JP2014511178A - 核酸の定量的かつ高度に多重化された検出 - Google Patents
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Abstract
本発明は、多重化単一チャンバー反応におけるサンプル中の標的核酸を検出及び定量化するための方法を提供する。高性能アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように最適化されたチャンバーを導入する消耗品、及びその使用方法が提供される。本方法を実行するために消耗品を使用するように構成されたデバイス及びシステムは、本発明の特徴である。
Description
連邦支援の研究開発の下で成された発明に対する権利に関する陳述
本発明は、米国、国土安全保障省助成、契約番号HSHQDC−10−C−00053の支持により成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、2011年2月18日に出願された米国特許仮出願第61/463,580号、及び2011年11月17日に出願された米国特許仮出願第61/561,198号に対する優先権を請求し、その全開示は、全ての目的のためにそれらの全体において、本明細書中に参照により組み込まれている。
本出願は、2011年2月18日に出願された米国特許仮出願第61/463,580号、及び2011年11月17日に出願された米国特許仮出願第61/561,198号に対する優先権を請求し、その全開示は、全ての目的のためにそれらの全体において、本明細書中に参照により組み込まれている。
本発明は、リアルタイムDNA増幅、検出及び定量化、並びにアレイを含む関連する消耗品(consumables)、デバイス、及びシステムの分野にある。
リアルタイムPCRは、生物試料中の注目の核酸を検出するために日常的に使われている。リアルタイムPCRの検討については、例えば、M TevfikDorak(編)(2006)Real−time PCR(改良法) Taylor & Francis,第1編ISBN−10:041537734X ISBN−13:978−0415377348、及びLogan等(編)(2009)Real−Time PCR:Current Technology and Applications,Caister Academic Press,第1編ISBN−10:1904455395,ISBN−13:978〜1904455394を参照する。さらなる詳細については、例えばGelfand等“Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity of A Nucleic Acid Polymerase”米国特許第5,210,015号;Leone等(1995)“Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real−time detection of RNA.” Nucleic Acids Res. 26:2150〜2155;並びにTyagi及びKramer(1996)“Molecular beacons:probes that fluoresce upon hybridization”Nature Biotechnology 14:303〜308も参照する。伝統的に、単一反応容器(例えばマルチウェルプレートのウェル)中のサンプルごとに2個以上の標的核酸を検出するために使用される単一ウェル多重化は、それぞれの単位複製配列に特異的なTAQMAN(商標)または分子指標プローブ等の自己消光PCRプローブを用いて達成される。溶液中の単位複製配列への結合において、またはPCRの間のプローブの分解において、プローブは消光せずに、検出可能なシグナルを生み出す。プローブは、異なる波長の蛍光色素分子により標識され、単一「ワンポット」反応において約5個までの標的の多重化能を可能にする。反応ごとに約6個以上のプローブは、実際のスペクトル範囲及び標識放出限界のために達成するのが困難である。これは単一反応の多重化を厳しく制限し、順にどのくらい多くの標的がサンプルごとにスクリーニングされ得るかを大いに制限し、そして注目の多重の標的の検出において試薬費用及び機器の複雑性をつり上げる。
核酸アレイは、増幅産物の検出を多重化する他の手法を表す。最も典型的には、増幅反応は、サンプル上で行われ、且つ単位複製配列は、核酸アレイ上で単独で検出される。例えば、Sorge “Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure”米国特許第6,350,580号は、増幅混合物の外のプローブを精製することにより、増幅へと放出され、そしてその後にそれを検出するプローブの捕捉を提案する。単位複製配列を作製し、且つ検出するためのこの多重ステップアプローチは、実現不可能な増幅混合物のリアルタイム分析を作製する。
捕捉核酸の存在中で反応物を増幅させる異なる手法もまた提案されてきた。例えば、Kleiber等“Integrated Method and System for Amplifying And Detecting Nucleic Acids”米国特許第6,270,965号は、蛍光を誘導した消失を介する単位複製配列の検出を提案する。同様にAlexandre等“Identification and Quantification of a Plurality of Biological (Micro) Organisms or Their Components”米国特許第7,829,313号は、アレイ上の単位複製配列の検出を提案する。他の例では、標的ポリヌクレオチドは、増幅の結果として生み出されるプローブフラグメントを検出すること、例えば電極へ結合し、その後に電気化学的な検出をすることにより検出される。例えばAivazachvilli等“Detection of Nucleic Acid Amplification”米国特許出願公開第2007/0099211号;Aivazachvilli等“Systems and Methods for Detecting Nucleic Acids”米国特許出願公開第2008/0193940、及びScaboo等“Methods And Systems for Detecting Nucleic Acids”米国特許出願公開第2008/0241838を参照する。
これらの方法は、全て多重標的核酸検出のためのそれらの使用を制限する実際的制限に悩まされている。例えばKleiber(米国特許第6270,965号)は、アレイ表面での単位複製配列の蛍光を検出するために、蛍光を誘導した消失に頼り、そして複雑且つ高価な光学及びアレイを要求する。Alexandre(7,829,313)は、アレイ上の単位複製配列の検出を提案し;Kleiberによれば、これは、それぞれのアレイが、それぞれの単位複製配列を検出するように特注設計されていなければならないので、有意にアレイのコストが上がる。Alexandreによれば、実際には、アレイ上、特に単位複製配列が比較的に大きいところの異種単位複製配列について同様のハイブリダイゼーション反応速度論を達成することは、困難であり得る。さらに本技術は、さらに高レベルのシグナルバックグラウンド、またはin situ熱循環を介して安定のままである高レベルのアレイも含んで成る付随の液相が存在する場合に、アレイ上のシグナルをどのように検出するかについて、殆ど助言を提供しない。
本発明は、当業界においてこれら及び他の問題を克服する。本発明のより完全な理解は、以下の完全な検討において得られるだろう。
発明の概要
本発明は、例えば生物サンプル中のウィルス、細菌、プラスモディウム、真菌、または他の病原体を検出するために、注目の核酸の高度に多重化された検出を可能にする方法、並びに関連するデバイス、システム及び消耗品を提供する。消耗品は、チャンバーの内面上に高性能熱安定核酸検出アレイを有するシグナル最適化チャンバーを含んで成る。アレイは、約100個以上までの異なる万能標識プローブを検出するために構成される。方法は、チャンバー中で行われている増幅反応により、注目の核酸の一部分の増幅の間に、(“プローブフラグメント”としての)標識万能プローブを作り出す。万能プローブは、数サイクルの増幅後、及びその後の選定された増幅サイクル後にアレイにハイブリダイズし、リアルタイムでのサンプル中の注目の1つ以上の核酸の検出及び定量化の両方を可能にする。
本発明は、例えば生物サンプル中のウィルス、細菌、プラスモディウム、真菌、または他の病原体を検出するために、注目の核酸の高度に多重化された検出を可能にする方法、並びに関連するデバイス、システム及び消耗品を提供する。消耗品は、チャンバーの内面上に高性能熱安定核酸検出アレイを有するシグナル最適化チャンバーを含んで成る。アレイは、約100個以上までの異なる万能標識プローブを検出するために構成される。方法は、チャンバー中で行われている増幅反応により、注目の核酸の一部分の増幅の間に、(“プローブフラグメント”としての)標識万能プローブを作り出す。万能プローブは、数サイクルの増幅後、及びその後の選定された増幅サイクル後にアレイにハイブリダイズし、リアルタイムでのサンプル中の注目の1つ以上の核酸の検出及び定量化の両方を可能にする。
したがって、第一の態様では、標的核酸を検出するための方法が提供される。これは、少なくとも1つのチャンバーの表面上に少なくとも1つの高性能核酸検出アレイを有する検出チャンバーを提供することを含む。高性能アレイは、典型的にチャンバーにおける反応によって生み出される検出可能なプローブフラグメントの増加した捕捉率を可能にする、非比率制限数(non-rate limiting number)の捕捉核酸(capture nucleic acids)を有し、且つ捕捉核酸は、アレイ効率も増加させる比較的に小さなプローブ核酸を捕捉するように構成される。プローブのアレイへの結合の検出は、好適には例えば未結合の遊離プローブから生じるアレイに近位のバックグラウンドシグナルレベルを減らすように選定され、または構成された条件下で実施される。例えば特定の実施形態では、チャンバー自体は、例えばバックグラウンドを減らすようにチャンバーを成形することにより(例えばアレイに近位が比較的に薄いチャンバー、例えば典型的に約500μmであるか、またはアレイ上方がより浅いチャンバーを作ることにより)、アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成される。またより薄いチャンバーは、厚みのあるチャンバーよりも少ない熱質量を有し、そしてより高速且つより効率的な温度サイクルであり得る。システム及び方法がバックグラウンドシグナルのレベルを減らすように構成されている他の方法は、以下により詳細に記載される。
検出されるべき標的核酸の1つ以上のコピーを有するサンプルは、検出チャンバー中に充填される。増幅プライマー及び標識プローブは、1つ以上の標的核酸のコピーにハイブリダイズする。1つ以上の標的核酸のコピーの少なくとも一部は、増幅プライマー依存性増幅反応において増幅される。増幅反応は、例えば増幅酵素のヌクレアーゼ活性のために、標識プローブの開裂をもたらす。これは、アレイにより検出される標識プローブフラグメントの放出をもたらす。標識プローブフラグメントは、(典型的に数サイクルの増幅で処理され、チャンバー中に放出された量のプローブフラグメントが増幅された後に)高性能アレイにハイブリダイズする。標識プローブフラグメントのアレイへの結合により生み出される標識シグナルがその後に検出されることにより、標的核酸が検出される。
検出チャンバーの正確な構成は、変えられ得る。構成は、アレイに近位のチャンバー中のシグナルバックグラウンドを減らすように選定される。一般に、チャンバー中で少なくとも1%、及びしばしば約5%以上のシグナルは、アレイの領域においてアレイで(例えば約6%、8%、またはさらに10%以上)濃縮される。99%以下の総シグナルのバックグラウンドは、より低いレベルがしばしば所望されるにもかかわらず、システムにより正規化(normalize)され得る。本明細書において記載される典型的な実施形態では、95%以下の総バックグラウンドのレベルは、アレイに近位のチャンバーの構成を最適化することにより達成される。この構成最適化は、例えばアレイの上方のチャンバーの深さを最小限に保つことにより達成される。典型的な実施形態では、チャンバーは、深さにおいて、またはアレイに近位の他の次元において約1mm未満であり、より典型的にはアレイに近位の少なくとも1つの次元において約500μm以下、好適には約250μm以下、例えば約10μm〜約200μmの間であり、及びいくつかの実施形態では、チャンバーは、アレイに近位の次元において約150μmである。本明細書における一例では、チャンバーは、アレイの上方で約142μmの深さである。本明細書のおける他の例では、チャンバーは、約100μmの深さである。関連のあるチャンバー次元は、検出システムのシグナル検出路、(例えば、シグナルがアレイ上に光を通すことにより作り出されるところ、いくつかの光がアレイを通り、そしてアレイ上方の流体中を抜け出すところ)次第であり、関連のある次元は、アレイ上方のチャンバーの深さである。検出されるバックグランドシグナルのレベルを減らすことに加えて、チャンバー厚を減らすこともバックグラウンドノイズ構成要素の寄与、例えば反応流体からのアレイスポットシグナル及びバックグラウンドシグナルの特異的検出とは関連しない検出器応答を減らすことの利益を有する。特に1つの主なノイズ寄与因子は、一般に検出されるシグナルの総量の平方根で増加し、順に反応チャンバーの厚さに対応する、使用される検出器からのショットノイズである。したがって反応チャンバーの減少した厚さを提供することにより、1つではバックグラウンドノイズが減らされ、そして結果としてシステム全体のシグナル対バックグラウンドノイズ比率(signal to background noise ratio)(SNR)が増える。他の潜在的ノイズ寄与因子は、過剰の光の検出、例えばフィルターなしの励起光、意図的でない周辺光、散在性蛍光、システム構成成分の自己蛍光等を含む。多くのこれらのノイズ寄与因子は、適切な光学フィルター(例えば過剰な励起光を取り除き、または減少させる)、検出器での周囲光を減少させ、または妨げる封じ込まれた光学系の使用を介し、またアレイスポットサイズの構成を通して、及び検出器でのシグナルクロストークを減らす、または取り除くために間隔を空けること等の従来からの手法を通して軽減され得る。特に好適な態様では、本発明のアッセイ方法及びシステムのためのSNRは、典型的に2.5超、好適には3超、4超、5超、10超、及びいくつかの場合では20以上である。
またバックグラウンドシグナルを減らすための本発明のシステム及び方法を構成するための代替または追加の手法は、本発明のデバイス及び方法との結合において採用され得る。例えば本発明のデバイス及びシステムは、全内部反射蛍光顕微鏡検査法(total internal reflection fluorescence microscopy)(“TIRF”)構成を用いて、励起光が内部全体に反射されるように捕捉アレイの下にある基板中に向かう場合に、励起照明を捕捉アレイに提供するように構成され得る(M.Tokunaga等、Biochem.and Biophys.Res.Comm.235,47(1997)及びP.Ambrose,Cytometry,36,244(1999)を参照)。これにもかかわらず、表面から離れて指数関数的に崩壊し、残りの溶液中で、蛍光色素分子を励起させずに、表面に例えば100nmの深さで隣接して効果的な照明をもたらすアレイの基板−流体境界面部分で、エバネッセント波が作り出される。
また他の代替または追加の手法では、本発明の分析方法において採用される反応物は、実際のプローブ/アレイ結合シグナルと比較して、バックグラウンドシグナルを減らすように構成される。例えば、バックグラウンドシグナルは、捕捉アレイプローブ及び標識フラグメントの両方において、例えばFRET構成物において、協力的な蛍光色素分子の使用を通して減らされ得る。特に第一の励起スペクトル及び第一の発光スペクトルを有する供与体蛍光色素分子は、1つの捕捉プローブまたは標識プローブフラグメントと結合され得る。供与体の発光スペクトルと重複し、且つ供与体の励起スペクトルとは異なる励起スペクトルを有する受容体蛍光色素分子は、他のプローブと結合される。捕捉プローブ及び標識プローブフラグメントがハイブリダイズする場合、供与体及び受容体は、エネルギーを伝達するのに十分な隣接にし、受容体蛍光色素分子の発光スペクトルに相当する固有の蛍光シグナルを産する。供与体の励起スペクトルの内部でのみ励起し、且つ供与体の発光スペクトルをフィルターするために光学システムを構成することにより、供与体からのエネルギー伝達シグナルから生じるシグナルを、ハイブリダイゼーションにおいて選択的に検出することができる。多種多様なFRET標識対は、以前に記載されている(例えば米国特許第6,008,373号、Waggoner、及び米国特許第7,449,298号、Lee等を参照する)。十分に理解されているように、本発明において、結合した標識プローブフラグメントから検出されるシグナルと比較して、反応溶液中の未結合の無傷の標識プローブからのシグナルの寄与、またはバックグラウンドシグナルを減らすための多くの方法、例えば検出器の焦点面の中のシグナルを濃縮するために反応チャンバーを構成すること、溶液中で未結合の場合と比べて、アレイに結合している場合には異なる発光スペクトル、または開裂プローブフラグメント中で分離した場合と比べて、同一の無傷のプローブが存在する場合には蛍光を減らす自己消光プローブのいずれかが存在する相互作用的な標識化技術を採用することを含む方法が採用され得る。
上述の通り、アレイは、典型的に標識プローブフラグメントにハイブリダイズする非比率制限数の捕捉核酸を含む。これは、増幅反応が、増幅の間に、反応混合物中にプローブフラグメントを結合させるために利用できるアレイ上の部位の数(例えば接近可能な相補的な捕捉核酸)を満たしていないプローブフラグメント濃度をもたらすいくらかのプローブフラグメントを生み出すことを意味する。言い換えると、アレイ上の結合部位の数は、増幅反応において生み出されるプローブフラグメントの濃度で満たされるものであるように過剰に維持され、且つ好適には、十分に過剰に維持される。アレイ上の部位の数に比率制限がないために、溶液中のバックグラウンドプローブフラグメントに対するアレイ上のプローブフラグメントの比率は、最適化される。典型的なアレイ密度は、約350fmol/cm2以上、例えば約2,000fmol/cm2以上、2,500fmol/cm2以上、3,000fmol/cm2以上、4,000fmol/cm2以上、4,500fmol/cm2以上、または5,000fmol/cm2以上の間である。いくつかの実施形態では、アレイ上でプローブを結合させる部位の数は、少なくとも1Xであり、そのサイトの数は、増幅反応の間に生み出されるプローブフラグメントの濃度により満たされ、且つ場合により5X、10X、50X以上である。比率は、増幅サイクルの数、及び生み出されるプローブの量により変わるだろう。アレイの効率は、捕捉されるべきプローブフラグメントの長さの機能でもある。プローブは、ハイブリダイゼーションの間に所定のTmで結合するために十分に長くなければならないが、より短いフラグメントは、典型的により効率的なハイブリダイゼーションを示す。アレイにより捕捉される典型的なプローブフラグメントは、約50個以下のヌクレオチド長であり;アレイは、対応する相補的捕捉核酸配列を有する部位を含んで成る(捕捉核酸は、例えば表面上方の相補的部位の間にスペースを置くための追加の配列、例えば表面効果を減らすための追加の配列も場合により含み得る)。より典型的には、プローブ及び捕捉配列は、約40個以下のヌクレオチド長、例えば約30個、約20個、または約15個以下のヌクレオチド長さである。
いくつかの場合では、所定の分析において使用される捕捉アレイプローブ、及び相補的標識プローブフラグメントは、それらが全てのアレイのメンバーに渡り、狭い範囲のTmを提供するように選定される。特に最適且つ一貫した捕捉アレイへのハイブリダイゼーションを確実にするために、所定のアレイにおける捕捉プローブは、それぞれアレイの全ての他のメンバーについて約10℃以内、及び好適にはアレイ中の全ての他のプローブについて約7℃、5℃、または3℃以内のTmを有するだろう。かかる狭いTmの範囲は、一貫したハイブリダイゼーションを可能にし、且つアレイの全てのメンバーに渡りシグナル発生をもたらす。
典型的な実施形態では、ハイブリダイゼーション温度は、捕捉核酸のためのプローブフラグメントのTmがプローブの分子内Tm未満であり得るように(例えばプローブがバックグラウンドを減らすためのクエンチャーを含んで成る場合)、及び/または標的核酸のためのプローブのTm未満であり得るように、増幅反応の温度未満である。すなわち、典型的な熱循環の実施形態では、増幅反応は、ハイブリダイゼーションステップよりも高い温度で行われ;したがってプローブは、典型的にプローブフラグメントがアレイのために有するよりも、標的核酸のためにより高いTmを有するだろう。標識プローブは、典型的に標的核酸に相補的でない第一の直交フラップ(orthogonal flap)を含んで成り;このフラップは、標識プロ―ブから開裂し、標識プローブフラグメントを生み出す。標識プローブは、場合により例えばクエンチャー部分と結合された、第一のフラップに少なくとも部分的に相補的である(例えば第一のフラップ上の標識の隣接度に基づいた消光を提供するための)第二の直交フラップを含んで成る。バックグラウンドは、第一のフラップがアレイに結合するために有するTmよりも、第二のフラップが第一のフラップに結合するために有するTmが高い場合に減らされる。かかる構成では、伸長反応は、第一の温度、すなわち標的核酸のための無傷の(intact)プローブのTmを下回るが、無傷のプローブの分子内Tm、及びアレイ上の捕捉プローブのプローブフラグメントのTmの両方を上回る温度で生じる。伸長に伴い、反応温度が低くなるので、プローブの分子内Tmを下回り、プローブの二次構造の形成を可能にし、そして蛍光色素分子の消光をもたらす。さらに捕捉プローブに対するプローブフラグメントのTmを下回るまで冷却することは、プローブフラグメントのアレイへのハイブリダイゼーション、及びその関連の蛍光色素分子の検出を可能にする。無傷のプローブは、予めその二次構造に形成されているため、あまり捕捉プローブに結合せず、且つ消光するので、無傷のプローブの意図されない捕捉、及び溶液中の無傷のプローブにおいて存在する蛍光色素分子からのバックグラウンドシグナルの両方を減らし、またはそれは捕捉プローブアレイに結合し得る。特定の態様において、クエンチャーは、本発明の無傷のプローブに作用されるが、特定の実施形態では、驚くべきことに、クエンチャーがプローブ上に必要とされないことが分かった。プローブからクエンチャーを除くことによりバックグラウンドが増加するとしても、最適化されたチャンバー設計及び高性能アレイにより、バックグラウンドからのアレイシグナルの識別が達成できるからである。
他の実施形態では、標識プローブフラグメント及びその相補的な捕捉核酸は、伸長反応の温度よりも高いTm、例えば10度以上を有するように設計または選定される。したがって、伸長反応が例えば55℃〜60℃の間で行われる場合、標識プローブフラグメント及び捕捉核酸のTmは、典型的に例えば71℃であるだろう。かかる場合において、アレイ上の捕捉核酸への標識プローブフラグメントのハイブリダイゼーションは、伸長反応と同一の温度で起こるので、アレイにハイブリダイズし、そして得られるシグナルを検出するために、温度をさらに低くする必要性がなくなる。結果として、3段階の温度プロファイルよりもむしろ2段階のプロファイルが使用され得る。
無傷の標識プローブにおいて、標的配列に結合するプローブ部分に対して直交である標識プローブフラグメントの方向性は、変えられ得る。特に放出標識プローブフラグメントは、プローブの標的特異的部分から開裂した末端が、捕捉プローブがアレイ表面につながれた点に近位または遠位のいずれかである場合の方向性において、アレイ上で捕捉プローブにハイブリダイズし得る。いくつかの場合では、例えば、任意の無傷のプローブは、アレイの表面に向かうプローブの標的特異的部分を提示する方向性において、捕捉プローブに結合するのみであるということを確実にすることにより、結果としてそれが結合することによる潜在的な表面干渉をうまく利用し、さらに無傷のプローブのアレイによる所望されない捕捉の可能性を減らし得る。かかる方法は、特にアレイ上の固体表面の場合、例えばシリカ基板等において有用である。
サンプルは、消耗品の正確な構成に応じて、任意の多様なメカニズムによりチャンバー中に充填され得る。1つの都合のよい適用では、サンプルは、チャンバーと動作可能に連結された(in operable communication with the chamber)少なくとも1つのポートまたは流体チャネルを通して充填される。例えば、ポートは、消耗品の頂部表面において、チャンバーに導くポートと共に組み立てられ得る。これは、例えばピペットまたは他の流体送達デバイスを介する簡易化充填を提供する。或いは、流体またはマイクロ流体チャネル、キャピラリー等は、サンプル送達のために使用され得る。
方法は、例えばリアルタイムでのサンプル中の注目の核酸(a nucleic acid of interest)の検出、及び/または核酸の定量化のために使用され得る。したがって一つの態様では、標的核酸は、シグナルの検出に先立ち、複数の増幅サイクルにおいて、シグナル検出後にさらに増幅される標的核酸部分により、すなわち標識プローブの追加のコピーの存在中で場合により増幅される。得られた放出標識プローブフラグメントは、その後にアレイにハイブリダイズし、そしてサンプル中に存在する標的核酸の存在及び/または量に相関して検出されるシグナル強度により検出される。典型的にサンプルは、増幅により放出されるプローブフラグメントの数を増やすことによりシグナルレベルを増やすために、最初の検出前に2回以上のサイクルで増幅される。例えば標的核酸は、アレイからのシグナルの検出に先立ち、少なくとも例えば2、3、4、5回以上の増幅サイクルで場合により増幅され得る。
標識プローブは、量子ドット等の他の標識も使用され得るが、典型的に蛍光または発光標識を含んで成る。1つの好適な実施形態では、標識は蛍光染料である。プローブフラグメントにより生み出されるシグナルは、典型的に光学シグナルである。標識プローブは、場合により標識及び標識クエンチャー(label quencher)を含んで成り;標識プローブの開裂は、標識とクエンチャーの分離をもたらすので、標識は消光されない。しかしながら上記の通り、クエンチャーは、本発明の実施において要求されない。
シグナルは、典型的にプローブまたはプローブフラグメント上の光学標識に対応する1つ以上の光学シグナル波長を検出することにより検出される。アレイ上のプローブフラグメントの結合位置が、異なるプローブ間を識別するために使用され得るので、多重化増幅反応(2つ以上の標的がサンプル中に存在する場合に、多重標的核酸を増幅するために設計された増幅反応)においてプローブを区別するために、異なるプローブ上で異なる標識を使用することは必要とされない。しかしながら、多重プローブ標識は、多重化能を増強するために使用され得る。多重プローブが使用される場合、シグナルを検出することは、複数の異なる標識(例えば異なるプローブ上の異なる蛍光染料部分)により作り出される複数のシグナルから複数の光学シグナル波長を検出することを含み得る。
アレイに結合するプローブフラグメントに結合した標識基、例えば標識プローブフラグメントに関して一般に記載されているが、予め標識されたプローブの使用を必要としない他の検出スキームがなされ得ることが理解される。例えばいくつかの実施形態では、インターカレーティング染料(intercalating dye)が使用され得る。インターカレーティング染料は通常、二本鎖核酸への取り込まれ時、またはインターカレーティング時に、検出可能なシグナル事象を提供する。本発明において、アレイ上の相補的プローブへの開裂プローブフラグメントのハイブリダイゼーションは、インターカレーティング染料を取り込めるアレイ表面で二重らせんの二本鎖を作り出し、そしてそのハイブリダイゼーションの特有のシグナル指標的なものを提供する。インターカレーティング染料は、当業界において周知であり、且つ例えば、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれている、Gudnason等、Nucleic Acids Research(2007)、Vol.35、No.19、el27において記載されたものを含む。同様に光学シグナル検出方法は、特に好適であるが、プローブ構成及びアッセイ方法は、一般に非光学標識及び/または検出方法を用いて、例えば電気化学的検出方法(例えばChemFETS、ISFETS、等)を用いて、場合により電気化学的標識基(例えば大きく荷電した基を有する)との結合においても実施されて、検出器表面での、または検出器表面近くでの、アレイプローブへのプローブフラグメントのハイブリダイゼーションの検出を増幅し得る。
ローカルバックグラウンドは、アレイの1つ以上の領域について、前記バックグラウンドを補正することにより正規化されているシグナル強度測定により検出され得る。典型的に、正規化されたシグナル強度は、総シグナルの約10%未満、例えば総シグナルの約1〜約10%の間である。実施形態の一例分類では、正規化されたシグナル強度は、総シグナルの約4〜約7%の間である。典型的に、およそ1%以上のシグナルがアレイに局部集中する場合、例えば約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、またはそれを上回るシグナルがチャンバーのある領域のアレイに局在化する場合、バックグラウンドからのアレイシグナルを識別することが可能である。バックグラウンドに対してより低いレベルのシグナルでさえ識別することが可能であるが、これは、一般的に好適ではない。方法は、アレイ捕捉核酸スポッティングにおける変動性を補正することにより(例えばスポットサイズ、スポット密度、または両方を補正することにより)、またはアレイの異なる領域の一様でない視野を補正することにより、シグナル強度を正規化することをさらに含み得る。
サンプル中の多重標的核酸を同時に検出するための能力は、本発明の好適な態様を表す。サンプルは、サンプルごとに2つ以上の標的を検出することが可能な複数の捕捉核酸タイプを含んで成るアレイと共に1つまたは複数の標的核酸を有し得る。捕捉核酸タイプは、アレイ上で空間的に分離され、(上記の通り、多重標識が使用され得るにもかかわらず)多重標識の使用の必要性を取り除く。多重化手法では、それぞれ多様な核酸標的に特異的である複数の増幅プローブは、1つ以上の標的核酸を含み得るサンプルと共にインキュベートされる。例えば約5〜約100個以上の捕捉核酸タイプが存在し得る。それぞれ検出されるべき潜在的な標的は、多様なプローブを利用するだろうし、同様に例えばそれぞれ注目の潜在的標的に特異的である約5〜約100以上の標識プローブタイプが増幅反応において場合により存在する。アレイは、対応する捕捉核酸、例えば約5〜約100以上の捕捉核酸タイプを含む。これは、検出されるべき対応する多くのシグナルを認め、且つアレイにより処理される。例えば約5〜約100個以上の異なるシグナルは、プローブフラグメントのアレイへのハイブリダイゼーション後にアレイ上のシグナルの位置付けに基づき検出され得る。理解されているように、アレイ上の捕捉プローブタイプの数は、一般にシグナル反応容積中で多重化され得る固有の増幅反応の数により決定される。しかしながら多くの数の多様な捕捉プローブ、例えば100個超、1000個超、10,000個超の捕捉プローブタイプを有する捕捉アレイも、状況次第で、例えば増幅反応がアレイによる監視のためにためられる場合等において採用され得る。
本発明の利点は、1つの捕捉アレイ構成が、多重の異なる標的核酸配列パネルに使用され得ることである。特に第一のパネルのプローブセットは、パネル中の標的に特異的である部分に特異的である第一の標的、及び捕捉アレイ上の個々のプローブに相補的である第二の捕捉部分を有するプローブを含むだろう。第二の多様なパネルのためのプローブセットは、(部分的に重複していても、または全く相違していても)そのパネルのための標的特異的部分を含むだろうが、一方で捕捉部分は、第一のパネルのプローブセットのためのものと同一であるだろう。言い換えると、標的の任意のパネルのためのプローブセットは、多くの捕捉アレイに常に相補的であるであろう、そのパネルのために使用されるプローブの半固定された部分を含むだろう。プローブは、標的核酸の特異的パネルに選定される可変部分も含むだろう。例えば分析工程では、第一のプローブセットは、第一のセット中のそれぞれのプローブが、捕捉プローブアレイ上の多様な捕捉プローブに相補的である第一の固定された部分を有する場合に採用される。それぞれのプローブは、第一のパネル中の所定の標的配列に相補的である標的特異的部分も含む。第二のパネルのためのプローブの第二のセットは、セット中のそれぞれのプローブが同一の第一の固定された部分を含むが、そのパネル中の標的に特異的な第二の標的特異的部分を有する場合に採用される。
図1Aに関して、標識プローブの部分Aは、可変部分に相当し、一方、部分Bは、アレイ上のプローブに相補的であるだろう固定された部分に相当するだろう。万能または一般的な捕捉アレイ及び捕捉プローブセットの使用は、本発明において使用される消耗品のより効率的な製造及びより低い製造コストを可能にする。
したがってサンプルが多重標的核酸を含んで成る一つの実施形態では、方法は、それぞれ異なる標的核酸に特異的な複数の標識プローブを、標的核酸と共にインキュベートすることを含む。増幅プライマー依存性増幅反応において、標的核酸の少なくとも一部分を増幅することは、複数の標識プローブタイプの開裂をもたらし、そして複数の標識プローブフラグメントタイプの放出をもたらす。複数のプローブフラグメントタイプは、アレイにハイブリダイズする。それぞれ多様なプローブフラグメントタイプは、空間的に別々の捕捉核酸タイプにハイブリダイズする。標識シグナルを検出することは、アレイ上の空間的に別々の捕捉核酸に対応する複数の空間的に別々の領域からの複数の標識シグナルを検出することを含む。場合により、且ついくつかの好適な実施形態では、標識プローブタイプは、同一の標識部分を含んで成るが、追加の多重化、及び/または異なるコントロールもしくは登録プローブの使用は、複数の異なる標識部分を使用することを含み得る。典型的に標識プローブタイプは、標識プローブタイプの数よりも少ない数の異なる部分と共に、1つ以上の異なる標識部分を含み得る。
方法を行うためのデバイス及びシステムは、本発明の特徴である。デバイスまたはシステムは、チャンバーの少なくとも1つの表面上に少なくとも1つの高性能核酸検出アレイを含んで成る検出チャンバーを含み得る。方法についての参照により示されたように、チャンバーは、アレイから検出されるシグナルのシグナルバックグラウンドを減らすように構成されている。デバイスまたはシステムは、典型的に検出チャンバーに動作可能に接続された(operably coupled to the detection chamber)熱調節モジュールを含み、それはデバイスの動作間のチャンバー内部の温度を調節する。光列(optical train)は、デバイスの動作間にアレイで生み出されるシグナルを検出する。
方法についての参照により示されたバックグラウンドを減らすためのチャンバーの全ての次元的な特徴は、場合によりデバイスに適用される。例えばデバイスは、アレイに近位の少なくとも1つの次元において約500μm未満の深さ、例えばアレイに近位の少なくとも1つの次元において約10μm〜約200μmの間の深さであり得る。アレイが形成されるチャンバー表面は、任意の適した材料、例えばセラミック、ガラス、石英、またはポリマーから構成され得る。いくつかの実施形態では、例えば落射蛍光を利用するものは、表面が少なくとも部分的に透明であるだろう。
方法について参照により示さるようなアレイ上の捕捉核酸は、典型的にデバイスの動作間に非比率制限の密度で存在する。アレイは、場合により、例えばアレイの空間的に固有の領域に局在化するような複数の捕捉核酸タイプを含む。例えば5個以上の多様な捕捉核酸タイプは、例えば約100個以上の多様なタイプまでアレイ上に存在し得る。捕捉核酸は、場合によりチャンバーの表面上で熱安定性コーティングにつながれ、アレイの熱循環を促進する。コーティングの例は、場合により:化学反応基、求電子基、NHSエステル、テトラ−またはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα,β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含み得る。
熱調節モジュールは、場合により熱電モジュール、ペルティエ素子、冷却ファン、ヒートシンク、チャンバーの外面の一部分と一緒になるように構成された金属板等の熱循環を促進する特徴を含む。典型的に熱調節モジュールは、モジュールの部分を制御し、またはモジュールの部分であるコンピューターに動作可能に接続された、フィードバックを可能とする制御システムを有する。
光列は、落射蛍光検出システムを含み得るか、または落射蛍光検出システムに動作可能に接続され得る。典型的な光列構成要素は、任意の:励起光源、アークランプ、水銀アークランプ、LED、レンズ、光学フィルター、プリズム、カメラ、光検出器、CMOSカメラ、及び/またはCCDアレイを含む。さらにデバイスは、アレイ中のシグナル位置を検出されるべき核酸に関連付ける、アレイ読み取りモジュールを含み得るか、またはかかるアレイ読み取りモジュールにつながれ得る。
デバイスまたはシステムは、例えばコンピューターまたはコンピューター読み取り可能媒体において具現化されるようなシステム指示を含み得るか、またはかかるシステム指示に動作可能に接続され得る。指示は、例えば熱調節モジュールにより行われる1つ以上のシグナル強度及び増幅サイクルの数の測定を、デバイスにより検出される標的核酸の濃度を決定することと関連付けるような、デバイスまたはシステムの任意の態様を制御し得る。
システムは、例えばコンピューターと動作可能に接続されたデバイスを含み得る。コンピューターは、例えば熱調節モジュールにより熱循環を制御する指示、及び/またはいつ画像が取得されたか、もしくは光列により見られたかを特定する指示を含むことができ、並びに/或いは画像情報を機能時間としてシグナル強度曲線に変換し、デバイスにより分析される標的核酸の濃度を決定すること等ができる。コンピューターは、バックグラウンドを説明するためのシグナル強度を正規化するための指示、例えばアレイの1つ以上の領域のローカルバックグラウンドを検出するための指示、及び前記バックグラウンドを補正することによりアレイシグナル強度を正規化するための指示を含み得る。同様にコンピューターは、アレイ捕捉核酸スポッティング、アレイの一様でない異なる領域の視野等における変動性を補正することによりシグナル強度を正規化するための指示を含み得る。
本発明は、1つの態様において、例えば本発明のデバイス及びシステムを使用するための、例えば本発明の方法を実行するための核酸検出消耗品を含む。チャンバーが、窓(window)の内面上に処理された高性能捕捉核酸アレイを有する光学的に透明な窓を含む場合に、消耗品は、例えば約500μm未満の深さの薄いチャンバーを含み得る。消耗品は、例えばチャンバーと流体接続された(fluidly coupled to the chamber)少なくとも1つの試薬送達ポートも含み得る。典型的に消耗品は、チャンバー内部での流体の熱循環を可能にするように構成される。
本発明のデバイス、システム及び方法において、アレイ及びチャンバーについて参照により上記に示された特徴の全ては、消耗品にも同様に適用される(逆もまた同様)。例えば核酸アレイは、複数の多様な捕捉核酸タイプを含むことができ、そのタイプは、アレイの空間的に明白に異なる領域に位置する。捕捉核酸の密度は、例えば約2,000fmol/cm2超、2,500fmol/cm2超、3,000fmol/cm2超、4,000fmol/cm2超、4,500fmol/cm2 超、または5,000fmol/cm2超であり得る。
同様にチャンバーは、例えば頂部及び底部表面が、感圧接着剤材料の形を成す側壁により接合される場合に、試薬送達ポートを含んで成る第一の上側表面(a first upper surface)、及び窓を含んで成る底部透明表面(a bottom transparent surface)を含み得る。チャンバーを形成するために頂部及び底部表面を接合するための他の構造も使用され得る。例えば頂部表面(top surface)及び底部表面(bottom surface)は、ガスケット、或いは上側表面もしくは下側表面(lower surface)、または両側の表面上の外形的特徴により一緒に接合され得る。ガスケットまたは特徴は、場合により上側もしくは下側表面、または両方の対応する領域に融合または結合される。いくつかの実施形態では、ガスケットまたは特徴は、UV硬化性接着剤の流れに関し、接着剤が、上側及び下側表面の間で流れ、そしてUV光にさらされることにより、上側及び下側表面が接合する。他の実施形態では、上側及び下側表面は、ガスケットまたは特徴と超音波的に一緒に融合され、融合された領域を区切り得る。他の例では、特徴は、上側または下側のいずれかの表面上の透明領域、及び関連した上側または下側表面上の対応する陰影領域である。この実施形態では、上側及び下側表面は、透明領域を通して、及び陰影領域上にレーザーを向けられることにより一緒にレーザー溶接され得る。
捕捉核酸アレイは、典型的に窓上の熱安定性コーティングにつながれる。例えば、コーティングは、化学反応基、求電子基、NHSエステル、テトラ−またはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα,β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含み得る。窓自体は、例えばガラス、石英、セラミック、ポリマー、または他の透明な材料を含み得る。
方法、システム及びデバイスに関して上記に示された特徴の全ては、消耗品におけるチャンバーの構成に関して適用される。例えばチャンバーは、約10μm〜約200μmの間の深さ、例えば約140μmの深さであり得る。チャンバーは、他の次元において有意に広く、例えば約1mm〜約50mmの間の平均直径であり得る。1つの特定の実施形態では、チャンバーは、約10mm〜約20mmの間の平均直径である。
本発明は、例えば本発明の消耗品を含んで成るキットを含む。キットは、包装材料、方法を実行するための指示、コントロール試薬(例えば消耗品のアレイ上のコントロール部位と結合するような例えばコントロール鋳型、プローブ、またはプライマー)も含み得る。
方法、システム、デバイス、消耗品及びキットは、例えば本発明のシステムまたはデバイスにおいて使用するための消耗品を提供するキットとの組み合わせにおいて、例えば本発明の方法を実行するために使用され得る。特に断りのない限り、方法のステップは、場合によりシステム、デバイス、消耗品またはキットにおいて対応する構造的特徴を有し、そして逆もまた同様である。
詳細な説明
標的核酸の増幅、検出、及びリアルタイム定量化を行うための方法は、本発明の特徴である。方法における標的核酸の増幅は、アレイにハイブリダイズする標的特異的標識プローブフラグメントを放出し;アレイは、増幅が起こるチャンバー中に分散する。シグナルは、アレイから検出され、標的核酸の検出及びリアルタイム定量化の両方を提供する。
標的核酸の増幅、検出、及びリアルタイム定量化を行うための方法は、本発明の特徴である。方法における標的核酸の増幅は、アレイにハイブリダイズする標的特異的標識プローブフラグメントを放出し;アレイは、増幅が起こるチャンバー中に分散する。シグナルは、アレイから検出され、標的核酸の検出及びリアルタイム定量化の両方を提供する。
本発明は、典型的に、チャンバー中に核酸検出アレイを含んで成る消耗品としてフォーマットされた反応チャンバー、並びに消耗品と相互に作用するデバイス及びシステムも提供する。
方法
本発明は、サンプル中の1つ以上の標的核酸を、リアルタイムで検出及び定量化するための方法を提供する。方法は、多重化に非常に適し、入手可能な溶液に基づくリアルタイム核酸検出方法を用いて達成され得るものよりも多くの数の多様な標的核酸の特異的検出及び定量化を、1つのチャンバー反応及び検出を用いて可能にする。これは、本発明が、液相スペクトル検出よりもむしろ、(検体と接触するアレイを用いる、)アレイに基づく検体の検出を利用するからである。核酸検出アレイは、例えば溶液中の異なる染料標識の識別と比較して、アレイ位置識別を介する有意により大きな検体分解能を有する。比較として、何千もの異なる検体を同時検出するアレイを構成することは可能であるが、溶液中の約6個以上の異なる標識蛍光色素分子を検出することは、典型的に可能ではない。
本発明は、サンプル中の1つ以上の標的核酸を、リアルタイムで検出及び定量化するための方法を提供する。方法は、多重化に非常に適し、入手可能な溶液に基づくリアルタイム核酸検出方法を用いて達成され得るものよりも多くの数の多様な標的核酸の特異的検出及び定量化を、1つのチャンバー反応及び検出を用いて可能にする。これは、本発明が、液相スペクトル検出よりもむしろ、(検体と接触するアレイを用いる、)アレイに基づく検体の検出を利用するからである。核酸検出アレイは、例えば溶液中の異なる染料標識の識別と比較して、アレイ位置識別を介する有意により大きな検体分解能を有する。比較として、何千もの異なる検体を同時検出するアレイを構成することは可能であるが、溶液中の約6個以上の異なる標識蛍光色素分子を検出することは、典型的に可能ではない。
図10は、方法の部分的な概観を提供する。示されているように、プライマーは、標識プローブとともに鋳型にハイブリダイズする。プローブは、標識部分と結合された鋳型(“フラップ”)に相補的でない直交配列を含んで成る。プローブは、増幅反応(例えばPCR増幅サイクル)の間に開裂する。1つの都合のよい手法では、天然のポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を使用して、フラップを開裂する。この手法では、ポリメラーゼによるプライマー伸長は、それがフラップと鋳型間の接合に遭遇するとポリメラーゼのヌクレアーゼ作用によりフラップの開裂をもたらす。これは、その後に例えば特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件に温度を調節することによりアレイにハイブリダイズする標識プローブフラグメントとしてのフラップを放出する。アレイ上の標識の検出は、リアルタイムでの鋳型の検出及び定量化を提供する。
一般に、1つ以上の標的核酸の存在(または不存在)を試験されるサンプルは、増幅反応にかけられる。反応は、単一のチャンバー中で容易に多重化され、約10〜約100個以上の異なる核酸を増幅、検出、及び定量化し得る。例えば約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、または約100個以上の核酸は、単一の増幅/検出チャンバー中で検出され得る。反応/検出チャンバーにおける10個の異なる標的核酸の同時増幅、検出及び定量化を実証する本明細書における実施例は、後に示されている。本実施例、及び本明細書における方法の能力は、典型的なスペクトル的に制限された、溶液に基づく多重検出の能力をしのぐ。
本方法において検出されるべきそれぞれの標的核酸は、少なくとも1個の、そして一般的には2個の増幅プライマー(2個のプライマーの使用は、単一のプライマーと比較して、反応に特異性を加え、且つ産物形成を加速させる)を用いて特異的に増幅される。プライマーは、典型的にサンプル中の標的核酸に特異的にハイブリダイズし、そして例えば標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、ポリメラーゼを用いて伸長される。注目の標的核酸を増幅するために使用され得る増幅プライマーの設計及び構造は、公知の方法に従う。PCRプライマー設計に関する詳細については、例えば後に示されている参考文献、及びAnton Yuryev(編)(2007)PCR Primer Design(Methods in Molecular Biology)[Hardcover]Humana Press;第1編ISBN−10:158829725X、ISBN−13:978−1588297259を参照のこと。
標的鋳型核酸上でプライマーを用いるPCR増幅は、標準的な増幅緩衝剤、酵素、温度、及びサイクル時間の使用を含む適切な反応条件を用いて行われ得る。ハイブリダイゼーション条件、緩衝剤、試薬、反応サイクル時間等を含むPCR技術の説明については、例えばYuryev(上記)、van Pelt−Verkuil等(2010)Principles and Technical Aspects of PCR Amplification Springer;第1編ISBN−10:9048175798、ISBN−13:978〜9048175796;Bustin(編)(2009)The PCR Revolution:Basic Technologies and Applications Cambridge University Press;第1編ISBN−10:0521882311、ISBN−13:978−0521882316;Viljoen等(2005)Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer、ISBN 1402034032;Kaufman等(2003)Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine第2編 Ceske(編)CRC Press(Kaufman);The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley(編)(2000)Cold Spring Harbor、Humana Press Inc(Rapley);Chen等(編)PCR Cloning Protocols、第二編(Methods in Molecular Biology、192巻)Humana Press;PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis等編)Academic Press Inc.San Diego、CA(1990)(Innis)を参照する。リアルタイムに基づくPCR方法に適用可能な増幅条件、プライマー設計、及び他の詳細は、例えばLogan等(編)(2009)Real−Time PCR:Current Technology and Applications、Caister Academic Press、第1編ISBN−10:1904455395、ISBN−13:978−1904455394、及びM Tevfik Dorak(編)(2006)Real−time PCR(改良方法)Taylor&Francis、第1編ISBN−10:041537734X ISBN−13:978−0415377348を参照のこと。
サンプル中のそれぞれの標的核酸に特異的な標識プローブは、増幅プライマーとともに標的核酸にハイブリダイズする。増幅反応は、鋳型にハイブリダイズした標識プローブを開裂し、標識プローブフラグメントを放出する。その後に本標識フラグメントは、図10に示されているように、反応チャンバー中のアレイにハイブリダイズする。
図1Aは、本発明の方法において有用なプローブを概略的に示す。プローブは、標的核酸に相補的である領域Aを含んで成る。プローブは、標的核酸に相補的でない「フラップ(flap)」Bをさらに含んで成る。標識Eは、フラップBに結合する。標識Eは、末端の位置に示されているが、標識は、実際にはフラップBに沿って任意の点でフォーマットされ得る。例えば任意の多様なヌクレオチドは標識され、そして標準または軽度に修飾された核酸合成プロトコルにおいて使用され、プローブ上の任意の所望される部分で標識を提供し得る。
図1Aにおける標識クエンチャーDを含んで成る任意の領域Cは、フラップBの部分に相補的である。適切な溶液条件下で、領域Cの塩基は、フラップBと対になり、標識E及びクエンチャーDを近づけることにより、標識Eを消光させる。これは、反応/検出チャンバー中の液相のシグナルバックグラウンドを減らすが、プローブクエンチャーは、本発明の実行に要求されない。本発明の一つの驚くべき態様は、アレイに近位の溶液中に未消光プローブが存在している場合でも、アレイに結合したプローブフラグメントを特異的に検出することが可能であることである。本実施形態の実施例は、本明細書中に記載されている。一般に液相バックグラウンドを減らすために構成される反応/検出チャンバーにおける高性能アレイの使用は、本発明の方法、消耗品、デバイス及びシステムにおける溶液中のシグナルバックグラウンドからのアレイでのシグナルの識別を可能にする。
アレイの構造に応じて、種々の異なる標識基は、標識プローブを標識化するために使用され得る。上記のように、かかる標識は、典型的に個々の蛍光色素分子または相互作用的な染料対または基、例えばFRET対を含み得る蛍光標識基、並びに供与体/クエンチャー対を含む。核酸プローブを標識化するために適する広範囲の異なる蛍光標識基は、例えばMolecular Probes Handbook、第11編(Life Technologies,Inc.)において記載される。
本明細書における多くの検討はPCRに基づく増幅に関するが、他の増幅反応も代用され得る。例えば切断可能な結合の開裂(例えば米国特許第5,011,769号;米国特許第5,660,988号;米国特許第5,403,711号;米国特許第6,251,600号を参照)、及び分岐核酸構造(米国特許第7,361,467号;米国特許第5,422,253号;米国特許第7,122,364号;米国特許第6,692,917号)を含むもの等の増幅反応と対になる開裂反応を伴う多酵素系が使用され得る。TaqManにつながれたヘリカーゼ依存性増幅のような開裂(Tong,Y等、2008 BioTechniques 45:543〜557)もまた使用され得る。核酸配列に基づく増幅(NASBA)、またはリガーゼ鎖反応(LCR)が使用され得る。NASBAに基づく手法では、プローブは、PCRにおけるように、増幅プライマーとともに鋳型にハイブリダイズし得る。プローブは、逆転写酵素、または添加されたエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ作用により開裂し、PCRにおけるポリメラーゼによる放出と類似の方法においてプローブフラグメントを放出し得る。NASBAの1つの潜在的な利点は、熱循環が必要とされないことである。これは、デバイス及びシステム全体の要求を単純化する。NASBAの識別については、例えばCompton(1991)、“Nucleic acid sequence−based amplification”、Nature 350(6313):91〜2を参照のこと。病原性核酸を検出するためのNASBAの使用については、例えばKeightley等(2005) “Real−time NASBA detection of SARS−associated coronavirus and comparison with real−time reverse transcription−PCR”、Journal of Medical Virology 77(4):602〜8を参照のこと。LCR−スタイル反応が使用される場合、プローブは、増幅酵素のヌクレアーゼ活性に頼ることよりもむしろエンドヌクレアーゼを用いて開裂され得る。
本明細書における方法では、チャンバーの少なくとも1つの内面上に、少なくとも1つの高性能核酸検出アレイを有する検出チャンバーが提供される。高性能アレイは、典型的にチャンバーにおける増幅反応により生み出されるプローブフラグメントの効率的な捕捉を可能にする、非比率制限数の捕捉核酸を有する。捕捉核酸は、比較的に小さなプローブ核酸を捕捉するように構成され、それはさらにアレイ効率も上昇させる。チャンバーは、例えばバックグラウンドを減らすようにチャンバーを成形することにより、アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成される。例えばバックグラウンドは、アレイに近位(例えば上方または下方)のチャンバー厚(浅い)を作ることにより減らされ;例えば1mm以上の深さのチャンバーでの検出は可能であるが、典型的にチャンバーは、アレイ上方または下方で約500μm以下の浅さである。反応チャンバー及びアレイに関するさらなる詳細は、本方法において有用な消耗品についての後述の参照により記載されている。
アレイにより捕捉されるシグナルは検出され、そしてシグナル強度が測定される。シグナル強度は、サンプル中の標的核酸の存在及び/または量に相関する。典型的にサンプルは、増幅により放出されるプローブフラグメントの数を増やすことによりシグナルのレベルを増やすために、最初の検出前に2回以上のサイクルで増幅される。例えば標的核酸は、アレイからのシグナルの検出に先立ち、場合により少なくとも例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10回以上の増幅サイクルで増幅され得る。
1つの典型的な実施形態では、蛍光または他の光学画像は、増幅反応の間に、選定された時間、温度、及び増幅サイクル間隔でアレイから捕捉される。これらの画像は、サンプル中に標的核酸が存在するか否かを決定するために、そしてサンプル中の出発標的核酸濃度の定量化を提供するために分析される。画像は、中間グレイ強度測定、バックグラウンド補正及びベースライン修正の組み合わせを用いて分析される。バックグラウンドは、アレイ上のそれぞれのスポットについて局所的に測定され得る。バックグラウンドは、注目のアレイ領域(例えばアレイスポット)を取り囲む溶液の同心環の画像強度を測定することにより計算される。それぞれの領域からのシグナルは、その後に領域中の局所バックグラウンドを説明するために補正される。補正されたそれぞれの領域からのシグナルは、スポッティングにおける変動性、及び視野における一様でない照明を説明するために、さらに正規化され得る。最初のいくつかのサイクル、典型的に5〜15サイクルから得られた補正された強度測定の平均値は、ベースラインを調整するために、及びそれぞれの領域からの測定を正規化するために使用される。
増幅後のシグナル強度測定に基づく核酸を定量化するための方法に関するさらなる詳細は、例えば本段落より前に示されている参考文献、並びにJang B.Rampal(編)(2010)Microarrays:第2巻、Applications and Data Analysis(Methods in Molecular Biology)Humana Press;第2編ISBN−10:1617378526、ISBN−13:978−1617378522;Stephen A. Bustin(編)(2004)A−Z of Quantitative PCR(IUL Biotechnology、No.5)(IUL Biotechnology Series)International University Line;第1編ISBN−10:0963681788、ISBN−13:978−0963681782;及びKamberova及びShah(2002)DNA Array Image Analysis:Nuts & Bolts(Nuts & Bolts series)DNA Press;第2編ISBN−10:0966402758、ISBN−13:978−0966402759において見出され得る。
代替的な構成において、捕捉プローブは、静的基板よりもむしろビーズ、樹脂、粒子等(本明細書において、一般に「ビーズ」と交換可能に呼ばれる)等の可動式基板に場合により結合され得る。例えば、本明細書の他の箇所で示されるように、平面基板は、標的核酸配列、またはサンプル材料内部の配列の増幅の間に生み出される開裂プローブフラグメントとハイブリダイズするであろう、配置された捕捉プローブを提供するために使用され得る。所定の標的核酸配列の存在は、プローブフラグメントがハイブリダイズするアレイ上のプローブ位置を捕捉する検出により検出される。それぞれのプローブフラグメントが特定の標的配列に特異的であるので、プローブフラグメントが存在するならば、標的は存在し、そして増幅されることを示す。可動式相基板では、所定の分析においてそれぞれ異なる捕捉プローブタイプは、さらに特有の標識を担持する異なる可動式基板につながれる。その後に可動式基板は、ビーズ、及び含蓄的に捕捉プローブ、並びに標識プローブフラグメントが存在するか否かを同定するために、検出チャネルを通過する。所定のビーズ上で、特定の捕捉プローブに対応する標識プローブが検出されれば、それは、プローブフラグメント(及び相補的捕捉プローブ)に関連する標識配列がサンプル中に存在し、そして増幅されたことを示す。本発明の本態様は、エンドポイント検出において、例えば全ての増幅反応の完了後に行われ得るが、例えば1回以上の増幅サイクル後に増幅混合物からビーズのフラクションを吸い上げ、そしてビーズからの標識プローブフラグメントシグナル強度を測定すること等の定量分析においても行われ得る。
所定のビーズ上の捕捉標識プローブフラグメントの濃度は、反応混合物からのビーズの分離が必要とされないように、検出チャネルにおいて十分に高いシグナル対バックグラウンド比率を提供するだろう。さらにアレイに基づく基板によるような、無傷のプローブ及び/または任意の消光基において二次構造を含むことは、溶液中であっても、または意図されていない可動式基板への結合からでも、プローブフラグメントと無傷のプローブ間のバックグラウンドシグナルを区別するより大きな能力を可能にする。いくつかの場合では、天然の無傷のプローブの二次構造は、可動式基板上の捕捉プローブとの結合において立体障害を生じさせ、いくつかの場合では、無傷のプローブがビーズに結合するという少なくなった可能性をもたらすることも予測されるだろう。
多様な異なるビーズタイプは、本発明の本態様と組み合わせて使用され得る。例えばポリスチレン、セルロース、アクリル、ビニル、シリカ、常磁性もしくは他の無機粒子、または任意の多様な他のビーズタイプが使用され得る。上記の通りビーズは、典型的に特有の標識サインにより別個に標識される。さらに、多様な異なる標識タイプは、有機蛍光標識、無機蛍光標識(例えば量子ドット)、発光標識、電気化学標識等を含めて使用され得る。かかる標識は、広く商業的に入手可能であり、且つ適切に活性化されたビーズに容易に結合するように構成される。蛍光標識基の場合では、広いスペクトルの励起放射、例えば多重レーザーの使用を必要とせずに広域の特有な標識特徴を提供するように、多くの数の標識サインは、2、3、4個以上のスペクトル的には固有の蛍光標識基の異なる組み合わせ、及びそれぞれの標識の異なるレベルを提供することにより提供され得る。
方法は、典型的に本明細書におけるデバイス、システム、消耗品及びキットを用いて行われる。デバイス、システム及び消耗品の全ての特徴は、本明細書における方法を実行するために提供され、そして本明細書における方法は、デバイス、システム、消耗品及びキットとの組み合わせにおいて実行され得る。
消耗品
本発明のワンポット反応チャンバーは、シグナルバックグラウンドを減らすように構成される。高性能アレイは、チャンバーの少なくとも1つの内面上に形成される。アレイは、典型的に本方法の増幅及びアレイハイブリダイゼーションステップの両方の間、増幅反応物及び産物と接触している。これは、使用者が1つ以上の増幅反応サイクルを行い、リアルタイムでアレイからのシグナルを監視することにより結果物を検出し、そしてその後に1つ以上の追加の増幅サイクルを行い、さらにその後に検出を行うことを可能にする。したがってアレイからのシグナル強度は、注目の核酸をリアルタイムで検出及び定量化するために使用され得る。
本発明のワンポット反応チャンバーは、シグナルバックグラウンドを減らすように構成される。高性能アレイは、チャンバーの少なくとも1つの内面上に形成される。アレイは、典型的に本方法の増幅及びアレイハイブリダイゼーションステップの両方の間、増幅反応物及び産物と接触している。これは、使用者が1つ以上の増幅反応サイクルを行い、リアルタイムでアレイからのシグナルを監視することにより結果物を検出し、そしてその後に1つ以上の追加の増幅サイクルを行い、さらにその後に検出を行うことを可能にする。したがってアレイからのシグナル強度は、注目の核酸をリアルタイムで検出及び定量化するために使用され得る。
本発明の消耗品は、チャンバーの内面上にチャンバー及び高性能アレイを含む。チャンバーは、典型的に薄く(浅く)、例えば約1mm未満の深さである。一般により薄いチャンバー、アレイ上方のより少ない溶液は、溶液中の標識プローブまたはプローブフラグメントからのシグナルバックグラウンドを減らす。典型的な所望されるチャンバーの深さは、約1μm〜約500μmの範囲にある。消耗品の組み立て易さのために、チャンバーは、しばしばアレイ上方に約10μm〜約250μmの深さ、例えば約100μm〜約150μmの深さの範囲にある。チャンバーは、例えば手動または自動分注器によるサンプルの送達のための試薬送達ポートを有する表面を含み得る。
図2は、実施例の消耗品の引き伸ばし概略図を提供する。本実施例では、底部表面層1及び上側表面層2は、中間層2により接合される。カットアウト(cutout)4は、層1,2、及び3の集合体上にチャンバーを形成する。ポート5は、集合体上のチャンバーに緩衝剤及び試薬を送達するための都合のよい通路を形成する。高性能アレイは、カットアウトの頂部または底部表面を形成する領域中の頂部または底部層において形成され得る。1つの都合のよい実施形態では、アレイに結合した標識の検出のために落射蛍光検出が使用される場合、アレイは、本発明のデバイス及びシステムにおいて下側表面の下方に置かれた検出光により見られるように構成されている消耗品と共に、下側表面上に組み立てられる。一般に頂部または底部表面のいずれか(または両方)は、窓を含め、その窓を通して検出光がアレイを見ることができるだろう。
中間層3は、使用される消耗品の組み立て方法に応じて、任意の多様な形態をとり得る。1つの都合のよい実施形態では、頂部及び底部表面1及び2は、感圧接着剤材料の形を成す層3により接合される。感圧接着剤の層(例えばテープ)は周知であり、且つ広く入手可能である。例えばBenedek及びFeldstein(編)(2008)Handbook of Pressure−Sensitive Adhesives and Products:第1巻:Fundamentals of Pressure Sensitivity、第2巻:Technology of Pressure−Sensitive Adhesives and Products、第3巻:Applications of Pressure−Sensitive Products、CRC Press;第1編ISBN−10:1420059343、ISBN−13:978−1420059342を参照のこと。
チャンバーを形成するために頂部及び底部表面を接合するための他の組み立て方法も使用され得る。例えば頂部及び底部表面は、ガスケット、或いは上側もしくは下側表面、または両表面上の外形的特徴により一緒になって接合され得る。ガスケットまたは特徴は、場合により上側または下側表面の対応する領域に融合または接着される。ケイ素及びポリマーチップの加工方法は、頂部または底部表面における特徴を形成するために適用され得る。マイクロ−特徴加工を含む加工方法を特徴付けるための紹介については、例えばFranssila(2010)Introduction to Micro fabrication Wiley;第2編ISBN−10:0470749830、ISBN−13:978−0470749838;Shen及びLin(2009)“Analysis of mold insert fabrication for the processing of microfluidic chip” Polymer Engineering and Science Publisher:Society of Plastics Engineers,Inc. 第49巻、第1版、104(11)頁;Abgrall(2009)Nanofluidics ISBN−10:159693350X、ISBN−13:978−1596933507;Kaajakari(2009)Practical MEMS:Design of microsystems、accelerometers、gyroscopes、RF MEMS、optical MEMS、and microfluidic systems Small Gear Publishing ISBN−10:0982299109、ISBN−13:978−0982299104;Saliterman(2006)Fundamentals of BioMEMS and Medical Microdevices SPIE Publications ISBN−10:0819459771、ISBN−13:978−0819459770;Madou(2002)Fundamentals of Microfabrication:The Science of Miniaturization、第2編CRC Press;ISBN−10:0849308267、ISBN−13:978−0849308260を参照のこと。これらの加工方法は、頂部または底部表面上に所望される本質的に任意の特徴を形成し、中間層の必要性を排除するために使用され得る。例えばくぼみは、頂部または底部表面(または両表面)において形成されてよく、且つ2つの層が接合することによりチャンバーが形成される。
いくつかの実施形態では、ガスケットまたは特徴は、UVまたは放射線硬化性接着剤(radiation curable adhisive)の流れを導く。本接着剤は、上側または下側表面の間で流れ、そしてUV光または放射線(例えば電子ビーム、または「EB」放射線)に曝されることにより上側及び下側表面を接合する。UV及び放射線硬化性接着剤を含む入手可能な接着剤の記載については、例えばEbnesajjad(2010)Handbook of Adhesives and Surface Preparation:Technology、Applications and Manufacturing William Andrew;第1編ISBN−10:1437744613、ISBN−13:978−1437744613;Drobny(2010)Radiation Technology for Polymers、第2編CRC Press;第2編ISBN−10:1420094041、ISBN−13:978−1420094046を参照。
他の実施形態では、上側及び下側表面は、ガスケット、或いは融合した領域とチャンバーまたは消耗品において生み出される他の構造的な特徴を区切る表面特徴と一緒になって、超音波的に融合され得る。超音波溶接、及び材料を融合するのに有用な関連技術は、例えばAstashev及びBabitsky(2010)Ultrasonic Processes and Machines:Dynamics、Control and Applications(Foundations of Engineering Mechanics)Springer;第1編ISBN−10:3642091245、ISBN−13:978−3642091247;及びLeaversuch(2002)“How to use those fancy ultrasonic welding controls”、 Plastics Technology48(10):70〜76において教示されている。
他の例では、特徴は、上側または下側表面のいずれかにおける透明領域、及び関連した上側または下側表面における対応の陰影領域である。本実施形態では、上側及び下側表面は、レーザー光が透明領域を通過し、そして陰影領域上に向かうことにより、一緒に溶接され得る。レーザー溶接方法は、例えばSteen等(2010)Laser Material Processing Springer;第4編ISBN−10:1849960615、ISBN−13:978−1849960618;Kannatey−Asibu(2009)Principles of Laser Materials Processing(Wiley Series on Processing of Engineering Materials)Wiley ISBN−10:0470177985、ISBN−13:978−0470177983;及びDuley(1998)Laser Welding Wiley−Interscience ISBN−10:0471246794、ISBN−13:978−0471246794において教示されている。
捕捉核酸アレイは、典型的に窓上で熱安定性コーティングにつながれる。窓自体は、例えばガラス、石英、セラミック、ポリマーまたは他の透明な材料を含み得る。窓をコーティングするのに適する多様なコーティングは、入手可能である。一般にコーティングは、(例えばアレイが結合したチャンバー表面が、ガラスであるか、またはポリマーであるかに関わらず)アレイ基板との互換性、アレイ膜を結合するのに適した反応基を含むための誘導化能力または処理能力、及び工程条件(例えば熱安定性、光安定性等)との互換性に基づき選定される。例えばコーティングは、化学反応基、求電子基、NHSエステル、テトラ−またはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα,β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含み得る。生体分子を表面に結合させる際の表面コーティング及びそれらの用途の記載については、例えばPlackett(編)(2011)Biopolymers:New Materials for Sustainable Films and Coatings Wiley ISBN−10:0470683414、ISBN−13:978−0470683415;Niemeyer(編)(2010)Bioconjugation Protocols:Strategies and Methods(Methods in Molecular Biology)Humana Press;第1編ISBN−10:1617373540、ISBN−13:978−1617373541;Lahann(編)(2009)Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science Wiley ISBN−10:0470699701、ISBN−13:978−0470699706;Hermanson(2008)Bioconjugate Techniques、第2編Academic Press;第2編ISBN−10:0123705010、ISBN−13:978−0123705013.Wuts及びGreene(2006)Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis Wiley−Interscience;第4編ISBN−10:0471697540、♯ISBN−13:978−0471697541;Wittmann(編)(2006)Immobilisation of DNA on ChipsII(Topics in Current Chemistry)Springer;第1編ISBN−10:3540284362、ISBN−13:978−3540284369;Licari(2003)Coating Materials for Electronic Applications:Polymers、Processing、Reliability、Testing(Materials and Processes for Electronic Applications)William Andrew ISBN−10:0815514921、ISBN−13:978−0815514923;Conk(2002)Fabrication Techniques for Micro−Optical Device Arrays Storming Media ISBN−10:1423509641、ISBN−13:978−1423509646、並びにOil及びColour Chemists’ Association(1993)Surface Coatings−Raw materials and their usage.第3編Springer;第3編ISBN−10:0412552108、ISBN−13:978−0412552106を参照のこと。
核酸アレイを作るための方法は利用可能であり、且つ内側のチャンバー表面上にアレイを形成することにより本発明に適用され得る。内側のチャンバー表面上にアレイを形成するために使用され得る核酸マイクロアレイを形成するための技術は、例えばRampal(編)Microarrays:第I巻:Synthesis Methods(Methods in Molecular Biology)Humana Press;第2編ISBN−10:1617376639、ISBN−13:978−1617376634;Muller及びNicolau(編)(2010)Microarray Technology and Its Applications(Biological and Medical Physics、Biomedical Engineering)Springer;第1編.ISBN−10:3642061826、ISBN−13:978−3642061820;Xing及びCheng(編)(2010)Biochips:Technology and Applications(Biological and Medical Physics、Biomedical Engineering)Springer;第1編.ISBN−10:3642055850、ISBN−13:978−3642055850;Dill等(編)(2010)Microarrays:Preparation、Microfluidics、Detection Methods、and Biological Applications(Integrated Analytical Systems)Springer ISBN−10:1441924906、ISBN−13:978−1441924902;Whittmann(2010)Immobilisation of DNA on Chips II(Topics in Current Chemistry)Springer;第1編ISBN−10:3642066666、ISBN−13:978−3642066665;Rampal(2010)DNA Arrays:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)Humana Press;第1編ISBN−10:1617372048、ISBN−13:978−1617372049;Schena(著、編)(2007)DNA Microarrays(Methods Express)Scion Publishing;第1編、ISBN−10:1904842151、ISBN−13:978−1904842156;Appasani(編)(2007)Bioarrays:From Basics to Diagnostics Humana Press;第1編ISBN−10:1588294765、ISBN−13:978−1588294760;及びUlrike Nuber(編)(2007)DNA Microarrays(改良法)Taylor & Francis ISBN−10:0415358663、ISBN−13:978−0415358668において記載される。アレイを形成するために表面にDNAを結合させる技術は、化学反応性の表面またはコーティング、光に関連する合成、DNAプリンティング技術、及び当業界において多くの他の利用可能な方法を使用する、任意の多様なスポッティング方法を含み得る。
アレイ密度を定量化するための方法は、上記の参照において、及びGong等(2006)“Multi−technique Comparisons of Immobilized and Hybridized Oligonucleotide Surface Density on Commercial Amine−Reactive Microarray Slides”Anal.Chem.78:2342−2351において提供される。
消耗品は、キットを形成するために容器、または容器材料中に包装され得る。キットは、さらに消耗品を使用するのに有用な構成要素、例えばコントロール試薬(例えばコントロール鋳型、コントロールプローブ、コントロールプライマー等)、緩衝剤等も含み得る。
デバイス及びシステム
本発明の消耗品を使用する、及び/または本発明の方法を実行するデバイス及びシステムは、同様に本発明の特徴である。デバイスまたはシステムは、消耗品の特徴、例えば(消耗品としてフォーマットされているか、またはデバイスの専用部分としてフォーマットされているかどうかに関わらず)反応チャンバー及びアレイを含み得る。最も典型的には、デバイスは、典型的にアレイを監視するための検出光、チャンバーを熱循環させるためのモジュール、及び熱循環を制御し、そして後シグナルを処理するシステム指示を有するコンピューターとともに、レシーバー、例えば上記の消耗品を搭載する載物台を有するだろう。
本発明の消耗品を使用する、及び/または本発明の方法を実行するデバイス及びシステムは、同様に本発明の特徴である。デバイスまたはシステムは、消耗品の特徴、例えば(消耗品としてフォーマットされているか、またはデバイスの専用部分としてフォーマットされているかどうかに関わらず)反応チャンバー及びアレイを含み得る。最も典型的には、デバイスは、典型的にアレイを監視するための検出光、チャンバーを熱循環させるためのモジュール、及び熱循環を制御し、そして後シグナルを処理するシステム指示を有するコンピューターとともに、レシーバー、例えば上記の消耗品を搭載する載物台を有するだろう。
図式のシステムの例は、図11において説明されている。示されているように、消耗品10は、載物台20の上に搭載される。環境制御モジュール(ECM)30(例えばペルティエ素子、冷却ファン等を含んで成る)は、環境制御(例えば熱循環の温度)を提供する。照明光は、光源40(例えばランプ、アークランプ、LED、レーザー等)により提供される。光列50は、照明光源40から消耗品10へ光を向ける。消耗品10からのシグナルは、光列により検出され、そしてシグナル情報は、コンピューター60に送られる。コンピューター60は、場合によりECM30も制御する。シグナル情報は、コンピューター60により処理され、そして使用者が見ることができるディスプレイ70、またはプリンター、或いは両方に出力され得る。ECM30は、消耗品10の上方か下方に搭載され、そして追加の視覚光80(載物台20の上方か下方に設置される)を含み得る。
載物台/レシーバーは、熱循環及び分析の間に消耗品を搭載するように構成される。載物台は、アラインメントアーム、戻り止め、穴、くぎ等の消耗品の対応する特徴と一緒になる登録及びアラインメント特徴を含み得る。載物台は、例えば消耗品が載物台に直接載せられる場合などの多くの実施形態において必要とされないが、消耗品を受け止め、そして正しい位置に置くカセットを含むことができ、他のデバイス要素と動作可能に接続されてそれは設置され得る。デバイス要素は、消耗品と共に動作するように構成され、そして緩衝剤及び試薬を消耗品に送達するための流体送達システム、熱循環もしくは他の温度制御、または環境制御モジュール、検出光等を含み得る。チャンバーが消耗品中に導入されるよりもむしろデバイス中に組み立てられる場合の実施形態では、デバイス要素は、典型的にチャンバー上で、またはチャンバー近位で動作するように構成される。
消耗品への流体送達は、デバイスもしくはシステムにより行われ得るか、またはデバイスもしくはシステム中への消耗品の充填に先立ち行われ得る。流体取扱い要素は、デバイスもしくはシステム中に統合され得るか、または別々のデバイスもしくはシステムから独立した処理位置にフォーマットされ得る。流体取扱い要素は、試薬もしくは緩衝剤を消耗品中のポートに送達する分注器(手動または自動)を含み得るか、またはキャピラリー、微細加工デバイスチャネル等を含み得る。消耗品を充填するために使用され得る手動及び自動分注器及び分注器システムは、Thermo Scientific(アメリカ)、Eppendorf(ドイツ)、Labtronics(カナダ)及びその他の多くを含む多様な入手源から得られる。一般的に言えば、多様な流体取扱いシステムは入手可能であり、且つ本発明のデバイス及びシステムに組み込まれ得る。例えばKirby(2010)Micro−and Nanoscale Fluid Mechanics:Transport in Microfluidic Devices ISBN−10:0521119030、ISBN−13:978−0521119030;Bruus(2007)Theoretical Microfluidics(Oxford Master Series in Physics)Oxford University Press、USA ISBN−10:0199235090、ISBN−13:978−0199235094;Nguyen(2006)Fundamentals And Applications of Microfluidics、第2編(Integrated Microsystems) ISBN−10:1580539726、ISBN−13:978−1580539722;Wells(2003) High Throughput Bioanalytical Sample Preparation:Methods and Automation Strategies(Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis)Elsevier Science;第1編ISBN−10:044451029X、ISBN−13:978−0444510297を参照する。消耗品は、場合により送達システムと一緒になるように構成されるポート、例えばピペットまたはキャピラリー送達デバイスによる充填に適した寸法のポートを含んで成る。
ECMまたは熱調節モジュールは、熱電モジュール、ペルティエ素子、冷却ファン、ヒートシンク、チャンバーの外面の一部分と一緒になるように構成された金属板、流体槽等の熱循環を促進する特徴を含み得る。多くのかかる熱調節構成要素は、本発明のデバイス及びシステムへの導入のために入手可能である。例えばKennedy及びOswald(編)(2011)PCR Troubleshooting and Optimization:The Essential Guide、Caister Academic Press ISBN−10:1904455727;ISBN−13:978−1904455721;Bustin(2009) The PCR Revolution:Basic Technologies and Applications Cambridge University Press;第1編ISBN−10:0521882311、ISBN−13:978−0521882316;Wittwer等(編)(2004) Rapid Cycle Real−Time PCR−Methods and Applications Springer;第1編、ISBN−10:3540206299、ISBN−13:978−3540206293;Goldsmid(2009)Introduction to Thermoelectricity(Springer Series in Materials Science) Springer;第1編、ISBN−10:3642007155、ISBN−13:978−3642007156;Rowe(編)(2005) Thermoelectrics Handbook:Macro to Nano CRC Press;第1編、ISBN−10:0849322642、ISBN−13:978−0849322648を参照する。熱調節モジュールは、例えば消耗品を受け止めるカセット中でフォーマットされ得るか、または消耗品に近位で動作可能に載物台に載せられ得る。
典型的にECMまたは熱調節モジュールは、モジュールを制御する、またはモジュールの一部であるコンピューターに動作可能に接続された、フィードバックを可能とする制御システムを有する。コンピューター依存性の、フィードバックを可能とする制御は、装置制御への利用可能な手法である。例えばTooley(2005)PC Based Instrumentation and Control、第3編、ISBN−10:0750647167、ISBN−13:978−0750647168;Dix等(2003)Human−Computer Interaction(第3編)Prentice Hall、第3編ISBN−10:0130461091、ISBN−13:978−0130461094を参照する。一般にシステム制御は、例えば標的温度及びサイクル時間を作り出すため、並びにいつ検出光により画像が見られたか/取得されたかを特定するために、インプットとしてスクリプトファイルを使用することができるコンピューターにより行われる。写真画像は、典型的に反応の間の異なる時間で取得され、そしてコンピューターにより分析され、機能時間としての強度曲線を作り出すことにより標的物の濃度を導き出す。
光列は、任意の典型的な光列構成要素を含み得るか、またはかかる構成要素に動作可能に接続され得る。光列は、例えば消耗品のアレイ上に、またはアレイ領域に焦点を当てるようにして、消耗品に照明を向ける。光列は、アレイから放出された光(例えば蛍光または発光シグナル)を検出することもできる。入手可能な光学的構成要素の説明については、例えばKasap等(2009)Cambridge Illustrated Handbook of Optoelectronics and Photonics Cambridge University Press;第1編ISBN−10:0521815967、ISBN−13:978−0521815963;Bass等(2009)Handbook of Optics、第3編、第I巻:Geometrical and Physical Optics, Polarized Light、Componets and Instruments(set) McGraw−Hill Professional;第3編、ISBN−10:0071498893、ISBN−13:978−0071498890;Bass等(2009)Handbook of Optics、第3編、第II巻:Design、Fabrication and Testing、Sources and Detectors、Radiometry and Photometry McGraw−Hill Professional;第3編ISBN−10:0071498907、ISBN−13:978−0071498906;Bass等(2009)Handbook of Optics、第3編、第III 巻:Vision and Vision Optics McGraw−Hill Professional、ISBN−10:0071498915、ISBN−13:978−0071498913;Bass等(2009)Handbook of Optics、第3編、第IV巻:Optical Properties of Materials, Nonlinear Optics、Quantum Optics McGraw−Hill Professional、第3編、ISBN−10:0071498923、ISBN−13:978−0071498920;Bass等(2009)Handbook of Optics、第3編、第V巻:Atmospheric Optics、Modulators、Fiber Optics、X−Ray and Neutron Optics McGraw−Hill Professional;第3編、ISBN−10:0071633138、ISBN−13:978−0071633130;並びにGupta及びBallato(2006)The Handbook of Photonics、第2編、CRC Press、第2編ISBN−10:0849330955、ISBN−13:978−0849330957を参照のこと。典型的な光列構成要素は、任意の:励起光源、アークランプ、水銀アークランプ、LED、レンズ、光学フィルター、プリズム、カメラ、光検出器、CMOSカメラ、及び/またはCCDアレイを含む。1つの所望される実施形態では、落射蛍光検出システムが使用される。デバイスは、さらにアレイ中のシグナル位置を検出されるべき核酸に関連づけるアレイ読み取りモジュールを含むか、またはアレイ読み取りモジュールに接続され得る。
本発明の可動式基板実施形態における特定の態様では、反応容器は、例えば統合されたマイクロ流体チャネルシステム中に、または増幅混合物と検出チャネルの間の適切な流体接触面を通して、検出器チャネルに直接接続され得る。或いは従来型のフローサイトメーター中に存在するような流体接触面は、増幅反応混合物をサンプリングするために検出チャネル上に提供され得る。検出チャネルは、典型的に所定の時間で実質的にシグナルビーズだけがチャネルを越えることができる次元を有するように構成される。検出チャネルは、典型的にビーズの励起、及びビーズから発せられる蛍光シグナルの収集を可能にする検出窓を含むだろう。多くの場合では、溶融シリカまたはガラスキャピラリー、或いは他の透明なマイクロ流体チャネルは、検出チャネルとして使用される。
本発明の光検出システムは、典型的に1つ以上の励起波長で励起光を送達することができる、1つ以上の励起光源を含むだろう。さらに含められるのは、検出チャネルから発せられる光を収集し、そして蛍光シグナルからの励起光をフィルターするために構成されている光列であるだろう。光列は、典型的に蛍光シグナルを送り、そしてビーズから発せられる蛍光シグナル構成要素と捕捉プローブフラグメントから発せられるシグナル構成要素を分離するためのさらなる分離要素も含み得る。
図14は、全体の検出システム1400の図式説明を提供する。示されているように、システムは、それぞれ多様な波長で励起光を提供するレーザー1402及び1404等の第一及び第二の励起光源を含む。或いはシグナル広域スペクトル光源または多重狭域スペクトル光源は、適切な波長範囲、または例えばビーズに関連したもの、及び標識プローブフラグメントに関連したもの等のサンプル中の検出可能標識を励起する範囲で、励起光を送達するために使用され得る。
実線矢印として示されるそれぞれのレーザーからの励起ビームは、例えば二色性の1406等の方向性の光の使用を通して検出チャネル1408に向けられる。検出チャネル1408においてビーズ1410から発せられる光は、収集光学、例えば対物レンズ1412によって収集される。その後に収集された光は、破線として示されているように、放射蛍光を通すように構成されている1414を、収集された励起放射線を拒絶しながら、通過する。収集された蛍光は、第一の発光スペクトルで捕捉プローブフラグメント上の標識から放射された蛍光、及びビーズ中で使用される標識の数に応じて、1つ以上の多様な発光スペクトルでのビーズ標識特徴からの蛍光シグナルを含む。その後に収集された蛍光は、第一の検出器1420に捕捉プローブフラグメントからの蛍光を反射させる、二色性の1416を通過する。その後にビーズからの残りの蛍光特徴は、第二の検出器1422に第一のビーズシグナル構成要素を反射させ、そして第二のビーズシグナル構成要素を第三の検出器1424に通過させる、第二の二色性1418を介してシグナルを通過することによるさらなる分離にかけられる。検出器は、典型的に検出ビーズに関連したシグナルデータを保管するため、及びシグナルデータを分析し、ビーズのアイデンティティ、ひいては捕捉プローブ及び関連の標的核酸配列を決定するために適切なプロセッサまたはコンピューターに接続される。さらにプロセッサまたはコンピューターは、経時的実験が行われる場合、例えば全増幅反応において1回以上の増幅サイクル後にビーズをサンプリングする場合に、シグナルデータを定量化するためにプログラミングし、そして標的配列コピー数を創出することを含み得る。
デバイスまたはシステムは、例えばコンピューター、またはコンピューター読み取り可能媒体中で具現化されるようなシステム指示を含み得るか、またはかかるシステム指示に動作可能に接続され得る。指示は、デバイスまたはシステムの任意の態様、例えば1つ以上のシグナル強度の測定及び熱調節モジュールにより行われる多くの増幅サイクルを相互に関連付け、デバイスにより検出される標的核酸の濃度を決定することを制御し得る。
システムは、他のデバイス構成要素に動作可能に、例えば適切な配線により、または無線接続により接続されたコンピューターを含み得る。コンピューターは、例えば熱調節モジュールにより、例えば上記のようにフィードバック制御を用いて、熱循環を制御し、そして/または光列により画像がいつ取得されたか、または見られたかを特定する指示を含み得る。コンピューターは、画像情報を受信し、または画像情報をデジタル情報及び/または機能時間としてのシグナル強度曲線に変換し、デバイス等により分析される標的核酸の濃度を決定する。コンピューターは、バックグラウンドを説明するためにシグナル強度を正規化するため、例えば1つ以上のアレイ領域の局所的なバックグラウンドを検出するため、及び前記バックグラウンドを補正することによりアレイシグナル強度測定を正規化するための指示を含み得る。同様にコンピューターは、アレイ捕捉核酸スポッティングにおける変動性、アレイの一様でない多様な領域の視野等を補正することによりシグナル強度を正規化するための指示を含み得る。
さらなる定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定のデバイスまた生体システムに限定されずに、当然に変化され得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、且つ限定されることを意図しないことも理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形「a」、「an」及び「the」は、内容が他に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば本明細書において検討される消耗品チャンバーの「表面(a surface)」は、場合により2つ以上の表面の組み合わせ等を含む。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定のデバイスまた生体システムに限定されずに、当然に変化され得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、且つ限定されることを意図しないことも理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形「a」、「an」及び「the」は、内容が他に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば本明細書において検討される消耗品チャンバーの「表面(a surface)」は、場合により2つ以上の表面の組み合わせ等を含む。
他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により通常に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似する、または同等である任意の方法及び材料は、本発明の試験を実施するのに使用され得るが、好適な材料及び方法は、本明細書において記載される。本発明の記載及び特許請求の範囲では、以下に記載される定義に従い、以下の専門用語が使用される。
「増幅プライマー(amplification primer)」は、鋳型依存性増幅反応において伸長され得る部分(例えば分子)である。最も典型的には、プライマーは、増幅条件下で鋳型に結合する核酸を含むだろうし、または増幅条件下で鋳型に結合する核酸であるだろう。典型的にプライマーは、ポリメラーゼにより(例えばポリメラーゼ連鎖反応における熱安定性ポリメラーゼにより)、またはリガーゼにより(例えばリガーゼ連鎖反応において)伸長され得る末端を含んで成るだろう。
「検出チャンバー(detection chamber)」は、部分的に、または完全に密閉された構造であり、ここにおいてサンプルは分析され、または標的核酸が検出される。チャンバーは、完全に閉鎖され得るか、または例えば試薬または反応物の送達のためにチャンバーと流体連結されたポートまたはチャネルを含み得る。チャンバーの外形は、例えば適用及び使用可能なシステム装置に応じて変えられ得る。例えばアレイ近くに狭い次元(例えばチャンバーの深さ)を含むことにより(それによりアレイに近位の溶液から生み出されるシグナルの量を減らすことにより)、チャンバーがシグナルバックグラウンドを減らすように次元的に形成される場合に、或いは例えばコーティング(例えば光学コーティング)、または構造物(例えばアレイに近位のバッフルまたは他の外形の構造物)の使用により、チャンバーがバックグラウンドを減らすように別に構成される場合に、チャンバーは、「アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成される」。典型的にチャンバーは、アレイでシグナルの差異を検出することを可能にするために、溶液中のシグナルが十分に低いように、アレイに近位の次元(例えば深さ)を有するように構成される。例えば1つの実施形態では、チャンバーは、アレイ上方に約1mmの深さ未満であり;望ましくは、チャンバーは、約500μm未満の深さである。典型的にチャンバーは、アレイ上方に約400μm未満、約300μm未満、約200μm未満、または約150μm未満の深さである。本明細書において提供される1例では、チャンバーは、約142μmの深さである。
「高性能核酸アレイ(high-efficiency nucleic acid array)」は、ハイブリダイゼーション条件下で、プローブまたはプローブフラグメントに効率的にハイブリダイズする捕捉核酸のアレイである。典型的な実施形態では、アレイは、反応/検出チャンバーの内面上にフォーマットされる。アレイは、表面上のスポッティングから化学または光化学合成までの任意の従来型のアレイ技術により形成され得る。高性能は、プローブまたはフラグメントを認識する捕捉プローブの領域の長さを制御することにより(より短いプローブは、長いプローブよりも効率的にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション条件のために最小のハイブリダイゼーションの長さに下げる)、そしてそれぞれのアレイ領域における捕捉核酸の数を制御することにより達成される。捕捉部位は、捕捉部位と表面の間に連結配列または構造を含むことにより、ハイブリダイゼーションのためにより効率的/利用可能であるように作製され得る(したがって、ハイブリダイゼーションにおける表面効果を減らし得る選定された表面からの距離で、捕捉部位をフォーマットする)。例えば核酸配列またはポリエチレングリコールリンカー(または両方)は、使用され得る。それぞれのアレイ領域における捕捉核酸の数は、所定のプローブまたは典型的な増幅反応の結果として生み出されるフラグメントのためのハイブリダイゼーションに利用可能なサイトの数が比率制限ではないように、分配される。上記のように、これは、増幅反応の間に生み出される標識プローブフラグメントを結合するために利用可能なサイトの数が過剰にあることを意味し、且つ好適には増幅反応後の反応混合物中のプローブフラグメントの濃度により飽和されるであろう部位の数が実質的に過剰にあることを意味する。
「標識プローブ(labeled probe)」は、増幅条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズする分子または化合物であり、そしてそれは、検出可能な部分を含んで成るか、または検出可能に作製され得る。最も典型的には、標識プローブは、蛍光色素分子、染料、発光原子団、量子ドット等の光学標識を含んで成る核酸である。標識は直接検出され得るか、または例えばプローブがクエンチャー部分を含んで成る場合には消光状態にあり得る。本明細書における多くの実施形態では、標識プローブは、標的核酸増幅の間に開裂し、検出可能な標識を含んで成るプローブフラグメントを放出する。例えば標識プローブは、例えば増幅反応がプローブの開裂をもたらし、標識プローブフラグメントを放出する場合の蛍光色素分子及びクエンチャーを含み得る。最も典型的には、プローブは、「フラップ」領域を含むだろう。このフラップ領域は、ハイブリダイゼーションの間に標的と塩基対にならず、そしてヌクレアーゼ(例えばポリメラーゼのヌクレアーゼ活性)により残りのプローブから開裂されることにより、プローブフラグメントを形成する。
以下の実施例は、説明のために示されるものであって、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。本明細書において記載されている実施例及び実施形態は、説明を目的とするだけであり、またそれを踏まえた多様な改良または変更は、当業者に提案されるだろうし、且つ本出願の精神及び視野、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
実施例 検出システム
本実施例の検出システムは、標的核酸の単一チャンバー、多重化、リアルタイムPCR検出を可能にする。システムは、伝統的なスペクトル識別からアレイに基づく空間識別に移行することにより、リアルタイムPCRの多重化能を広げ、増幅されるそれぞれの標識に特異的なリアルタイム情報を作り出す。
本実施例の検出システムは、標的核酸の単一チャンバー、多重化、リアルタイムPCR検出を可能にする。システムは、伝統的なスペクトル識別からアレイに基づく空間識別に移行することにより、リアルタイムPCRの多重化能を広げ、増幅されるそれぞれの標識に特異的なリアルタイム情報を作り出す。
伝統的に単一ウェル多重化は、それぞれの単位複製配列に特異的であり、且つ異なる波長の蛍光色素分子により標識されるTAQMAN(商標)プローブ等のPCRプローブを用いて達成される。この手法では、染料発光スペクトル及びスペクトルウィンドウに制限されるために、単一反応多重化能が、最大で約5個の標的までに制限される。
本実施例において記載される手法では、単位複製配列の代わりとしての役割を果たし、処理の間にアレイを固定した表面に増幅の進行についての情報を伝達する、標識PCRプローブを使用する。増幅の反応速度論についての情報は保存され、サイクル数の閾値化法に基づき、検出及び定量化情報の両方を獲得することを可能にする。
PCRサイクルにおける伸長ステップの間に、Taqポリメラーゼの5’−3’ヌクレアーゼ活性は、PCRプローブを開裂し、その後に選択的にアレイ表面上の捕捉プローブにハイブリダイズし得るフラップ核酸を放出する。それぞれのフラップ及び対応する捕捉プローブは、試験パネル中で潜在的な標的に特有である。
反応チャンバーの深さ
実験は、所定のアレイについてのシグナル対バックグラウンドノイズ比率に対するチャンバー厚の関係を評価するために行った。さまざまな深さのチャンバーにより基板を機械加工し、そして官能化ポリマーでコーティングした。チャンバーの実際の深さを測定した。その後に捕捉プローブにより基板をスポット化し、そしてUV硬化エポキシを用いて囲まれた反応チャンバー中に集めた。アレイ上でそれぞれの捕捉プローブに相補的である標識プローブフラグメントの45nMの合成模倣体、及び255nMの対応の無傷のプローブ(模倣体に対し15%の開裂)を含む溶液を、それぞれの囲まれた反応チャンバーの中にピペットで取り、そしてシグナル対バックグラウンドシグナルを、30℃での3分のハイブリダイゼーション後に測定した。1つの分析の結果は、図13に示されている。図13から明らかなように、600ミクロン〜200ミクロンを下回る反応チャンバー厚の減少は、300ミクロン厚を下回る、及びより好適に200ミクロン厚を下回る最適な比率により、シグナル対バックグラウンドノイズ比率の劇的な増加を示した。
実験は、所定のアレイについてのシグナル対バックグラウンドノイズ比率に対するチャンバー厚の関係を評価するために行った。さまざまな深さのチャンバーにより基板を機械加工し、そして官能化ポリマーでコーティングした。チャンバーの実際の深さを測定した。その後に捕捉プローブにより基板をスポット化し、そしてUV硬化エポキシを用いて囲まれた反応チャンバー中に集めた。アレイ上でそれぞれの捕捉プローブに相補的である標識プローブフラグメントの45nMの合成模倣体、及び255nMの対応の無傷のプローブ(模倣体に対し15%の開裂)を含む溶液を、それぞれの囲まれた反応チャンバーの中にピペットで取り、そしてシグナル対バックグラウンドシグナルを、30℃での3分のハイブリダイゼーション後に測定した。1つの分析の結果は、図13に示されている。図13から明らかなように、600ミクロン〜200ミクロンを下回る反応チャンバー厚の減少は、300ミクロン厚を下回る、及びより好適に200ミクロン厚を下回る最適な比率により、シグナル対バックグラウンドノイズ比率の劇的な増加を示した。
PCRチャンバー及びアレイ
大部分の実験において使用したPCRチャンバーは、図2に示されている。示されているように、チャンバーは、PCRプローブのフラップ配列に相補的である捕捉オリゴのアレイを含んで成る底部表面から成る。捕捉プローブは、Integrated DNA Technologies Inc.(Coralville, Iowa)により合成され、且つ結合化学構造とオリゴ配列の間のポリエチレングリコールリンカーとともに、PCRチャンバーの底部を形成している基板への共有結合のために5’末端アミノ基を有する。配列の長さは、対応するPCRプローブフラップと同一である。PCRチャンバーの底部は、商業的に入手可能なスライドから形成した。このスライドは、捕捉プローブのその後の結合のために活性NHSエステルを含むポリマーコーティングを備えた。スライドは、ポリマーコーティングによりコーティングされたガラス及びプラスチック基板の両方を含めた。両タイプのスライドは、類似の実験データをもたらす。捕捉プローブは、標準的なアレイプロトコルに従い、SPOTBOT(商標)(Arrayit Technologies (Sunnyvale、CA))を用いてスポット化される。捕捉プローブスポットは、典型的にスポット間で200μmの中心から中心のピッチで、100μmの直径であった。
大部分の実験において使用したPCRチャンバーは、図2に示されている。示されているように、チャンバーは、PCRプローブのフラップ配列に相補的である捕捉オリゴのアレイを含んで成る底部表面から成る。捕捉プローブは、Integrated DNA Technologies Inc.(Coralville, Iowa)により合成され、且つ結合化学構造とオリゴ配列の間のポリエチレングリコールリンカーとともに、PCRチャンバーの底部を形成している基板への共有結合のために5’末端アミノ基を有する。配列の長さは、対応するPCRプローブフラップと同一である。PCRチャンバーの底部は、商業的に入手可能なスライドから形成した。このスライドは、捕捉プローブのその後の結合のために活性NHSエステルを含むポリマーコーティングを備えた。スライドは、ポリマーコーティングによりコーティングされたガラス及びプラスチック基板の両方を含めた。両タイプのスライドは、類似の実験データをもたらす。捕捉プローブは、標準的なアレイプロトコルに従い、SPOTBOT(商標)(Arrayit Technologies (Sunnyvale、CA))を用いてスポット化される。捕捉プローブスポットは、典型的にスポット間で200μmの中心から中心のピッチで、100μmの直径であった。
捕捉プローブのスポッティング及び洗浄後に、図2において示されているように、感圧接着剤(PSA)、及び入口及び出口を有するポリカーボネート頂部部品を用いてPCRチャンバーを集めた。チャンバーは、142μMの最終的な深さ/厚さ(または高さ)、及び15mmの直径を有した。チャンバーは、約45μLの容積のPCR試薬を保持する。
熱循環装置及び光学ブレッドボード
熱循環及び光検出システムは、(1)励起光源(例えば水銀アークランプまたはLED)、(2)Cy3、Cy5等の特異的な組み合わせの蛍光色素分子が検出されるように、励起光及び発光のために使用される干渉光学フィルター、並びに(3)CCDまたはCMOSカメラである光検出器を含む落射蛍光、単一チャネル検出システムを含めた。
熱循環及び光検出システムは、(1)励起光源(例えば水銀アークランプまたはLED)、(2)Cy3、Cy5等の特異的な組み合わせの蛍光色素分子が検出されるように、励起光及び発光のために使用される干渉光学フィルター、並びに(3)CCDまたはCMOSカメラである光検出器を含む落射蛍光、単一チャネル検出システムを含めた。
システムは、さらに封入された消耗品(例えば上記のアレイ及びチャンバー)を所望される温度及び所望される時間で急速に熱循環させるために使用した1対の熱電モジュール、金属板、ヒートシンク及び強力な冷却ファン等の熱循環構成要素も含めた。制御システムへのフィードバックとして消耗品に近位のサーミスタを使用した、フィードバックを可能とする制御システムの使用により、熱電モジュールを特定の期間、特定の温度に制御した。
システム制御は、標的温度及び期間を作り出し、並びに光検出器により画像がいつ取得されたかを特定するインプットとしてスクリプトファイルを用いたコンピューターにより行った。熱反応の間の異なる時間で取得された画像をコンピューターにより分析し、機能時間としての強度曲線を作り出し、それにより標的の濃度を導き出した。
単一チャネル蛍光画像は、熱反応が進む間の多様な時間及び温度で消耗品から得た。その後にこれらの蛍光画像を分析し、出発標的核酸濃度の定量化を生み出した。中間グレイ強度測定、バックグラウンド補正及びベースライン修正の組み合わせを用いて、蛍光画像を分析した。バックグラウンドは、アレイ中のそれぞれのスポットについて局所的に測定した。バックグラウンドは、注目のスポットを取り囲む溶液の同心環の蛍光強度を測定することにより計算した。その後に局所バックグラウンドを説明するために、それぞれのスポットからのシグナルを補正した。スポッティングにおける変動性、及び視野における一様でない照明を説明するために、補正したそれぞれのスポットからのシグナルをさらに正規化した。最初のいくつかのサイクル、典型的に5〜15サイクルから得られた補正された強度測定の平均値は、ベースラインを調整するために、及びそれぞれのスポットからの測定を正規化するために、その後に使用した。
実施例1:3段階増幅反応
増幅試薬混合は、それぞれ増幅される標的に特異的である2つのPCR増幅プライマー、及びそれぞれ増幅される標的に特異的であるPCRプローブを含む標準的なPCR試薬を含んだ。典型的なプローブの構造は、図1Aに概略的に示されている。示されているように、図1Aのプローブ領域(A)は、伝統的なリアルタイムPCRプローブに典型的なもの(例えばTAQMAN(商標)プローブにおけるようなもの)と同一の法則を用いて設計された標的単位複製配列に相補的であるプローブの核酸領域を表す。プローブ領域(B)は、標的核酸ではなく、対応する捕捉プローブ(後に検討されている)に相補的である直交核酸「フラップ」配列を表す。説明の目的のための一例では、本配列は、他のプローブ設計が置き換えられ得るが、40°〜46℃の間のTmを有するように設計される。一例では、配列の長さは、約13または14塩基である。プローブ領域(C)は、核酸領域(B)の配列の一部分に相補的である配列を有する核酸を表す。この配列は、例えば47〜51℃のTmを有する全長プローブの二次構造の形成を促進するように設計される。クエンチャー(D)は、任意のクエンチャー分子を表す。標識(E)は、蛍光色素分子または他の光検出標識を表す。蛍光色素分子Cy3は、以下に提示したデータのために使用した。
増幅試薬混合は、それぞれ増幅される標的に特異的である2つのPCR増幅プライマー、及びそれぞれ増幅される標的に特異的であるPCRプローブを含む標準的なPCR試薬を含んだ。典型的なプローブの構造は、図1Aに概略的に示されている。示されているように、図1Aのプローブ領域(A)は、伝統的なリアルタイムPCRプローブに典型的なもの(例えばTAQMAN(商標)プローブにおけるようなもの)と同一の法則を用いて設計された標的単位複製配列に相補的であるプローブの核酸領域を表す。プローブ領域(B)は、標的核酸ではなく、対応する捕捉プローブ(後に検討されている)に相補的である直交核酸「フラップ」配列を表す。説明の目的のための一例では、本配列は、他のプローブ設計が置き換えられ得るが、40°〜46℃の間のTmを有するように設計される。一例では、配列の長さは、約13または14塩基である。プローブ領域(C)は、核酸領域(B)の配列の一部分に相補的である配列を有する核酸を表す。この配列は、例えば47〜51℃のTmを有する全長プローブの二次構造の形成を促進するように設計される。クエンチャー(D)は、任意のクエンチャー分子を表す。標識(E)は、蛍光色素分子または他の光検出標識を表す。蛍光色素分子Cy3は、以下に提示したデータのために使用した。
本実施例におけるデータについてのPCRは、以下の試薬製剤:200nMプライマー、IX FAST START(商標)PCR緩衝剤(Rocheから入手可能)、2〜6mMのMgC12、0.5mg/mLのBSA、0.2単位/μL FAST START(商標)Taqポリメラーゼ(Roche)、及び150nMのPCRプローブにより行った。
100μLのPCR反応は、上記の製剤を用いて調製した。本実施例において使用したPCRプローブ配列は:
であった。
5’及び3’フラップは、下線/二重下線で表示され、そして伝統的なTaqMan配列は、太字で示されている。二重下線の配列は、二次構造を形成するために設計された相同領域を表示する。mFold(idtdna.com)により、PCR緩衝剤条件を用いて決定された二次構造の予測される融解温度は、51℃であった。PCRプローブは、3’末端で、5’Cy3蛍光色素分子及びBlack Hole Quencher moietyにより標識した。
PCRチャンバーの底部基板に結合した捕捉プローブ配列は:PCR緩衝剤条件を用いて42℃のTmを有す、NNN NNNNNNNNN N(配列番号:2)であった。
標的配列を含んで成るDNAプラスミドを、106、104、及び102コピー/μLの濃度で、それぞれのPCR反応に添加した。その後に溶液を95℃に加熱することにより脱気した。脱気後、ポリメラーゼを添加し、そしてピペットを用いて、反応をPCRチャンバー中に充填した。平行分析のために、残された溶液をApplied Biosystems 7500に充填した。
アレイに基づくPCRのサイクル条件は、以下の通りである:
変性及び伸長は、5サイクルの間に行い、そしてその後の変性/伸長/ フラップハイブリダイゼーション及び光読み取りは、8サイクルの間に繰り返した。
ABI7500のサイクル条件は、以下の通りである:
変性/伸長及び読み取りは、40サイクルの間に行った。
コピー数滴定の結果は、アレイに基づくPCRについては図3、及び液相PCRについては図4に示されている。図に示されるように、結果は同等なものであり、類似の滴定についての挙動を与える。
実施例2:2段階増幅反応
上記の実施例1のように、増幅試薬混合は、増幅されるべきそれぞれの標的と相補的である2個のPCRプライマー(200nM)、及び増幅されるべきそれぞれの標的に相補的である配列を有するPCRプローブ(300nM)を含む標準PCR試薬を含んだ。典型的なプローブの構造は、図1Bに示されている。示されているように、標識プローブは、さらに伝統的なリアルタイムPCRプローブ(すなわちTaqMan)に典型的なものと同一の法則を用いて設計された標的単位複製配列に相補的である核酸フラグメント(A)を含む。さらに含められるのは、捕捉アレイ上の対応する捕捉プローブに相補的である直交核酸「フラップ」配列(B)である。プローブは、フラップ部分Bにつながれた蛍光標識(C)、及び標的特異的部分(A)につながれたクエンチャー部分(D)も含む。
上記の実施例1のように、増幅試薬混合は、増幅されるべきそれぞれの標的と相補的である2個のPCRプライマー(200nM)、及び増幅されるべきそれぞれの標的に相補的である配列を有するPCRプローブ(300nM)を含む標準PCR試薬を含んだ。典型的なプローブの構造は、図1Bに示されている。示されているように、標識プローブは、さらに伝統的なリアルタイムPCRプローブ(すなわちTaqMan)に典型的なものと同一の法則を用いて設計された標的単位複製配列に相補的である核酸フラグメント(A)を含む。さらに含められるのは、捕捉アレイ上の対応する捕捉プローブに相補的である直交核酸「フラップ」配列(B)である。プローブは、フラップ部分Bにつながれた蛍光標識(C)、及び標的特異的部分(A)につながれたクエンチャー部分(D)も含む。
2段階増幅のための直交フラップ(B)は、70℃の捕捉アレイ上でその相補体が持つTmを有するように設計された配列を含んで成る。典型的に配列の長さは、25〜27塩基である。上記の実施例1のように、全体のプローブは、最も安定した二次構造が、PCRに使用される緩衝剤条件における伸長及び測定温度を下回るわずか10℃ほどのTmを有すように設計される。オリゴは、www[dot]idtdna[dot]comで入手可能な公表されたソフトウェアを用いて設計した。以下のPCRプローブ配列は、本実施例において使用した。
二重下線の配列は直交フラップを構成し、そして下線がない配列は、単位複製配列と相同である。プローブの最も安定な二次構造は、45℃の溶融温度を有する。直交フラップのTmは、71℃である。PCRプローブは、3’末端上で内部Cy3蛍光色素分子C(GE Healthcare Biosciences、Piscataway、NJより入手可能)及びBlack Hole Quencher 2 moiety D(Biosearch Inc. Novato、CAより入手可能)により標識した。
PCRプローブのフラップ部分と相同であった捕捉プローブをスポット化した。以下のサイクル条件以外は、上記の通りPCRを行った。
40回のサイクルを実施し、そしてそれぞれの伸長ステップの終了時に蛍光シグナルを測定した。図12は、1回目が標的DNAプラスミド104個のコピーの着手で存在し、さらに2回目が106個のコピーで存在した場合、2つの標的のためのアレイに基づくPCRについてのコピー数滴定を示す。
実施例3:未消光PCRプローブを用いるアレイに基づくPCR曲線
以下の例外を除き、実施例1と同一のプロトコルを用いた。使用されるPCRプローブ配列は、以下の通りである。
以下の例外を除き、実施例1と同一のプロトコルを用いた。使用されるPCRプローブ配列は、以下の通りである。
本配列を5’Cy3蛍光色素分子で標識したが、3’クエンチャーを含めなかった。106個の標的のコピーを添加し、そしてPCRを処理した。リアルタイムデータは、図5に示されている。
実施例4:多重化アレイに基づく増幅
本実験は、同一のPCRチャンバー中の多重標的についてのデータ取得能及び増幅能を確立する。PCR条件は、以下の例外を除き、実施例1に示されたものと同一である。第一に、それぞれデータを取得されるべき標的に特異的である5セットのプライマー及び5個の別個のPCRプローブを、PCR反応に添加する。第二に、5個の特有の捕捉プローブを、それぞれ5個のPCRプローブの5’フラップ配列に対応するPCRチャンバーの底部基板上に付着させる。第三に、10回目のPCRサイクル後に、実施例1では5サイクルごとであったところ、2サイクルごとに温度を30℃の表面ハイブリダイゼーション温度まで下げた。これは、PCR増幅の間により高頻度の光学的データ取得を可能にする。
本実験は、同一のPCRチャンバー中の多重標的についてのデータ取得能及び増幅能を確立する。PCR条件は、以下の例外を除き、実施例1に示されたものと同一である。第一に、それぞれデータを取得されるべき標的に特異的である5セットのプライマー及び5個の別個のPCRプローブを、PCR反応に添加する。第二に、5個の特有の捕捉プローブを、それぞれ5個のPCRプローブの5’フラップ配列に対応するPCRチャンバーの底部基板上に付着させる。第三に、10回目のPCRサイクル後に、実施例1では5サイクルごとであったところ、2サイクルごとに温度を30℃の表面ハイブリダイゼーション温度まで下げた。これは、PCR増幅の間により高頻度の光学的データ取得を可能にする。
PCRプローブ及び捕捉プローブ配列を以下に示す。
上記のプライマー及びPCRプローブに特異的な配列を包含する5個の標的プラスミドを、100μLのPCR反応に添加し、そして上記のように溶液を調製及び充填した。得られたリアルタイムアレイに基づくPCRデータは、図6に示されている。
実施例5:高レベル多重化
本実施例は、本実施例のパネル中に含められる任意の10個の潜在的な標的であり得る多重標的を検出するための単一チャンバー多重化を実証する。この多重化のレベル−6個以上の潜在的な標的のパネル−は、伝統的な液相PCRにおいては達成され得ない。
本実施例は、本実施例のパネル中に含められる任意の10個の潜在的な標的であり得る多重標的を検出するための単一チャンバー多重化を実証する。この多重化のレベル−6個以上の潜在的な標的のパネル−は、伝統的な液相PCRにおいては達成され得ない。
実験材料及び手順は、以下を除き、上記のものと同一であった。最初の10個のプライマーセット及びPCRプローブは、上記と同じ濃度でPCR反応中に導入された。PCRプローブ及び捕捉プローブの配列を以下に示す。
図7は、PCR反応に添加された標的がない場合(鋳型コントロールなし)に得られたリアルタイムのアレイに基づくPCR曲線を示す。図に示されるように、標的を除き、全てのPCR構成要素を含む溶液から得られたシグナルはなかった。図8は、10,000個のコピー/μLで添加された3個のプラスミド標的(MPV、OPC−1、PIV2)による同一の実験を示す。
実施例6:高速ハイブリダイゼーション反応速度論の実証
上記のようにPCRチャンバーを構成した。以下のアミン、ペグ化捕捉プローブ配列を底部基板上に付着させた:NNNNNNNNNNNNN(配列番号:38)。
上記のようにPCRチャンバーを構成した。以下のアミン、ペグ化捕捉プローブ配列を底部基板上に付着させた:NNNNNNNNNNNNN(配列番号:38)。
PCRプローブの5’フラップ部分を模倣し、5’末端でCy3蛍光色素分子により標識され、且つ捕捉プローブに相補的である、以下のオリゴ配列(100nM)を含む上記のPCR緩衝剤を含む溶液を調製した:NNNNNNNNNNNN N(配列番号:39)。
溶液をPCRチャンバー中に充填し、そしてチャンバーを60℃に加熱し(二本鎖のTmを15度超える)、そしてその後に30℃まで冷却した。これは、PCRプロトコルのハイブリダイゼーションステップ間の条件を模倣する。光読み取りは、2分間で、20秒ごとに行った。得られたデータは、図9に示されている。
データの1つの注目の態様は、内部温度が30℃に達する瞬間に、すでに著しいハイブリダイゼーションが起こっていることを示す。
本明細書において概説した手法は、これまでの手法では見いだされなかった多重の利点を有する。本発明のシステムは、増幅工程の間にリアルタイムで、液相PCRからアレイをとどめた表面に情報を効果的に伝達することにより、単一チャンバー、高度に多重化された定量的なPCRを可能にする。これは、液相リアルタイムPCRの効率を維持し、且つ蓄積された膨大な知識体系を活用しながらより高いレベルの多重化を可能にする。これを達成するために、システムの多重の新規の態様が開発される必要があった。
例えば、本発明の1つの特徴は、液相と固相を橋渡しする代わりに、単位複製配列を使用することである。アレイに基づくリアルタイムPCRのゴールに向かうことを目的としたこれまでの教示は、一般に固相アレイへの単位複製配列自体のハイブリダイゼーションに依存してきた。これは、要求される情報を解明するために、システムを複雑化し、効果を妨げ、そしてより高価な構成要素を要求する、多重の論点を提示する。多重化PCR環境では、類似する長さ及びハイブリダイゼーション効率の単位複製配列を設計することは、非常に困難である。開裂可能な5’フラップを有するPCRプローブの使用は、ハイブリダイゼーション反応速度論に理想的な非常に短い配列を採用することにより、それぞれの単位複製配列から表面へ情報を伝達する物質を均質にする。本手法は、さらに検出されるべき単位複製配列の配列から独立したアレイ上の捕捉プローブ配列も作製する。これは、最も好都合な捕捉配列の選定、及び多くの多様な標的パネルに使用され得る万能アレイの実現性を可能にし、設計及び製造手法を簡略化する。
本明細書において開示されるようなPCRプローブは、さらにプローブに基づく液相リアルタイムPCRのためにすでに開発済みである設計規則も活用する。ハイブリダイゼーションへの非常に短い配列(例えば13〜14塩基)の使用は、ハイブリダイゼーションを非常に効率的にし、標準的なPCR緩衝剤の低い塩環境において、アレイ上に高いシグナルを可能にする。したがってシステムは、表面ハイブリダイゼーションが、最適な液相PCRとつながれる必要がある場合に、単一チャンバー中で非常によく働くことができる。
本発明の他の特徴は、液相バックグラウンド蛍光から、表面ハイブリダイズシグナルを識別することある。本発明の本態様は、アレイからの関連情報を抽出するのに重要である。これまでの教示は、この問題を克服するために、表面シグナルを液相バックグラウンドから単離するための全内部反射率または共焦点顕微鏡検査法の使用のような、複雑化された、または高価な光学上の手法を採用する。それに反して、本発明は、識別を達成するために光学的「トリック」がないことを要求する、単純な標準光学装置の使用を提供する。シグナル識別能は、多重源から生じる。アレイにおいて使用される表面化学は、非常に高い捕捉プローブ密度、及び上記のようにハイブリダイズされる標的密度を提供する。表面は、100%の標的核酸の捕捉効率に近づけることができることが示されている。この高い捕捉密度及び効率は、表面シグナルを濃縮し、表面/液相識別を補助する役割を果たす。短い標的核酸の使用は、この効果を劇的に増強する役割を果たす。
シグナル識別を補助する本発明の他の態様は、非常に薄いチャンバーの使用である。溶液からのバックグラウンドシグナルは、アレイ上方の溶液の高さに線形的に関連する。薄いチャンバーの使用は、この効果をうまく利用する。
本発明の他の態様は、液相情報の表面アレイへのリアルタイム伝達を可能にする、高速ハイブリダイゼーション反応速度論の使用である。これらの実施例において記載されるシステムは、極めて高速な固相ハイブリダイゼーションを実証する。この現象は技術を促進し、そして短い5’フラップ標的、最適な固相表面化学構造、薄い消耗品、及び熱循環温度プログラムの間に生み出される温度勾配を含む本発明の多重の態様に起因し得る。
前記の発明は、明瞭さ及び理解の目的のために多少詳しく記載されているが、形態及び詳細における多様な変化は、本発明の真の範囲から逸脱せずに成され得ることは、本開示を読むことから当業者には明確であるだろう。例えば上記の全ての技術及び器具は、多様な組み合わせにおいて使用され得る。本出願において引用されている全ての刊行物、特許、特許出願、及び/または他の資料は、全ての目的のために、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、及び/または他の資料が参照により組み込まれていることが示されているならば、全ての目的のために、同一の範囲で、参照によりそれらの全体が組み込まれている。
PCRチャンバーの底部基板に結合した捕捉プローブ配列は:PCR緩衝剤条件を用いて42℃のTmを有す、NNN NNNNNNNNN Nであった。
実施例6:高速ハイブリダイゼーション反応速度論の実証
上記のようにPCRチャンバーを構成した。以下のアミン、ペグ化捕捉プローブ配列を底部基板上に付着させた:NNNNNNNNNNNNN。
上記のようにPCRチャンバーを構成した。以下のアミン、ペグ化捕捉プローブ配列を底部基板上に付着させた:NNNNNNNNNNNNN。
PCRプローブの5’フラップ部分を模倣し、5’末端でCy3蛍光色素分子により標識され、且つ捕捉プローブに相補的である、以下のオリゴ配列(100nM)を含む上記のPCR緩衝剤を含む溶液を調製した:NNNNNNNNNNNN N。
Claims (85)
- 標的核酸を検出するための方法であって:
少なくとも1つの表面上に、少なくとも1つの高性能核酸検出アレイを有する検出チャンバーを提供し;
前記検出チャンバーに、検出されるべき1つ以上の前記標的核酸のコピーを含んで成るサンプルを充填し;
増幅プライマー及びプローブを前記1つ以上のコピーにハイブリダイズさせ;
増幅プライマー依存性増幅反応において、1つ以上の前記標的核酸のコピーの少なくとも一部を増幅させ、ここで前記増幅反応が、プローブの開裂及び第一のプローブフラグメントの放出をもたらし;
前記第一のプローブフラグメントを前記高性能アレイにハイブリダイズさせ;そして
前記第一のプローブフラグメントを前記アレイに結合させることにより生み出されるシグナルを検出し、それにより前記標的核酸を検出し、ここで前記検出ステップが、前記アレイに近位のバックグラウンドシグナルを減らす条件下で実施されることを含んで成る、前記方法。 - 前記プローブが、標識プローブを含んで成り、且つ前記第一のプローブフラグメントが、標識プローブフラグメントを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記標識プローブフラグメントが、前記アレイへのハイブリダイズにおいて検出可能シグナルを生み出す標識を含んで成る、請求項2に記載の方法。
- 前記検出チャンバーが、前記アレイに近位のシグナルバックグラウンドを減らすように構成されている、請求項1に記載の方法。
- 前記検出チャンバーが、前記アレイに近位の少なくとも1つの次元において500μm未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記検出チャンバーが、前記アレイに近位の少なくとも1つの次元において約10μm〜約200μmの間である、請求項1に記載の方法。
- 前記アレイが、前記第一のプローブフラグメントにハイブリダイズする非比率制限数の捕捉核酸を含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記第一のプローブフラグメントが、前記標的核酸と相補的ではない、請求項1に記載の方法。
- 前記アレイの前記捕捉核酸にハイブリダイズする前記第一のプローブフラグメントが、約30ヌクレオチド長未満である、請求項7に記載の方法。
- 前記アレイの前記捕捉核酸にハイブリダイズする前記第一のプローブフラグメントが、約20ヌクレオチド長未満である、請求項7に記載の方法。
- 前記アレイの前記捕捉核酸にハイブリダイズする前記第一のプローブフラグメントが、約15ヌクレオチド長以下である、請求項7に記載の方法。
- 前記サンプルが、前記チャンバーと動作可能に連結されている少なくとも1つのポートまたは流体チャネルを通って充填される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が、前記検出に先立ち、少なくとも5つの増幅サイクルで増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が、前記検出に先立ち、複数の増幅サイクルにおいて増幅され、ここで前記標的核酸部分が、前記検出後に、前記プローブのさらなるコピーの存在下で増幅され、その結果放出される第一のプローブフラグメントは、その後に前記アレイにハイブリダイズし、そして検出され、ここで検出されるシグナル強度は、前記サンプル中に存在する前記標的核酸の量に相関する、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルが、1つ以上の光学シグナル波長を検出することにより検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルを検出することが、複数のシグナルから複数の光学シグナル波長を検出することを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション温度が、前記増幅反応温度未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記第一のプローブが、前記標的核酸に相補的でない第一の直交フラップを含んで成り、前記フラップが、前記標識プローブから開裂して、前記標識プローブフラグメントを生み出す、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブが、前記第一のフラップに少なくとも部分的に相補的である第二の直交フラップを含んで成り、前記第一のフラップが前記アレイに結合するために有するTmよりも、前記第二のフラップが前記第一のフラップに結合するために有するTmの方が高い、請求項14に記載の方法。
- 前記標識プローブが、蛍光または発光標識を含んで成る、請求項2に記載の方法。
- 前記標識が、蛍光染料である、請求項20に記載の方法。
- 前記プローブが、標識及び標識クエンチャーを含んで成り、前記プローブの開裂が、前記標識及び前記クエンチャーの分離をもたらすことにより、前記標識を未消光化する、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブが、未消光化標識を含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルが光学シグナルである、請求項1に記載の方法。
- 前記検出されたシグナルが、前記第一のプローブフラグメントの前記高性能アレイへのハイブリダイゼーションを示すインターカレーティング染料からのシグナルを含んで成る、請求項24に記載の方法。
- 前記アレイの1つ以上の領域のローカルバックグラウンドを検出し、そして前記バックグラウンドを補正することによりシグナル強度測定を正規化することを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記検出ステップにおいて検出されたシグナルが、2.5超のシグナル対バックグラウンドノイズ比率を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記検出ステップにおいて検出されたシグナルが、5超のシグナル対バックグラウンドノイズ比率を有する、請求項1に記載の方法。
- アレイ捕捉核酸スポッティングにおける変動性、または前記アレイの一様でない多様な領域の視野を補正することにより、シグナル強度を正規化することをさらに含んで成る、請求項26に記載の方法。
- 前記サンプルが、複数の標的核酸を含んで成り、且つ前記アレイが、複数の捕捉核酸タイプを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉核酸タイプが、前記アレイ上で空間的に分離される、請求項30に記載の方法。
- それぞれ異なる核酸標的に特異的である複数の増幅プローブを、前記標的核酸と共にインキュベートすることを含んで成る、請求項30に記載の方法。
- 約5〜約100個の捕捉核酸タイプ、及び約5〜約100個の対応する標識プローブタイプが増幅反応において存在し、ここで5〜100個までの異なるシグナルが前記アレイ中の前記シグナルの位置に基づき検出され得る、請求項30に記載の方法。
- 前記捕捉核酸が、約350fmole/cm2〜約5,000fmole/cm2超の密度で配置される、請求項30に記載の方法。
- 前記捕捉核酸が、2000fmole/cm2超の密度で配置される、請求項30に記載の方法。
- それぞれ異なる標的核酸に特異的である複数の標識プローブを、前記標的核酸と共にインキュベートすることを含んで成り、ここで前記増幅プライマー依存性増幅反応において前記標的核酸の少なくとも一部分を増幅することが、複数の標識プローブタイプの開裂をもたらし、そして複数の標識プローブフラグメントタイプの放出をもたらし、ここで前記ハイブリダイズが、前記複数のプローブフラグメントタイプを前記アレイにハイブリダイズさせることを含んで成り、ここでそれぞれの前記異なるプローブフラグメントタイプが、空間的に別々の捕捉核酸タイプにハイブリダイズし、ここで前記標識シグナルを検出することが、前記アレイ上の空間的に別々の捕捉核酸に対応する複数の空間的に別々の領域からの複数の標識シグナルを検出することを含んで成る、請求項32に記載の方法。
- 前記標識プローブタイプが、同一の標識部分を含んで成る、請求項36に記載の方法。
- 前記標識プローブタイプが、複数の異なる標識部分を含んで成る、請求項36に記載の方法。
- 前記標識プローブタイプが、1つ以上の異なる標識部分を含んで成り、ここで前記異なる部分の数が、前記標識プローブタイプの数よりも少ない、請求項36に記載の方法。
- 前記増幅ステップ、及び前記第一のプローブフラグメントを高性能アレイにハイブリダイズさせるステップが、同一の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 複数の標的核酸配列のサンプルを分析するための方法であって:
前記サンプルを第一の複数の標識プローブと接触させ、
それぞれ前記第一の複数の標識プローブが、標的核酸配列の第一のパネル中の注目の異なる標的配列に相補的な第一の部分、及び高性能プローブアレイ上の異なる捕捉プローブに相補的な第二の部分を含んで成り、ここで前記第二の部分が、そこに結合した標識を有し、且つ前記注目の標的配列に相補的でなく;
増幅プライマー依存性増幅反応において、任意の標的配列を、前記サンプル中に存在する前記標的核酸配列の第一のパネルから増幅し、
ここで前記増幅反応が、前記標的配列にハイブリダイズした標識プローブの開裂、及び前記標識を担持している前記標識プローブの前記第二の部分の放出をもたらし;
前記標識プローブの前記放出された第二の部分を、前記高性能アレイにハイブリダイズさせ;
前記高性能アレイにおける捕捉プローブへの前記標識プローブの前記第二の部分の結合を検出し;そして
前記サンプル中に存在する標的配列を、前記高性能アレイにハイブリダイズする前記標識プローブの前記第二の部分から同定すること、
を含んで成る、前記方法。 - 前記サンプルを、第二の複数の標識プローブと接触させ、
それぞれ前記第二の複数の標識プローブが、前記第二の部分、及び標的核酸配列の第二のパネル中の異なる注目の標的配列に相補的である第三の部分を含んで成り;
増幅プライマー依存性増幅反応において、前記サンプル中に存在する前記標的核酸配列の第二のパネルから、任意の標的配列を増幅し、
ここで前記増幅反応が、前記標的配列にハイブリダイズした標識プローブの開裂、及び前記ラベルを担持している前記標識プローブの前記第二の部分の放出をもたらし;そして
前記ハイブリダイゼーション、検出、及び同定ステップを繰り返すことをさらに含んで成る、請求項41に記載の方法。 - 核酸検出デバイスであって、
少なくとも1つの表面上に少なくとも1つの高性能核酸検出アレイを含んで成り、前記アレイから検出されるシグナルのシグナルバックグラウンドを減らすように構成された検出チャンバー;
前記デバイスの動作間に前記チャンバー中の温度を調節する、前記検出チャンバーに動作可能に接続された熱調節モジュール;及び
前記デバイスの動作間に前記アレイで生み出されるシグナルを検出する光列を含んで成る、核酸検出デバイス。 - 前記デバイスが、前記アレイに近位の少なくとも1つの次元において、約500μm未満の深さである、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記デバイスが、前記アレイに近位の少なくとも1つの次元において、約10μm〜約200μmの深さである、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記表面が、セラミック、ガラス、石英、またはポリマーから構成される、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記捕捉核酸が、前記デバイスの動作間に、非比率制限の密度で前記アレイ中に存在する、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記捕捉核酸が、前記チャンバーの表面上の熱安定性コーティングにつながれた、請求項47に記載の核酸検出デバイス。
- 前記コーティングが、1つ以上の:化学反応基、求電子基、NHSエステル、テトラ−またはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα,β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含んで成る、請求項48に記載の核酸検出デバイス。
- 前記アレイが、多数の捕捉核酸タイプを含んで成り、ここで前記アレイの空間的に固有の領域に異なるタイプが局在化される、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記アレイ上に6個以上の異なる捕捉核酸タイプが存在する、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記アレイ上に、約5〜約100個の異なる捕捉核酸タイプが存在する、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記捕捉核酸が、2000fmole/cm2超の密度で配置される、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記熱調節モジュールが、1つ以上の:熱電モジュール、ペルティエ素子、冷却ファン、ヒートシンク、または前記チャンバーの外面の一部分と一緒になるように構成された金属板を含んで成る、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記熱調節モジュールが、コンピューターに動作可能に接続された、フィードバックを可能とする制御システムを含んで成る、請求項54に記載の核酸検出デバイス。
- 前記光列が、落射蛍光検出システムを含んで成るか、または前記システムと動作可能に接続されている、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記光例が、1つ以上の:励起光源、アークランプ、水銀アークランプ、LED、レンズ、光学フィルター、プリズム、カメラ、光検出器、CMOSカメラ、またはCCDアレイを含んで成る、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記アレイ中のシグナルの位置を検出されるべき核酸と関連付ける、アレイ読み取りモジュールを含んで成る、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- 前記デバイスが、1回以上のシグナル強度の測定と熱調節モジュールにより行われる多くの増幅サイクルを相互に関連付け、前記デバイスにより検出される標的核酸の濃度を決定するコンピューターまたはコンピューター読み取り可能媒体において具現化されるシステム指示を含んで成るか、または前記指示に動作可能に接続される、請求項43に記載の核酸検出デバイス。
- コンピューターと動作可能に接続されており、ここで前記コンピューターは、前記熱調節モジュールにより前記熱循環を制御し、そして光列により画像がいつ取得されたか、または見られたかを特定する指示を含んで成り、そして前記コンピューターは、画像情報を時間関数としてシグナル強度曲線に変換し、そして/または前記デバイスにより分析された標的核酸の濃度を決定する指示をさらに含んで成る、請求項43に記載のデバイスを含んで成るシステム。
- 前記コンピューターが、前記アレイの1つ以上の領域についてのローカルバックグラウンドを検出するための指示、及び前記バックグラウンドを補正することによりシグナル強度測定を正規化するための指示を含んで成る、請求項60に記載のシステム。
- 前記コンピューターが、アレイ捕捉核酸スポッティングにおける変動性、または一様でない前記アレイの異なる領域の視野を補正することにより、シグナル強度を正規化するための指示を含んで成る、請求項60に記載のシステム。
- 核酸検出消耗品であって:約500μm未満の深さの薄いチャンバーを含んで成り、ここで前記チャンバーは透明な窓を含んで成り、ここで前記窓は、前記窓の内面上に配置された高性能捕捉核酸アレイを含んで成り、そして前記チャンバーは、前記チャンバーと流体接続された少なくとも1つの試薬送達ポートをさらに含んで成り、前記チャンバー内の流体の熱循環を可能とするように構成されている、前記核酸検出消耗品。
- 前記核酸アレイが、前記アレイの空間的に固有の領域に位置する複数の異なる捕捉核酸タイプを含んで成る、請求項63に記載の消耗品。
- 前記チャンバーが、前記試薬送達ポートを含んで成る第一の上側表面、及び前記窓を含んで成る底部透明表面を含んで成り、前記頂部及び底部表面が、感圧接着剤材料を含んで成る側壁により接合される、請求項63に記載の消耗品。
- 前記チャンバーが、前記試薬送達ポートを含んで成る第一の上側表面、及び前記窓を含んで成る底部透明表面を含んで成り、前記頂部及び底部表面が、ガスケットにより、或いは前記上側もしくは下側表面、または両表面上の外形的特徴により一緒に接合され、ここで前記ガスケットまたは特徴が、前記上側もしくは下側表面、または両表面の対応する領域に融合または付着される、請求項63に記載の消耗品。
- 前記上側及び下側表面が、超音波により一緒に融合され、前記ガスケットまたは特徴が、融合される領域を区切る、請求項66に記載の消耗品。
- 前記特徴が、前記上側または下側表面のいずれにおいて透明領域であり、且つ関連した上側または下側表面において対応する陰影領域であり、ここで前記上側及び下側表面が、前記透明領域を通り抜け、且つ前記陰影領域上にレーザー光を向けられることにより一緒にレーザー溶接される、請求項66に記載の消耗品。
- 前記ガスケットまたは特徴が、UV硬化性接着剤の流れを導き、ここで前記接着剤は、前記上側及び下側表面の間で流れ、そしてUV光にさらされ、それにより前記上側と下側表面とを接合する、請求項66に記載の消耗品。
- 前記捕捉核酸アレイが、前記窓上の熱安定性コーティングと接続される、請求項65に記載の消耗品。
- 前記コーティングが、化学反応基、求電子基、NHSエステル、テトラまたはペンタフルオロフェニルエステル、モノ−またはジニトロフェニルエステル、チオエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、エポキシド、アジリジン、アルデヒド、ビニルケトンまたはマレイミドを含んで成るα,β−不飽和ケトンまたはアミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミダート、環状酸無水物、環付加反応において活性である基、アルケン、ジエン、アルキン、アジド、或いはその組み合わせを含んで成る、請求項70に記載の消耗品。
- 前記捕捉核酸アレイが、2000fmole/cm2超の密度で配置される、請求項65に記載の消耗品。
- 前記捕捉核酸アレイが、2500fmole/cm2超の密度で配置される、請求項65に記載の消耗品。
- 前記窓が、ガラス、石英、セラミック、またはポリマーを含んで成る、請求項70に記載の消耗品。
- 前記チャンバーが、約10μm〜約200μmの深さである、請求項63に記載の消耗品。
- 前記チャンバーが、約140μm以下の深さである、請求項63に記載の消耗品。
- 前記チャンバーが、約100μm以下の深さである、請求項63に記載の消耗品。
- 前記チャンバーが、約1mm〜約50mmの平均直径である、請求項63に記載の消耗品。
- 前記チャンバーが、約10mm〜約20mmの平均直径である、請求項63に記載の消耗品。
- 包装材料中に包装された請求項63に記載の消耗品を含んで成り、場合により1つ以上のコントロール試薬を含んで成るキット。
- サンプル中の標的核酸配列の存在を検出するための方法であって:
第一の標的核酸配列に相補的である第一の部分、及び前記第一の標的核酸配列に相補的でない第二の標識部分を含んで成る第一の標識プローブの存在下で、前記標的核酸配列が増幅される時に前記第二の部分が前記第一の部分から開裂するように、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いて、前記サンプルにおいて増幅反応を行い;
前記第二の標識部分を、前記第二の部分に相補的である捕捉プローブを含んで成る基板にハイブリダイズさせ;そして
前記基板上の前記捕捉プローブにハイブリダイズした前記第二の標識部分の存在を検出すること
を含んで成る、前記方法。 - 前記基板が、平面基板を含んで成る、請求項81に記載の方法。
- 前記基板が、ビーズを含んで成る、請求項81に記載の方法。
- それぞれ異なる標的核酸配列に相補的である第一の部分、及び任意の前記異なる標的核酸配列に相補的でないそれぞれ異なる配列を含んで成る第二の標識部分を有する多数の標識プローブを、前記異なる標的核酸配列が増幅される時に、前記第二の標識部分が、前記第一の部分から開裂されるように提供すること;
前記増幅反応の間に開裂される前記第二の標識部分を、それぞれ異なる標識された第二の部分に相補的であり、それぞれ前記平面基板上の異なる公知の位置に配置される複数の異なる捕捉プローブにハイブリダイズさせること;そして
前記基板上で標識された第二の部分が前記捕捉プローブにハイブリダイズする位置から、前記サンプル中の標的核酸配列の存在を同定すること
をさらに含んで成る、請求項82に記載の方法。 - それぞれ異なる標的核酸配列に相補的である第一の部分、及び任意の前記異なる標的核酸配列に相補的でないそれぞれ異なる配列を含んで成る第二の標識部分を有する多数の標識プローブを、前記異なる標的核酸配列が増幅される時に、前記第二の標識部分が、前記第一の部分から開裂されるように提供すること;
前記増幅反応の間に開裂される前記第二の標識部分を、それぞれ異なる標識された第二の部分に相補的であり、それぞれ特有の標識を担持している異なるビーズ上に配置される複数の異なる捕捉プローブにハイブリダイズさせること;そして
所定の標的核酸配列の存在を、それが結合する前記ビーズを同定することにより検出すること
をさらに含んで成る、請求項83に記載の方法。
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