇄반응장치의 또 다른 예를 보여주는 단면도,
도 9는 본 발명에 따른 실험에 사용된 중합효소 연쇄반응장치의 외관을 보여주는 사진,
도 10은 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응장치에 반응기를 장착한 모습을 보여주는 사진,
도 11 및 도 12는 본 발명에 따른 실험에 사용된 반응기를 보여주는 사진,
도 13은 본 발명에 따른 실험에 사용된 시약,
도 14 및 도 15는 본 발명에 따른 실험 결과를 보여주는 사진이다.

이하 첨부도면을 참조하여 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응장치에 대해서 상세히 설명하다.

도 1은 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응장치의 중요 부분을 보여주는 사시도이고, 도 2는 도 1에 도시된 중합효소 연쇄반응장치의 중요 부분의 분해 사시도, 도 3은 도 1에 도시된 중합효소 연쇄반응장치의 중요 부분의 단면도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응장치(이하 'PCR 장치 또는 핵산증폭장치'라 함)(100)는, 크게 히터(110)와, 상기 히터(110) 위에 올려지는 반응기(120)와, 상기 반응기(120)의 일 측에 설치되는 광 조사기(130)와, 상기 반응기(120)의 상부에 설치되어 형광을 관찰하기 위한 투시부(140)를 포함하여 구성된다.

또한, 본 발명의 PCR 장치(100)는 히터(110)와 광 조사기(130)를 수용하는 하부케이스(160b)와 투시부(140)가 형성된 상부케이스(160a)를 더 포함하여 이루어진다.

바람직하게, 상기 반응기(120)는 하부케이스(160b)의 상면에 형성된 안치 홈(161)에 안치된다. 또한, 상기 안치 홈(161)에는 도시되지 않은 고정 쇠가 더 구비될 수 있다. 그리고 상기 상부케이스(160a)는 반응기(120)가 안착된 하부케이스(160b) 상부에 설치된다.

또한, 본 발명의 PCR 장치(100)는 상기 히터(110)와 광 조사기(130)에 전원을 공급하기 위한 도시되지 않은 전원부와 상기 히터(110)의 열을 식혀주는 도시되지 않은 송풍기가 더 설치된다. 이러한 전원부와 송풍기는 당해 분야에서 널리 사용되는 것이므로 상세한 설명을 생략한다.

따라서 본 발명의 PCR 장치(100)는 상기 반응기(120)에 시료와 시약을 주입하고 시료와 시약이 주입된 반응기(120)를 히터(110) 위에 올려놓고 고정 한 다음, 상부케이스(160a)를 덮어서 반응기(120)와 히터(110)를 밀착시킨 후, 전원을 인가하여 히터(110)와 송풍기를 이용하여 가열-냉각 사이클을 반복함으로써 목표로 하는 핵산을 대량으로 증폭할 수 있다.

또한, 핵산이 증폭된 시료에 상기 광 조사기(130)를 이용하여 특정 파장의 광을 조사하고 이 광에 반응하여 여기되는 형광을 관찰함으로써 그 결과를 확인할 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 PCR 장치는, 히터(110)의 열을 시료에 신속히 전달하여 가열-냉각의 온도변화를 신속하게 수행함으로써 핵산 증폭시간을 단축할 수 있도록 한 것이다.

이를 위해, 본 발명의 PCR 장치(100)는 반응기(120)의 하면에 얇은 필름(220)을 부착하여 히터(100)의 열을 신속히 전달할 수 있게 한다.

또한, 본 발명에 따른 PCR 장치는, 조사 광의 경로를 가능한 길게 하여 시료에서 발광하는 형광을 육안으로 관찰할 수 있도록 하여 복잡한 장치나 과정 없이 그 결과를 신속하게 확인할 수 있게 한다.

이를 위해서 본 발명은 광 조사기(130)를 반응기(120)의 일 측에 설치하고 광 조사기(130)에서 조사된 광이 투명기판(121)을 통해서 챔버(123)를 측 방향으로 통과하도록 하는 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 PCR 장치(100)는, 하면에 필름(220)이 부착된 판 형상의 반응기(120)와 이 반응기(120)의 필름(220)이 밀착되도록 편평한 상면을 갖는 히터(110)를 포함하여 이루어진다.

즉, 상기 반응기(120)는 도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이, 직사각의 판 형태로 이루어진 것으로, 일정한 두께를 갖는 투명기판(121)과 이 투명기판(121)의 하면에 부착되는 얇은 필름(220)으로 이루어진다.

상기 투명기판(121)에는 미량 또는 극미량의 시료용액을 수용하는 챔버(123)가 구비된다. 그리고 상기 챔버(123)의 개방된 하부에는 상기 필름(220)을 부착하여 밀봉한다.

그리고 투명기판(121)의 상면에는 챔버(123)와 연통하도록 관통 홀(126)이 형성된다. 그리고 상기 관통 홀(126)을 밀폐하기 위한 실링 커버(230)를 상기 투명 기판(121)의 상면에 설치한다.

더욱 구체적으로 상기 투명기판(121)은 투명한 소재로 이루어지고 일정한 두께를 갖는다. 상기 투명기판(121)의 두께는 0.7 내지 7mm, 바람직하게는 1.5 내지 5mm 정도이다. 그리고 투명기판(121)의 적어도 하나의 측면은 수직면으로 이루어진다. 또한, 투명기판(121)은 자외선 및 가시광선의 투과가 가능하고 사출성형이 용이한 플라스틱으로 이루어진다.

상기 투명기판(121)은 사출성형 방식으로 만들어지고, 상기 챔버(123)는 투명기판(121)을 사출성형할 때 그 하면에 일정 깊이의 홈을 형성하여 이루어진다. 따라서 상기 챔버(123)는 일정한 양의 시료와 반응시약을 수용하는 공간을 형성한다. 바람직하게 상기 챔버(123)의 깊이는 0.5 내지 5mm, 바람직하게는 1 내지 3mm 정도이다.

더욱 바람직하게 상기 투명기판(121)에 다수 개의 챔버(123)가 평행하게 형성된다. 이때 챔버(123)는 폭이 좁고 길이가 긴 채널 형태로 이루어지고 각 챔버(123)의 양단에 관통 홀(126)이 형성된다.

상기 필름(220)은 투명기판(121)에 비해 매우 얇은 두께를 갖는다. 바람직하게 필름(220)은 0.05mm ~ 0.2mm의 두께로 이루어진다. 필름(220)은 열전도성과 내열성이 우수한 합성소재로 이루어진다. 또한, 필름(220)은 얇은 금속판과 같이 열전도성이 우수한 소재로 이루어질 수도 있다.

상기 투명기판(121)과 필름(220)은 챔버(123)에 수용된 시약이 누출되지 않도록 밀접하게 접착된다. 예를 들어, 투명기판(121)과 필름(220)은 접착제로 접착하거나 열로 융착하여 접착될 수 있다.

상기 실링 커버(230)는 얇은 플라스틱으로 이루어지고, 가열과정에서 시료나 시약이 증발되지 않도록 하다. 이를 위해 상기 실링 커버(230)의 하면에는 관통 홀(126)과의 밀착력을 높이기 위한 밀착 패드(234)가 설치된다. 상기 밀착 패드(234)는 실리콘으로 이루어질 수 있다.

더욱 바람직하게, 상기 실링 커버(230)는 시료 및 시약 용액을 챔버(123)의 내부로 주입하거나 반응이 완료된 시료 및 시약을 추출할 수 있도록 투명기판(121)의 상면에 회동가능하게 설치된다. 이를 위해서 실링 커버(230)의 양쪽 측면에는 회동 축(233)이 형성되고 상기 회동 축(233)은 투명기판(121)의 상면에 돌출되게 형성된 축 돌기(128)의 구멍(129)에 삽입되도록 돌출된다.

또한, 실링 커버(230)를 고정하기 위한 잠금 수단이 더 구비될 수 있다. 상기 잠금 수단은 실링 커버(230)의 후단에 돌출되게 형성된 결합 판(235)과 이 결합 판(235)이 긴밀하게 결합하도록 상기 투명기판(121)의 테두리가 부분적으로 개방된 결합 홈(176)으로 이루어진다. 이때, 하나의 실링 커버(230)는 다수 개의 챔버(123)에 형성된 관통 홀(126)을 밀폐할 수 있는 크기로 이루어진다.

따라서 상기 실링 커버(230)를 투명기판(121)의 상면에 회동가능하게 결합하고, 실링 커버(230)의 결합 판(235)을 상기 결합 홈(176)에 억지 끼워 넣으면 상기 실링 커버(230)가 단단히 고정되어 하나 또는 다수 개의 관통 홀(126)을 밀폐시키게 된다.

그리고 상기 챔버(123)의 둘레에는 일정한 깊이로 홈을 파서 격리 홈(127)을 형성한다. 상기 격리 홈(127)은 챔버(123)의 깊이에 비해 얇게 형성된다. 따라서 챔버(123)는 일정한 높이와 폭으로 이루어진 테두리(125)로 둘러싸여 지게 되며, 상기 투명기판(121)의 가장자리에도 일정한 높이의 테두리(125)가 형성되게 된다.

따라서 상기 필름(220)은 상기 테두리(125)의 상면에 접착된다. 즉, 필름(220)을 반응기(120)의 하면에 부착할 때 접촉 면적이 너무 넓으면, 필름(220)과 투명기판(121) 사이에 기포가 생겨서 누수가 발생할 수 있다. 그러나 본 발명은 필름(220)이 테두리(125)의 상면에 부착되므로 접촉 면적을 적절하게 줄이고 기포가 쉽게 빠져나갈 수 있도록 하여 접착력이 좋도록 한다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 PCR 장치(100)는 상기한 반응기(120)의 챔버(120)에 미량 또는 극미량의 생물학적 시료와 시약을 투입하고, 실링 커버(230)로 밀봉한 상태에서 히터(110)와 송풍기를 이용하여 가열-냉각 사이클을 반복함으로써 목적으로 하는 핵산을 대량으로 증폭할 수 있다.

상기 히터(110)는 전기적인 가열수단을 이용하여 이루어진다. 바람직하게 상기 히터(110)는 전류의 인가에 따라 발열과 방열을 반복하는 펠티어 소자(Peltier effect)로 이루어진다. 예를 들어, 도 3에서 보는 바와 같이, 상기 히터(110)는 소정 규격의 펠티어 소자(112)와, 상기 펠티어 소자(112)의 상부에 부착되고 반응기(120)의 하면과 밀착할 수 있도록 판 형태로 이루어진 가열 판(113)과 펠티어 소자의 하부에 부착되어 방열을 원활하게 하는 히트 싱크(114)로 이루어진다.

그리고 히트 싱크(114)의 일 측에는 도시되지 않은 송풍기가 설치되어 발열이나 방열이 원활하게 이루어지도록 할 수 있다.

한편, 일정 시간 동안 가열-냉각 사이클을 반복하여 목표로 하는 핵산이 증폭되면, 특정 파장의 광을 시료에 조사하고 시료에서 여기되는 형광을 관찰함으로써 그 결과를 확인할 수 있다. 이를 위해 챔버(123)에는 특정 유전자 샘플을 염색하는 염료가 주입되는데, 이 염료는 광 조사기(130)에서 조사되는 특정 파장의 광에 반응하여 형광을 발하게 된다.

본 발명에 따른 PCR 장치(100)는 광 조사기(130)를 반응기(120)의 일 측면에 설치하여 광 조사기(130)에서 방사되는 특정 파장의 광이 반응기(130)의 챔버(123)를 측 방향으로 관통하도록 한다. 이를 위해서 상기 광 조사기(130)는 특정 파장의 광을 발광하는 발광다이오드(LED)(131)와 이 발광다이오드(131)에 전류를 공급하는 전원부와, 전원부를 제어하는 스위치를 포함하여 이루어진다.

특히, 발명에 따른 PCR 장치(100)는 광 조사기(130)에서 방사되는 조사 광이 반응기(120)의 측면으로 입사되도록 한다. 그러면 광 조사기(130)에서 방사되는 광은 반응기(120)의 투명기판((121)을 통해 챔버(123)로 전달되고, 챔버(123)로 전달된 광은 챔버(123)에 수용된 시료(S)를 투과하게 된다.

이때, 상기 챔버(123)에 수용된 시료는 넓게 퍼진 상태로 수용되어 있으므로 시료를 통과하는 광의 경로가 길어져서 시료에서 발하는 형광의 양이 육안으로 관찰할 수 있게 된다. 따라서 관찰자는 반응기(120)의 상부에 설치된 투시부(140)를 통해 시료에서 발광하는 형광을 육안으로 관찰할 수 있다.

이와 같이 본 발명에 따른 PCR 장치(100)는 조사 광의 경로를 길게 하여 시료에서 발광하는 형광을 육안으로 관찰할 수 있게 하는 것이다. 형광을 육안으로 관찰할 수 있게 되면, 장치의 구조가 단순하게 될 뿐만 아니라 핵산 증폭의 결과를 현장에서 쉽게 확인할 수 있기 때문에 신종플루, 광우병, 구제역 등과 같이 급속히 전염되는 전염병을 발병 현장에서 신속하게 진단할 수 있게 된다.

즉, 종래의 PCR 장치(1)는 도 8에서 보는 바와 같이, 광 조사기(30)를 실리콘 칩 반응기(50)의 상부에 설치하였다. 광 조사기(30)를 실리콘 칩 반응기(50)의 상부에 설치하면, 광 조사기(30)에서 조사된 광이 실리콘 칩 반응기(50)의 상면으로 입사한 후 챔버(53)를 상부에서 하부로 관통한 다음 반응기(50)의 하면에서 반사되어 다시 상부로 투사되게 된다.

따라서 실질적으로 조사된 광과 염료가 반응할 수 있는 광 투사거리는 챔버(53)의 높이에 따라 결정된다. 그런데 종래의 실리콘 칩 반응기(50)에 형성된 챔버(53)는 미량 또는 극미량의 시료가 수용되도록 얇게 형성된 것이므로 광의 경로가 매우 짧다.

이에 따라 종래의 PCR 장치(1)는 시료에서 발광하는 미약한 광을 관찰하기 위해서 별도의 검출계(40)가 요구되었다. 이러한 검출계(40)는 광전변환부, 렌즈, 필터부, 미러 등과 같은 복잡한 광학계로 이루어지므로 구조가 복잡해지고 가격이 상승하고 부피가 커서 휴대하기 불편한 문제점이 있었다.

반면에 본 발명의 PCR 장치(100)는 도 6에서 보는 바와 같이 광 조사기(130)를 반응기(120)의 일 측면에 설치하여 광 조사기(130)에서 조사된 광이 반응기(120)의 측면으로 입사하여 챔버(123)를 측 방향으로 관통하도록 한다. 따라서 본 발명은 조사 광과 시료가 접촉하는 광의 경로가 챔버(123)의 폭에 따라 결정된다.

이때, 본 발명의 챔버(123)에 수용되는 미량 또는 극미량의 시료는 넓고 얇게 수용되어 있으므로 챔버(123)를 측 방향으로 관통하는 조사 광의 경로가 길어지게 된다. 즉, 판 형태의 반응기(120)에 형성된 챔버(123)는 그 높이(h)에 비해서 폭(W)이 넓다. 또한, 얇은 반응기에 형성할 수 있는 챔버(123)의 높이는 크게 제한되는 반면에 챔버(123)의 폭은 비교적 자유롭다.

따라서 판 형태의 반응기(120)를 사용하는 경우에는 챔버(123)의 폭 방향으로 관통하는 조사 광이 더 많은 시약과 접촉할 수 있으므로 시료에서 발하는 형광의 양이 커지게 된다. 그리고 많은 양의 형광이 발하면 별도 광학계의 도움 없이 육안으로 형광을 관찰할 수 있게 된다.

아울러, 종래의 PCR 장치(1)는 광 조사기(130)에서 조사 광이 반응기(120)의 하면에서 반사되기 때문에 광 산란이 발생하기 않도록 반응기(130)의 하면이 평평해야 한다. 따라서 종래의 PCR 장치(1)는 반응기(120)의 하면에 필름을 부착할 경우 광 산란이 발생하여 광량이 적어지는 문제가 있었다. 따라서 종래의 PCR 장치는 반응기의 하면에 굴곡이 생기기 쉬운 얇은 두께의 필름을 부착하는 것이 어려웠다.

반면에 본 발명의 PCR 장치(100)는 조사 광이 측면으로 입사하여 측면으로 방출되기 때문에 반응기(120)의 하면에 얇은 필름(220)을 부착하여 열 전달이 신속하게 이루어지도록 할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 PCR 장치(100)는 반응기(120)에서 발하는 형광 양이 많기 때문에 투시부(140)를 통해서 육안으로 관찰할 수 있다. 이때, 상기 투시부(140)는 반응기(120)에서 발광하는 형광을 육안으로 관찰할 수 있도록 광 조사기(130)에서 방사되는 조사 광은 차단하고 이웃하는 챔버(123)에서 발광하는 형광 사이에 간섭이 일어나지 않도록 하는 다수 개의 격벽(145)으로 이루어진다.

그리고 격벽(145) 사이에는 일정한 간격으로 투시 통로(143)를 형성하고 이 투시 통로(143)의 상단에 투명 유리로 이루어진 투시 창(141)을 설치한다. 상기 격벽(145)은 반응기(120)의 상부에 근접하도록 설치되고, 상기 격벽(145) 사이의 투시 통로(143)는 각각의 챔버(123)에 대응하도록 한다. 따라서 상기 각 챔버(123)에 수용된 시료에서 발광하는 형광을 대응되는 투시 창(141)을 통해서 육안으로 관찰할 수 있게 된다.

또한, 상기 투시 통로(143)에는 형광을 감지하는 도시되지 않은 형광감지센서를 설치할 수 있다. 상기 형광감지센서는 시료에서 발하는 형광을 수광한 후 이를 소정의 전기신호로 변환하여 준다. 그리고 이 전기신호는 제어부에서 특정한 값으로 변환된 후 메모리에 저장된다. 이와 같이, 형광감시센서를 이용하여 형광을 감지하면, 그 데이터를 저장하거나 원격으로 전송할 수 있는 장점이 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 PCR 장치(100)는 투명기판(121)과 필름(220) 사이에 다수 개의 챔버(123)를 형성하고 투명기판(121)의 일 측면에 광 조사기(130)를 설치함으로써 상기 필름(220)은 히터(110)의 열을 상기 챔버(123)에 수용된 시약(S)으로 신속히 전달하고, 상기 투명기판(121)은 조사 광을 챔버(123)에 손실 없이 전달하여 챔버(123)에 넓게 펴진 상태로 수용된 시료를 수평방향으로 관통하도록 함으로써 핵산 증폭의 시간을 단축할 뿐만 아니라 핵산 증폭의 결과를 육안으로 확인할 수 있게 한다.

또한, 본 발명은 투명기판(121)을 사출성형할 때 챔버(123)를 동시에 형성하고 챔버(123)를 필름(220)으로 밀봉함으로써 생산공정을 단순하고 용이하게 한다. 따라서 종래의 실리콘 칩 반응기에 비해 생산비용을 크게 절감할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 PCR 장치의 특징과 장점을 확인하기 위한 실시 예에 대해서 설명한다.

<실시 예>

-실험재료

본 실험에 사용된 PCR 장치는 도 9에서 보는 바와 같이, 가로 220mm, 세로 180mm, 높이 130mm로, 종래의 PCR 보다 초당 가열 및 냉각 온도 폭을 높여 시간 단축을 도모한 것이다. 또한, 작고 가벼워 이동이 용이하고 현장 진단 시 종래의 PCR 보다 유리할 것으로 사료된다.

또한, 본 발명에 따른 실험에 사용된 PCR 장치는 드로어를 열어 반응기를 장착하는 방식이다. 도 10에서 보는 바와 같이, 드로어를 열면 히터의 상면이 노출된다. 그러면 히터 위에 반응기를 올려놓고 누름쇠로 고정한 다음 드로어를 닫으면 준비가 완료된다.

도 11 및 도 12는 본 발명에 따른 시험에 사용되는 반응기를 보여주는 것으로, 도 11은 실링 커버가 설치된 상태이고, 도 12는 실링 커버가 제거된 상태를 보여준다. 반응기는 편의상 고정 누름쇠가 있는 왼쪽을 인사이드(inside), 이동식 누름쇠가 있는 오른쪽을 아웃사이드(outside)로 명하였고, 인사이드에서 아웃사이드 방향으로 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6번 챔버라 칭해 실험결과 혼돈에 대비하였다. 한 개의 챔버에는 총 10의 반응액을 주입시킬 수 있고, 챔버는 넓고 얕기 때문에 열전도율이 높으며 3개의 챔버가 실리콘이 부착된 실링 커버 2개를 공유한다.

-시약

상기한 PCR 장치의 성능 확인 및 기기 업그레이드를 위한 데이터 확보를 위하여, Ultra-rapid real-time PCR (Samsung, Korea)로 증폭이 확인된 IS6110 F/R2 primer <도 13>를 이용하여 실험을 수행하였다. Mycobacterium tuberculosis (strain H37Rv)의 genomic DNA 10ng을 PCR template로 사용하였으며 Master Mix로는 GenetBio 사의 2XPrime Q-Master Mix for TMC-1000 micro PCR을 사용하였다.

-실험방법

실험은 4개의 챔버(1, 3, 4, 6번)를 사용하였고, 한 챔버 당 10를 총량으로 하여 10ng의 M. tuberculosis strain H37Rv의 gDNA와 각각 10pmole의 F/R2 primer, 2XPrme Q-Master Mix for TMC-1000 micro PCR (GenetBio, Korea)를 사용하였다.

DNA의 합성유무를 확인하기 위하여 반응기에 특정 파장의 광을 조사하였다. 이를 위하여 1번 챔버는 기존의 시약조성과 동일(SYBR Green 의 최종농도 1%)하게 하였으며, 2번 챔버는 SYBR Green 의 최종농도를 10%, 3번 챔버는 SYBR Green 의 최종농도를 20%로 조성하였으며, 4-6번 챔버도 1-3번 챔버와 동일한 SYBR Green 을 첨가하였으나 template를 제외하였다.

한편 본 발명의 PCR과 종래의 PCR (GeneAmp PCR system 2700)과 비교하기 위하여 동일한 조건<표 13>으로 PCR 수행 뒤, 반응액을 1.5% agarose gel에 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하였으며 UV transilluminator상에서 생성물의 크기를 확인하였다.

-실험결과

본 발명에 따른 PCR 장치를 이용한 실험의 총 running time은 11분 35초로 측정되었으며, template를 첨가한 1-3번 챔버에서는 모두 형광이 관찰되었으나 template를 첨가하지 않은 4-6번 챔버에서는 형광이 관찰되지 않았다(도 14참조:형광을 육안으로 확인한 후 찍은 사진임, 총 running time 11분 35초, Well 1: SYBR Green Ⅰ 최종농도 1%, with template, Well 2: SYBR Green Ⅰ 최종농도 10%, with template, Well 3: SYBR Green Ⅰ 최종농도 20%, with template, Well 4: SYBR Green Ⅰ 최종농도 1%, without template, Well 5: SYBR Green Ⅰ 최종농도 10%, without template, Well 6: SYBR Green Ⅰ 최종농도 20%, without template)

또한 SYBR Green 의 최종농도가 1%가 되도록 조성한 1번 챔버는 SYBR Green 의 최종농도가 10%가 되도록 조성한 2번 챔버 보다 형광 발현율이 낮았으나 SYBR Green 의 최종농도가 20%가 되도록 조성한 3번 챔버의 경우 2번 챔버와 비슷한 형광 발현율을 보였으나 육안으로 관찰시 2번 챔버가 좀 더 밝게 관찰되었다.

본 발명의 PCR과 비교하기 위하여 GeneAmp PCR system 2700으로 수행한 실험은 같은 조건으로 PCR을 실행하였으나 초당 heating 및 cooling 온도가 본 발명의 PCR에 미치지 못하여 총 running time이 39분 09초로 측정되었는데 이는 약 3.4배 느린 속도이다. 증폭량 확인을 위한 전기영동 수행결과에서는 두 기기에서 증폭된 DNA의 형광 발현량의 차이는 거의 없었으나 본 발명의 PCR로 수행한 반응액에서는 band가 좀 더 퍼져 보이는 것을 관찰할 수 있었다(도 15참조(다른 PCR로 반응 후 전기영동으로 두 장비 결과 비교: 총 running time 39분 09초, Lane M : 100bp marker (Bioneer, Korea), Lane 1 : 1번 well 반응액 by URT Ⅰ, Lane 2 : 2번 well 반응액 by URT Ⅰ, Lane 3 : 3번 well 반응액 by URT Ⅰ, Lane 4 : 4번 well 반응액 by URT Ⅰ, Lane 5 : 5번 well 반응액 by URT Ⅰ, Lane 6 : 6번 well 반응액 by URT Ⅰ, Lane 7 : 1번 tube 반응액 by GeneAmp PCR system 2700, Lane 8 : 2번 tube 반응액 by GeneAmp PCR system 2700, Lane 9 : 3번 tube 반응액 by GeneAmp PCR system 2700, Lane 10 : 4번 tube 반응액 by GeneAmp PCR system 2700, Lane 11 : 5번 tube 반응액 by GeneAmp PCR system 2700, Lane 12 : 6번 tube 반응액 by GeneAmp PCR system 2700 ).

이는 heating 및 cooling이 느린 GeneAmp PCR system 2700의 경우 heating 및 cooling이 진행되는 동안에서 반응이 일어남을 보여준다고 사료된다. 하지만 같은 온도 및 시간 조건에서 총 running time이 본 발명이 3.4배 빠르므로, 본 발명의 PCR로 PCR 수행시 각 단계별 시간을 충분히 주어도 시중의 PCR 보다는 신속성이 뛰어나다는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명은 도면에 도시된 실시 예들을 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

100: 중합효소 연쇄반응장치 110: 히터
112: 펠티어 소자 113: 가열 판
114: 히트 싱크 120: 반응기
121: 투명기판 122: 손잡이
123: 챔버 124,125: 테두리
126: 관통 홀 130: 광 조사기
131: 발광다이오드 132: 회로기판
140: 투시부 141: 투시 창
143: 투시 통로 145: 격벽
160a: 상부케이스 160b: 하부케이스
161: 안치 홈 176: 결합 홈
220: 필름 230: 실링 커버
233: 회동 축 234: 밀착 패드
235: 결합 판 S: 시료 또는 시약

Claims (11)

1. 판 형상을 갖는 투명기판과 상기 투명기판의 하면에 형성된 다수 개의 챔버와 상기 투명기판의 하면에 부착되어 상기 다수 개의 챔버를 밀봉하는 필름으로 이루어진 반응기와;
   상기 필름을 통해서, 상기 챔버에 수용된 시료에 열을 전달하도록 상기 필름의 하면이 밀착되게 설치되는 히터와;
   상기 투명기판을 통해서, 상기 챔버에 수용된 시료에 특정 파장의 광을 조사하도록 상기 반응기의 일 측면에 설치된 광 조사기와;
   상기 챔버에 수용된 시료에서 발하는 형광을 육안으로 관찰할 수 있도록 상기 반응기의 상부에 설치되고 상기 광 조사기에서 발광하는 광이 직접 전달되는 것을 차단하고 상기 챔버들에서 발광하는 형광 사이의 간섭을 방지하도록 설치된 하나 이상의 격벽으로 이루어진 투시부를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 투명기판에는 상기 챔버에 시료를 주입할 수 있도록 관통 홀이 형성되고, 상기 투시기판의 상면에는 상기 관통 홀을 밀폐하도록 실링 커버가 회동 가능하게 구비되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 투명기판에 형성된 챔버는 높이에 비해 폭이 넓은 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 격벽 사이에는 상기 챔버에서 발하는 형광을 안내하는 투시 통로가 형성되고 그 상단에는 투명 유리로 된 투시 창이 설치되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 챔버는 상기 투명기판의 하면에 일정 깊이의 홈을 형성하여 이루어지고, 상기 챔버의 둘레에는 일정 깊이로 격리 홈을 형성하여 상기 챔버의 둘레에 일정한 높이의 테두리가 형성되며, 상기 필름은 상기 테두리의 상면에 밀착되어 상기 챔버를 밀봉하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 투명기판은 사출성형이 가능한 플라스틱 소재로 이루어지고, 상기 챔버는 투명기판을 사출성형할 때 함께 형성되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 투명기판은 사각 판 형태로 이루어지고 적어도 하나의 측면에는 상기 광 조사기에서 조사되는 광을 수광할 수 있도록 수직면이 형성되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 필름은 열 전도성이 우수한 합성수지로 이루어지고, 0.05mm ~ 0.2mm의 두께로 이루어지는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치
9. 제 5항에 있어서,
   상기 격벽 사이의 투시 통로에는 상기 챔버에서 발하는 형광을 감지할 수 있는 형광감지센서가 설치되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
10. 제 2항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 실링 커버는 얇은 플라스틱 판으로 이루어지고, 하면에는 관통 홀과의 밀착력을 높이기 위한 밀착 패드가 설치되며, 상기 실링 커버의 양측 면에는 상기 투명기판의 상면에 형성된 축 돌기의 구멍에 삽입되는 회동 축이 형성된 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
11. 제 10항에 있어서,
    상기 투명기판의 가장자리에 형성된 테두리에는 일부가 개방되어 상기 실링 커버의 후단에 형성된 결합 판이 긴밀하게 삽입되는 결합 홈이 형성된 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응장치.
    

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