KR101717966B1 - 금 원자클러스터 및 핵산 구조체를 포함하는 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 광열 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금 원자클러스터 및 핵산 구조체를 포함하는 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 광열 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 복합체는 생분해성이 우수한 핵산이 증폭하여 형성되는 핵산구조체를 안정제로 사용하고 배출이 용이한 직경이 10nm 이하 금 원자클러스터를 포함하므로, 안정제로서 고분자와 수백 나노미터 입자크기를 갖는 금 나노입자를 포함하는 종래 복합체보다 생체적합성이 우수하고, 복합체의 직경이 30nm 내지 100μm로 조절되어 암조직에 용이하게 침투할 수 있으며, 근적외선을 조사하였을 때 금 이온을 응집시키지 않은 복합체와 비교하여 온도 상승률이 30℃ 이상으로 최고 도달 온도가 60℃까지 나타나 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있어 광열 치료용 약학적 조성물로 용이하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

금 원자클러스터 및 핵산 구조체를 포함하는 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 광열 치료용 약학적 조성물{A complex comprising gold atom cluster and nucleic acid structure, preparation method thereof, and pharmaceutical composition for photothermal therapy comprising the same}
본 발명은 금 원자클러스터 및 핵산 구조체를 포함하는 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 광열 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
광열 치료는 광 감응성 물질을 투여한 이후에 질환 부위에 근적외선 레이저를 조사함으로서 발생하는 열에너지를 치료에 응용하는 방법이다. 특히 종양 분야에서 광열 치료는 비침습적 치료 방법으로서 주목받고 있다. 광열 치료를 위해서 현재까지 주로 연구되고 있는 광감응성 물질로, 금, 은 또는 그래핀과 같은 탄소 나노입자 등이 있다. 하지만, 수백 나노미터 입자크기를 갖는 나노입자는 생체 내에서 장기간 미배출 상태로 있어 치명적인 독성을 보이며 전신 조직으로의 분포 문제가 해결과제로 남아 있어, 생체적합성이 높으며 종양 선택성을 보유한 광 감응성 물질의 연구가 필요한 실정이다.
직경이 약 10nm 이하의 크기를 갖는 금 원자클러스터(또는, 금 나노클러스터로도 명명함)는 근적외선 파장대의 빛과 상호작용을 하고 일반적인 유기 물질에 비해 104 내지 105배 큰 흡광계수를 갖고 있으며 높은 광안정성을 보이는 광학적 성질을 나타낸다. 또한, 금 나노입자에 비해 작은 입자크기 때문에 생체 독성이 낮다고 알려져 있다. 이러한 특성으로 인하여 금 원자클러스터는 광열 치료를 위한 광 감응 물질로서 주목받고 있다.
일례로, 특허문헌 1에서는 생체적합성 고분자가 금 나노입자를 둘러싸고 있는 복합체를 개시하고 있으며, 상기 복합체는 근적외선 영역에서 높은 흡광도를 나타내고, 근적외선 레이저를 조사할 경우 온도 상승효과가 있음을 확인하여 종양의 광열치료에 사용할 수 있음을 보이고 있다. 다만, 상기 복합체는 금 전구체와 파이레닐 덱스트란 생체고분자를 반응시켜 제조되는데 이때 95℃ 이상의 고온에서 교반시키는 과정을 필수적으로 수행하여야 한다. 이러한 고온 조건에서의 교반 과정은 추후 금 나노입자가 환원제와 안정제로서 역할을 하는 파이레닐 덱스트란 생체고분자에 안정적으로 응집하거나 결합하는 것을 현저히 저해하게 된다. 결과적으로, 고온 조건에서 제조된 복합체는 상기 등록특허공보의 실험예 2에 나타나 있듯이 추후 근적외선을 조사하였을 때 증류수 비교군에 비해 온도 상승률이 15℃에 불과한 것으로 확인하고 있다. 하지만, 광열 치료를 통해 효율적으로 암세포를 사멸시키기 위해서는 최소한 42℃ 이상의 온도를 필요로 한다.
한편, 금 원자클러스터는, 직경이 약 10nm를 초과하는 큰 입자크기를 갖는 금 나노입자를 산성을 띠는 용매 등을 이용하여 입자 표면을 부식시키는 방법으로 제조할 수 있다. 하지만, 상기 방법은 금 나노입자가 물 분산성과 광 안정성이 낮으므로 금 원자클러스터를 원하는 물성으로 확보하기 어려운 단점이 있다. 이에 대한 대체 방법으로, 안정제로서 역할을 하는 물질이 존재하는 상태에서 금 이온을 환원제를 통해 환원시키는 방법으로 금 원자클러스터를 제조할 수 있다.
현재까지 보고된 안정제로는 시스테인 및 히스티딘 아미노산 잔기를 갖는 단백질, 또는 펩타이드 그리고 아미노 및 카르복실기를 갖는 고분자 폴리머가 있다. 또한, 짧은 DNA 단일가닥을 안정제로 사용한 연구도 보고된 바 있다. 단백질, 펩타이드 및 고분자 폴리머와 비교하였을 때, DNA는 그 길이와 서열을 쉽게 조정할 수 있어 금 원자클러스터의 크기를 균일하게 제조할 수 있으며 광 안정성 또한 우수한 것으로 알려져 있다. 하지만, 짧은 DNA 단일가닥과 금 이온의 반응시간은 3 내지 5일이 요구되므로 제조시간이 길다는 단점이 있는바 이를 단축 할 수 있는 방법이 요구된다.
롤링-써클 복제/전사(Rolling Circle Amplification, RCA)란, DNA 또는 RNA 중합효소를 이용해 원형의 짧은 DNA를 주형으로 하여 이에 상보적인 DNA 또는 RNA 단일가닥을 무한 반복적으로 복제 및 생산하는 기술을 말한다. 주형 DNA의 길이와 서열만 조정하면 쉽고 빠르게 다양한 상보적 DNA 또는 RNA 단일가닥을 생산할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 롤링-써클 복제/전사 기술을 사용하여 특정 DNA/RNA 또는 단백질을 검출하는 바이오센서 연구들이 많이 보고되어 있다. 하지만, 롤링-써클 복제/전사 기술을 통해 핵산 구조체를 제조하고 여기에 금 원자클러스터를 응집 또는 결합시킨 복합체를 광열 치료용도로 사용할 수 있다는 보고나 연구는 전혀 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 생체적합성이 우수하고, 암조직에 용이하게 침투할 수 있는 직경을 가지며, 광열 치료를 위해 근적외선을 조사하였을 때 암세포를 사멸시키기에 충분한 온도로 발열할 수 있는 복합체를 개발하기 위하여 노력하던 중, 본 발명에 따른 복합체는 생분해성이 우수한 핵산이 증폭하여 형성되는 핵산구조체를 안정제로 사용하고 배출이 용이한 직경이 10nm 이하 금 원자클러스터를 포함하므로, 안정제로서 고분자와 수백 나노미터 입자크기를 갖는 금 나노입자를 포함하는 종래 복합체보다 생체적합성이 우수하고, 복합체의 직경이 30nm 내지 100μm로 조절되어 암조직에 용이하게 침투할 수 있으며, 근적외선을 조사하였을 때 금 이온을 응집시키지 않은 복합체와 비교하여 온도 상승률이 30℃ 이상으로 최고 도달 온도가 60℃까지 나타나 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있어 광열 치료용 약학적 조성물로 용이하게 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허공보 제10-1349360호.
본 발명의 목적은 생체적합성이 우수하고, 근적외선을 조사하였을 때 암세포를 사멸시키기 충분한 온도로 도달 가능하며, 경구투여, 정맥투여, 피하투여 등 투여 형태에 제한받지 않고 암조직에 용이하게 침투 가능한 직경을 갖는 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 금 원자클러스터 및 핵산 구조체를 포함하되,
상기 금 원자클러스터는 핵산 구조체에 응집되어 있는 구조의 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 용매 하에서 핵산 구조체와 금 전구체를 반응시키는 단계(단계 1); 및
환원제를 첨가하여 반응시키는 단계(단계 2);를 포함하는 상기 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 복합체는 생분해성이 우수한 핵산이 증폭하여 형성되는 핵산구조체를 안정제로 사용하고 배출이 용이한 직경이 10nm 이하 금 원자클러스터를 포함하므로, 안정제로서 고분자와 수백 나노미터 입자크기를 갖는 금 나노입자를 포함하는 종래 복합체보다 생체적합성이 우수하고, 복합체의 직경이 30nm 내지 100μm로 조절되어 암조직에 용이하게 침투할 수 있으며, 근적외선을 조사하였을 때 금 이온을 응집시키지 않은 복합체와 비교하여 온도 상승률이 30℃ 이상으로 최고 도달 온도가 60℃까지 나타나 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있어 광열 치료용 약학적 조성물로 용이하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 복합체의 제조방법과 광열 치료 과정의 모식도를 나타내는 그림이다.
도 2는 롤링-써클 반응 시간(10분, 6시간 또는 24시간)에 따른 복합체의 광열 효과를 나타내는 그림이다.
도 3은 광원의 종류(LED, UV 또는 근적외선)에 따른 복합체의 광열 효과를 나타내는 그림이다.
도 4는 복합체를 구성하는 핵산의 종류(DNA 또는 RNA)에 따른 광열 효과를 나타내는 그림이다.
도 5는 암세포에 복합체를 처리한 후 근적외선을 조사하였을 때, 복합체에서 발생하는 광열 효과를 나타내는 그림이다.
도 6은 암세포에 복합체를 처리한 후 근적외선을 조사하였을 때, 광열에 의한 암세포의 사멸 효과를 나타내는 그림이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 금 원자클러스터 및 핵산 구조체를 포함하되,
상기 금 원자클러스터는 핵산 구조체에 응집되어 있는 구조의 복합체를 제공한다.
여기서, 상기 금 원자클러스터란 원자 단위의 금 원자가 일정량 응집하거나 모여 이루는 구조체를 뜻하며 통상적인 금 나노입자보다 작은 직경을 갖는다. 특별한 제한은 없으나 금 원자클러스터의 직경은 0.3-10nm 범위인 것을 사용할 수 있고, 0.3-5nm 범위인 것이 바람직하고, 0.3-3nm 범위인 것이 더욱 바람직하다. 상기 금 원자클러스터의 직경이 10nm를 초과할 경우는 생체 내 투여시 배출이 용이하지 않아 생체 독성을 나타내는 문제가 있고, 상기 금 원자 클러스터의 직경이 0.3nm 미만일 경우는 특별한 문제는 없으나 하나의 금 원자의 반지름이 약 144pm(0.144nm)임을 고려할 때 하나 또는 두 개의 금 원자가 응집한 경우를 의미한다.
또한, 상기 금 원자클러스터는 UV나 LED에 대하여는 빛을 흡수하지 않아 발열을 하지 않지만, 근적외선 영역의 빛은 선택적으로 흡수하여 발열하는 것을 특징으로 한다.
나아가, 상기 핵산 구조체는 DNA 또는 RNA의 핵산이 RCA(Rolling Circle Amplification) 또는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 과정을 통해 서로 결합하고 엉키면서 증폭하여 형성되는 것이면 제한 없이 사용 가능하다. 핵산 구조체의 형태는 특별한 제한은 없으나 삼각형 형태, 사각형 형태, 스타(star) 형태, 구 형태 등을 사용할 수 있고, 그중에서도 특히 구 형태를 사용하는 것이 암조직의 침투 효율을 확보하는데 바람직하다. 핵산은 안정제나 지지체로 사용할 경우 생분해성이 우수하여 생체 독성을 나타내지 않으므로 본 발명에 따른 복합체의 생체적합성을 확보할 수 있게 한다. 상기 핵산은 siRNA, 앱타머, 및 안티올리고뉴클레오타이드 서열을 포함 할 수 있다.
또한, 상기 복합체는 암조직에 용이하게 침투하기 위한 직경을 갖는 것이면 제한 없이 사용할 수 있으나, 구체적으로는 직경이 30nm 내지 100μm인 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 40nm 내지 800nm인 것을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 45nm 내지 500nm인 것을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 50nm 내지 400nm인 것을 사용할 수 있다. 여기서, 상기 복합체의 직경이 30nm 이하일 경우에는 복합체가 암세포의 사멸을 유도하게 충분하지 못한 금 원자클러스터를 포함하게 되어 광열치료 효율이 떨어지는 문제가 있고, 상기 복합체의 직경이 100μm 초과일 경우 암조직의 침투 효율이 떨어지는 문제가 있다. 상기 복합체의 직경은 주로 핵산 구조체의 직경에 의존하며, 상기 핵산 구조체의 직경은 핵산 증폭 시간에 비례하여 증가한다.
나아가, 본 발명은 용매 하에서 핵산 구조체와 금 전구체를 반응시키는 단계(단계 1); 및
환원제를 첨가하여 반응시키는 단계(단계 2);를 포함하는 상기 복합체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 복합체의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 용매 하에서 핵산 구조체와 금 전구체를 반응시키는 단계이다.
여기서, 상기 핵산 구조체는 DNA 또는 RNA의 핵산으로부터 증폭되어 형성되는 것이면 제한 없이 사용 가능하지만, 구체적으로는 핵산 증폭 방법으로 공지된 RCA(Rolling Circle Amplification) 또는 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통해 제조되는 것을 사용할 수 있다.
일례로 상기 RCA는 단일 가닥 주형 DNA와 프라이머를 반응시켜 두 가닥의 DNA를 준비하는 단계(단계 a);
상기 단계 a에서 준비한 두 가닥의 DNA에 DNA 연결효소(ligase)를 반응시켜 원형의 DNA 주형가닥을 제조하는 단계(단계 b); 및
상기 단계 b에서 제조한 원형의 DNA 주형가닥에 dNTP(deoxyribonucleotide tri-phosphate) 또는 rNTP(ribonucleotide tri-phosphate); 및 중합효소(polymerase)를 반응시키는 단계(단계 c);를 포함하여 수행할 수 있다.
여기서, 상기 DNA 연결효소는 종래에 잘 알려진 연결효소라면 제한 없이 사용할 수 있으나 바람직하게는 T4 DNA 연결효소를 사용할 수 있다. 또한, 상기 중합효소는 종래에 잘 알려진 중합효소라면 제한 없이 사용할 수 있으나 바람직하게는 phi29 DNA 중합효소(phi29 DNA polymerase) 또는 T7 RNA 중합효소(T7 RNA polymerase)를 사용할 수 있다.
또한, 상기 금 전구체는 금 이온을 제공할 수 있는 것이면 제한 없이 사용할 수 있으나, 보다 구체적으로는 금의 할로겐 염, 금의 칼코젠 화합물, KAu(CN)2, C5H5AuCl3N 및 [(C6H5)3P]AuCl로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다. 여기서, 상기 금의 할로겐 염으로는 HAuCl4, AuCl, AuCl3, Au4Cl8, KAuCl4, NaAuCl4, NaAuBr4, AuBr3, AuBr, AuF3, AuF5, AuI, AuI3 등을 사용할 수 있고; 금의 칼코젠 화합물로는 Au2O3, Au2S, Au2S3, AuSe, Au2Se3, AuTe2 등을 사용할 수 있다.
나아가, 상기 용매는 특별한 제한은 없으나 인산완충식염수(PBS), N-3-히드록시에틸피페라진-N'-3-에탄올 술폰산(HEPES) 완충식염수(HBS) 및 트리스완충식염수(TBS)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있고, 인산완충식염수(PBS)를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 1의 반응 온도는 특별한 제한은 없으나 10-40℃의 온도일 수 있고, 20-30℃의 온도일 수 있으며, 상온일 수 있다. 나아가, 상기 단계 1의 반응 시간은 특별한 제한은 없으나 6-18시간 동안 반응시키는 것이 바람직하고, 9-15시간 동안 반응시키는 것이 더욱 바람직하고, 10-14시간 동안 반응시키는 것이 더욱더 바람직하고, 12시간 동안 반응시키는 것이 가장 바람직하다. 여기서, 상기 반응시간이 6시간 미만일 경우 용매 내에서 금 전구체가 핵산 구조체의 내·외부적으로 균일하게 위치하기에 충분치 못한 문제가 있고, 상기 반응시간이 18시간 초과일 경우 불필요하게 제조시간이 늘어나는 문제가 있다.
본 발명에 따른 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 환원제를 첨가하여 반응시키는 단계이다.
여기서, 상기 단계 2의 환원제는 금 이온을 환원시킬 수 있는 것이면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으나, 구체적으로는 디메틸아민 보레인(dimethylamine borane), 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride), 폴리알릴아민 하이드로클로라이드(poly(allylamine) hydrochloride), 2-메르캅토숙신산(2-mercaptosuccinic acid) 및 알데하이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있고, 디메틸아민 보레인을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 2의 반응 온도는 특별한 제한은 없으나 10-40℃의 온도일 수 있고, 20-30℃의 온도일 수 있으며, 상온일 수 있다. 나아가, 상기 단계 2의 반응 시간은 특별한 제한은 없으나 1-50분 동안 반응시키는 것이 바람직하고, 1-30분 동안 반응시키는 것이 더욱 바람직하고, 1-10분 동안 반응시키는 것이 더욱더 바람직하고, 5분 동안 반응시키는 것이 가장 바람직하다. 여기서, 상기 반응 시간이 1분 미만일 경우 금 이온이 핵산 구조체에 충분히 환원되어 응집되지 못하는 문제가 있고, 상기 반응 시간이 50분을 초과할 경우 불필요하게 제조시간이 늘어나는 문제가 있다.
나아가, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 암 치료용 약학적 조성물은 암세포의 광열치료를 통해 암을 치료하는 것을 특징으로 하며, 상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 미만성거대B세포림프종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 비호지킨림프종, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
본 발명에 따른 복합체는 생분해성이 우수한 핵산이 증폭하여 형성되는 핵산구조체를 안정제로 사용하고 배출이 용이한 직경이 10nm 이하 금 원자클러스터를 포함하므로, 안정제로서 고분자와 수백 나노미터 입자크기를 갖는 금 나노입자를 포함하는 종래 복합체보다 생체적합성이 우수하고, 복합체의 직경이 30nm 내지 100μm로 조절되어 암조직에 용이하게 침투할 수 있으며, 근적외선을 조사하였을 때 금 이온을 응집시키지 않은 복합체와 비교하여 온도 상승률이 30℃ 이상으로 최고 도달 온도가 60℃까지 나타나 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있어 광열 치료용 약학적 조성물로 용이하게 사용할 수 있는 현저한 효과가 있다. 상기 효과는 하기 실험예를 통해 확인할 수 있다.
먼저, 핵산의 RCA 증폭시간에 따른 광열 효과를 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 10분 동안 RCA 증폭을 수행한 군에 비해 6시간 또는 24시간 동안 RCA 증폭을 수행한 핵산 구조체를 포함하는 복합체는 근적외선 조사 시간에 따른 온도 증가가 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도로 용이하게 확보되는 것으로 나타났다(실험예 1의 도 2 참조).
또한, 광원의 종류에 따른 광열 효과를 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, UV나 LED의 경우 본 발명의 복합체에 응집되어 있는 금 원자클러스터의 광열 효과를 유도하지 못하는 것으로 나타나는 반면, 근적외선을 조사할 경우는 금 원자클러스터의 온도가 약 60℃까지 상승하여 암세포를 용이하게 사멸시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 2의 도 3 참조).
나아가, 핵산 구조체를 구성하는 핵산의 종류에 따른 광열 효과를 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 핵산으로 DNA나 RNA를 사용하는 것과는 무관하게 핵산 구조체는 금 원자클러스터의 광열 효과를 용이하게 유도할 수 있는 것을 확인하였다(실험예 3의 도 4 참조).
또한, 금 원자클러스터의 존재 유무에 따른 광열 효과를 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 금 원자클러스터를 포함하는 본 발명의 복합체는 금 원자클러스터를 포함하지 않는 복합체보다 현저히 우수한 광열 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실험예 4의 도 5 참조).
나아가, 금 원자클러스터의 존재 유무에 따른 암세포 사멸효과를 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 금 원자클러스터를 포함하는 본 발명의 복합체는 금 원자클러스터를 포함하지 않는 복합체보다 현저히 우수한 암세포 사멸효과를 나타내는 것을 확인하였다(실험예 5의 도 6 참조).
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 금-핵산 복합체의 제조 1 (DNA-6시간)
<1-1> 핵산 구조체의 제조
5'에 인산화(phosphorylated)된 단일 가닥 주형 DNA와 프라이머 서열(Macrogen, Republic of Korea)을 0.5μM의 농도가 되도록 혼성화 완충용액(hybridization buffer, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8.0)에 첨가 하였다. 위의 용액을 95℃에서 30℃까지 서서히 온도를 하락시키며 3시간 반응시켜 두 가닥의 단일 DNA를 서열 상보적으로 결합시켰다. 반응물에 T4 DNA ligase (Thermo Scientific, USA)를 125 units/mL이 되도록 가하고, 4℃에서 12시간 동안 반응시켜 직선 DNA 주형 가닥의 빈틈을 연결하여 원형의 주형가닥을 제조하였고, 70℃에서 10분 동안 노출시켜 T4 DNA ligase를 비활성화시켰다. 상기 용액 200μL에 phi29 DNA polymerase (Thermo Scientific), dNTP(Intron Biotechnology, Republic of Korea)를 각각 100 units/mL, 2mM이 되도록 첨가하여 전체 부피가 1mL이 되도록 하였고, 30℃에서 6시간 동안 반응시켜 핵산을 증폭시켰다. 반응 후, 70℃에서 10분 동안 노출시켜 phi29 DNA polymerase를 비활성화시키고, 13000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 남은 dNTP를 제거하였다. 원심분리 후 얻어진 DNA pellet을 증류수에 재분산시키고, 나노드롭 분광 광도계(Nanodrop spectrophotometer, Thermo Scientific)을 통해 농도를 정량하였다.
<1-2> 금-핵산 복합체의 제조
상기 <1-1>에서 제조한 핵산 구조체 12μg과 1.15M의 Gold(III) chloride hydrate (Sigma-Aldrich, USA) 수용액 1μL을 버퍼(1 mM의 마그네슘 아세테이트를 함유하는 인산완충식염수, pH 4.4)에 가하여 전체 부피가 100μL이 되도록 하여 상온에서 12시간 동안 반응시켰다. 위의 반응물에 환원제인 55mM의 디메틸아민 보레인(Sigma-Aldrich) 수용액을 1μL 가하고, 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 이후, 5000 rpm 으로 5분 동안 원심분리하여 남아 있는 금이온 및 디메틸아민 보레인을 제거하여 금-핵산 복합체를 제조하였다.
< 실시예 2> 금-핵산 복합체의 제조 2 (DNA-24시간)
6시간 동안 핵산을 증폭시키는 대신 24시간 동안 핵산을 증폭시켜 핵산 구조체를 제조하는 것을 제외하고, 상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 수행하여 금-핵산 복합체를 제조하였다.
< 실시예 3> 금-핵산 복합체의 제조 3 (RNA-6시간)
dNTP를 사용하는 대신 rNTP(New England Biolabs, UK)를 사용하여 핵산 구조체를 제조하는 것을 제외하고, 상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 수행하여 금-핵산 복합체를 제조하였다.
< 실시예 4> 금-핵산 복합체의 제조 4 (RNA-24시간)
6시간 동안 핵산을 증폭시키는 대신 24시간 동안 핵산을 증폭시켜 핵산 구조체를 제조하고; dNTP를 사용하는 대신 rNTP(New England Biolabs, UK)를 사용하는 것을 제외하고, 상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 수행하여 금-핵산 복합체를 제조하였다.
< 비교예 1> 금-핵산 복합체의 제조 5 (DNA-10분)
6시간 동안 핵산을 증폭시키는 대신 10분 동안 핵산을 증폭시키는 것을 제외하고, 상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 수행하여 금-핵산 복합체를 제조하였다.
< 실험예 1> 롤링- 써클 복제(RCA) 시간에 따른 광열효과 평가
핵산의 RCA 증폭시간에 따른 광열 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
롤링-써클 복제(RCA) 시간을 10분, 6시간 또는 24시간으로 제조한 핵산 구조체를 포함하는 비교예 1, 실시예 1 또는 실시예 2의 금-핵산 복합체에서, 핵산의 농도가 240 ng/μL이 되도록 인산완충식염수에 분산하였다. 시료 50μL에 대하여 광원과의 거리를 0.5 cm로 고정한 후, 총 5분 동안 근적외선인 808 nm의 광원을 조사하였다. 시료의 온도 변화를 열화상 카메라(FLIR T420, FLIR Systems Inc., Sweden)를 사용하여 1분 간격으로 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 10분 동안 RCA 증폭을 수행한 비교예 1은 최종 온도가 34.4 ±0.6℃인 반면, 6시간 또는 24시간 동안 RCA 증폭을 수행한 실시예 1, 실시예 2는 각각 최종 온도가 56.6 ±2.8 ℃, 60.7 ±0.6 ℃인 것으로 나타났다. 광열 치료를 통해 암세포를 사멸시키기 위해서 요구되는 최소한의 온도가 42℃인 점을 고려할 때, 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 2의 금-핵산 복합체는 광열을 통해 암세포를 용이하게 사멸시킬 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 2> 광원 종류에 따른 광열효과 평가
광원의 종류에 따른 광열 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<2-1> UV 조사
실시예 3에서 제조한 금-핵산 복합체를 핵산의 농도가 240 ng/uL가 되도록 인산완충식염수 50μL에 분산하였다. 1.5 mL Eppendorf Tube (EP tube)에 상기 50μL의 시료를 옮기고 365 nm 파장의 UV 광 (VL-4LC, Vilber Lourmat, France)을 5분 동안 조사하였다.
<2-2> LED 조사
실시예 3에서 제조한 금-핵산 복합체를 핵산의 농도가 240 ng/uL가 되도록 인산완충식염수 50μL에 분산하였다. 1.5 mL Eppendorf Tube (EP tube)에 상기 50μL의 시료를 옮기고 LED 광원 (LD-E650H05, Koolason, China)과의 거리가 0.5 cm에서 250mW의 세기 650nm의 LED 광원을 5분 동안 조사하였다.
<2-3> 근적외선 조사
실시예 3에서 제조한 금-핵산 복합체를 핵산의 농도가 240 ng/uL가 되도록 인산완충식염수 50μL에 분산하였다. 1.5 mL Eppendorf Tube (EP tube)에 상기 50μL의 시료를 옮기고 0.5 cm 거리에서 근적외선 광원인 808nm 레이저 (PSU-FC, ChangChun New Industries Optoelectronics Tech. Co., LTD, China)를 1.5W 세기로 5분 동안 조사하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, UV나 LED의 경우 본 발명의 복합체에 응집되어 있는 금 원자클러스터의 광열 효과를 유도하지 못하여 확보되는 온도가 26.6 ±0.6 ℃, 26.8 ±0.8℃에 불과하였지만, 근적외선을 조사할 경우는 금 원자클러스터의 온도가 약 60℃까지 상승하여 암세포를 용이하게 사멸시킬 수 있는 것으로 나타났다. 이는, 금 원자클러스터가 봉입된 복합체는 근적외선 조사에 의해서만 광열 효과를 나타내는 것을 의미한다.
< 실험예 3> 핵산 종류에 따른 광열효과 평가
핵산 구조체를 구성하는 핵산의 종류에 따른 광열 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
핵산 구조체가 DNA로 구성되어 있는 실시예 1에서 제조한 금-핵산 복합체와, 핵산 구조체가 RNA로 구성되어 있는 실시예 3에서 제조한 금-핵산 복합체를 핵산의 농도가 240 ng/uL가 되도록 인산완충식염수 50μL에 분산하였다. 1.5 mL Eppendorf Tube (EP tube)에 상기 50μL의 시료를 옮기고 0.5 cm 거리에서 근적외선 광원인 808nm 레이저 (PSU-FC, ChangChun New Industries Optoelectronics Tech. Co., LTD, China)를 1.5W 세기로 5분 동안 조사하였다. 대조군으로는 금-핵산 복합체를 첨가하지 않은 인산완충식염수에 근적외선 광원을 조사하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1과 실시예 3의 경우 근적외선 조사 후 5분 뒤의 최종 온도가 각각 56.6 ±2.8℃, 58.6 ±3.4℃로 측정되었으며 이 두 값은 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않는 결과였다. 따라서, 금-핵산 복합체는 핵산의 종류에 상관없이 암세포를 용이하게 사멸시킬 수 있는 광열 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
< 실험예 4> 암세포에서 금-핵산 복합체의 광열효과 평가
암세포에서 금-핵산 복합체의 광열효과가 발생하는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
사람의 상피암 세포인 KB 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하여 10% 우태아 혈청 w/v (HyClone laboratories Inc, USA)와 100 unit/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(GenDepot Inc., USA)을 포함하는 RPMI-1640 (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다. 상기 같은 조건으로 배양된 KB 세포주는 웰 당 2x105개로 12 웰 플레이트에 분주되었다. 실시예 2에서 제조한 금-핵산 복합체의 핵산 농도를 기준으로 하여 최종 농도가 24 ng/μL이 되도록 처리한 후, 37℃의 CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 세포를 수확하여 배지 50μL에 재분산한 후, 808nm 의 근적외선을 5분간 조사하였다. 온도 변화는 열화상 카메라(FLIR T420, FLIR Systems Inc., Sweden)를 사용하여 측정하였다. 대조군으로는 금-핵산 복합체를 처리하지 않은 군과, 실시예 2에서 제조한 금-핵산 복합체에서 금을 포함하지 않는 핵산구조체만을 세포에 처리한 군으로 설정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 금-핵산 복합체를 처리하지 않은 군은 온도가 30.9 ±1.9℃, 핵산구조체만을 세포에 처리한 군은 온도가 33.6 ±1.5℃로 측정된 반면, 실시예 2의 금-핵산 복합체를 처리한 군은 최종 온도가 51.0 ±2.5℃ 까지 상승하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 금-핵산 복합체의 근적외선 조사에 따른 광열 효과는 암세포에 처리된 후에도 유지되며, 이에 암세포를 용이하게 사멸시킬 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 5> 금-핵산 복합체의 광열에 따른 암세포 사멸효과 평가
암세포에서 금-핵산 복합체의 광열에 따른 암세포 사멸이 용이하게 유도되는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
사람의 상피암 세포인 KB 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하여 10% 우태아 혈청 w/v (HyClone laboratories Inc, USA)와 100 unit/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(GenDepot Inc., USA)을 포함하는 RPMI-1640 (Welgene, Korea) 배지에서 배양하였다. 위와 같은 조건으로 배양된 KB 세포주는 웰 당 2x105개로 12 웰 플레이트에 분주하였다. 실시예 4에서 제조한 금-핵산 복합체의 핵산 농도를 기준으로 하여 최종 농도가 24 ng/μL이 되도록 처리한 후, 37℃의 CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 세포를 수확하였고, 세포를 1000 rpm에서 3분간의 원심분리를 통해 침전시켰다. 상층액을 제거하고 배지 50μL를 가한 후, 808nm 의 근적외선을 5분간 조사하였다. 세포를 다시 웰 플레이트에 분주하여 37℃의 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT, Sigma, USA)를 배지의 10% 되도록 가하고, 2시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더(ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, Mannnedorf, Switzerland)를 이용하여 570nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 금-핵산 복합체를 처리하지 않은 군과, 실시예 4에서 제조한 금-핵산 복합체에서 금을 포함하지 않는 핵산구조체만을 세포에 처리한 군으로 설정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 금을 포함하지 않는 핵산구조체만을 세포에 처리한 군은 미처리군 대비 암세포의 생존율이 104.9 ±8.8 %인 것으로 측정되었다. 반면, 실시예 4에서 제조한 금-핵산 복합체를 처리한 군의 암세포 생존율은 47.5 ±2.6 %에 불과한 것으로 나타났다.
이로부터, 본 발명에 따른 복합체는 생체적합성이 우수하고, 암조직에 용이하게 침투할 수 있으며, 근적외선을 조사하였을 때 금 이온을 응집시키지 않은 복합체와 비교하여 온도 상승률이 30℃ 이상으로 최고 도달 온도가 60℃까지 나타나 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있어 광열 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (13)

  1. 금 원자클러스터 및 핵산 구조체를 포함하되,
    상기 금 원자클러스터는 핵산 구조체에 응집되어 있는 구조의 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금 원자클러스터는 근적외선 영역의 빛을 흡수하여 발열하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 금 원자클러스터의 직경은 0.3 내지 10nm 이하인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 복합체는 직경이 30nm 내지 100μm인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 복합체는,
    용매 하에서 핵산 구조체와 금 전구체를 반응시키는 단계(단계 1); 및
    환원제를 첨가하여 반응시키는 단계(단계 2);를 포함하는 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 핵산 구조체는 핵산에 dNTP(deoxyribonucleotide tri-phosphate) 또는 rNTP(ribonucleotide tri-phosphate); 및 중합효소(polymerase)를 반응시키는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 단계 1의 금 전구체는 금의 할로겐 염, 금의 칼코젠 화합물, KAu(CN)2, C5H5AuCl3N 및 [(C6H5)3P]AuCl로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 단계 1의 용매는 인산완충식염수(PBS), N-3-히드록시에틸피페라진-N'-3-에탄올 술폰산(HEPES) 완충식염수(HBS) 및 트리스완충식염수(TBS)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 단계 2의 환원제는 디메틸아민 보레인(dimethylamine borane), 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride), 폴리알릴아민 하이드로클로라이드(poly(allylamine) hydrochloride), 2-메르캅토숙신산(2-mercaptosuccinic acid) 및 알데하이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 중합효소(polymerase)는 phi29 DNA 중합효소(phi29 DNA polymerase) 또는 T7 RNA 중합효소(T7 RNA polymerase)인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  11. 금 원자클러스터 및 핵산 구조체를 포함하되,
    상기 금 원자클러스터는 핵산 구조체에 응집되어 있는 구조의 복합체를 포함하는 광열 치료용 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 암 치료용 약학적 조성물은 암세포의 광열치료를 통해 암을 치료하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 미만성거대B세포림프종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 비호지킨림프종, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
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