KR20190136909A

KR20190136909A - 중합효소연쇄반응 장치 및 이를 이용한 중합효소연쇄반응 방법

Info

Publication number: KR20190136909A
Application number: KR1020190019825A
Authority: KR
Inventors: 정기훈; 이영섭; 강병훈
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2019-12-10
Also published as: US20210205816A1; KR102220637B1

Abstract

본 발명에 따른 중합효소연쇄반응 장치는 서로 이격 배열된 투명 나노 기둥 어레이가 형성된 투명 플레이트 및 상기 나노 기둥의 상부면 및 측면을 포함하는 표면에 위치하는 플라즈모닉 금속 나노섬을 포함하는 투명 광열 기판; 상기 광열 기판의 하부에 위치하며 상기 플라즈모닉 금속 나노섬에 광을 조사하는 광원; 및 상기 투명 광열 기판에 의해 가열되는 유체를 보유하는 챔버;를 포함한다.

Description

중합효소연쇄반응 장치 및 이를 이용한 중합효소연쇄반응 방법{Apparatus for Polymerase Chain Reaction and the Method for Polymerase Chain Reaction Using The Same}

본 발명은 중합효소연쇄반응 장치 및 이를 이용한 중합효소연쇄반응 방법에 관한 것으로, 상세하게, 빠르고 간단하며 사용이 용이하고 휴대성이 높아 현장진단이 가능한 중합효소연쇄반응 장치 및 이를 이용한 중합효소연쇄반응 방법에 관한 것이다.

분자진단은 고유의 바이오마커(DNA, RNA, 단백질 등)를 분석함으로써 의료분야부터 법의학 분야 등에 걸친 다양한 분야에서 중요한 역할을 하고 있다. 최근 분자진단 분야는 감염성 질환 및 암 등을 포함한 다양한 질병의 시기적절한 진단과 개인 맞춤형 치료를 가능하게 하는 현장진단(point-of-care, POC)용 분자진단 방법에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 분자진단 방법이 현장진단용으로 사용되기 위해서는 진단 기술이 저렴하고, 휴대성 있고, 간단하고, 사용하기 쉽고, 빠르게 결과를 얻을 수 있는 등의 특징(Affordable, Small, Simple, User-friendly, Rapid&robust, Equipment-free, Disposable의 ASSURED criteria)을 갖춰야 한다.

중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 핵산(nucleic acid)을 증폭시키는 기술로써, 분자생물학적(molecular biological) 진단법에서 필수적으로 사용되는 핵심적인 기술이다. 상세하게, PCR은 DNA 중합효소(polymerase)에 의해 DNA가 복제(replication)되는 특성을 이용한 방법으로, DNA 중합효소는 외가닥(single stranded) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두 가닥(double stranded) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 복제를 시작하기 위해서는 시작 부위가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 주형 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합(annealing)하여 두 가닥 형태의 DNA가 되어야 한다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제가 개시될 수 있다. 주형 DNA 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머(primer) 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extension)된다.

PCR 반응은 상술한 기작에 기반하기 때문에, PCR 주기(cycle)는 두 가닥 주형 DNA를 외가닥 DNA로 바꾸어 주는 변성(denaturation) 단계, 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합하는 결합(annealing) 단계 및 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 되는 신장(elongation) 단계의 3단계로 구성된다. 최초 1회의 PCR 주기가 끝난 후에 그 다음으로 이어지는 PCR 주기에서는 최초(original) 주형 DNA와 PCR에 의해 새로 합성된 DNA 모두가 DNA 주형이 된다. 이렇게 PCR은 주기가 계속적으로 반복될수록 DNA 주형의 수가 급격히 증가하게 된다.

변성(denaturation)-결합(annealing)-신장(elongation)의 3단계 반응은 온도에 의해 제어되며, 이에 PCR 주기는 변성 온도-결합 온도-신장 온도의 온도 주기에 대응할 수 있다. 이러한 온도 주기를 형성해주는 PCR용 기기를 일반적으로 열순환 장치 (thermal cycler)라고 한다.

종래의 PCR용 기기, 또는 열순환 장치는 펠티어 소자 (Peltier element)를 기반으로 금속판의 온도를 조절하여 온도 주기를 만든다. 종래의 PCR용 열순환 장치는 대부분의 실험실 및 병원 등에서 광범위하게 사용되고 있다. 하지만, 부피가 크고, 소비 전력이 높을 뿐만 아니라 결과를 얻는데 시간이 오래 걸리기 때문에, 현장에서 실시간으로 진단해야 하는 현장진단 분자진단에 활용하기에는 적합하지 않다.

1세대 PCR 방법 이후 다양한 PCR 기술들이 연구되고 있다. 예를 들어 모세관을 이용해 열에 노출되는 샘플 표면적을 넓힌 방법, 마이크로유체 기판을 이용한 방법(대한민국 등록특허 제10-0756874호), 작은 물방울 및 레이저를 이용한 방법등이 보고된 바 있다. 그러나, 새로이 개발되는 PCR 기술들 또한, 휴대성이 낮고 증폭 효율이 떨어지며, 숙련된 전문가에 의한 처리가 요구되거나, 1회용으로 사용하기에는 너무 고가임에 따라 장치의 전문적인 유지 관리가 요구되는 등, 현장진단용 분자진단에 바로 사용하기에는 한계를 가지고 있다.

대한민국 등록특허 제10-0756874호

본 발명은 현장진단용 분자진단에 사용 가능한 중합효소연쇄반응 장치 및 이를 이용한 중합효소연쇄반응 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 초고속 중합효소연쇄반응 장치 및 이를 이용한 중합효소연쇄반응 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 중합효소연쇄반응에 의한 물질(핵산 등) 증폭 정도를 실시간으로 관측 가능한 중합효소연쇄반응 장치 및 이를 이용한 중합효소연쇄반응 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 플라즈모닉 금속 나노섬은 서로 이격되어 위치할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 나노 기둥의 평균 직경은 50 내지 1000nm이며, 상기 나노 기둥의 평균 길이를 평균 직경으로 나눈 종횡비는 0.1 내지 10일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 나노 기둥 어레이가 위치하는 투명 플레이트의 일 면을 기준으로, 일 면의 면적에서 나노 기둥 어레이에 의해 일 면이 덮인 면적의 비인 커버리지는 0.1 내지 0.9일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 나노 기둥의 상부면에 위치하는 나노섬은 상기 나노 기둥의 상부면에 대응하는 형상이며, 상기 나노기둥의 측면에 위치하는 나노섬은 평균 직경이 5 내지 100nm일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 광열 기판은 상기 플라즈모닉 금속 나노섬이 위치하는 나노 기둥을 덮는 방열층을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 광원의 광은 가시광 내지 근적외선일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 챔버는 하부면 및 측면에 의해 구획되는 내부 공간을 가지며, 상기 내부 공간에 상기 유체가 보유될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 챔버는 상기 나노 기둥의 상부면에 위치하는 금속 나노섬과 접하여 위치하되 나노 기둥 어레이를 덮는 상부판 및 상기 나노 기둥 어레이를 감싸도록 상기 상부판으로부터 연장되어, 연장된 일 단이 상기 투명 플레이트와 접하는 측부를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 중합효소연쇄반응 장치는 상기 광열 기판 또는 상기 챔버에서 유체가 보유되는 공간의 온도를 측정하는 온도 센서를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 광원을 제어하는 광 조사 제어부를 더 포함하며, 상기 광 조사 제어부는 적어도 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어할 수 있따.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 광 조사 제어부는 기 설정된 온도 프로파일에 부합하도록 상기 광원을 제어할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치에 있어, 상기 중합효소연쇄반응 장치는 상기 유체에서 발생하는 라만 신호를 검출하는 검출기를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 상술한 중합효소연쇄반응 장치를 이용한 중합효소연쇄반응 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 중합효소연쇄반응 방법은 상술한 중합효소연쇄 반응장치를 이용한 중합효소연쇄 반응 방법이며, a) 챔버에 중합효소연쇄반응 대상인 유체를 투입하는 단계; 및 b) 유체가 시간에 따른 온도 프로파일에 부합하도록 광원에서 발생하는 광을 투명 광열 기판에 조사하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 방법에 있어, 상기 투명 광열 기판에 조사되는 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어함으로써 상기 시간에 따른 온도 프로파일을 만족시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 방법에 있어, 상기 시간에 따른 온도 프로파일은 결합 온도(annealing temperature)에서 변성 온도(denaturation)로의 승온 및 변성 온도에서 결합 온도로의 감온을 사이클로 하여 상기 사이클이 반복되는 프로파일일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 방법은, b) 단계의 중 또는 b) 단계 후, 상기 유체에 라만 산란을 위한 여기광을 조사하거나 광원의 광을 조사하여 표면 증강 라만 산란 분석을 수행하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 중합효소연쇄반응 장치는 서로 이격 배열된 투명 나노 기둥 어레이가 형성된 투명 플레이트 및 상기 나노 기둥의 상부면 및 측면을 포함하는 표면에 위치하는 플라즈모닉 금속 나노섬을 포함하는 투명 광열 기판에 의한 플라즈모닉 광열효과(plasmonic photothermal effect)를 기반으로 광 에너지를 열 에너지로 변환시킴에 따라, 가시광 영역대에서 높은 흡광도 및 고효율의 광열효과를 갖는 장점이 있으며, 초고속 온도 변화 및 이에 의한 초고속 중합효소연쇄반응이 가능하여 종래의 중합효소연쇄반응 기술보다 효율적으로 핵산(DNA, RNA, cDNA 등)을 빠르게 증폭 시킬 수 있다. 또한, 저비용으로 제작 가능하여 상업성이 우수할 뿐만 아니라, 휴대성을 가져 실험실 수준의 분자진단 뿐만 아니라 현장진단용 분자진단 도구로 사용할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 중합효소연쇄반응 장치에서 플라즈모닉 광열 효과를 발생하는 투명 광열 기판이 서로 이격 배열된 투명 나노 기둥 어레이가 형성된 투명 플레이트 및 상기 나노 기둥의 상부면 및 측면을 포함하는 표면에 위치하는 플라즈모닉 금속 나노섬을 포함함에 따라 표면 증강라만 산란 활성을 가져, 핵산의 증폭과 함께, 핵산의 증폭 정도를 실시간으로 측정 가능한 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치에서, 투명 광열 기판을 도시한 단면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 투명 광열 기판의 광 파장별 흡광도를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 투명 광열 기판의 상부를 관찰한 주사전자현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 투명 광열 기판의 측부를 관찰한 주사전자현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 PCR 장치의 장치도를 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어, 투명 광열 기판의 다른 예를 도시한 일 단면도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어, 투명 광열 기판과 챔버를 도시한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 PCR 장치의 광학 사진 및 광 조사 여부에 따른 챔버의 온도 맵핑 결과를 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 PCR 장치에서 광 조사의 제어에 따른 온도 사이클 특성을 측정 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 PCR 장치에서, 설정된 온도 프로파일 및 해당 온도 프로파일을 구현한 광원의 제어 조건을 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 PCR 장치를 이용하여 증폭된 DNA를 SERS 분석한 결과를 도시한 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 PCR 장치를 이용하여 증폭 과정중의 DNA를 실시간 표면증강라만산란 분광 분석한 결과를 도시한 도면이다.

이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 중합효소연쇄반응 장치 및 이를 이용한 중합효소연쇄반응 방법을 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 발명에 따른 PCR 장치는 서로 이격 배열된 투명 나노 기둥 어레이가 형성된 투명 플레이트 및 상기 나노 기둥의 상부면 및 측면을 포함하는 표면에 위치하는 플라즈모닉 금속 나노섬을 포함하는 투명 광열 기판; 및 광열 기판의 하부에 위치하며 상기 플라즈모닉 금속 나노섬에 광을 조사하는 광원; 및 투명 광열 기판에 의해 가열되는 유체를 보유하는 챔버;를 포함한다.

본 발명에 따른 PCR 장치는 투명 나노 기둥 어레이를 이루는 각 투명 나노 기둥의 상부면 및 측면을 포함하는 표면에 플라즈몬 활성을 갖는 금속인 플라즈모닉 금속의 나노섬이 위치함으로써, 플라즈모닉 금속 나노섬에 의해 광 에너지가 강하게 흡수되고 흡수된 광 에너지가 열 에너지로 방출되는 플라즈모닉 광열효과에 기반한 PCR 장치이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치에서, 투명 광열 기판(1000)을 도시한 단면도로, 도 1에 도시한 일 예와 같이, 투명 광열 기판(1000)은 서로 이격 배열된 투명 나노 기둥(110) 어레이가 형성된 투명 플레이트(100) 및 나노 기둥(110)의 상부면 및 측면을 포함하는 표면에 위치하는 플라즈모닉 금속 나노섬(210, 220)을 포함한다.

또한, 도 1에 도시한 일 예와 같이, 투명 광열 기판(1000)은 각 나노 기둥(110)의 상부면에 위치하는 금속 나노섬(210), 각 나노 기둥(110)의 측면에 위치하는 금속 나노섬(220)과 함께, 나노 기둥 사이의 투명 플레이트 표면에도 금속 나노섬(230)이 위치할 수 있다.

즉, 투명 광열 기판(1000)은 투명 나노 기둥 어레이를 이루는 각 나노 기둥(110)의 상부면과 측면 및 나노 기둥(110)간의 사이에 노출된 투명 플레이트의 표면을 포함하는 영역에 플라즈모닉 금속 나노섬(210, 220, 230)이 위치할 수 있다.

이때, 금속 나노섬(210, 220, 230)의 나노섬은 투명 광열 기판(1000)에 위치하는 플라즈모닉 금속이 서로 연결되어 연속체(continuum)를 형성하지 않는 상태를 의미할 수 있다. 이때, 연속체의 기준은 나노 기둥의 기둥 길이 방향으로, 기둥의 상부면(일단의 면)에서 기둥의 하부 단(타단)까지 플라즈모닉 금속이 연속적으로 연결되었는지 여부를 통해 판별될 수 있다. 이를 달리 상술하면, 플라즈모닉 금속 나노섬은 서로 이격되어 위치하는 상태일 수 있으며, 랜덤(random)하게 위치하되 서로 이격된 상태일 수 있다.

플라즈모닉 금속 나노섬에 의한 광 에너지의 흡수는 투명 광열 기판(1000)에 위치하는 금속 나노섬(210, 220, 230)의 SPR(surface plasmon resonance), 일 나노기둥(110)에 위치하는 금속 나노섬간(220간 또는 210과 220간)의 핫-스팟에서 발생하는 LSPR(localized sourface plasmon resonance) 및 서로 인접하는 나노기둥에서 일 나노기둥에 위치하는 금속 나노섬(210, 220)과 다른 일 나노기둥에 위치하는 금속 나노섬(210, 220)간의 핫-스팟에서 발생하는 LSPR(localized sourface plasmon resonance)에 의한 광 에너지의 흡수를 포함할 수 있다.

금속 나노섬간의 핫-스팟은 서로 인접하는 나노 기둥의 상부면에 위치하는 금속 나노섬간(210간)의 핫-스팟을 포함할 수 있으며, 이와 함께 또는 이와 독립적으로, 금속 나노섬간의 핫-스팟은 서로 인접하는 나노 기둥의 측면에 위치하는 금속 나노섬간(서로 인접하는 110 에 속하는 210간)의 핫-스팟을 포함할 수 있다.

나아가, 금속 나노섬간의 핫-스팟은 투명 플레이트 표면에 위치하는 금속 나노섬간(230간), 이와 함께 또는 이와 독립적으로, 일 나노 기둥(110)의 측면에 위치하는 금속 나노섬(220)과 투명 플레이트 표면에 위치하는 금속 나노섬(230)간의 핫-스팟을 포함할 수 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 투명 광열 기판(도 2의 GNA w/ AuNIs)의 광 파장별 흡광도(absorbance)와 Au 박막(120nm 두께, 도 2의 Au film)의 광 파장별 흡광도(absorbance)를 도시한 도면이다. 이때, 흡광도는 도 2에 흡광도와 같이 도시한 투과도(T, transmittance)와 반사도(R, reflectance)로부터 산출된 것이다.

상세하게, 도 2의 투명 광열 기판은 4인치의 보로실리케이트 유리 기판을 황산과 과산화수소수를 이용하여 세척한 후, 열증착을 이용하여 10nm 두께의 은(Ag) 막을 증착한 후, 300℃에서 30분 동안 어닐링을 수행함으로써 고체 상태 디웨팅(solid-state dewetting)을 통해 은 박막을 은 나노섬들로 전환시키고, 은 나노섬들을 식각 마스크로, 유리 기판을 건식 식각(반응성 이온 식각, reactive ion etching)한 후 잔류하는 은 마스크를 은 에칭액으로 습식 식각 제거하여 유리 나노 기둥 어레이가 형성된 유리 기판을 제조하고, 이후, 유리 나노 기둥 어레이가 형성된 유리 기판에 열 증착을 이용하여 금(Au)을 증착하여 유리 나노 기둥의 상부면과 측면 및 유리 나노기둥 사이에 노출된 유리 기판의 표면에 Au 나노섬들을 형성한 광열 기판이다. 이때, 건식 식각의 시간을 조절하여 나노 기둥의 길이를 조절하였으며, 금의 증착 시간을 조절하여 금속 나노섬의 크기와 밀도를 제어하였다. 상세하게, 건식 식각은 CF₄ 15 sccm, CHF₃ 45 sccm, Ar 150 sccm, 압력 0.2 torr, RF 파워 300 W 조건으로 86초 동안 수행되었으며, 금(Au)의 열 증착은 유리 나노 기둥의 상부면에 30nm두께의 Au 나노섬이 형성될 때까지 수행되었다. 에칭 마스크인 금속 마스크 형성 방법, 나노기둥 어레이 형성 방법 및 금속 나노섬의 형성방법은 본 출원인의 공개특허(KR2014-0140886, KR2017-0008045, KR2018-0000831)를 참고하여 수행될 수 있으며, 본 발명은 에칭 마스크인 금속 마스크 형성 방법, 나노기둥 어레이 형성 방법 및 금속 나노섬의 형성방법 관련한 본 출원인의 공개특허(KR2014-0140886, KR2017-0008045, KR2018-0000831)의 기재된 내용을 참조로 포함한다.

도 2에서 알 수 있듯이, 본 발명의 일 실시예에 따른 투명 광열 기판의 경우 플라즈모닉 금속 나노섬 자체의 SPR과 함께, 일 나노기둥에 위치하는 금속 나노섬간의 LSPR, 서로 인접한 나노기둥 각각에 속하는 금속 나노섬간의 LSPR, 나노기둥의 측면에 위치하는 금속 나노섬과 투명 기판에 위치하는 금속 나노섬간의 LSPR등의 강한 국소 전기장의 증강이 이루어지는 다양한 핫-스팟을 가짐에 따라, 넓은 광 대역에서 높은 광 흡수도를 가질 수 있다. 또한, 나노기둥 자체라 불규칙적으로(랜덤하게) 서로 이격되어 있으며, 나노기둥에 형성된 금속 나노섬들 또한 불규칙적으로(랜덤하게) 측면에 위치하며 서로 이격되어 있음에 따라, 동일한 종류의 LSPR(일 예로, 일 나노 기둥에 위치하는 금속 나노섬간의 LSPR)이라도, 서로 상이한 LSPR 파장을 가져, 투명 광열 기판은 가시광 내지 근적외선 대역, 특히 가시광 대역 전 영역의 광에 대해 0.5 이상의 우수한 광 흡수도를 가질 수 있다.

반면, Au 박막의 경우 Au의 플라즈모닉 특성에 의한 흡수가 발생하는 400~500nm 대역에서는 0.5 이상의 광 흡수도를 나타내나, 광의 파장이 500nm를 초과하며 파장이 길어짐에 따라 광 흡수도가 급격하게 감소하여 600nm 파장에서의 광 흡수도가 0.1에도 미치지 못함을 알 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 투명 광열 기판이 가시광 내지 근적외선 대역, 특히 가시광 대역(400 ~ 700nm) 전 영역의 광에 대해 0.5 이상의 우수한 광 흡수도를 가짐에 따라, 핵산을 포함하는 생화학 물질에 광학적 손상을 야기하지 않는 단순 가시광 조사에 의해 광열 효과가 발생할 수 있으며, 400 ~ 700nm 전 파장 대역에서 극히 우수한 광 흡수도로 광 에너지를 흡수함에 따라, 보다 빠르게 열이 발생할 수 있으며, 동일한 크기의 광 에너지를 조사할 때 보다 큰 열에너지가 발생할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치에서 '투명'하다 함은, 광, 구체적으로 가시광(400~700nm) 내지 근적외선(0.78~3μm)의 투과율, 구체적으로는 가시광의 투과율이 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더 구체적으로는 98% 이상인 것을 의미할 수 있다.

투명 플레이트는 광, 구체적으로 가시광 내지 근적외선, 보다 구체적으로 가시광에 대해 투명한 절연 물질이면 어떠한 물질이든 무방하다. 실질적인 일 예로, 투명 플레이트는 유리등과 같은 투명 무기물, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리우레탄아크릴레이트(PUA)등과 같은 투명 고분자등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

투명 나노 기둥은 투명 플레이트와 동종 또는 이종의 물질일 수 있으며, 광, 구체적으로 가시광 내지 근적외선, 보다 구체적으로 가시광에 대해 투명한 절연 물질이면 어떠한 물질이든 무방하다. 실질적인 일 예로, 나노 기둥은 유리등과 같은 투명 무기물, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리우레탄아크릴레이트(PUA)등과 같은 투명 고분자등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

나노 기둥 어레이를 이루는 나노 기둥의 평균 직경은 50 내지 1000nm, 구체적으로 100 내지 500nm, 보다 구체적으로 100 내지 300nm이며, 나노 기둥의 평균 길이를 평균 직경으로 나눈 종횡비는 0.1 내지 10, 구체적으로 1 내지 10, 보다 구체적으로, 1.5 내지 7, 보다 더 구체적으로 1.5 내지 4일 수 있다. 이러한 나노 기둥의 평균 직경과 종횡비는, 동일한 종류의 LSPR이라 할지라도 크기 분포가 큰 금속 나노섬과 불규칙적인(랜덤한) 금속 나노섬의 배열에 의해 다양한 LSPR 파장이 형성되어 400 ~ 700nm 전 파장 대역에서 0.55 이상의 높은 광 흡수도를 나타낼 수 있는 크기와 종횡비임과 동시에, 우수한 기계적(물리적) 안정성을 확보할 수 있으며, 또한, 광열 효과에 의해 다량의 열을 발생할 수 있고, 발생하는 열이 빠르게 유체로 전도될 수 있는 크기와 종횡비이나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 나노 기둥 어레이가 위치하는 투명 플레이트의 일 면을 기준으로, 일 면의 면적에서 나노 기둥 어레이에 의해 일 면이 덮인 면적의 비인 커버리지는 0.10 내지 0.90, 구체적으로 0.40 내지 0.85, 보다 구체적으로 0.50 내지 0.85일 수 있다.

나노 기둥 어레이에 의해 투명 플레이트의 일 면이 덮이는 면적의 비(커버리지)는 투명 광열기판의 단위 면적당 발생하는 열에 영향을 미치며, 상술한 커버리지는 4인치에 이르는 대면적의 투명 광열기판에서도 균일한 유체의 가열 내지 온도 변화가 발생할 수 있는 커버리지이나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

금속 나노섬의 금속은 플라즈몬 활성을 갖는 금속이면 무방하다. 구체예로, 금속 나노섬의 금속은 금, 백금, 은등과 같은 귀금속(noble metal), 구리, 니켈, 알루미늄등을 들 수 있으며, 생체 적합성 측면에서 금일 수 있으나, 본 발명이 반드시 금에 한정되는 것은 아니다.

투명 광열 기판에서, 나노 기둥의 상부면에 위치하는 나노섬(도 1의 210)은 나노 기둥의 상부면(상부면의 형상)에 대응하는 형상을 가질 수 있다. 구체적으로, 나노 기둥의 상부면에 위치하는 나노섬은 나노 기둥의 상부면의 형상과 크기(직경)에 대응하는 형상과 크기를 가지며 나노 기둥의 상부면을 덮을 수 있다. 실질적으로, 나노섬(210)은 디스크 형상 또는 잘린 입자상일 수 있다. 일 구체예에 따라 나노 기둥의 상부면에 위치하는 나노섬이 디스크 형상인 경우 그 측면이 볼록한 곡률을 가질 수 있다. 일 구체예에 따라 나노 기둥의 상부면에 위치하는 나노섬이 잘린 입자상인 경우 잘린 면을 제외한 표면이 부드럽게 곡률진 형상을 가질 수 있으며, 나노 기둥의 상부면과 평행하게 눌린 형상일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 나노 기둥의 상부면에 위치하는 나노섬(210)의 두께는 10 내지 50nm, 구체적으로 10 내지 40nm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 나노기둥의 측면에 위치하는 나노섬(220) 또는 나노 기둥 사이의 투명 플레이트의 표면에 위치하는 나노섬(230)은 원형, 타원 또는 불규칙한 형상등일 수 있으며, 금속 나노섬(220, 230)의 평균 직경은 5 내지 100nm일 수 있다. 구체적인 일 예로, 금속 나노섬(220, 230)은 5 내지 100nm, 구체적으로 5 내지 50nm, 보다 구체적으로 5 내지 30nm의 평균 직경을 가질 수 있으며, 나노기둥의 길이 방향으로 평균 4 내지 10개의 금속 나노섬이 이격되어 위치할 수 있다.

도 3은 도 2를 기반으로 상술한 실 제조된 투명 광열 기판의 상부를 관찰한 주사전자현미경 사진이며, 도 4는 도 2를 기반으로 상술한 실 제조된 투명 광열 기판의 측부를 관찰한 주사전자현미경 사진이다.

도 3 및 도 4를 통해 알 수 있듯이, 제조된 투명 광열 기판에서 투명 나노 기둥이 불규칙적으로 배열되며 나노 기둥 어레이를 이룸을 알 수 있으며, 투명 나노기둥의 평균 직경은 100 nm, 평균 높이 180 nm 였으며, 표면 충전율(fill factor)은 약 0.55 였다. 나노 기둥의 상부면에 위치하는 금속 나노섬은 나노섬이 위치하는 각 나노 기둥의 상부면에 대응하는 크기(직경) 및 형상을 가짐을 알 수 있으며, 30nm 두께의 디스크 형상임을 알 수 있다. 또한, 나노 기둥의 상부면을 제외한 표면에 위치하는 금속 나노섬은 그 크기가 50 nm 이며, 간격이 10 nm 이하이며, 서로 이격되어 위치하되, 랜덤하게 위치함을 알 수 있다.

플라즈모닉 금속 나노섬(210, 220, 230)은 잘린 입자상, 구체적으로 잘린 구형상일 수 있으며, 잘린 부분이 나노 기둥(110)이나 투명 플레이트(100)와 계면을 이루는 형태일 수 있다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치의 장치도를 도시한 도면이다. 도 5의 일 예와 같이, 광원(2000)은 투명 광열 기판(1000)의 하부에 위치하여 투명 광열 기판(1000)의 금속 나노섬이 위치하는 나노 기둥 어레이에 광을 조사할 수 있다.

광원의 광은 가시광 내지 근적외선일 수 있다. 가시광은 400 내지 700nm 대역에 속하는 광일 수 있으며, 근적외선은 0.78 내지 3μm 대역에 속하는 광일 수 있다. 높은 광 흡수율, 핵산을 포함하는 생화학 물질의 손상 방지, 보다 빠르고 균일한 광열 효과의 발생을 위해, 조사되는 광원의 광은 가시광인 것이 유리하다. 이때, 가시광은 백색광만을 의미하는 것은 아니며, 적색광, 녹색광, 청색광, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있음은 물론이다. 즉, 광원은 적색 광원, 녹색 광원, 청색 광원, 또는 백색 광원을 포함한 이들의 조합을 포함할 수 있다.

다만, 상술한 바와 같이, 본 발명의 일 구체예에 따른 투명 광열 기판(1000)은 가시광 대역(400~700nm) 전 영역에서 0.5, 실질적으로 0.55 이상의 극히 높은 광 흡수도를 가질 수 있다. 이에, 단파장의 광이 조사되어도 무방하나, 보다 빠른 시간에 보다 많은 열이 발생될 수 있도록 광원은 백색 광원인 것이 유리하다. 실질적으로 백색 광원은 할로겐 램프나 제논 램프, 백색 LED 등일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 필요시 필터등을 이용하여 광원에서 발생하는 자외선등이 제거된 백색광(가시광)이 조사될 수 있음은 물론이다.

또한, 도 5에 도시한 일 예와 같이, 챔버(3000)는 투명 광열 기판(1000) 상부에 위치할 수 있으며, 챔버(3000)는 하부면 및 측면에 의해 구획되는 내부 공간을 가질 수 있고, 내부 공간에 유체가 보유될 수 있다. 챔버의 내부 공간은 PCR용 유체가 수용되는 수용 공간으로 반응이 발생하는 영역이다.

도 5의 일 예에서 일 투명 광열 기판(1000)에 단일한 챔버(3000)가 구비된 예를 도시하였으나, 일 투명 광열 기판(1000) 상에 둘 이상의 챔버(3000)가 서로 이격되어 구비될 수 있음은 물론이며, 챔버들에는 서로 동일하거나 상이한 유체가 보유될 수 있음은 물론이다. 챔버는 분석 대상물(생화학 물질등)을 함유하는 유체가 보유되는 공간을 구획함에 따라, 웰로도 치징될 수 있다. 챔버(3000)의 형상은 원형 또는 사각 내지 팔각의 다각 형상일 수 있으며, 그 직경은 수 mm 내지 수 cm 수준 또는 이와 달리 직경이 1000 μm 이하의 미세 챔버(미세 웰)일 수 있다.

유체(PCR용 유체)는 목적 핵산, 핵산 중합효소 및 목적 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 용액(완충 용액을 포함함)일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 PCR에 사용되는 조성물이면 족하다. 목적 핵산은 PCR 등의 증폭반응으로 증폭시킬 수 있는 모든 핵산을 의미하며, 일 예로, 1개 또는 복수 개의 염기 변이 부위를 함유하고 있는 DNA, RNA, cDNA 등의 핵산일 수 있다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어, 투명 광열 기판(1000)의 다른 예를 도시한 일 단면도로, 도 6에 도시한 일 예와 같이, 투명 광열 기판(1000)은 플라즈모닉 금속 나노섬(210, 220)이 위치하는 나노 기둥(110)을 덮는 방열층(300)을 더 포함할 수 있다.

방열층(300)은 플라즈모닉 광열 효과에 의해 발생하는 열을 챔버에 보다 신속히 전달하는 역할을 수행할 수 있으며, 이와 함께 표면 전하를 중화시키는 역할 또한 수행할 수 있다.

방열층(300)은 투명 플레이트의 열전도도(thermal conductivity)와 비교하여 이와 유사하거나 높은 값의 열전도도를 가지는 물질이면 족하다. 구체예로, 방열층(300)은 a-Si, SiO₂, HSQ(Hydrogen silsesquioxane)등의 무기물이나 PDMS(Polydimethylsiloxane)등의 고분자등일 수 있으며, 방열층의 두께는 1nm 내지 100μm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 도 6에서는 방열층(300)에 나노 기둥 어레이가 모두 함입된 예를 도시하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 나노 기둥에 의한 요철이 그대로 유지되는 수 내지 수십 나노미터의 얇은 막 형태로 방열층이 구비될 수도 있음은 물론이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어, 투명 광열 기판(1000)과 챔버(3000)를 도시한 일 단면도이다. 도 7에 도시한 일 예와 같이, 챔버(3000)는 나노 기둥(110)의 상부면에 위치하는 금속 나노섬(210)과 접하여 위치하되 나노 기둥 어레이를 덮는 상부판 및 나노 기둥 어레이를 감싸도록 상기 상부판으로부터 연장되어, 연장된 일 단이 상기 투명 플레이트와 접하는 측부를 포함할 수 있다.

금속 나노섬이 형성된 나노 기둥(110)간의 빈 공간이 챔버(3000)에서 유체가 보유되는 내부 공간에 해당할 수 있으며, 또한, 챔버(3000)의 가장자리 영역에 유체 주입을 위한 주입구 및 벤트를 위한 관통공이 더 구비될 수 있음은 물론이다.

나노 기둥(110)간의 빈 공간이 유체의 보유 공간이 됨에 따라, 플라즈모닉 광열 효과를 발생하는 금속 나노섬들이 직접 유체와 접촉할 수 있다. 이에, 광에 에 의해 발생되는 열이 직접적으로 유체를 가열할 수 있으며, 이와 함께 보다 신속하고 균질하게 유체의 온도를 제어할 수 있고, 또한, 광의 제어에 의해 주입된 유체가 전체적으로 설정된 온도 프로파일에 매우 정확하게 부합되게 그 온도가 제어될 수 있다.

도 5 또는 도 7의 일 예에 도시한 챔버(3000)의 재료는 핵산과 반응하지 않으며, 투명한 절연 재질인 한 특별히 제한되지 않는다. 구체예로, 챔버는 유리등과 같은 투명 무기물, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리우레탄(PU), 폴리프로필렌(PP), 폴리우레탄아크릴레이트(PUA)등과 같은 투명 고분자등일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치는 광열 기판 또는 챔버에서 유체가 보유되는 공간의 온도를 측정하는 온도 센서를 더 포함할 수 있다. 온도 센서는 열측정 카메라(thermographic camera), 열전대(thermocouple) 등 챔버내 수용 공간의 온도를 측정할 수 있는 장치이면 무방하다. 온도 센서는 PCR 진행시 에는 불필요할 수 있으나, 설정된 온도 프로파일에 부합하도록 광원의 제어 인자들의 값들을 설정할 때 요구될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치는 광원을 제어하는 광 조사 제어부를 더 포함할 수 있으며, 광 조사 제어부는 적어도 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어할 수 있다.

구체적으로, 광 조사 제어부는 기 설정된 온도 프로파일에 부합하도록 광원을 제어할 수 있으며, 기 설정된 온도 프로파일에 부합하도록 적어도 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어할 수 있다. 이때, 광 조사 제어부는 온도 센서의 출력을 입력받아 입력된 온도 센서의 정보를 기반으로 기 설정된 온도 프로파일에 부합하도록 적어도 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어할 수 있음은 물론이다.

광 조사 시간의 제어는 펄스 조사나 연속 조사와 같은 조사 형태의 제어를 포함할 수 있다. 광의 조사 주기의 제어는 광의 온/오프 제어를 포함할 수 있으며, 펄스 조사의 경우 펄스의 폭과 펄스간 간격의 제어를 포함할 수 있다. 광의 세기는 시간에 따른 광의 세기(일정하거나 변화되는 세기), 펄스 조사의 경우 펄스를 구성하는 최대 크기(세기)와 최소 크기(세기)(0을 포함)의 제어를 포함할 수 있다. 광의 세기는 광원에 인가되는 전압이나 전류등에 의해 제어될 수 있음은 물론이다.

시간에 따른 온도 프로파일은 기 설정된 온도 프로파일로, 선행 실험을 통해 해당 온도 프로파일에 부합하도록 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)의 제어값이 광 조사 제어부에 기 입력된 상태일 수 있다. 이와 달리 온도 센서의 출력을 입력받아 기 설정된 온도 프로파일에 부합하도록 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어할 수 있다.

제어부에 기 입력된 시간에 따른 온도 프로파일의 일 예로, 결합 온도(annealing temperature)에서 변성 온도(denaturation)로의 승온 및 변성 온도에서 결합 온도로의 감온을 사이클로 하여 상기 사이클이 반복되는 프로파일일 수 있으며, 승온 속도값, 감온 속도값, 결합 온도값, 변성 온도값, 결합 온도에서의 유지 시간(0을 포함함), 변성 온도에서의 유지 시간, 사이클 반복 횟수등이 기 정해진 온도 프로파일일 수 있으나, 본 발명이 온도 프로파일의 구체 조건에 의해 한정될 수 없음은 물론이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 중합효소연쇄반응 장치는 유체에서 발생하는 라만 신호를 검출하는 검출기를 더 포함할 수 있다. 즉, 라만 신호를 검출하는 검출기를 더 포함함으로써, 표면 증강 라만 산란 분광법(SERS)에 의해 증폭되는 핵산의 물질 정보 및 증폭 정도를 실시간으로 분석할 수 있다. 이때, 광원이 라만 산란을 위한 여기 광의 파장을 포함하는 경우, 별도의 레이저(여기 파장의 광을 발생하는 레이저)가 불필요하나, 선택적으로 필요시 검출기와 함께 여기 파장의 광을 발생하는 레이저를 더 포함할 수 있다.

핵산 증폭과 함께 수행될 수 있는 실시간 SERS 분석은, 상술한 투명 광열 기판이 라만 신호를 증강할 수 있는 핫-스팟이 구비된 기판인 점, 투명 광열 기판에 존재하는 LSPR의 파장이 400~700nm에 이르는 넓은 파장 대역에 걸쳐 존재하는 점, 특히 도 7과 같은 챔버의 경우 유체가 직접 핫 스팟과 접촉할 수 있어 매우 강한 신호 증강이 가능한 점에 근간한다.

이때, SERS 분석을 동시 수행하고자 하는 경우, 유체는 목적 핵산, 핵산 중합효소 및 목적 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍과 함께, 목적 핵산에 결합되는 라만 프로브(Raman prove)를 더 포함할 수 있음은 물론이다.

SERS 분석은 핵산 증폭 도중에 실시간으로 수행될 수 있으며, 이와 달리 핵산의 증폭이 완료된 후 수행될 수 있다.

도 8은 도 5와 유사한 구조로 PDMS 챔버를 도 2를 기반으로 상술한 광열 기판 상부에 형성하고, 광열 기판 하부에 백색 LED 광원(3W)을 위치시켜 제조한 PCR 장치의 광학 사진 및 온도 맵핑 결과를 도시한 도면으로, 광원이 꺼지는 경우 챔버 내부의 온도가 주변과 동일하나, 광원이 켜지는 경우 챔버 내부가 균일하게 가열된 것을 확인 할 수 있다.

도 9는 도 8로 도시한 PCR 장치에서 광 조사의 제어에 따른 온도 사이클 특성을 측정 도시한 도면으로, 도 9에서 붉은색으로 도시된 GNA w/ AuNIs는 도 8로 도시한 PCR 장치의 결과이며, 푸른색으로 도시된 Au film은 도 8로 도시한 PCR 장치에서 금속 나노섬이 위치하는 나노 기둥 어레이가 형성된 투명 광열 기판 대신, 도 2에서 Au 박막(120nm 두께)이 형성된 유리 기판을 투명 광열 기판으로 사용한 장치의 결과이다. 도 10은 도 9에서 기 설정된 온도 프로파일(결합 온도(55℃) -> 변성 온도(93℃)->결합 온도(55℃)의 사이클의 반복) 및 해당 온도 프로파일을 구현한 광원의 제어 조건을 도시한 도면으로, 백색 LED 광원에 의해 펄스형 백색광이 조사되었으며, 펄스 인가시 광원의 전압은 24V였고, 펄스의 폭(t1)은 4 sec이었으며, 펄스간 간격(t2)은 3 sec였다.

도 9에서 알 수 있듯이, 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치의 경우, 3분 30초 이내에 30회의 열 사이클이 구현됨을 알 수 있으며, 열 사이클 별로 최대 온도와 최소 온도가 편차 없이 균일하게 제어됨을 알 수 있으며, 설계된 온도(93℃의 결합 온도 및 55℃의 변성 온도)가 매우 정확하게 구현됨을 알 수 있다.

도 9의 Au film의 결과를 통해 알 수 있듯이, 이러한 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치를 통해, 종래의 플라즈모닉 광열 효과에서 구현될 수 없는 초고속 온도 조절(가열 & 냉각)이 구현됨을 보이는 것이며, 초고속 및 초 고효율 PCR이 구현됨을 보이는 것이다. 또한, 도 2의 일 예를 기반으로 상술한 바와 같이, 증착, 어닐링, 건식 에칭, 습식 에칭, 증착이라는 단순한 공정을 통해 광열 기판의 제조가 가능하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치가 저비용으로 대량 생산될 수 있음을 알 수 있으며, 도 8과 같이, 광열 기판, 광원 및 챔버라는 작고 가벼우며 단순한 장치 구조를 가져 휴대 및 이동 가능하며, 기 설정된 온도 프로파일에 부합하도록 제어부에 제어값들이 입력되어 온도 사이클이 반복 구현 될 수 있음에 따라, 비숙련자라도 안정적이고 효과적이며 정확하게 핵산을 증폭시킬 수 있어, 현장진단(POC)에 매우 적합함을 알 수 있다.

도 11은 도 8로 도시한 장치(도 11의 Plasmonic PCR)를 이용한 핵산을 증폭 결과를 도시한 도면으로, 비교를 위해 펠티에 메탈 블록을 이용한 상용의 서멀 사이클러(도 11의 thermal cycler)에 의한 증폭 결과를 함께 도시하였다.

상세하게, 도 11의 결과는 주형 λ-DNA(template λ-DNA), Z-Taq DNA 중합효소 (Z-Taq DNA polymerase, Takara Bio Inc.), Z-Taq 완충액 (Z-Taq buffer, Takara Bio Inc.), 뉴클리오시드3인산 (dNTP, Takara Bio Inc.), 정방향 프라이머 (Forward primer, Bioneer Inc.), 역방향 프라이머 (Reverse primer, Bioneer Inc.)를 사용한 것이며, PCR용 유체(PCR 조성물)은 0.2 μL Z-Taq DNA 중합효소, 2 μL Z-Taq 완충액, 1.6 μL 뉴클리오시드3인산, 1.8 μL 정방향 프라이머, 1.8 μL 역방향 프라이머, 1 μL 주형 λ-DNA (1 ng/μL), 12.4 μL 증류수를 혼합하여 제조되었으며, 도 8에 따른 PCR 장치의 챔버에 20μL의 PCR 조성물과 30 μL 미네랄오일을 순차적으로 투입한 후, 도 9 및 도 10을 기반으로 상술한 바와 유사하게, 온도 사이클이 반복되도록 하여 광열 PCR을 실시하였다.

도 11에서 증폭된 DNA의 강도(intensity)는 전기 영동에 의한 값이며, cycle number는 증폭을 위해 수행된 온도 사이클의 반복 횟수이며, PCR time(s)은 해당 횟수의 온도 사이클이 반복될 때 소요된 시간(sec)을 의미한다.

도 11에서 알 수 있듯이, 종래의 PCR 기술 중 매우 빠른 증폭이 이루어지는 펠티에 소자 기반 써멀 사이클러의 경우 20회의 반복에 약 1100초가 소요되나, 본 발명의 일 실시예에 따른 장치의 경우 20회의 반복에 약 600초가 소요될 뿐임을 알 수 있으며, 동일한 10회, 20회의 온도 사이클 반복 횟수에서의 DNA 강도를 살피면, 동일한 횟수로 온도 사이클이 반복된 경우 종래의 써멀 사이클러보다 본 발명의 일 실시예에 따른 장치에서 핵산 증폭이 보다 효과적으로 이루어짐을 알 수 있다.

도 12는 라만 프로브로 SYBR green을 더 포함하는 PCR용 유체(도 11에서 상술한 바와 동일)를 도 8로 도시한 장치에 투입하고 열 사이클의 반복에 의해 핵산을 증폭시키는 과정 중, 도 10과 같이 광원이 꺼지는 시간(t2) 동안 633nm의 레이저를 챔버 내 유체에 조사하고 DNA에서 방출되는 SERS 신호를 분광기(spectrometer)를 통해 검출한 결과를 도시한 도면이다.

도 12에서 알 수 있듯이, PCR과 SERS에 의한 핵산 검출이 동시 수행될 수 있음을 알 수 있으며, SERS 측정에 의해 증폭되는 DNA의 정보 및 증폭 정도를 '실시간'으로 검출 가능한 것을 알 수 있다.

도 12의 결과에서 LED 백색 광원이 꺼져 있는 시간 동안 633nm의 레이저를 여기 광으로 조사하였으나, 광원이 여기광의 파장을 포함하는 백색광을 생성하는 경우 별도의 레이저 조사 없이 광원에서 발생하는 광을 조사하는 것만으로도 SERS 측정이 수행될 수 있음은 물론이다.

본 발명은 상술한 PCR 장치를 이용한 PCR 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 PCR 방법은 상술한 중합효소연쇄 반응장치를 이용한 중합효소연쇄 반응 방법이며, a) 챔버에 중합효소연쇄반응 대상인 유체(PCR용 유체)를 투입하는 단계; 및 b) 유체가 시간에 따른 온도 프로파일에 부합하도록 광원에서 발생하는 광을 투명 광열 기판에 조사하는 단계;를 포함한다.

PCR 장치를 기반으로 상술한 바와 같이, 투명 광열 기판에 조사되는 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어함으로써 기 설정된 시간에 따른 온도 프로파일에 부합하도록 유체의 온도가 제어될 수 있다.

이때, 시간에 따른 온도 프로파일은 결합 온도(annealing temperature)에서 변성 온도(denaturation temperature)로의 승온 및 변성 온도에서 결합 온도로의 감온을 사이클로 하여 상기 사이클이 반복되는 프로파일일 수 있다. 구체 예로, 결합 온도는 50 내지 60℃일 수 있고, 변성 온도는 90 내지 98℃일 수 있으나, 증폭하고자 하는 핵산인 목적 핵산, 핵산 중합효소 및 목적 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍의 구체 물질에 따라 알려진 결합 온도와 변성 온도로 온도 프로파일을 구성할 수 있음은 물론이다.

b) 단계의 중 또는 b) 단계 후, 유체에 라만 산란을 위한 여기광을 조사하거나 광원의 광을 조사하여 표면 증강 라만 산란 분석을 수행하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 방법은 초고속 및 초고효율 핵산 증폭과 함께, SERS를 이용한 실시간 핵산 검출(증폭 과정 중 핵산의 실시간 검출)이 동시 수행될 수 있다.

이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.

따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims

서로 이격 배열된 투명 나노 기둥 어레이가 형성된 투명 플레이트 및 상기 나노 기둥의 상부면 및 측면을 포함하는 표면에 위치하는 플라즈모닉 금속 나노섬을 포함하는 투명 광열 기판;
상기 광열 기판의 하부에 위치하며 상기 플라즈모닉 금속 나노섬에 광을 조사하는 광원; 및
상기 투명 광열 기판에 의해 가열되는 유체를 보유하는 챔버;
를 포함하는 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 플라즈모닉 금속 나노섬은 서로 이격되어 위치하는 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 나노 기둥의 평균 직경은 50 내지 1000 nm이며, 상기 나노 기둥의 평균 길이를 평균 직경으로 나눈 종횡비는 0.1 내지 10인 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 나노 기둥 어레이가 위치하는 투명 플레이트의 일 면을 기준으로, 일 면의 면적에서 나노 기둥 어레이에 의해 일 면이 덮인 면적의 비인 커버리지는 0.1 내지 0.9인 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 나노 기둥의 상부면에 위치하는 나노섬은 상기 나노 기둥의 상부면에 대응하는 형상이며, 상기 나노기둥의 측면에 위치하는 나노섬은 평균 직경이 5 내지 100 nm인 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 광열 기판은 상기 플라즈모닉 금속 나노섬이 위치하는 나노 기둥을 덮는 방열층을 더 포함하는 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 광원의 광은 가시광 내지 근적외선인 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 챔버는 하부면 및 측면에 의해 구획되는 내부 공간을 가지며, 상기 내부 공간에 상기 유체가 보유되는 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 챔버는 상기 나노 기둥의 상부면에 위치하는 금속 나노섬과 접하여 위치하되 나노 기둥 어레이를 덮는 상부판 및 상기 나노 기둥 어레이를 감싸도록 상기 상부판으로부터 연장되어, 연장된 일 단이 상기 투명 플레이트와 접하는 측부를 포함하는 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항에 있어서,
상기 중합효소연쇄반응 장치는 상기 광열 기판 또는 상기 챔버에서 유체가 보유되는 공간의 온도를 측정하는 온도 센서를 더 포함하는 중합효소연쇄반응 장치.
제 10항에 있어서,
상기 광원을 제어하는 광 조사 제어부를 더 포함하며, 상기 광 조사 제어부는 적어도 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어하는 중합효소연쇄반응 장치.
제 11항에 있어서,
상기 광 조사 제어부는 기 설정된 온도 프로파일에 부합하도록 상기 광원을 제어하는 중합효소연쇄반응 장치.
제 11항에 있어서,
상기 중합효소연쇄반응 장치는 상기 유체에서 발생하는 라만 신호를 검출하는 검출기를 더 포함하는 중합효소연쇄반응 장치.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 중합효소연쇄 반응장치를 이용한 중합효소연쇄 반응 방법이며,
a) 챔버에 중합효소연쇄반응 대상인 유체를 투입하는 단계; 및
b) 유체가 시간에 따른 온도 프로파일에 부합하도록 광원에서 발생하는 광을 투명 광열 기판에 조사하는 단계;
를 포함하는 중합효소연쇄 반응 방법.
제 14항에 있어서,
상기 투명 광열 기판에 조사되는 광의 세기, 광 조사 시간 및 광의 조사 주기에서 하나 이상 선택되는 인자(factor)를 제어함으로써 상기 시간에 따른 온도 프로파일을 만족시키는 중합효소연쇄 반응 방법.
제 14항에 있어서,
상기 시간에 따른 온도 프로파일은 결합 온도(annealing temperature)에서 변성 온도(denaturation)로의 승온 및 변성 온도에서 결합 온도로의 감온을 사이클로 하여 상기 사이클이 반복되는 프로파일인 중합효소연쇄 반응 방법.
제 16항에 있어서,
b) 단계의 중 또는 b) 단계 후,
상기 유체에 라만 산란을 위한 여기광을 조사하거나 상기 광원의 광을 조사하여 표면 증강 라만 산란 분석을 수행하는 단계;를 더 포함하는 중합효소연쇄 반응 방법.