KR20190130975A

KR20190130975A - 방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체

Info

Publication number: KR20190130975A
Application number: KR1020190056385A
Authority: KR
Inventors: 김상경; 김봉균; 김정민
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2019-11-25
Also published as: US20210197201A1; KR102306112B1; WO2019221489A1

Abstract

본 발명은 온도 조절을 통해 내부에서 핵산 증폭이 일어나는 다공성 입자에 광을 흡수하여 열을 발생시키는 광열 나노소자를 분포시켜, 열판 등을 이용하여 시료 전체의 온도를 조절하는 것이 아니라, 광을 다공성 입자에 조사하여 입자 내부의 온도를 조절하여 내부에서 핵산 증폭이 가능하도록 하여, 에너지 사용량을 줄일 수 있고 진단 시간을 단축할 수 있는 피씨알용 다공성 입자 복합체에 대한 것이다.

Description

방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체{Porous particle complex for PCR having heat radiant function}

중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction, PCR)은 검출을 원하는 특정 유전물질을 증폭하는 방법으로, 인간의 DNA를 증폭하여 유전질환을 진단하거나, 세균이나 바이러스, 진균의 DNA에 적용하여 감염성 질환을 진단하는 등에 이용되고 있다. 하지만, 종래의 중합효소 연쇄 반응 기술은 여러 종류의 핵산을 동시에 신속하게 분석하기 어려운 문제가 있어, 하기의 특허문헌처럼 다공성 입자를 이용하여 여러 종류의 핵산을 동시에 실시간으로 분석하는 기술이 개발되고 있다.

<특허문헌>

특허 제10-1670232호(2016. 10. 24. 등록) "다공성 구조체 및 이의 제조방법"

상기 다공성 입자를 이용한 PCR 증폭에 있어서, 95℃와 50 ~ 60℃ 정도의 온도 사이클링을 통해 입자 내에서 핵산 증폭이 일어나는데, 현재의 히팅(Heating) 시스템은 다공성 입자를 포함한 피씨알칩 또는 채널 내 액체(물이나 오일) 전체에 대하여 온도를 조절하여야 하여, 즉 핵산 증폭에 참여하지 않는 다공성 입자 외부 액체의 온도도 조절하게 되어 불필요한 에너지가 사용되며 핵산 증폭에 많은 시간이 소요되는 문제가 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,

본 발명은 온도 조절을 통해 내부에서 핵산 증폭이 일어나는 다공성 입자에 광을 흡수하여 열을 발생시키는 광열 나노소자를 분포시켜, 열판 등을 이용하여 시료 전체의 온도를 조절하는 것이 아니라, 광을 다공성 입자에 조사하여 입자 내부의 온도를 조절하여 내부에서 효과적으로 핵산 증폭이 일어날 수 있도록 하는 방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 샘플 전체의 온도 조절이 아니라 다공성 입자 내부의 온도 조절을 수행함으로, 에너지 사용량을 줄일 수 있고 진단 시간을 단축할 수 있는 방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머를 광열 나노소자의 표면에 결합시키고, 타 방향 프라이머를 다공성 입자 내부에 결합시켜, 시료를 포함하는 피씨알 용액에 따로 프라이머를 공급할 필요가 없는 방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 피씨알을 수행하기 위해 가해지는 열에 의해 일 방향 프라이머는 상기 광열 나노소자의 표면에서 떨어져 피씨알 반응에 참가하므로, 양 방향 프라이머가 다공성 입자 내부에 위치함에도 피씨알 효율이 떨어지는 것을 방지할 수 있는 방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 광열 나노소자와 프라이머를 혼합한 후 일정 시간 이상 소니케이션을 실시하여, 추가적인 링커를 사용하지 않고서도, 열에 의해 분리가 가능하도록 광열 나노소자와 프라이머를 결합시킬 수 있는 방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발병은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체는 온도가 조절되면 내부에서 핵산 증폭이 일어나는 다공성 입자와, 상기 다공성 입자 내부에 위치하여 광을 흡수하여 열을 발생시키는 광열 나노소자를 포함하여, 상기 다공성 입자에 특정 광을 조사하여 다공성 입자 내부의 온도를 핵산 증폭에 필요한 온도로 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체는 상기 다공성 입자는 총 부피에 대하여 10 내지 95부피%의 기공율을 가질 수 있으며, 10um 내지 1mm의 입경을 가질 수 있고, 친수성 폴리머의 고형물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체에 있어서 상기 광열 나노소자는 금속 나노입자, 카본 나노소자, 무기 나노소자, 유기 나노소자, 퀀텀닷 및 희토류로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체에 있어서 상기 광열 나노소자는 1 내지 500nm의 직경 또는 길이를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체에 있어서 상기 광열 나노소자는 상기 다공성 입자 내에 ml당 0.01내지 50mg이 존재하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체에 있어서 상기 광열 나노소자는 물리적 또는 화학적으로 다공성 입자에 고정되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체에 있어서 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머가 상기 다공성 입자 내부에 고정되고, 타 방향 프라이머는 상기 다공성 입자 내부에 고정되는 광열 나노소자의 표면에 부착되며, 피씨알을 위해 상기 다공성 입자 복합체에 광을 조사할 때 상기 광열 나노소자에서 발생된 열에 의해 상기 타 방향 프라이머는 상기 광열 나노소자에서 떨어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체의 제조방법은 광열 나노소자가 분산된 용액에, 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머를 혼합하여, 광열 나노소자의 표면에 상기 일 방향 프라이머를 결합시키는 결합단계와; 상기 일 방향 프라이머가 결합된 광열 나노소자와 다공성 입자 형성 폴리머 용액을 혼합하여 제1혼합용액을 형성하는 제1혼합단계와; 상기 제1혼합용액과 타 방향 프라이머를 혼합하여 제2혼합용액을 형성하는 제2혼합단계와; 상기 제2혼합용액을 경화시켜, 다공성을 가지며, 내부 기공에 표적 핵산의 타 방향 프라이머가 고정되고, 일 방향 프라이머가 부착된 광열 나노소자가 내부 기공에 고정된 다공성 입자 복합체를 제조하는 경화단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체의 제조방법에 있어서 상기 결합단계는 광열 나노소자가 분산된 용액에, 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머를 혼합하고, 30 내지 60분 동안 소니케이션을 실시하여 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치는 표적 핵산을 내부에서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시키는 다공성 입자 복합체를 포함하는 피씨알칩과, 상기 다공성 입자 복합체에 광을 조사하는 광조사부와, 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 상기 광조사부에서 조사되는 광을 조절하는 컨트롤러를 포함하며, 상기 다공성 입자 복합체는 제1항의 다공성 입자 복합체가 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치는 상기 광조사부에 공급되는 전원의 전류, 전압, 듀티 사이클 및 주파수 중 어느 하나 이상을 조절하여 상기 광조사부에서 조사되는 광의 세기를 제어할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치에 있어서 상기 컨트롤러는 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가질 수 있도록 상기 광조사부에서 조사되는 광의 조건을 설정하는 광세팅부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 증폭 장치는 상기 광조사부에 의해 광이 조사된 피씨알칩에 위치하는 다공성 입자 복합체를 측정하는 측정유닛을 추가로 포함하며, 상기 컨트롤러는 상기 측정유닛에 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 또는 양을 산출하는 결과분석부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 증폭 방법은 표적 핵산을 내부에서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시키는 다공성 입자 복합체와 시료를 반응시키는 시료반응단계와, 상기 시료반응단계 후 상기 시료와 반응한 다공성 입자 복합체에 광을 조사하여 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 하는 광조사단계와, 상기 광조사단계 후에 다공성 입자 복합체의 변화를 측정하는 측정단계와, 상기 측정단계에서 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 또는 산출하는 분석단계를 포함하며, 상기 다공성 입자 복합체는 제1항의 다공성 입자 복합체가 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 온도 조절을 통해 내부에서 핵산 증폭이 일어나는 다공성 입자에 광을 흡수하여 열을 발생시키는 광열 나노소자를 분포시켜, 열판 등을 이용하여 시료 전체의 온도를 조절하는 것이 아니라, 광을 다공성 입자에 조사하여 입자 내부의 온도를 조절하여 내부에서 효과적으로 핵산 증폭이 일어날 수 있도록 할 수 있다.

또한, 본 발명은 샘플 전체의 온도 조절이 아니라 다공성 입자 내부의 온도 조절을 수행함으로, 에너지 사용량을 줄일 수 있고 진단 시간을 단축할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머를 광열 나노소자의 표면에 결합시키고, 타 방향 프라이머를 다공성 입자 내부에 결합시켜, 시료를 포함하는 피씨알 용액에 따로 프라이머를 공급할 필요가 없는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 피씨알을 수행하기 위해 가해지는 열에 의해 일 방향 프라이머는 상기 광열 나노소자의 표면에서 떨어져 피씨알 반응에 참가하므로, 양 방향 프라이머가 다공성 입자 내부에 위치함에도 피씨알 효율이 떨어지는 것을 방지할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 광열 나노소자와 프라이머를 혼합한 후 일정 시간 이상 소니케이션을 실시하여, 추가적인 링커를 사용하지 않고서도, 열에 의해 분리가 가능하도록 광열 나노소자와 프라이머를 결합시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체를 이용하는 핵산 증폭 장치의 개략 구성도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체의 현광 현미경 이미지.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체를 이용하여 핵산 증폭 결과를 분석한 형광 현미경 이미지.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체를 이용하여 핵산 증폭 결과를 정량화하여 나타낸 도표.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체의 핵산 증폭 효과를 설명하는데 이용되는 참고 현광 현미경 이미지.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체를 이용하여 핵산 증폭 결과를 분석한 형광 현미경 이미지.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 피씨알용 다공성 입자 복합체를 이용하여 핵산 증폭 결과를 정량화하여 나타낸 도표.

이하에서는 본 발명에 따른 방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체 및 이를 이용하는 핵산 증폭 장치 및 방법을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 방열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체는 온도가 조절되면 내부에서 핵산 증폭이 일어나는 다공성 입자와, 상기 다공성 입자 내부에 위치하여 광을 흡수하여 열을 발생시키는 광열 나노소자를 포함하여, 상기 다공성 입자에 특정 광을 조사하여 다공성 입자 내부의 온도를 핵산 증폭에 필요한 온도로 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.

상기 다공성 입자는 온도가 조절되면 내부에서 핵산 증폭이 일어나는 구성으로, 다공성을 가지며 내부에 핵산 증폭반응이 일어나는 종래의 다양한 다공성 입자가 이용될 수 있다. 예컨대, 상기 다공성 입자는, 기공을 포함하며 기공 내부에 표적 핵산의 중합효소 연쇄 반응을 위한 전방향 프라이며 및/또는 역방향 프라이머가 물리적 또는 화학적으로 고정될 수 있으며(표적 핵산의 프라이머가 기공 내부에 고정되지 않고, 액상으로 두 방향 프라이머를 제공받을 수도 있음), 다공성 입자 총 부피에 대하여 10 내지 95부피%의 기공율을 가질 수 있고, 구형, 디스크형 및 반구형의 형태 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있으며, 입경은 10um 내지 1mm를 가질 수 있고, 기공에 고정된 프라이머 정보를 제공하는 인코더, 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 형광표시인자 및 형광을 내는 프루브 중 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으며, 다공성 구조체의 재료는 고형화가 가능한 폴리머(pre-polymer)가 사용될 수 있으며, 예컨대 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(polyethylene glycol-diacrylate, PEG-DA), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamideimide, PA) 및 아가로스(agarose) 중 어느 하나 이상의 폴리머를 포함할 수 있다. 상기 기공 내부에 프라이머의 고정은 예컨대 프라이머가 말단에 아크릴기를 포함하고 상기 아크릴기가 다공성 입자에 화학적으로 고정되어 이루어질 수 있으며, 상기 프라이머는 링커에 의해 다공성 입자 내부에 고정될 수 있고, 상기 링커의 길이는 1 내지 100nm를 가질 수 있으며, 상기 링커는 열, 빛 및 화학물질 중 어느 하나에 의해 끊어지는 것도 가능하다.

상기 광열 나노소자는 상기 다공성 입자 내부에 위치하여 광을 흡수하여 열을 발생시키는 구성으로, 금속 나노입자, 카본 나노소자, 무기 나노소자, 유기 나노소자, 퀀텀닷 및 희토류로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 이용될 수 있고, 상기 금속 나노입자는 금, 은, 백금 및 팔라듐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 상기 카본 나노소자는 graphene, graphene oxide(GO), carbon nono tube(CNT), CNT-COOH 및 reduced graphene oxide(rGO)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있고, 상기 무기 나노소자는 Porous silicon, silicon oxide nanoparticles, Bismuth sulfide nanorods, FeSe₂-Decorated Bi₂Se₃Nanosheets, PEGylated Cu₃BiS₃ semiconductor nanorods 및 Iron Oxide Decorated MoS₂Nanosheets으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 상기 유기 나노소자는 Porphysome based NPs, Core formed by a mixture of doxorubicin (DOX) and ICG surrounded by a poly-(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)-lecithin-polyethylene shell, Nanostructured Porphyrin, Indocyanine green (ICG), Polyaniline, Polypyrrole, Poly[(diketopyrrolopyrrole-alt-cyclopentadithiophene)-ran-(diketopyrrolopyrrole-alt-thiadiazoloquinoxaline)] 및 PEDOT:PPS로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있고, 상기 퀀텀닷은 CuS, SuSe QDs, Ge-QDs 및 MoO₃-x quantum dots으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 상기 희토류는 Yb³⁺-Er³⁺ co-doped nanoparticles, Nd³⁺ ion doped nanocrystals, Nd³⁺ doped NaYF₄ 및 Neodymium(III) doped fluoride nanoparticles로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있다. 또한, 상기 광열 나노소자는 구, 막대, 육각면체, 양뿔(bipyramid), 나노케이지(nanocage) 및 나노스타(nanostar) 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있고, 1 내지 500nm의 직경 또는 길이를 가질 수 있으며, 다공성 입자 내에 ml당 0.01내지 50mg이 존재하는 것이 바람직하고, 물리적 또는 화학적으로 다공성 입자에 고정될 수 있으며, 예컨대 일단에 광열 나노소자와 반응하는 반응기가 존재하고 타단에 다공성 입자(예컨대, 아크릴기, 싸이올기 등)와 반응하는 반응기가 존재하는 링커에 의해 다공성 입자 결합할 수 있다. 상기 다공성 입자 내부에 분포하는 광열 나노소자에는 한 방향 이상의 프라이머 및/또는 프루브가 물리적 또는 화학적으로 고정될 수 있으며, 예컨대 상기 프라이머(또는 프루부)는 링커에 의해 연결될 수 있고, 상기 링커의 길이는 1 내지 100nm를 가질 수 있으며, 상기 링커는 열, 빛 및 화학물질 중 어느 하나에 의해 끊어지는 것도 가능하다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 발열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체의 제조방법은 다공성 입자 형성 폴리머 용액, 광열 나노소자 및 표적 핵산의 프라이머를 혼합하여 혼합용액을 형성하는 혼합단계와, 상기 혼합용액을 경화시켜 다공성을 가지며 내부 기공에 표적 핵산의 프라이머가 고정되고 내부에 광열 나노소자가 분포된 다공성 입자 복합체를 제조하는 경화단계를 포함한다. 상기 다공성 입자 형성 폴리머 용액을 입자 형성을 위한 친수성 폴리머(예컨대, PEG 700DA 등), 기공유도체(예컨대, PEG 600 등), 광개시제(예컨대 Darocur 1173 등) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따른 발열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체의 제조방법은 광열 나노소자가 분산된 용액에 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머를 혼합하고 30 내지 60분 동안 소니케이션을 실시하여 광열 나노소자의 표면에 상기 일 방향 프라이머를 결합시키는 결합단계와, 상기 일 방향 프라이머가 결합된 광열 나노소자와 다공성 입자 형성 폴리머 용액을 혼합하여 제1혼합용액을 형성하는 제1혼합단계와, 상기 제1혼합용액과 타 방향 프라이머를 혼합하여 제2혼합용액을 형성하는 제2혼합단계와, 상기 제2혼합용액을 경화시켜 다공성을 가지며 내부 기공에 표적 핵산의 타 방향 프라이머가 고정되고 내부에 일 방향 프라이머가 부착된 광열 나노소자가 분포된 다공성 입자 복합체를 제조하는 경화단계를 포함한다. 상기의 제조방법에 의해 제조된 다공성 입자 복합체에 피씨알을 수행하기 위해 광을 조사하면, 타 방향 프라이머는 다공성 입자 내에 고정되나, 상기 광열 나노소자에서 발생한 열에 의해 상기 일 방향 프라이머는 상기 광열 나노소자의 표면에서 떨어지게 되어, 양 방향 프라이머가 다공성 입자 내부에 위치함에도 피씨알 효율이 떨어지는 것을 방지할 수 있게 된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따른 발열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체를 이용하는 핵산 증폭 장치를 도 1을 참조하여 설명하면, 상기 핵산 증폭 장치는 표적 핵산을 내부에서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시키는 다공성 입자 복합체가 위치하는 피씨알칩(1)과, 상기 피씨알칩(1)에 광을 조사하는 광조사부(2)와, 상기 광조사부(2)에 의해 광이 조사된 피씨알칩(1)에 위치하는 다공성 입자 복합체를 측정하는 측정유닛(3)과, 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 상기 광조사부(2)에서 조사되는 광을 조절하고 상기 측정유닛(3)에 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 산출하는 컨트롤러(4) 등을 포함한다.

상기 피씨알칩(1)은 표적 핵산을 내부에서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시키는 다공성 입자 복합체가 위치하는 구성으로, 상기 피씨알칩에 시료를 주입한 후 광조사부(2)를 통해 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 광을 조사하면 상기 시료에 표적 물질이 있는 경우 중합효소 연쇄 반응에 의해 표적 물질이 증폭되게 된다. 상기 다공성 입자 복합체는 앞서 설명하였음으로 이하에서는 자세한 설명은 생략하기로 한다. 상기 피씨알칩(1)은 예컨대 유입구와 유출구가 형성된 마이크로 채널을 가지며, 상기 마이크로 채널 내에는 버퍼에 분산된 다공성 입자 복합체가 위치하게 되며, 상기 시료는 상기 마이크로 채널 내에 주입되어 분석되게 된다.

상기 광조사부(2)는 상기 컨트롤러(4)의 제어 하에 상기 피씨알칩(구체적으로, 다공성 입자 복합체)에 광을 조사한다. 상기 광조사부(2)에 의해 다공성 입자 복합체에 광을 조사하면, 상기 다공성 입자 복합체의 광열 나노소자는 광을 흡수하여 발열하게 되어, 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 할 수 있다. 상기 광조사부(2)는 예컨대 레이저나 LED가 사용될 수 있으며, 200 내지 20000nm의 파장을 가지는 광을 조사할 수 있고, 상기 광조사부(2)에 공급되는 전원의 전류, 전압, 듀티 사이클, 주파수 등을 조절하여 상기 광조사부(2)에서 조사되는 광의 세기를 조절할 수 있다(즉, 다공성 입자 복합체의 온도를 조절할 수 있음).

상기 측정유닛(3)은 상기 광조사부(2)에 의해 광이 조사된 피씨알칩(1)에 위치하는 다공성 입자 복합체의 변화를 측정하는 구성으로, 표적 핵산이 포함된 시료가 주입된 피씨알칩(1)에 적정 광을 조사하는 경우 다공성 입자 복합체에서 중합효소 연쇄 반응이 일어나 다공성 입자 복합체에 변화가 일어나므로 상기 측정유닛(3)은 이를 측정하여 상기 컨트롤러(4)에 전달하게 된다. 상기 측정유닛(3)은 예컨대 현광 현미경이 사용될 수 있다.

상기 컨트롤러(4)는 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 상기 광조사부(2)에서 조사되는 광을 조절하고 상기 측정유닛(3)에 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 산출하는 구성으로, 상기 광조사부(2) 및 측정유닛(3)과 정보를 교환하는 송수신모듈(41)과, 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가질 수 있도록 상기 광조사부(2)에서 조사되는 광의 조건을 설정하는 광세팅부(42)와, 상기 광세팅부(42)의 설정 조건에 따라 상기 광조사부(2)에 공급되는 전원을 조절하여 상기 광조사부(2)에서 조사되는 광을 제어하는 광조절부(43)와, 상기 측정유닛(3)에 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 산출하는 결과분석부(44)와, 상기 컨트롤러(4)의 전체적인 작동을 제어하는 제어부(45) 등을 포함한다.

상기 광세팅부(42)는 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가질 수 있도록 상기 광조사부(2)에서 조사되는 광의 조건을 설정하는 구성으로, 예컨대 시료가 주입되지 않은 피씨알칩(1)을 거치대(100)에 놓고 상기 광조사부(2)에 공급되는 전원을 조절하여 상기 광조사부(2)에서 상기 다공성 입자 복합체(1)에 조사되는 광이 달라지도록 한 후 온도센서(미도시) 등을 이용하여 다공성 입자 복합체의 온도를 측정하고 이를 분석하여 이루어지게 된다.

상기 결과분석부(44)는 상기 측정유닛(3)에 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 산출하는 구성으로, 예컨대 상기 측정유닛(현경 현미경)에서 측정된 결과로부터 형광 세기를 측정하여 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 산출할 수 있으며, 산출 결과는 디스플레이(미도시)에 도시되게 된다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따른 발열 기능을 가지는 피씨알용 다공성 입자 복합체를 이용하는 핵산 증폭 방법은 표적 핵산을 내부에서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시키는 다공성 입자 복합체가 위치하는 피씨알칩(1)에 시료를 주입하는 시료반응단계와, 상기 시료반응단계 후 상기 광조사부(2)를 이용하여 상기 피씨알칩(1)에 광을 조사하여 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 하는 광조사단계와, 상기 광조사단계 후에 상기 측정유닛(3)을 이용하여 상기 피씨알칩(1)에 위치하는 다공성 입자 복합체의 변화를 측정하는 측정단계와, 상기 측정단계에서 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 산출하는 분석단계를 포함한다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 피씨알용 다공성 입자 복합체의 준비

1. 피씨알용 다공성 입자 복합체 1

PEG(Polyethylene glycol) 600-40%, PEG 700DA-20%, 금 나노입자 용액-35%(상기 금 나노입자 용액은 Nanopartz사의 AC12-10-808-CTAB-DIH-100-1를 2배 농축하여 형성하였는데, 농축 과정은 12000rpm으로 10분 동안 원심 분리를 진행한 후 용액 안에 골고루 분포되어 있던 금 나노입자들을 튜브 밑면에 모이게 한 후 상측액의 절반은 피펫으로 제거하여 수행함), 및 Darocur 1173-5%(v/v)를 섞은 다음 볼텍스와 스핀다운(vortex & spindown)을 수행하여 용액을 준비하고, 위 용액을 10uM농도의 β-actin forward primer[5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'(서열번호:1)]와 9:1(v/v)로 섞은 다음 볼텍스와 스핀다운을 수행하고, UV를 쬐어서 경화시키고, 경화된 입자를 DIT 용액(DI water + Twin 20(Twin 20 농도: 0.05wt%))에 담고 20초 동안 볼텍스와 스핀다운을 수행하고, DIT 용액으로 버퍼 교환 후 20초 동안 볼텍스와 스핀다운을 총 3회 실시한 후, 새로운 DIT 용액으로 버퍼 교체하여 DIT 용액에 분산된 피씨알용 다공성 입자 복합체 1을 준비하였다.

2. 피씨알용 다공성 입자 복합체 2

(1) 탄소나노소자 용액(DI water 1ml당 rGO(5 내지 7㎛의 길이를 가지는 rGO가 사용됨) 0.5mg이 혼합됨)과 200uM의 β-actin reverse primer[5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3'(서열번호:2)]를 1:1의 부피비로 혼합한 후 30분 동안 소니케이션(Sonication)을 실시하여 혼합용액을 얻었다.

(2) PEG 600-40%, PEG 700DA-20%, 상기 혼합용액-35% 및 Darocur 1173-5%(v/v)를 섞은 다음 볼텍스와 스핀다운을 수행하여 용액을 준비하고, 위 용액을 10uM농도의 β-actin forward primer[5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'(서열번호:1)]와 9:1(v/v)로 섞은 다음 볼텍스와 스핀다운을 수행하고, UV를 쬐어서 경화시키고, 경화된 입자를 SC 용액(DI water + Sodium chlorate(Sodium chorate 농도 : 0.2wt%))에 담고 20초 동안 볼텍스와 스핀다운을 수행하고, SC 용액으로 버퍼 교환 후 20초 동안 볼텍스와 스핀다운을 총 6회 실시한 후, 새로운 SC 용액으로 버퍼 교체하여 SC 용액에 분산된 피씨알용 다공성 입자 복합체 2를 준비하였다.

3. 피씨알용 다공성 입자 복합체 3

rGO 대신에 CNT-COOH(1㎛의 길이와 1nm의 폭을 가지는 CNT-COOH가 사용됨)가 사용되는 것을 제외하는 다른 조건을 실시예 1의 2와 동일하게 하여 SC 용액에 분산된 피씨알용 다공성 입자 복합체 3을 준비하였다.

4. 피씨알용 다공성 입자 복합체 4

rGO 대신에 GO(5 내지 7㎛의 길이를 가지는 GO가 사용됨)가 사용된 것을 제외하는 다른 조건을 실시예 1의 2와 동일하게 하여 SC 용액에 분산된 피씨알용 다공성 입자 복합체 4를 준비하였다.

<실시예 2> 피씨알용 다공성 입자의 준비

금 나노입자 용액 대신에 DI water를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 1과 동일하게 하여 DIT에 분산된 피씨알용 다공성 입자를 준비하였다.

<실시예 3> 피씨알용 다공성 입자 복합체의 특성 확인

1. 실시예 1의 1에서 준비된 다공성 입자 복합체와 실시예 2에서 준비된 다공성 입자를 로다민 B로 염색한 후 현광 현미경(Zeiss Axionplan 2 imaging(LSM 5 PASCAI))으로 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 위 사진은 다공성 입자를 나타내며 아래 사진은 다공성 입자 복합체를 나타낸다.

2. 도 2를 보면, 다공성 입자와 달리 다공성 입자 복합체의 이미지에는 검은 점이 보이는 것으로 보아, 다공성 입자에 금 나노입자가 균일하게 분산되어 있음을 알 수 있다.

<실시예 4> 피씨알용 다공성 입자 복합체의 발열 온도 조절이 가능함을 확인

1. PDMS와 경화제가 혼합된 용액을 실리콘 웨이퍼(mold) 위에 부어 경화시켜, 유입구와 유출구가 형성된 마이크로 채널을 가지는 피씨알칩을 형성하였다.

2. 피펫을 이용하여 실시예 1의 1에서 제조된 다공성 입자 복합체가 분산된 DIT 용액을 유입구를 통해 마이크로 채널에 주입하였다. 이후, 피씨알칩로부터 3mm 떨어진 곳에 광원을 위치시킨 후 광을 조사하고 다공성 입자 복합체의 내부 온도를 측정하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 광원은 2W 800nm 레이저(Changchun New Industries Optoelectronics Tech)를 사용하였고, 2W 800nm 레이저에 공급되는 전원의 주파수는 1000Hz로 고정하고 듀티를 조절하여 측정하였다.

공급전원 듀티(Duty)	10%	20%	40%	60%
다공성 입자 복합체 온도(℃)	30	60	95	130

3. 또한, DI water 1ml당 rGO가 0.25, 0.125, 0.0625mg가 사용된 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 2와 동일하게 하여, SC 용액에 분산된 피씨알용 다공성 입자 복합체를 준비하였다. 상기 실시예 1의 2 및 실시예 4의 3에서 준비된 피씨알용 다공성 입자 복합체가 분산된 SC 용액 각각을 유입구를 통해 마이크로 채널에 주입하였다. 이후, 피씨알칩로부터 1cm 떨어진 곳에 광원을 위치시킨 후 광을 조사하고 다공성 입자 복합체의 내부 온도를 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다. 광원은 2W 800nm 레이저를 사용하였고, 2W 800nm 레이저에 공급되는 전원의 주파수를 1000Hz로 하고 듀티를 100%로 하여 측정하였다.

다공성 입자 복합체	rGO가 0.5mg/ml로 사용된 경우	rGO가 0.25mg/ml로 사용된 경우	rGO가 0.125mg/ml로 사용된 경우	rGO가 0.0625g/ml로 사용된 경우
다공성 입자 복합체 온도(℃)	95	78	64	48

4. 또한, 실시예 1의 2 내지 4에서 준비된 피씨알용 다공성 입자 복합체가 분산된 SC 용액 각각을 유입구를 통해 마이크로 채널에 주입하였다. 이후, 피씨알칩으로부터 3mm 떨어진 곳에 광원을 위치시킨 후 조사되는 광을 세기를 순차적으로 증가시켜 다공성 입자 복합체의 내부 온도를 측정하고, 광의 세기가 증가함에 따라 다공성 입자 복합체의 내부 온도가 상승하는지, 상기 다공성 입자 복합체가 60 및 95℃의 온도를 가지는지를 확인하여 그 결과를 표 3에 나타내었다. 광원은 2W 800nm 레이저를 사용하였고, 2W 800nm 레이저에 공급되는 전원의 주파수를 1000Hz로 하고, 듀티를 0에서 100%까지 순차적으로 증가시켜 측정하였다.

	실시예 1의 2	실시예 1의 3	실시예 1의 3
다공성 입자 복합체의 온도 상승여부	○	○	○
다공성 입자 복합체가 60, 90℃를 가지는지 여부	○	○	○

5. 표 1을 보면, 광원에 공급되는 전원의 듀티를 조절하여 상기 다공성 입자 복합체의 온도를 조절할 수 있음을 확인할 수 있어, 상기 다공성 입자 복합체가 피씨알(PCR)을 수행함에 필요한 온도(대략적으로 변성의 경우 95℃에서 수행되고, 어닐링의 경우 60℃에서 수행됨)로 조절될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 표 2를 보면, 금속 나노입자 대신에 탄소 나노소자를 이용하여도 상기 다공성 입자 복합체가 피씨알을 수행함에 필요한 온도로 조절될 수 있음을 알 수 있고, 탄소 나노소자의 농도에 따라 다공성 입자 복합체의 온도가 변하는 것을 확인할 수 있어 탄소 나노소자가 상기 다공성 입자 복합체에서 광열 반응을 일으킴을 알 수 있다. 또한, 표 3을 보면, 여러 종류의 탄소 나노소자를 이용하여도 상기 다공성 입자 복합체가 피씨알을 수행함에 필요한 온도로 조절될 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 5> 피씨알용 다공성 입자 복합체를 이용하여 핵산 증폭이 가능함을 확인

1. 금속 나노입자가 사용된 다공성 입자 복합체를 이용한 핵산 증폭

(1) 실시예 1의 1에서 제조된 다공성 입자 복합체가 분산된 DIT 용액을 피펫을 이용하여 실시예 4의 1에서 제조된 피씨알칩의 마이크로 채널에 주입하고, 이후 피씨알 용액을 마이크로 채널 안에 주입하여 30분 동안 침습하고 마이크로 채널에 미네랄 오일(Mineral oil)을 주입하여 퍼버 교환하여 피씨알칩 1을 준비하였다. 피씨알 용액 조성(v/v)은 β-actin reverse primer[5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3'(서열번호:2)] 5%, Template(β-actin[5'-CCTGGCACCCAGCACAATGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTGTGGATCGGC-3'(서열번호:3)]) 6.25%, DI water 38.75%, SYBR 1 Mastermix(Nanobiosys) 50%로 이루어진다.

(2) 상기 피씨알칩 1을 현광 현미경(Zeiss Axionplan 2 imaging(LSM 5 PASCAI))에 안착 시킨 후, 피씨알칩 1로부터 3mm 떨어진 곳에 광원(2W 800nm 레이저)를 위치시킨 후 변화되는 광을 조사하여 하기의 온도 사이클에 따라 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 전변성은 95℃에서 8초, 변성은 95℃에서 7초, 어닐링은 60℃에서 15초로 수행되었는데(총 888초 수행), 2W 800nm 레이저에 공급되는 전원의 듀티를 조절하여 피씨알칩 1 내부의 다공성 입자 복합체가 60℃ 및 95℃의 온도를 가지도록 할 수 있다(실시예 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 주파수가 1000Hz로 고정된 전원의 듀티를 20%로 하는 경우 다공성 입자 복합체의 온도가 60℃가 되도록 할 수 있고, 튜티를 40%로 하는 경우 다공성 입자 복합체의 온도가 95℃가 되도록 할 수 있음). 상기 중합효소 연쇄반응은 총 40 사이클로 진행하였고, 매 사이클이 끝난 후 다공성 입자 복합체의 형광이미지를 얻고 형광 강도를 정량화하였다. 도 3은 특정 사이클이 끝난 후 다공성 입자 복합체의 형광 현미경 측정 결과를 나타내는데, (a)는 사이클의 시작 전의 형광 이미지이고, (b)는 10 사이클 후의 형광 이미지이며, (c)는 25 사이클 후의 형광 이미지이고, (d)는 40 사이클 후의 형광 이미지이다. 도 4는 각 사이클이 끝난 후 다공성 입자 복합체의 형광 강도를 정량화한 도표이다. 도 4에서 샘플 1은 도 3에 도시된 다공성 입자 복합체 중 왼쪽에 위치하는 것의 측정결과를 나타내며, 샘플이 2는 도 3에 도시된 다공성 입자 복합체 중 오른쪽에 위치하는 것의 측정결과를 나타낸다.

(3) 상기 피씨알칩 1을 현광 현미경에 안착시킨 후 광을 조사하지 않고 888초 후에 형광 이미지를 얻어 도 5의 (a)에 나타내었고, 다공성 입자 복합체가 분산된 DIT 용액 대신에 실시예 2에서 제조된 다공성 입자가 분산된 DIT 용액을 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 5의 1의 (1)과 동일하게 하여 피씨알칩 2를 제조하고 피씨알칩 2를 현광 현미경에 안착한 후 3mm 떨어진 곳에 광원을 위치시킨 후 실시예 5의 1의 (2)와 동일 조건의 광을 조사한 후(즉 40 사이클이 지난 후) 다공성 입자의 형광 이미지를 얻어 도 5의 (b)에 나타내었다.

(4) 도 3 및 4를 보면, 사이클이 진행될수록 형광 세기가 강해지는 것을 확인할 수 있어, 종래와 같이 열판을 사용하지 않고서도 다공성 입자 복합체의 자체 발열에 의해 중합효소 연쇄반응을 수행할 수 있음을 알 수 있다. 도 3 내지 5를 대비해 보면, 도 3의 (d)에 비해 도 5의 (a) 및 (b)의 형광 세기가 월등히 낮은 것을 확인할 수 있어, 다공성 입자 복합체에 적절한 광이 조사되지 않거나, 다공성 입자에 광을 조사하여도 중합효소 연쇄반응이 수행되지 않음을 알 수 있다. 즉, 다공성 입자에 금속 나노입자가 분포되고 적절한 광이 조사되면, 자체 발열에 의해 중합효소 연쇄반응을 효과적으로 수행할 수 있음을 알 수 있다.

2. 탄소 나노소자가 사용된 다공성 입자 복합체를 이용한 핵산 증폭

(1) 실시예 1의 2에서 제조된 다공성 입자 복합체가 분산된 SC 용액을 피펫을 이용하여 실시예 4의 (1)에서 제조된 피씨알칩의 마이크로 채널에 주입하고, 이후 피씨알 용액을 마이크로 채널 안에 주입하여 30분 동안 침습하고 마이크로 채널에 미네랄 오일(Mineral oil)을 주입하여 퍼버 교환하여 피씨알칩 3을 준비하였다. 피씨알 용액 조성(v/v)은 Template(β-actin[5'-CCTGGCACCCAGCACAATGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTGTGGATCGGC-3'(서열번호:3)]) 6.25%, DI water 43.75%, SYBR 1 Mastermix(Nanobiosys) 50%로 이루어진다.

(2) 상기 피씨알칩 3을 현광 현미경(Zeiss Axionplan 2 imaging(LSM 5 PASCAI))에 안착 시킨 후, 피씨알칩 3으로부터 3mm 떨어진 곳에 광원(2W 800nm 레이저)를 위치시킨 후 변화되는 광을 조사하여 하기의 온도 사이클에 따라 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 전변성은 95℃에서 8초, 변성은 95℃에서 4초, 어닐링은 60℃에서 20초로 수행되었으며, 상기 레이저에 공급되는 전원의 주파수를 1000Hz로 고정하고, 듀티를 60%로 하여 다공성 입자 복합체가 95℃의 온도를 가지도록 하고, 듀티를 30%로 하여 다공성 입자 복합체가 60℃의 온도를 가지도록 하였다. 상기 중합효소 연쇄반응은 총 40 사이클로 진행하였고, 매 사이클이 끝난 후 다공성 입자 복합체의 형광이미지를 얻고 형광 강도를 정량화하였다. 도 6은 특정 사이클이 끝난 후 다공성 입자 복합체의 형광 현미경 측정 결과를 나타내는데, (a)는 사이클 시작 전의 형광 이미지이고, (b)는 10 사이클 후의 형광 이미지이며, (c)는 25 사이클 후의 형광 이미지이고, (d)는 40 사이클 후의 형광 이미지이다. 도 7은 각 사이클이 끝난 후 다공성 입자 복합체의 형광 강도를 정량화한 도표이다.

(3) 도 6 및 7을 보면, 사이클이 진행될수록 형광 세기가 강해지는 것을 확인할 수 있어, 탄소 나노소자를 이용하여도 다공성 입자 복합체의 자체 발열에 의해 중합효소 연쇄반응을 수행할 수 있음을 알 수 있다.

3. 제조 조건을 달리한 다공성 입자 복합체를 이용한 핵산 증폭

(1) 소니케이션을 실시하지 않을 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 2와 동일하게 하여 SC 용액에 분산된 피씨알용 다공성 입자 복합체를 준비하였다.

(2) PEG 600-40%, PEG 700DA-20%, 상기 탄소나노소자 용액(1ml당 rGO가 0.25mg이 혼합됨)-35% 및 Darocur 1173-5%(v/v)를 섞은 다음 볼텍스와 스핀다운을 수행하여 용액을 준비하고, 9:3.5:1의 부피비로 위 용액을 100uM의 β-actin reverse primer[5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3'(서열번호:2)] 및 10uM농도의 β-actin forward primer[5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'(서열번호:1)]와 섞은 후 볼텍스와 스핀다운을 수행하고, UV를 쬐어서 경화시키고, 경화된 입자를 SC 용액(DI water + Sodium chlorate(Sodium chorate 농도 : 0.2wt%))에 담고 20초 동안 볼텍스와 스핀다운을 수행하고, SC 용액으로 버퍼 교환 후 20초 동안 볼텍스와 스핀다운을 총 6회 실시한 후, 새로운 SC 용액으로 버퍼 교체하여 SC 용액에 분산된 피씨알용 다공성 입자 복합체를 준비하였다.

(3) 실시예 1의 2에서 제조된 다공성 입자 복합체가 분산된 SC 용액 대신에 실시예 5의 3의 (1) 및 (2)에서 준비된 다공성 입자 복합체가 분산된 SC 용액을 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 5의 2와 동일하게 하여 핵산 증폭 실험을 수행하여 총 40 싸이클이 종료된 후, 형광 세기를 상대 비교하였다.

(4) 형광 세기 상대 비교 결과, 실시예 5의 3의 (1) 및 (2)에서 준비된 다공성 입자 복합체를 이용한 경우 실시예 1의 2에서 준비된 다공성 입자 복합체를 이용한 경우보다 형광 세기가 현저히 낮음을 확인할 수 있어, 광열 나노소자와 프라이머를 혼합한 후 일정 시간 이상 소니케이션을 실시하지 않는 경우 프라이머가 광열 나노소자에 충분히 부착되지 않아 피씨알이 원활하게 이루어지지 않으며, 일 방향 프라이머를 광열 나노소자에 부착하지 않고 다공성 입자 네트워크에 양 방향 프라이머를 모두 결합시킨 경우 양 방향 프라이머 모두가 다공성 입자 내에서 견고하게 고정되어 피씨알이 원활하게 이루어지지 않은 것으로 보인다. 즉, 소니케이션을 통해 프라이머를 광열 나노소자 표면에 부착할 수 있고, 광열 나노소자에 부착된 프라이머는 피씨알을 수행하기 위해 제공된 열에 의해 광열 나노소자의 표면에서 떨어짐으로, 양 방향 프라이머가 다공성 입자 내부에 위치함에도 피씨알 효율이 떨어지는 것을 방지할 수 있다.

이상에서, 출원인은 본 발명의 다양한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며, 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

1: 피씨알칩 2: 광조사부 3: 측정유닛
4: 컨트롤러 41: 송수신부 42: 광세팅부
43: 광조절부 44: 결과분석부 45: 제어부

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Porous particle complex for PCR having heat radiant function <130> PDAHJ-19123 <150> KR 2018/0055629 <151> 2018-05-15 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 1 cctggcaccc agcacaat 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 2 gccgatccac acggagtact 20 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin <400> 3 cctggcaccc agcacaatga agatcaagat cattgctcct cctgagcgca agtactccgt 60 gtggatcggc 70

Claims

온도가 조절되면 내부에서 핵산 증폭이 일어나는 다공성 입자와, 상기 다공성 입자 내부에 위치하여 광을 흡수하여 열을 발생시키는 광열 나노소자를 포함하여, 상기 다공성 입자에 특정 광을 조사하여 다공성 입자 내부의 온도를 핵산 증폭에 필요한 온도로 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체.
제1항에 있어서, 상기 다공성 입자는
총 부피에 대하여 10 내지 95부피%의 기공율을 가질 수 있으며, 10um 내지 1mm의 입경을 가질 수 있고, 친수성 폴리머의 고형물인 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체.
제1항에 있어서, 상기 광열 나노소자는
금속 나노입자, 카본 나노소자, 무기 나노소자, 유기 나노소자, 퀀텀닷 및 희토류로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용되는 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체.
제1항에 있어서, 상기 광열 나노소자는
1 내지 500nm의 직경 또는 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체.
제1항에 있어서, 상기 광열 나노소자는
상기 다공성 입자 내에 ml당 0.01내지 50mg이 존재하는 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체.
제1항에 있어서, 상기 광열 나노소자는
물리적 또는 화학적으로 다공성 입자에 고정되는 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체.
제1항에 있어서,
정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머가 상기 다공성 입자 내부에 고정되고,
타 방향 프라이머는 상기 다공성 입자 내부에 고정되는 광열 나노소자의 표면에 부착되며,
피씨알을 위해 상기 다공성 입자 복합체에 광을 조사할 때 상기 광열 나노소자에서 발생된 열에 의해 상기 타 방향 프라이머는 상기 광열 나노소자에서 떨어지는 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체.
광열 나노소자가 분산된 용액에, 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머를 혼합하여, 광열 나노소자의 표면에 상기 일 방향 프라이머를 결합시키는 결합단계와; 상기 일 방향 프라이머가 결합된 광열 나노소자와 다공성 입자 형성 폴리머 용액을 혼합하여 제1혼합용액을 형성하는 제1혼합단계와; 상기 제1혼합용액과 타 방향 프라이머를 혼합하여 제2혼합용액을 형성하는 제2혼합단계와; 상기 제2혼합용액을 경화시켜, 다공성을 가지며, 내부 기공에 표적 핵산의 타 방향 프라이머가 고정되고, 일 방향 프라이머가 부착된 광열 나노소자가 내부 기공에 고정된 다공성 입자 복합체를 제조하는 경화단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 결합단계는
광열 나노소자가 분산된 용액에, 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 일 방향 프라이머를 혼합하고, 30 내지 60분 동안 소니케이션을 실시하여 수행되는 것을 특징으로 하는 피씨알용 다공성 입자 복합체의 제조방법.
표적 핵산을 내부에서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시키는 다공성 입자 복합체를 포함하는 피씨알칩과, 상기 다공성 입자 복합체에 광을 조사하는 광조사부와, 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 상기 광조사부에서 조사되는 광을 조절하는 컨트롤러를 포함하며,
상기 다공성 입자 복합체는 제1항의 다공성 입자 복합체가 사용되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
제10항에 있어서,
상기 광조사부에 공급되는 전원의 전류, 전압, 듀티 사이클 및 주파수 중 어느 하나 이상을 조절하여 상기 광조사부에서 조사되는 광의 세기를 제어할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
제10항에 있어서, 상기 컨트롤러는
상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가질 수 있도록 상기 광조사부에서 조사되는 광의 조건을 설정하는 광세팅부를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
제10항에 있어서,
상기 핵산 증폭 장치는 상기 광조사부에 의해 광이 조사된 피씨알칩에 위치하는 다공성 입자 복합체를 측정하는 측정유닛을 추가로 포함하며,
상기 컨트롤러는 상기 측정유닛에 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 또는 양을 산출하는 결과분석부를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 장치.
표적 핵산을 내부에서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시키는 다공성 입자 복합체와 시료를 반응시키는 시료반응단계와, 상기 시료반응단계 후 상기 시료와 반응한 다공성 입자 복합체에 광을 조사하여 상기 다공성 입자 복합체가 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 온도를 가지도록 하는 광조사단계와, 상기 광조사단계 후에 다공성 입자 복합체의 변화를 측정하는 측정단계와, 상기 측정단계에서 측정된 결과를 분석하여 표적 핵산의 존재 또는 산출하는 분석단계를 포함하며,
상기 다공성 입자 복합체는 제1항의 다공성 입자 복합체가 사용되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.