KR20170106995A

KR20170106995A - 핵산 증폭용 led 구동 플라즈몬 가열 장치

Info

Publication number: KR20170106995A
Application number: KR1020177022610A
Authority: KR
Inventors: 루크 이; 준 호 손; 병래 조
Original assignee: 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2017-09-22
Also published as: WO2016115542A1; EP3245283A4; US11130993B2; KR102292998B1; US20180080064A1; EP3245283A1; US20220042073A1; EP3245283B1

Abstract

중합 효소 연쇄 반응(PCR)의 고속 열 순환을 통하여 핵산을 증폭시키기 위하여, 플라즈몬 박막-기반 2D 및 3D 구조체 및 발광 다이오드(LED)의 조합된 용도에 의해 플라즈몬 가열을 일으키는 시스템 및 방법이 설명되었다.

Description

핵산 증폭용 LED 구동 플라즈몬 가열 장치

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 각각 참고에 의해 여기에 완전히 통합되는, 2015년 1월 16일에 출원한, 미국 가출원 번호 62/104,574의 우선권을 요구한다.

전산 프로그램 부록의 문헌의 원용

해당 사항 없음

콤팩트 디스크로 제출된 소재의 참조를 통한 결합

해당 사항 없음

저작권 보호를 수신하는 소재의 고시

본 특허 문서의 소재의 일부는 미국 및 다른 나라의 저작권법 하에서 저작권 보호를 받는다. 모든 저작권이 유보된 것이 아니라면 미국 특허상표청(United States Patent and Trademark Office)에서 공중이 이용가능한 파일 또는 기록으로서 나타난 것인 한, 저작권의 소유자는 특허문서 또는 특허 개시내용의 어느 것에 의해 팩시밀리복제(facsimile reproduction)에 반대할 수 없다. 저작권 소유자는 이에 의하여 37 C.F.R. $ 1 .14에 의하여 그 권리를 제한하지 않는 것을 포함하여, 기밀로 유지되는 본 특허 문서를 가지는 그 권리의 어떤 것도 포기하지 않는다.

본 명세서는 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 진단 시스템 및 방법, 및 더 특히 고속/초고속 PCR용 플라즈몬 가열 시스템 및 방법에 관한 것이다.

1983년 처음 도입된 이후, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)은 임상 실험실, 농업 과학, 환경 과학 및 법의학 분야에서 필수적인 기술이 되었다.

PCR은 열 순환을 이용하거나, 특정 핵산 표적 서열(nucleic acid target sequences)을 증폭하기 위해 2 또는 3의 불연속 온도(discrete temperature) 사이에서 반복되는 온도 변화를 이용한다. 열을 순환시키기 위하여, 종래의 벤치-탑 열 순환기(bench-top thermal cyclers)는 일반적으로 펠티에 소자(Peltier elements)에 의해 움직이는 금속 열 블록을 이용한다. 상업용 PCR 시스템은 증폭 시간을 감소시키기 위해 가열 및 냉각 속도를 향상시키나, 상대적으로 시간을 많이 소모한다(일반적으로 증폭 당 1시간 이상 필요). 그 이유는 균일하게 가열된 96-웰 또는 384-웰 플라스틱 PCR 플레이트 및 웰 당 수십 마이크로리터의 반응 부피가 필요한 시스템의 더 큰 열 용량 때문일 수 있다.

고속/초고속 PCR은 현장 진료(POC; point of care) 수준에서 전염성 질환, 심장 질환, 암, 신경 장애 질환, 신속한 생물학전(biowarfare) 및 병원균 식별의 시기적절한 진단과 같은 응용 분야에 매우 바람직하기 때문에 많은 학계 및 산업 그룹 PCR 시스템을 개선해왔다. 하지만, 기존의 시스템은 전력 소모가 많고 중량이 크기 때문에 복잡한 제조 공정이 필요하며 인적 오류가 발생하고 고가의 레이저 및 검출 시스템이 필요하거나 안정성 문제가 있기 때문에 POC 테스트에 적합하지 않다.

따라서, 본 발명의 목적은 휴대성이 있고, 튼튼하고 단순하며 사용이 용이하고 소형화 및 집적화를 통해 전력 소모가 낮은 것을 특징으로 하는 고속/초고속 PCR 시스템에 있다.

본 명세서는 임상 실험실, 정밀 의학, 개인 맞춤형 의학, 농업 과학, 과학 수사 및 환경 과학용 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 핵산을 증폭시키고 정량화하는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 전력 소모가 낮고 컴팩트한 사이즈이며 단순하게 작동되는 것을 특징으로 하는 초고속 다중 PCR은 현장 진료(POC)에 있어서 신속하게 진단하는데 적합하다.

일 측면은 광자-전자-포논(photon-electron-phonon) 결합을 통해 플라즈몬 광열 변환을 이용하는 초고속 포토닉 PCR에 있다. 플라즈몬-보조된 높은 광 흡수율(450 nm에서 ~65%, 열원 LED의 피크 파장)을 위해 Au 박막을 사용하는 효율적인 광자 열 변환기(photonic heat converter)가 개시되었다. 플라즈몬-여기된 Au 필름은 3분 안에 150℃ 이상으로 주변 용액을 빠르게 가열할 수 있다. 이 방법을 이용하여, 55℃(어닐링 온도)에서 95℃(변성 온도)로 초고속 열 순환(예를 들어, 30 사이클: 각각 12.79 ± 0.93℃ sec^-1 및 6.6 ± 0.29℃ sec^- ¹)은 5분 내에 성취된다. 포토닉 PCR 열 순환을 이용하여, 성공적인 핵산(λ-DNA)의 증폭을 증명하였다. 효과적인 광자-기반 가열 방법을 이용하여 초고속 PCR에 대한 간단하고 견고하며 저비용의 접근법은 일반적으로 등온 증폭을 위하여 온-칩 열 용해(on-chip thermal lysis) 및 가열 단계를 포함하여 다양한 장치 또는 방법에 통합될 수 있다.

전자 빔 증착에 의해 제조된 나노 미터 크기의 입자를 가지는 Au 박막은 표면 플라즈몬 공명을 통해 광 흡수를 향상시켜 Au 박막의 플라즈몬 가열을 빠르게 하는 것을 특징으로 한다. 저비용(<5$) LED는 저비용 렌즈(<1$)로 광을 포커싱하여 140℃까지 액체의 온도를 효과적으로 증가시킬 수 있다. 최대 램프 속도는 7℃/sec이며, 50℃ 및 90℃에서 온도 안정성은 각각 ±0.5℃ 및 ±0.7℃이다.

PCR을 위한 고속 열 순환(50~90℃, 19분 동안 40 사이클)을 통한 핵산 증폭은 Au 박막의 LED 구동 플라즈몬 가열을 이용하여 성공적으로 증명되었다. 본 발명에 따라, 현장 진단을 위한 매우 저렴한 비용과 낮은 전력 소모로 간단하고 휴대성있는 PCR 열 순환기(thermal cycler)를 얻을 수 있다.

이 기술은 PCR 및 / 또는 LAMP 및 RPA를 포함하는 등온 증폭을 이용하여 핵산을 검출하는 고속 열 순환기에 용이하게 사용될 수 있다. PCR 핵산 검출을 위한 고속 열 순환기가 개시된 본 발명을 이용하는 최선의 방법이 될 것이다.

일반적으로 본 발명은 인간, 동물의 건강 관리 또는 환경에 대한 현장 진료 검사에 있어서, 검사 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 고리-매개 등온 증폭법(loop- mediated isothermal amplification, LAMP) 및 재조합 효소 중합 효소 증폭법(recombinase polymerase amplification, RPA)을 이용하여 핵산을 증폭시키는 고속 열 순환에 사용될 것이다.

가장 뛰어난 장점은 단순한 플라즈몬 히터 제조(복잡한 패터닝 공정 또는 값 비싼 금 나노 입자는 필요 없음)로 저비용(LED <$5, 초점 렌즈 <$1) 및 저전력 소모(LED <3W) 열 순환기를 얻는 것이다. 또한, 현장 진단 핵산 테스트를 위한 간단하고 쉬운 시스템 레벨의 통합은 다른 장점이다.

본 기술의 추가 양상은 본 명세서의 다음 부분에서 제시될 것이며, 발명의 상세한 설명은 한정하지 않고 기술의 바람직한 실시예를 완전히 개시하기 위한 것이다.

여기에 설명된 기술은 단지 설명을 목적으로 하는 다음의 도면을 참조하여 더욱 완전하게 이해될 것이다:
도 1은 본 발명의 기술에 따른 초고속 포토닉 PCR의 원리를 나타내는 개략도이다.
도 2a 및 도 2b는 광-열 변환기로서 Au 박막을 사용하고 발광 다이오드로부터의 여기 광을 사용하는 초고속 포토닉 PCR 시스템의 개략도이다.
도 3은 LED 구동 초고속 포토닉 PCR 시스템의 개략도이다.
도 4a~4f는 전자기 방사선을 사용하여 본 명세서의 Au 박막의 열 발생에 대한 시뮬레이션을 도시한다. 도 4a 및 도 4b는 PMMA 기판 상에 각각 10 nm 및 120 nm 두께의 Au 필름의 전자기장에 대한 이미지를 도시한다. 도 4c 및 도 4D는 PMMA 기판 상에 각각 10 nm 및 120 nm 두께의 Au 필름의 저항성 열 분포에 대한 이미지를 도시한다. 도4e는 다른 두께를 가지는 Au 박막의 측정된 흡수 스펙트럼의 도표를 나타낸다. 도 4f는 Au 필름 두께의 함수로서 3개의 다른 컬러의 LED로부터 방출 파장에 대한 평균으로 Au 박막의 열-광 전환율의 도표를 나타낸다.
도 5~5f는 Au 박막의 LED 구동 광열 가열 및 PCR 열 순환의 도표를 나타낸다.
도 6a는 95℃(변성)에서 55℃(어닐링 및 연장)로 30 초고속 포토닉 PCR 열 순환의 대표 온도 프로파일의 도표이다.
도 6b는 초고속 광자 열 순환으로부터 얻어진 가열 및 냉각 속도의 도표이다.
도 6c는 λ DNA 템플릿을 이용하여 벤치-탑 열 순환기와 비교하여 포토닉 PCR 열 순환기로부터 생성물을 형성하는 것을 나타내는 이미지이다.
도 7은 박막에 분포된 전자기장 및 저항성 열(resistive heat)에 대한 시뮬레이션에 이용된 대표 형상의 단면도이다.
도 8은 각각 450 nm(blue I), 480 nm(Blue II) and 530 nm(Green)의 피크 파장에 따라 3개의 다른 LED로부터 측정된 표준화된 광 방사 스펙트럼의 도표이다.
도 9a 및 도 9b는 다른 두께에 따른 PMMA 기판 상의 Au 박막의 각각의 투과율 및 반사율의 도표이다.
도 10은 냉각 팬(cooling fan) 없이 62~94℃로 31 초고속 열 순환의 도표 비교이다.
도 11은 Au 박막의 LED 구동 플라즈몬 가열에 대한 실험 장치의 개략도이다.
도 12는 Au 박막의 LED 구동 플라즈몬 가열을 이용하여 고속 열 순환을 나타내는 도표이다.
도 13a는 다른 Au 박막 두께에 따른 액체(글리세롤, 5μL)의 온도 변화를 나타내는 도표이다. LED의 주입 전류는 700 mA로 고정된다.
도 13b는 박막(20) 두께를 변경하기 위한 플롯 온도(plot temperature)를 도시한다.
도 13c는 파장의 함수로서 Au 박막의 흡수율 변화를 도시하는 도표이다. 삽입된 그림은 나노 미터 크기의 입자를 포함하는 Au 박막의 대표적인 SEM 이미지를 보여준다.
도 13d 및 13e는 각각 56 nm 및 96 nm에서 Au 박막의 이미지를 도시한다.
도 14a는 LED의 다른 주입 전류에 따른 액체(글리세롤, 5μL)의 온도 변화를 나타내는 도표이다.
도 14b는 주입 전류의 함수로서 최대 온도(왼쪽 축) 및 램프 속도(오른쪽 축)의 변화를 도시하는 도표이다.
도 15는 50℃ 및 90℃에서 Au 박막의 LED 구동 플라즈몬 가열의 온도 안정성을 나타내는 도표이다.
도 16은 PCR 반응 중 IR 카메라에 의해 측정된 열 순환의 온도 프로파일을 나타내는 도표이다.
도 17은 플라즈몬 및 벤치 탑 열 순환기로부터 생성물을 형성하는 것을 증명하는 겔 아가로스 겔(gel agarose gel)의 사진이다.

도 1~도 3을 참조하여, 광-열 변환기로서 Au 박막의 사용 및 열원으로서 발광 다이오드(LED)와 같은 광원을 조합하는 신규 초고속 포토닉 PCR 시스템 및 방법이 도시되었다.

도 1은 본 명세서의 기술에 따라 플라즈몬 광열 광-열 변환(plasmonic photothermal light-to-heat conversion) 및 그 후 광자-전자-포논(photon-electron-phonon) 결합을 통한 주변 매체의 가열의 개략도이다. 광(광자)(10)는 광자 결합(photon coupling, 14)을 생성하기 위하여 Au 분자(Au molecule, 12) 쪽으로 향하며 이로 인하여 매체(16)(PCR 혼합물)에 열이 발생한다.

물질과의 광자 상호 작용을 고려할 때, 광자의 흡수는 종종 열로 처리된다. 여기원(excitation source)으로부터 광자(10)가 얇은 Au 분자(12)의 표면에 도달할 때, 플라즈몬-보조된 강한 광 흡수가 발생할 수 있다. 이것은 차례로 표면 근처에서 전자를 더 높은 에너지 상태로 여기하여, 100fs 내에서 고온 전자를 생성한다. 이러한 고온 전자는 작은 전자 열 용량으로 인해 수천 도의 켈빈 온도에 도달할 수 있다. 또한, 고온 전자는 Au 박막 전체에 빠르게 확산되어 고온 전자를 균일하게 분포시킨다. 급속 가열은 5~10 ps 후에 고온 전자와 격자 포논(lattice phonons) 사이의 에너지 교환에 의해 평형 상태로 냉각된다. 따라서, Au가 빛을 받을 때, 고온 금속 표면과 냉각기 주변 용액(cooler surrounding solution, 16) 사이의 큰 온도 차이가 발생하여, 100 ps 이상의 장시간 동안 주변 용액(16)의 가열(14)을 초래한다.

도 2a 및 도 2b(분해도)는 광-열 변환기로서 플라즈몬(예를 들어, 금(Au)) 박막(20) 및 광원(22)(예를 들어, LED)으로부터 여기 광(10)을 이용하여 초고속 포토닉 PCR용 시스템의 개략도를 도시하였다. 일 실시예에서, 박막(20)은 전자 빔 증착에 의해 제조된 나노 미터 크기의 입자로 제조되며, 표면 플라즈몬 공명을 통하여 광 흡수를 향상시키도록 구성되어, Au 박막의 플라즈몬 가열을 빠르게 한다.

플라즈몬 박막(20)이 Au 인 것으로 설명되는 동안, 물질의 선택은 단지 설명을 목적으로 하는 것이 이해될 것이며, 임의의 개수의 플라즈몬 물질이 샘플 용액(16)의 플라즈몬 가열을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 플라즈몬 박막(20)은 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 크롬(Cr), 게르마늄 텅스텐(W), 이리듐(Ir) 등, 또는 이들의 임의 조합물 또는 합금을 포함할 수 있다. 플라즈몬 박막은 금(Au),은(Ag), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 크롬(Cr), 게르마늄(Ge), 텅스텐(W), 이리듐(Ir) 등, 또는 이들의 임의의 조합 또는 합금으로 이루어진 다층 금속 구조체일 수 있다. 또한, 플라즈몬 박막은 그라핀(graphene), 그라핀 옥사이드(graphene oxide), 그래파이트, 또는 탄소 나노튜브(CNTs)일 수 있거나, 플라즈몬 박막은 그라핀, 그라핀 옥사이드, 그래파이트, 또는 탄소 나노튜브(CNTs), 또는 합성물 또는 이들로 이루어진 물질일 수 있다.

또한, 광원(22)은 하나 이상의 LED 인 것으로서 본 명세서에 걸쳐 상세히 설명되었지만, 그러한 선택은 오직 설명을 목적으로 하는 것이 이해될 것이며, 임의의 개수의 상이한 광원이 플라즈몬 박막(20)의 조명을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 광원(22)은 LED, 다이오드 레이저(diode lasers), 다이오드 레이저 어레이(diode laser array), 양자 웰(수직)-공동 레이저(quantum well(vertical)-cavity laser), 또는 이들의 조합물 또는 어레이를 포함할 수 있다. 또한, 광원의 방출 파장은 자외선(UV), 가시광선 또는 적외선(IR) 등일 수 있다.

도 2b의 상세한 설명에서 볼 수 있는 바와 같이, PCR 혼합물(16)은 변성(상 1), 어닐링 및 연장(상 2), 및 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 통한 핵산 증폭 상(상 3)에 대한 2개 또는 3개의 불연속 온도를 포함하는, 3-상태의 열 순환을 거친다.

도 2에 더 도시된 바와 같이, LED's 어레이(22)는 투명 또는 반투명 플랫폼(26)에 배치된 PCR 웰(PCR wells, 24)의 어레이를 조명하기 위해 기판(28) 상에 배치될 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같은 다중 PCR 반응에 대하여, 각각의 LED(22)는 각 프라이머 디자인(primer design)에 대하여 고유한 어닐링 온도를 가지도록 개별적으로 조절될 수 있다.

웰(24) 내에 증착된 Au 박막(20)은 도 2에 도시한 바와 같이 PCR 열 순환을 위한 플라즈몬(즉, 플라즈몬-여기가능한) 광열 가열원으로서 작용하는 광-열 변환기로서 사용된다.

단일 LED로 다수의 PCR 반응을 일으키는 것 외에, LED 어레이와 통합된 다수의 웰 플레이트(well plates)는 다양한 프라이머 디자인에 대하여 고유한 어닐링 온도를 가지도록 각각의 LED(22)를 조절함으로써 다중화된 PCR에 사용될 수 있다. 이러한 다중 웰 LED 어레이 PCR 열 순환기 구성은 POC 진단에서 다중화된 초고속 PCR에 이상적인데, 그 이유는 한 번에 여러 가지 검사를 수행할 수 있기 때문이다.

도 3은 LED-구동 초고속 포토닉 PCR 시스템(40)의 개략도를 나타낸다. blue LED(22)로부터 연속파 광(Continuous-wave light)은 포커스 렌즈(focus lens, 32)를 통해(PCR 웰(24)의 하부에 증착된) 플라즈몬 Au 박막(20)에 포커싱된다. 렌즈(32)는 광원으로부터의 광으로 플라즈몬 박막(20)의 고르게 분포된 광 노출을 생성하도록 구성될 수 있으며, LED의 피크 파장은 450nm이다.(blue LED I). Au-코팅 된 PCR 웰(24)은 중합체(예를 들어, 폴리(메틸 메타크릴레이트)(poly(methyl methacrylate);PMMA) 플랫폼(26))에 형성되었다.

바람직하게, 플랫폼(26)은 광이 박막(20)을 통과하는 것을 허용하는 투명 또는 반투명 조성물을 포함한다. 플랫폼(26)은 일반적으로 PMMA를 포함하는 것으로 명세서에 걸쳐 상세히 설명되어 있지만, 이러한 재료의 선택은 단지 설명을 목적으로 하는 것이 이해될 것이며, 임의의 개수의 중합체 또는 반투명/투명 물질이 플랫폼으로 사용되도록 선택될 수 있다. 또한, 지지 플랫폼(support platform, 26)은 필라 어레이(pillar array), 1D 또는 2D 격자, 광자 결정(photonic crystal), 반구(hemi-sphere), 또는 다른 패턴화된 구조 또는 랜덤 구조 중 하나 이상을 포함할 수있는 2D 또는 3D 마이크로구조체 또는 나노구조체를 포함할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 플랫폼은 나노플라즈몬 구조체의 공명 파장에서 및 나노 플라즈몬 구조체의 플라즈몬 광열을 일으키는 기간 동안 조사되도록 구성된, 웰의 표면 상의 나노플라즈몬 구조체 또는 나노플라즈몬 피드백 레이저 공동을 포함한다.

온도 센서(34)는 샘플(16) 및/또는 박막(20)의 온도를 측정하는 플랫폼(26)에 결합되거나 플랫폼(26)을 향할 수 있다. 이러한 온도 센서(34)는 플랫폼(26)을 향하는 열전대(thermocouple) 또는 카메라(예를 들어, IR 카메라)와 같이 다수의 센서 타입을 포함할 수 있다.

또한, PCR 시스템(40)이 샘플 용액(16)의 핵산 및/또는 형광 신호를 실시간으로 검출하는 디지털 카메라, 포토다이오드(photodiode), 분광 광도계(spectrophotometer) 또는 유사한 촬상 장치(imaging device)(미도시, 도 11에 도시한 IR 카메라(52)를 대신하거나 통합될 수 있음)와 같은 진단 장치와 통합되거나 호환될 수 있는 것이 이해될 것이다. 일부 구성에서, 카메라는 스마트폰 카메라 일 수 있으며, 스마트폰은 샘플 용액(16)을 분석하는 어플리케이션 소프트웨어를 포함한다.

바람직한 실시예에서, 센서 및 LED's(22)는 센서 데이터의 획득 및 LED's(22)의 제어를 위한 컴퓨팅 장치(computing unit, 42)에 결합할 수 있다. 일반적으로, 컴퓨팅 장치(42)는 프로세서(44) 및 LED(22)를 구동하기 위한(예를 들어, LED 타이밍, 강도/주입 전류 등을 제어하기 위한) 프로세서(44)로 실행 가능한 어플리케이션 소프트웨어(48)에 저장되는 메모리(46)를 포함하여, 센서(34)로부터 데이터를 획득하고 및/또는 핵산 및/또는 샘플 용액(26)의 형광 신호의 디지털 카메라 실시간 검출과 같이 진단 장치로부터 데이터를 처리할 수 있다. 컴퓨팅 장치(42)는 별개의 컴퓨터 또는 장치를 포함할 수 있거나, 나머지 구성 요소들 가지는 마이크로컨트롤러 모듈(microcontroller module)에 통합될 수 있다.

얻어진 데이터 및/또는 사용자 인터페이스는 컴퓨팅 장치(42)와 통합되거나 결합된 디스플레이(미도시) 상에 출력될 수 있다.

일 실시예에 따르면, Au 박막(22)의 강한 광 흡수율(예를 들어, 65%, 120 nm 두께)은 Au 박막(20)에서 광자-전자-포논 결합 이후 3분 내에 150℃ 이상의 최대 온도로 주변 용액(16)을 가열하여, 플라즈몬 광열 광-열 변환으로 인한 열을 발생시킨다. 55~95℃의 초고속 30 열 순환(12.79 ± 0.93℃ sec^-1의 가열 속도 및 6.6 ± 0.29℃ sec^-1의 냉각 속도)은 λ-DNA의 성공적인 증폭을 위해 5분 내에 달성된다.

도 1~3에 나타낸 PCR 시스템은 시스템 레벨 통합을 위하여 초고속 열 순환 능력, 다중화된 PCR, PCR 열 순환(현재 설정에서 최대 3.5W)을 위한 저전력 소모, 저렴한 비용 및 간단한 구성으로 인해 POC 진단에 이상적이다.

또한, 일반적으로 본 명세서의 광자-기반 가열 방법은 등온 증폭을 위하여 온-칩 열 용해 및 가열 단계를 포함하는 다양한 장치 또는 방법에 일반적으로 통합될 수 있다.

예시 1

a. 제조

복수의 4 mm-두께의 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 시트(26)는 4 mm의 지름을 가지는 반응 웰(24)를 형성하기 위하여 VersaLASER VL-200 레이저 절단 시스템(Universal Laser System, Inc.)으로 절단된다. 1.5 mm-두께의 하부 PMMA 시트는 열 접착을 사용하여 반응 웰이 함께 결합된 상부 시트에 부착되었다. 열 접착은 10분 동안 PMMA 시트의 UV/오존 처리 후 1.0 미터톤(metric ton)의 압력으로 84℃에서 수행된다. 다른 두께의 Au 박막(20)은 2 x 10^-7 토르(torr)의 베이스 압력(base pressure) 하에 전자 빔 증착(electron beam evaporation)에 의해 증착된다. 그 후, Au 박막(20)은 3μL의 PDMS를 웰에 적하시키고 Au 박막 및 열전대에 의해 PCR 반응이 억제되는 것을 방지하기 위해 2시간 동안 오븐에서 큐어링(curing)하여 얇은 폴리(디메틸실록산)(ploy(dimethylsiloxane); PDMS)로 부동태화된(passivated)다.

b. 시뮬레이션

COMSOL 멀티피직스 소프트웨어(버전 4.3)는 시뮬레이션을 수행하는데 사용되었다. 시뮬레이션을 위한 상세한 형상 및 물질 특성이 도 7 및 표 1에 도시되었다. Au 박막을 PMMA 기판 위에 배치시키고 물을 Au 필름의 상단에 놓았다. Au 박막의 다른 두께(10 nm, 20 nm, 40 nm, 80 nm, 120 nm)는 Au 박막의 흡수와 그에 따른 저항 발열을 계산하기 위해 시뮬레이션에 적용되었다. x- 편광된 전기장을 갖는 평면파는 도 7에 도시된 좌표에서 양의 z 방향으로 이동한다. PMMA와 물의 유전율은 각각 3 및 1.77이다.

전자기장 시뮬레이션의 설정은 Au 박막의 플라즈몬 광열 광-열 변환을 이론상으로 특성화하기 위해 수행되었다. PMMA 기판 상의 10 nm 및 120 nm 두께의 Au 박막에 대한 전자기(EM)장 및 저항성 열 분포가 측정되었다.

도 4a 및 도 4b는 각각 PMMA 기판 상의 10 nm 및 120 nm 두께의 Au 박막의 전자기장에 대한 이미지이다. 도 4c 및 도 4d는 각각 PMMA 기판 상의 10 nm 및 120 nm 두께의 Au 박막의 저항성 열 분포에 대한 이미지이다. 도 4e는 다른 두께를 가지는 Au 박막의 측정된 흡수 스펙트럼의 도표를 나타낸다. 도 4f는 Au 박막 두께의 함수로서 3개의 다른 LED의 방출 파장으로 평균화된 Au 박막의 광-열 변환 효율의 도표를 도시하였다.

표피 깊이로부터 예상되는 바와 같이,

에서 ω: 각 주파수(angular frequency), μ: 투자율(permeability), σ: 전도성을 나타내며, Au 박막의 두께는 광-열 변환되는 양을 결정한다. 450 nm 파장 광원의 수직 입사(normal incidence)에서는, 10 nm 두께의 Au 박막이 막대한 양의 EM 에너지를 전달하고(도 4a), 열 변환 에너지는 박막 깊이를 따라 포화된다(도 4c). 하지만, 120nm 두께의 Au 박막은 대부분의 입사광을 흡수하고(도 4b), 광을 열로 변환시킴으로써 Au 박막에서 더 많은 열을 생성한다(도 4d).

도 4e는 다른 두께를 가지는 Au 박막의 측정된 흡수 스펙트럼의 도표를 나타내며, Au 필름 두께의 함수로서 3개의 다른 LED로부터 방출 파장에 대해 평균화된 Au 박막의 광-열 변환 효율을 나타낸다. 450nm 피크 파장을 가지는 blue LED는 가장 높은 평균 광-열 변환 효율을 나타내며, 10-120nm 범위의 Au 박막의 두께가 증가하면 광 흡수율이 증가하는 것을 나타낸다. 540 nm 파장 이하에서 광 흡수율의 상당한 증가는 금의 플라즈몬 전자 공명에 기여 할 수 있다. 결과적으로 각 LED의 방출 파장 평균 광-열 변환 효율은 3개의 다른 LED(450nm에서의 Blue I, 480nm에서의 Blue II 및 530nm에서 Green)에 대하여 Au 박막의 두께가 증가함에 따라 증가한다. 450nm의 피크 방출 파장을 가지는 blue LED가 Au 박막에서 가장 높은 광- 열 변환 효율을 나타내는 것은 주목할만한 사실이다.

c. 테스트 셋업(test Setup)

도 3에 도시한 시스템(40)과 유사한 테스트 셋업이 실험하는데 이용되었다. LED(22)(447.5 nm의 피크 파장, 700 mA의 주입 전류에서 890 mW를 나타내는 Luxeon Rebel royal blue star LED)는 Keithley 2400 소스 미터(source meter)(미도시)를 이용하여 Au 박막(20)의 플라즈몬 광열 가열하는데 이용되었다. LED로부터 광을 포커싱하기 위하여, Carclo 20 mm 섬유 결합 광(fiber coupling optic, 32)이 이용되었다. 용액의 온도는 열 순환을 위해 타입-K 단열 열전대(OMEGA 엔지니어링)에 의해 실시간으로 모니터링되고 기록된다. LED, 80mm 냉각 팬(미도시), 소스 미터 및 열전대를 사용한 온도 순환은 어플리케이션 소프트웨어로서 LabVIEW를 통해 제어되었다. 고속 모드, 자동 제로 및 냉 접점 보상(cold junction compensation; CJC)을 포함하는 국가 기구(National Instruments; Nl) 16 채널 열전대 모듈(미도시)을 사용하여 타입-K 열전쌍으로부터 정확한 온도를 획득하는데 이용되었다.

d. PCR 시약 및 DNA 템플릿의 제조

템플릿 λ-DNA 및 Takara Z-Taq DNA 중합 효소(2.5 U/μL), 10x Z-Taq Buffer(Mg² ⁺ plus, 30 mM) 및 dNTP 혼합물(각각 2.5 mM)이 이용되었다. 순방향 프라이머(forward primer)(5'-CATCGTCTGCCTGTCATGGGCTGTTAAT- 3') 및 역방향 프라이머(5'-TCGCCAGCTTCAGTTCTCTGGCATTT-3')는 통합된 DNA 기술로부터 구입하였다.

반응은 0.5 μL의 Z-Taq DNA 중합 효소, 5 μL의 10 x Z-Taq 완충액, 4 μL의 dNTP 혼합물, 4.5 μL의 10 μM프라이머(각각), 10 μL의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)(50 μg)에 포함된 Z-Taq DNA 중합 효소로 98 염기쌍(bp) λ-DNA 표적을 증폭시키기 위해 이용되었고, PCR 등급의 물로 50μL로 만들었다. 템플릿 λ-DNA의 최종 농도는 0.1 ng/μL이다. 10μL의 PCR 혼합물은 포토닉 PCR의 Au-코팅된 PMMA PCR 웰 내에 놓인 후, 열 순환 중에 증발을 방지하기 위해 30μL의 미네랄 오일로 덮어진다. 증폭 후, 10μL의 PCR 생성물 및 10μL의 E-Gel 샘플 로딩 버퍼(sample loading buffer(Invitrogen))의 혼합물이 SYBR Safe(Invitrogen)를 이용하여 E-Gel 2% 아가로스 겔 상으로 로딩되며, 30분 동안 E-Gel 베이스(Invitrogen)에 흘러내렸다.

e. LED 구동 포토닉 PCR 열 순환기

도 5a~5f는 Au 박막의 LED 구동 광열 가열 및 PCR 열 순환의 도표를 도시하였다. 도 5a는 다른 두께를 가지는 Au 박막의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 흡수율(%) = 100 - 투과율(%) - 반사율(%). 도 5b는 500 mA 주입 전류에서 Au 필름 두께의 함수로서 액체의 온도 프로파일을 나타낸다. 도 5c는 120 nm-두께의 Au 박막과 LED의 주입 전류의 함수로서 액체의 온도 프로파일을 도시하였다. 피크 파장이 450nm인 blue LED가 이용되었다, 도 5d는 Au 박막의 다른 두께를 가지는 액체 온도의 분포 및 3분 동안 가열한 후 LED의 주입 전류를 나타내었다. 도 5e는 3개의 다른 온도의 LED 구동 포토닉 PCR 열 순환을 나타내었다: 94℃(변성), 60℃(어닐링) 및 72℃(연장). 도 5f는 PCR 열 순환에 대한 온도 제어와 낮은 온도 변화를 나타내었다. 94℃, 60℃ 및 72℃에서 표준 편차를 가지는 평균 값은 각각 94.09 ± 0.17℃, 59.94 ± 0.13℃, 72.02 ± 0.12℃이다.

도 5a를 참조하여, PMMA 기판에 증착된 다른 두께를 가지는 Au 박막의 광 흡수 스펙트럼이 도시되었다. 시뮬레이션 결과는 광열 가열을 최대로 하는 것이 중요함에 따라, 가장 강력한 광 흡수가 언제 발생하는 지를 측정하는 데 도움이 될 수 있다. Au 박막의 두께가 증가함에 따라 광 흡수도 증가하여 120nm 두께의 Au 박막에서 여기 LED의 피크 파장(450nm)에서 65 %의 흡수를 나타낸다.

도 3에 도시된 포토닉 PCR 열 순환기(40)를 이용하여, LED(22)로부터의 광은 연속파이며 랜덤하게 편광된다. 따라서 전자가 높은 에너지 상태로 여기 될 때 더 많은 여기의 가능성이 감소하기 때문에 광-열 변환의 효율은 펄스 레이저(pulsed laser)보다 낮을 것이다. 그러나 펄스 광원보다 낮은 광-열 변환 효율에도 불구하고, LED는 전력 소모를 최소화하고 레이저 소스에 비해 비용이 매우 낮으므로 LED를 POC 테스트에 이상적인 PCR 가열원으로 만든다. LED, 포커스 렌즈 및 드라이버를 포함하는, 초고속 포토닉 PCR 열 순환을 위한 기구의 구성 요소 비용은 Labview(어플리케이션 소프트웨어(48)의 일부) 및 마이크로컨트롤러 모듈(예를 들어, 도 3의 컴퓨팅 모듈(42))에 통합된 온도 제어를 위한 데이터 획득 보드를 사용하여 US $100 미만으로 제작될 수 있다.

일반적으로 LED의 최대 전력 소모는 1 A의 주입 전류에서 약 3.5 W이다. 도 5b는 500 mA의 고정된 주입 전류에서 다른 두께의 Au 박막에 따른 10μL의 용액 부피의 온도 프로파일을 나타낸다. Au 박막의 두께가 증가된 광 흡수율 때문에 10nm에서 120nm로 증가함에 따라 최대 온도가 증가한다.

120 nm 두께의 Au 막의 광열 가열은 가열 속도가 소비된 전력의 양(즉, LED의 주입 전류)에 의해 결정되기 때문에, 도 5c에 도시된 바와 같이 주입 전류의 함수로서 추가로 특성화된다. 도 5d는 다른 두께의 Au 박막 및 다양한 주입 전류에 따라 3분 가열 후 용액의 온도를 요약하였다(표 2). 이러한 결과는 Au 박막의 두께가 120 nm로 증가하고 주입 전류가 1A로 증가함에 따라 최대 온도가 증가함을 명확하게 나타낸다.

도 5e에 도시된 바와 같이, 3개의 대표적인 온도(변성을 위해 94 ℃, 어닐링을 위해 60 ℃, 및 연장을 위해 72 ℃)로 구성된 완전한 PCR 열 순환이 LED 구동 포토닉 PCR 열 순환기를 사용하여 증명된다. 열 순환 동안 증발을 방지하기 위해 10 μL의 PCR 완충액은 30 μL의 미네랄 오일로 덮여졌다. 각 온도에서의 평균 및 표준 편차는 온도 프로파일로부터 얻어졌으며, 결과는 각각 94 ℃에서 94.09 ± 0.17℃, 60 ℃에서 59.94 ± 0.13℃, 72 ℃에서 72.02 ± 0.12℃이며, 우수한 온도 정확성 및 안정성을 나타내었다. 설정 온도에 도달하기 전의 초기 온도 변동은 Labview에서 비례-적분-미분(proportional-integral-derivative; PID) 컨트롤러 값을 최적화하여 더 줄일 수 있다.

f. 초고속 열 순환 및 핵산 증폭

최대 가열 속도 및 냉각 속도를 측정하기 위하여, 열 순환이 수행되었고, 이로 인하여 용액(여기에서, 30μL의 미네랄 오일로 덮여진 5μL의 PCR 혼합물) 온도는 55~95℃ 사이에서 빠르게 순환된다. 온도 범위는 동일한 변성 온도(95 ℃) 및 어닐링(55 ℃) 온도를 반영한다.

도 6a ~ 도 6c는 초고속 열 순환 및 DNA 증폭의 도표 및 이미지를 도시한다. 도 6a는 95℃(변성)에서 55℃(어닐링 및 연장)까지 30 초고속 포토닉 PCR 열 순환의 대표적인 온도 프로파일의 도표이다. 5μL의 PCR 버퍼는 열 순환 도중 증발을 방지하기 위해 20μL의 미네랄 오일로 덮여진다. 도 6b는 초고속 광자 열 순환으로부터 얻어진 가열 속도 및 냉각 속도의 도표를 나타낸다. 도 6c는 λ-DNA 템플릿을 이용하여 벤치-탑 열 순환기와 비교하여 포토닉 PCR 열 순환기로부터 생성물을 형성하는 것을 나타내는 이미지이다. 가열 속도 및 냉각 속도는 각각 12.79 ± 0.93 ℃sec^-1 및 6.6 ±0.29 ℃sec^-1이다.

도 6a를 참조하여, 5분 내에 초고속 광자 30 사이클이 도시되었다. 열 순환 결과를 이용하여, 가열 및 냉각 속도는 연속 최대 온도와 최소 온도 사이의 온도차를 측정한 다음 이들 사이의 시간 간격으로 나누어 계산되었다. 평균 속도 및 샘플 표준 편차는 도 6b에 도시한대로 얻어진다. 얻어진 평균 가열 속도 및 냉각 속도는 각각 12.79 ± 0.93 ℃sec^-1 및 6.6 ±0.29 ℃sec^-1이다. λ-DNA의 증폭은 본 발명의 포토닉 PCR 방법을 입증하기 위해 수행되었다.

도 6c에 도시한 바와 같이 PCR 반응을 수행한 후, 앰플리콘(amplicons)은 SYBR Safe로 E-Ge 2% 아가로스겔에 의해 시각화되었다. 레인(lane) 1 은 1kb DNA marker이며, 레인 2 및 3은 다른 사이클수에 나타내는 초고속 포토닉 PCR로부터의 PCR 생성물이며, 레인 4 및 6는 벤치-탑 열순환기(Bio-Rad C1000 Thermal Cycler)에 의해 표준 열 순환 조건(1초 동안 94℃, 1초에서 62℃, 60 사이클)으로부터 제조된 양성 조절을 포함한다. 단일 메이저 밴드(single major band)(98bp)가 포토닉 PCR에서 100bp 근처로 검출되었다(레인 2 및 3). 이는 λ-DNA가 본 발명의 초고속 포토닉 PCR 방법 및 시스템을 사용하여 성공적으로 증폭되었음을 나타낸다. 포토닉 PCR에 의해 증폭된 PCR 생성물의 약한 밴드 강도는 종래의 벤치 탑 열 순환기에 비해 낮은 증폭 효율 때문일 수 있다. 현재, Au 박막만 2차원 광열 히터 역할을 하여 용액의 온도 구배를 야기하며 PCR의 증폭 효율을 잠재적으로 낮출 수 있다. 이러한 제한은 PCR 혼합물의 균일한 광열 가열을 위해 PCR 챔버에서 3차원 기판을 이용함으로써 개선될 수 있다. 증폭 시간 및 시약 소비량은 더욱 감소 될 수 있으며, 동시에 빠른 분자 확산과 균일한 용액 온도에 의한 PCR 반응의 효율을 향상시킨다.

도 8은 각각 450 nm(Blue I), 480 nm(Blue II) 및 530 nm(Green)의 피크 파장을 갖는 3개의 다른 LED로부터 측정된 표준화된 발광 스펙트럼을 도시한다. Blue I은 700 mA 주입 전류에서 447.5 nm, 890 mW의 피크 파장을 가지는 Luxeon Rebel royal blue star LED로 생성되었다. Green은 700mA 주입 전류에서 530 nm, 161 Im의 피크 파장을 가지는 Luxeon Rebel green star LED로 생성되었다. 스펙트럼은 Ocean Optics USB 2000+ 분광 광도계를 사용하여 측정되었다.

도 9a 및 도 9b는 다른 두께를 갖는 PMMA 기판상의 Au 박막의 투과율 및 반사율 스펙트럼을 각각 도시한다. 투과율 및 반사율 스펙트럼은 Shimadzu UV-3101 PC UV-Vis-NIR 분광 광도계를 사용하여 측정되었다. 적분된 구(integrating sphere)는 확산 반사(diffuse reflection)뿐만 아니라 거울 반사(specular reflection)를 측정하기 위해 사용되었다.

도 10은 PCR 서멀 사이클러의 전력 소비를 추가로 줄이는 냉각 팬의 효과를 보여주기 위하여, 냉각 팬이 있는 경우와 냉각 팬이 있는 경우의 62~94 ℃의 31 초고속 열 순환을 비교한 도표이다.

예시 2

도 11은 Au 박막의 LED 구동 플라즈몬 가열을 위한 실험용 셋업(50)의 개략도이다. 447.5nm의 피크 파장을 갖는 청색 LED(22)가 광 조사에 사용되고, LED로부터의 광은 상업적으로 이용 가능한 플라스틱 렌즈(32)에 의해 포커싱된다. 나노 미터 크기의 입자를 가지는 Au 박막(20)은 전자 빔 증착 방법에 의해 증착되었다. 액체(16)의 표면 온도는 장파장 적외선(long wavelength infrared; LWIR) 카메라(52)에 의해 측정되었다.

도 12는 Au 박막의 LED 구동 플라즈몬 가열을 이용하여 9분 동안 50~90℃로 2μL의 글리세롤을 이용하여 고속 열 사이클을 증명하였다. 주입 전류는 1A이며, Au 박막의 두께는 56nm이다.

도 13a는 다른 Au 박막 두께를 가지는 액체의 온도 변화를 도시하였다. Au 막의 두께가 증가함에 따라, 도 13b에 도시한 바와 같이, 액체의 최대 온도가 증가한다. 액체의 온도는 LED가 꺼지면 급격히 감소된다.

도 13c는 다른 두께를 갖는 Au 박막의 흡광도 스펙트럼을 도시한다. 440nm 부근의 흡수 피크는 LED의 피크 파장과 잘 매칭된다. Au 박막의 두께가 증가함에 따라 흡광도가 증가하여 최고 온도가 상승한다. 도 13d 및 도 13e는 각각 56 nm 및 96 nm에서의 Au 박막(20)의 이미지를 도시한다.

도 14a는 다른 주입 전류를 가지는 액체의 온도 변화를 도시한다. Au 박막의 두께는 64nm이다. 주입 전류가 증가함에 따라, 최대 온도는 도 14b에 도시한 바와 같이 증가한다. 따라서 온도는 LED의 주입 전류를 간단히 변경하여 쉽게 제어될 수 있다. 최대 램프 속도는 각 주입 전류에서 계산되며 1 A 주입 전류로 최대 7℃/초에 도달한다.

도 15는 Au 박막의 LED 구동 플라즈몬 가열에 의한 온도 안정성을 도시한다. 50℃ 및 90℃는 고속 2 단계 PCR 셋업을 위한 대표적인 어닐링 및 변성 온도이다. 50℃ 및 90℃에서의 온도 변화는 ± 0.5 및 ± 0.7℃로 양호한 온도 안정성을 나타낸다.

도 16 및 도 17은 Au 박막의 LED 구동 플라즈몬 가열을 이용하여 전형적인 PCR을 도시한다. Au 박막의 두께는 64nm이다. 상세한 PCR 조건은 도 16에 설명되었다. 도 16은 PCR 반응 동안 IR 카메라에 의해 측정된 열 순환의 온도 프로파일을 도시한다.

IR 카메라는 액체의 표면 온도만을 측정하기 때문에 IR 카메라로 측정한 온도 프로파일과 약간 다르다. 도 17은 본 발명을 통한 LED 구동 플라즈몬 열 순환기가 종래의 벤치 탑 열 순환기와 비교 가능한 핵산 증폭 생성물을 나타내는 것을 도시한다.

요약하면, LED에 의해 구동되는 Au 박막의 플라즈몬 광열 가열을 이용하는 신규 초고속 포토닉 PCR 시스템이 개시된다. Au 박막 기반의 광-열 변환기는 골드 플라즈몬 보조된 높은 광 흡수율(gold plasmon-assisted high optical absorption)을 이용하여 PCR 용액을 150℃ 이상으로 가열하기 위해 설계 및 제작되었다.

55℃에서 95℃로 초고속 열 순환은 초고속 가열(12.79 ± 0.93℃sec^-1) 속도 및 냉각 속도(6.6 ± 0.29℃sec^-1)로 30 사이클 동안 5분 내로 이루어졌다.

본 발명의 초고속 포토닉 PCR 열 순환기를 이용한 핵산(λ-DNA) 증폭이 성공적으로 증명되었다. 본 발명의 시스템 및 방법은 POC 분자 진단에 이상적인 초고속 열 순환 능력을 가지는 단순하고 견고하며 저비용의 포토닉 PCR 기술을 제공하기 위해 다음과 같은 유익한 특성을 포함한다: 1) 경제성 (LED 및 렌즈가 포함하는 저렴한 시스템); 2) 휴대성 (가열 블록 없이 컴팩트하고 가벼운 PCR 시스템); 3) 단순성 (일회용 PCR 칩과 함께 사용); 4) LED 드라이버 및 디스플레이를 포함하는 사용자-친화적 인터페이스; 5) 환경 스트레스 없이 신속하고 강력한 PCR; 6) 일반적으로 장비가 필요없이 LED 및 마이크로 컨트롤러 모듈만을 필요로 하며 휴대 전화 카메라를 사용할 수 있음; 7) 열악한 환경 & 저전력 소모에서의 내구성.

테스트 된 셋업은 하나의 PCR 웰에만 기반을 두었지만, 높은 처리량 및 다중 증폭을 허용하고 균일한 가열을 위한 PCR 반응 챔버를 최적화할 수 있도록 다중 웰 및 LED 어레이의 통합이 고려된다.

본 기술의 실시예들은 이 기술의 실시예들에 따른 방법 및 시스템의 흐름도 예시(flowchart illustrations), 그리고/또는 또한 컴퓨터 프로그램 제품으로 구현될 수도 있는 알고리즘, 공식(formulae), 또는 다른 계산적 묘사(computational depictions)를 참조하여 설명될 수도 있다. 이와 관련하여, 흐름도의 각 블럭 또는 단계, 그리고 흐름도 내의 블럭들(및/또는 단계들)의 조합, 알고리즘, 공식, 또는 계산적 묘사는 하드웨어, 펌웨어(firmware) 및/또는 컴퓨터 판독 가능 프로그램 코드 로직에서 구현되는 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 지시들을 포함하는 소프트웨어와 같은 다양한 수단에 의해 구현될 수 있다. 이해할 수 있는 바와 같이, 그와 같은 컴퓨터 프로그램 지시들은 컴퓨터 또는 다른 프로그램 가능한 처리 장치에서 실행하는 그 컴퓨터 프로그램 지시들이 흐름도(들)의 블럭(들)에서 지정된 기능들을 구현하기 위한 수단을 창출하도록 제한 없이 일반 목적의 컴퓨터 또는 특수 목적의 컴퓨터, 또는 하나의 기계를 만들기 위한 다른 프로그램 가능한 처리 장치를 포함하는 하나의 컴퓨터에서 로딩될 수도 있다.

따라서, 흐름도의 블럭, 알고리즘, 공식, 또는 계산적 묘사는 지정된 기능, 지정된 기능을 수행하기 위한 단계들의 조합, 그리고 지정된 기능을 수행하기 위해 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드 로직 수단에서 구현되는 것과 같은 컴퓨터 프로그램 지시를 지원한다. 또한 여기에 기재된 흐름도 예시의 각 블럭, 알고리즘, 공식, 또는 그것들의 조합은 지정된 기능 또는 단계, 또는 특수 목적의 하드웨어 및 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드 로직 수단의 조합을 수행하는 특수 목적의 하드웨어 기반의 컴퓨터에 의해 구현될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

더욱, 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드 로직에 구현되는 것과 같은 이 컴퓨터 프로그램 지시들은 또한 어떤 컴퓨터 또는 특별한 방식으로 기능하기 위한 다른 프로그래밍 가능한 처리 장치를 명령할 수 있는 컴퓨터 판독 가능한 메모리에 저장될 수도 있어서, 컴퓨터 판독 가능한 메모리에 저장된 상기 지시들이 흐름도(들)의 블럭(들)에 지정된 기능을 구현하는 지시 수단을 포함하는 제조품(an article of manufacture)을 만들도록 한다. 상기 컴퓨터 프로그램 지시들은 또한 어떤 컴퓨터 또는 다른 프로그램 가능한 처리 장치에서 실행하는 이 지시들이 흐름도(들)의 블럭(들)에 지정된 기능들, 알고리즘(들), 공식(들), 또는 계산적 묘사(들)을 구현하기 위한 단계들을 제공하도록 이 컴퓨터 또는 다른 프로그램 가능한 처리 장치에서 수행될 일련의 작동 단계들이 컴퓨터-구현 프로세스를 생성하게 하기 위해 이 컴퓨터 또는 다른 프로그램 가능한 처리 장치에 로딩될 수도 있다.

여기에 기재된 것으로부터, 본 발명은 아래의 기재를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 실시예들을 포함한다는 것이 이해될 것이다:

1. 샘플을 고정하도록 형성된 하나 이상의 웰(wells)을 포함하는 지지 플랫폼(support platform); 상기 하나 이상의 웰(well) 내부에 배치된 플라즈몬 박막(plasmonic thin film); 및 광원(light source);을 포함하며,

상기 광원은 상기 지지 플랫폼을 향하도록 형성되어서, 상기 광원으로부터 노출된 광은 상기 플라즈몬 박막 내부에 플라즈몬 광열 광-열 변환(plasmonic photothermal light-to-heat conversion) 및 이어서 상기 샘플의 가열을 일으키는, 핵산 증폭 장치.

2. 상기 광원 및 상기 지지 플랫폼 사이에 배치된 렌즈(lens)를 더 포함하며,

상기 렌즈는 상기 하나 이상의 웰에 상기 노출된 광을 포커싱 하도록 형성되는, 선행 실시예의 장치.

3. 상기 샘플의 온도를 모니터링 하도록 형성된 온도 센서(temperature sensor)를 더 포함하는, 선행 실시예의 장치.

4. 상기 하나 이상의 광원 및 상기 온도 센서에 결합된 컨트롤러(controller)를 더 포함하며,

상기 컨트롤러는 상기 온도 센서로부터 하나 이상의 데이터 획득 및 상기 광원의 작동을 제어하도록 형성되는, 선행 실시예의 장치.

5. 상기 컨트롤러는 상기 플라즈몬 박막에서의 적어도 한 번의 노출 기간 및 주입 전류(injection current)를 변경하기 위해 상기 광원의 작동을 제어하도록 형성되는, 선행 실시예의 장치.

6. 플라즈몬 박막 시트(plasmonic thin-film sheet)는 표면 플라즈몬 공명을 통한 광 흡수율을 향상시키기 위해 나노미터 크기의 입자를 포함하는, 선행 실시예의 장치.

7. 상기 지지 플랫폼은 반투명 중합체 또는 투명 중합체를 포함하는, 선행 실시예의 장치.

8. 상기 온도 센서는 상기 샘플에 인접하게 배향된 장파장 적외선(LWIR) 카메라를 포함하는, 선행 실시예의 장치.

9. 상기 노출된 광을 상기 플라즈몬 박막에 고르게 분포시키기 위하여 포커싱 렌즈(focusing lens)와 결합된 디퓨저(diffuser)를 더 포함하는, 선행 실시예의 장치.

10. 상기 광원은 상기 플라즈몬 박막 내에서 광 흡수율을 최대로 하기 위해 선택된 파장을 가지는 하나 이상의 LED's를 포함하는, 선행 실시예의 장치.

11. 상기 샘플 내에서 핵산을 실시간으로 검출하기 위하여 디지털 카메라(digital camera); 포토다이오드(photodiode); 또는 분광 광도계(spectrophotometer);를 더 포함하는, 선행 실시예의 장치.

12. 상기 지지 플랫폼은 하나 이상의 필라 어레이(pillar array), 1D 또는 2D 격자(grating), 광자 결정(photonic crystal), 반구(hemisphere) 중 하나 이상의 형상으로 2D 또는 3D 마이크로구조체(microstructures) 또는 나노구조체(nanostructures)을 포함하는, 선행 실시예의 장치.

13. 플라즈몬 박막을 포함하는 하나 이상의 웰 내부에 유체 샘플을 배치하는 단계; 상기 플라즈몬 박막 내부에 플라즈몬 광열 광-열 변환을 생성하도록 광원을 상기 플라즈몬 박막에 향하게 하는 단계; 및 상기 플라즈몬 박막 내부에서 광-열 변환의 결과로서 샘플을 가열하는 단계;를 포함하는, 핵산 증폭 방법.

14. 상기 하나 이상의 웰에 상기 광원을 포커싱하는 단계를 더 포함하는, 선행 실시예의 방법.

15. 상기 샘플의 온도를 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 선행 실시예의 방법.

16. 온도 센서로부터 하나 이상의 데이터 획득 및 상기 광원의 작동을 제어하는 단계를 더 포함하는, 선행 실시예의 방법.

17. 상기 광원의 작동을 제어하는 단계는 상기 플라즈몬 박막에서의 한 번 이상의 노출 기간 및 주입 전류를 조절하는 단계를 포함하는, 선행 실시예의 방법.

18. 플라즈몬 박막 시트는 표면 플라즈몬 공명을 통하여 광 흡수율을 향상시키기 위해 나노미터 크기의 입자를 포함하는 Au 박막을 포함하는, 선행 실시예의 방법.

19. 상기 하나 이상의 웰은 반투명 플랫폼 또는 투명 플랫폼으로 형성되고,

상기 광원으로부터의 광은 상기 플랫폼의 적어도 일부를 통해 상기 플라즈몬 박막을 향하는, 선행 실시예의 방법.

20. 상기 플라즈몬 박막에 광을 고르게 분포시키기 위해 포커싱된 광을 분산시키는 단계를 더 포함하는, 선행 실시예의 방법.

21. 상기 광은 상기 플라즈몬 박막 내부의 광 흡수율을 최대로 하기 위해 선택된 파장으로 방출되는, 선행 실시예의 방법.

22. 상기 샘플 내부의 형광 신호를 검출하는 단계를 더 포함하는, 선행 실시예의 방법.

23. 샘플을 고정하도록 형성된 복수의 반응 웰을 포함하는 기판; 및 상기 기판을 향하는 광원;을 포함하며,

각각의 상기 복수의 반응 웰의 표면은 플라즈몬 박막으로 덮여지고,

상기 광원은 상기 플라즈몬 박막의 광열 가열 및 이어서 상기 샘플의 가열을 일으키는 파장 및 기간에서 상기 플라즈몬 박막을 조사하도록 형성되는, 핵산을 증폭시키는 플라즈몬 가열 장치.

24. 각각의 웰에서 상기 샘플의 온도를 모니터링 하도록 형성된 적어도 하나의 온도 센서를 더 포함하는, 선행 실시예의 장치.

25. (a) 상기 온도 센서 및 광원에 결합된 제어 모듈(control module); (b) 프로세서; 및 상기 프로세서 상에서 실행 가능한 명령들을 저장하는 메모리;를 포함하는 제어 모듈; (c) 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 다음의 단계를 수행하는 상기 명령;을 더 포함하는, 선행 실시예의 장치:

(i) 상기 샘플의 온도를 모니터링하는 단계; 및

(ii) 시간에 따른 선택된 샘플 온도를 생성하기 위해 주파수 및 기간에서 상기 광원을 작동시키는 단계.

26. 상기 프로세서에 의해 실행될 때의 상기 명령은 상기 샘플 내부의 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하는 단계를 더 수행하는, 선행 실시예의 장치.

27. 상기 기판은 투명 중합체 또는 반투명 중합체를 포함해서 상기 반응 웰이 디지털 미소유체 어레이(digital microfluidic array)로서 시트에 형성되는, 선행 실시예의 장치.

28. 상기 각각의 웰의 표면은 나노플라즈몬 구조체로 덮여지며, 상기 광원은 상기 나노플라즈몬 구조체의 플라즈몬 광열 가열을 일으키는 상기 나노플라즈몬 구조체의 공명 파장 및 기간에서 상기 웰의 표면 상으로 상기 나노플라즈몬 구조체를 조사하도록 형성된, 선행 실시예의 장치.

29. 상기 제어 모듈은 낮은 소비 전력에서 휴대가능한 다중 PCR의 초고속 열 순환을 위해 상기 광원을 제어하도록 형성된, 선행 실시예의 장치.

여기서의 기재는 많은 세부 사항을 포함하고 있지만, 이러한 기재는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아닌, 단지 현재의 바람직한 실시예들의 일부의 예시를 제공하는 것으로 유추해야 한다. 그러므로, 본 발명의 범위는 통상의 기술자에게 자명하게 될 수 있는 다른 실시예들을 충분히 포함한다는 것이 이해될 것이다.

청구범위에서, 단수의 한 요소에 대한 언급은 명백하게 그렇게 설명된 것이 아니라면 "하나 및 오직 하나"를 의미하는 것이 아닌, "하나 또는 그 이상"을 의미하는 것으로 의도된 것이다. 통상의 기술자에게 알려진 상기 개시된 실시예들의 요소들에 대한 모든 구조적, 화학적 및 기능적 등가물은 여기에 참조로 명백히 포함되며, 제시된 청구범위에 의해 포함되도록 의도된다. 더욱, 본 개시에서 요소, 구성 또는 방법 단계는 그 요소, 성분 또는 방법 단계가 청구항들에서 명시적으로 인용되어 있는지에 관계없이 공중에 전용되도록 의도된 것이 아니다. 여기서 청구항 요소는 그 요소가 분명하게 "위한 수단(means for)"이라는 문구를 사용하여 인용되지 않는다면 "수단 플러스 기능(means plus function)"의 요소로서 유추되어야 한다. 여기서 청구항 요소는 그 요소가 분명하게 "위한 단계(step for)"라는 문구를 사용하여 인용되지 않는다면 "단계 플러스 기능(step plus function)"의 요소로서 유추되어야 한다.

Claims

샘플을 고정하도록 형성된 하나 이상의 웰(wells)을 포함하는 지지 플랫폼(support platform);
상기 하나 이상의 웰 내부에 배치된 플라즈몬 박막(plasmonic thin film); 및
광원(light source);을 포함하며,
상기 광원은 상기 지지 플랫폼을 향하도록 형성되어서, 상기 광원으로부터 노출된 광은 상기 플라즈몬 박막 내부에 플라즈몬 광열 광-열 변환(plasmonic photothermal light-to-heat conversion) 및 이어서 상기 샘플의 가열을 일으키는, 핵산 증폭 장치.
제1항에 있어서,
상기 광원 및 상기 지지 플랫폼 사이에 배치된 렌즈(lens)를 더 포함하며,
상기 렌즈는 상기 하나 이상의 웰에 상기 노출된 광을 포커싱 하도록 형성되는, 핵산 증폭 장치.
제1항에 있어서,
상기 샘플의 온도를 모니터링 하도록 형성된 온도 센서(temperature sensor)를 더 포함하는, 핵산 증폭 장치.
제3항에 있어서,
상기 하나 이상의 광원 및 상기 온도 센서에 결합된 컨트롤러(controller)를 더 포함하며,
상기 컨트롤러는 상기 온도 센서로부터 하나 이상의 데이터 획득 및 상기 광원의 작동을 제어하도록 형성되는, 핵산 증폭 장치.
제4항에 있어서,
상기 컨트롤러는 상기 플라즈몬 박막에서의 적어도 한 번의 노출 기간 및 주입 전류(injection current)를 변경하기 위해 상기 광원의 작동을 제어하도록 형성되는, 핵산 증폭 장치.
제1항에 있어서,
플라즈몬 박막 시트(plasmonic thin-film sheet)는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 통한 광 흡수율을 향상시키기 위해 나노미터 크기의 입자를 포함하는, 핵산 증폭 장치.
제1항에 있어서,
상기 지지 플랫폼은 반투명 중합체 또는 투명 중합체를 포함하는, 핵산 증폭 장치.
제3항에 있어서,
상기 온도 센서는 상기 샘플에 인접하게 배향된 장파장 적외선(LWIR) 카메라를 포함하는, 핵산 증폭 장치.
제2항에 있어서,
상기 노출된 광을 상기 플라즈몬 박막에 고르게 분포시키기 위하여 포커싱 렌즈(focusing lens)와 결합된 디퓨저(diffuser)를 더 포함하는, 핵산 증폭 장치.
제1항에 있어서,
상기 광원은 상기 플라즈몬 박막 내에서 광 흡수율을 최대로 하기 위해 선택된 파장을 가지는 하나 이상의 LED를 포함하는, 핵산 증폭 장치.
제1항에 있어서,
상기 샘플 내에서 핵산을 실시간으로 검출하기 위하여 디지털 카메라(digital camera); 포토다이오드(photodiode); 또는 분광 광도계(spectrophotometer);를 더 포함하는, 핵산 증폭 장치.
제1항에 있어서,
상기 지지 플랫폼은 하나 이상의 필라 어레이(pillar array), 1D 또는 2D 격자(grating), 광자 결정(photonic crystal), 반구(hemisphere) 중 하나 이상의 형상으로 2D 또는 3D 마이크로구조체(microstructures) 또는 나노구조체(nanostructures)을 포함하는, 핵산 증폭 장치.
플라즈몬 박막을 포함하는 하나 이상의 웰 내부에 유체 샘플을 배치하는 단계;
상기 플라즈몬 박막 내부에서 플라즈몬 광열 광-열 변환을 생성하도록 광원을 상기 플라즈몬 박막에 향하게 하는 단계; 및
상기 플라즈몬 박막 내부에서 광-열 변환의 결과로서 샘플을 가열하는 단계;를 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제13항에 있어서,
상기 하나 이상의 웰에 상기 광원을 포커싱하는 단계를 더 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제13항에 있어서,
상기 샘플의 온도를 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제15항에 있어서,
온도 센서로부터 하나 이상의 데이터 획득 및 상기 광원의 작동을 제어하는 단계를 더 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제16항에 있어서,
상기 광원의 작동을 제어하는 단계는 상기 플라즈몬 박막에서의 한 번 이상의 노출 기간 및 주입 전류를 조절하는 단계를 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제13항에 있어서,
플라즈몬 박막 시트는 표면 플라즈몬 공명을 통하여 광 흡수율을 향상시키기 위해 나노미터 크기의 입자를 포함하는 Au 박막을 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제13항에 있어서,
상기 하나 이상의 웰은 반투명 플랫폼 또는 투명 플랫폼으로 형성되고,
상기 광원으로부터의 광은 상기 플랫폼의 적어도 일부를 통해 상기 플라즈몬 박막을 향하는, 핵산 증폭 방법.
제14항에 있어서,
상기 플라즈몬 박막에 광을 고르게 분포시키기 위해 포커싱된 광을 분산시키는 단계를 더 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제13항에 있어서,
상기 광은 상기 플라즈몬 박막 내부의 광 흡수율을 최대로 하기 위해 선택된 파장으로 방출되는, 핵산 증폭 방법.
제13항에 있어서,
상기 샘플 내부의 형광 신호를 검출하는 단계를 더 포함하는, 핵산 증폭 방법.
샘플을 고정하도록 형성된 복수의 반응 웰을 포함하는 기판; 및 상기 기판을 향하는 광원;을 포함하며,
각각의 상기 복수의 반응 웰의 표면은 플라즈몬 박막으로 덮여지고,
상기 광원은 상기 플라즈몬 박막의 광열 가열 및 이어서 상기 샘플의 가열을 일으키는 파장 및 기간에서 상기 플라즈몬 박막을 조사하도록 형성되는, 핵산을 증폭시키는 플라즈몬 가열 장치.
제23항에 있어서,
각각의 웰에서 상기 샘플의 온도를 모니터링 하도록 형성된 적어도 하나의 온도 센서를 더 포함하는, 플라즈몬 가열 장치.
제24항에 있어서,
(a) 상기 온도 센서 및 광원에 결합된 제어 모듈(control module);
(b) 프로세서; 및 상기 프로세서 상에서 실행 가능한 명령들을 저장하는 메모리;를 포함하는 제어 모듈;
(c) 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 다음의 단계를 수행하는 상기 명령;을 더 포함하는, 플라즈몬 가열 장치:
(i) 상기 샘플의 온도를 모니터링하는 단계; 및
(ii) 시간에 따른 선택된 샘플 온도를 생성하기 위해 주파수 및 기간에서 상기 광원을 작동시키는 단계.
제25항에 있어서,
상기 프로세서에 의해 실행될 때의 상기 명령은 상기 샘플 내부의 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하는 단계를 더 수행하는, 플라즈몬 가열 장치.
제23항에 있어서,
상기 기판은 투명 중합체 또는 반투명 중합체를 포함해서 상기 반응 웰이 디지털 미소유체 어레이(digital microfluidic array)로서 시트에 형성되는, 플라즈몬 가열 장치.
제27항에 있어서,
각각의 웰의 표면은 나노플라즈몬 구조체로 덮여지며, 상기 광원은 상기 나노플라즈몬 구조체의 플라즈몬 광열 가열을 일으키는 상기 나노플라즈몬 구조체의 공명 파장 및 기간에서 상기 웰의 표면상으로 상기 나노플라즈몬 구조체를 조사하도록 형성된, 플라즈몬 가열 장치.
제25항에 있어서,
상기 제어 모듈은 낮은 소비 전력에서 휴대가능한 다중 PCR의 초고속 열 순환을 위해 상기 광원을 제어하도록 형성된, 플라즈몬 가열 장치.