CN105189583A - 螯合生物分子的表面氧化及相关方法 - Google Patents

Abstract

提供了包含与固体基底共价结合的聚合物的固体支撑物。所述聚合物在许多应用中具有功效，所述应用包括将分析物分子固定在固体支撑物上以用于高通量测定。

Description

螯合生物分子的表面氧化及相关方法

政府权益声明

本文所述工作的部分资金由美国国土安全部根据资助号HSHQDC-10-C-00053提供的。美国政府拥有本发明的某些权利。

背景

发明领域

本发明通常涉及与氧化表面结合的聚合物、新颖的聚合物及其使用方法。

相关技术描述

生物测定用于探测生物样品中分析物的存在和/或含量。在基于表面的试验中，例如DNA微阵列，通常在固体支撑物或固体基底上捕获并检测分析物种类。由于同时监测大量基因的能力，DNA微阵列的使用在基因表达和基因分型的研究中被广泛采用(Schena等人，Science270:467-470(1995)；Pollack等人，Nat.Genet.23:41-46(1999))。为了促进阵列型的生物测定，也可以使用其他的连接部分，例如糖类、抗体、蛋白质、半抗原或适体来制造表面阵列。

用于生物测定应用的有效官能化材料必须有足够的能力从相关样品中固定足量的分析物，以便在进行检测(例如，聚合酶链反应)时提供适合的信号。适合的官能化材料也必须提供高度重现性的表面，以便将其有利地应用于图谱表征试验中，特别是在样品和对照组必须在与其结合的不同的支撑物表面上来进行分析的测定方式中，例如，不同的支撑物或同一支撑物上不同的位置。例如，由于支撑物与支撑物的差异，或在同一支撑物上不同位置的差异，未基于高度可重现表面化学的支撑物在进行测定(例如图谱表征对比)时会导致显著误差。

通过用聚合物固体支撑物来制备表面阵列(例如，“DNA芯片”)将分析物连接到固体支撑物上。通常，通过固体基底(例如，珠、颗粒、板等)上的前体单体或预聚物的原位聚合反应形成含聚合物的阵列。包含有机聚合物的阵列的选择性和重现性经常高度依赖于多种试验变量，包括单体浓度、单体比例、引发剂浓度、溶剂挥发速率、环境湿度(当溶剂为水时的情况)、交联剂浓度、单体/交联剂/溶剂的纯度、试验室温度、移液时间、喷射条件、反应温度(在热聚合反应的情况下)、反应湿度、紫外辐射的均匀性(在UV光聚合反应的情况下)和环境氧气情况。虽然可以在生产设定中控制这些参数中的许多种，但是即使可能也难以控制所有这些参数。因此，原位聚合反应会导致相对较差的点样与点样、芯片与芯片、批到批之间的重现性。

此外，虽然耗费了大量的工作来开发使用基于二氧化硅的基底(例如玻璃、石英、熔融二氧化硅和硅)的阵列表面(参见，例如，D.Cuschin等人，Anal.Biochem.1997,250,203-211；G.M.Harbers等人，Chem.Mater.2007,19,4405-4414；以及Shi等人的第6,790,613号美国专利，Boles等人的第5,932,711号美国专利，Bardhan等人的第6,994,972号美国专利，Frutos等人的第7,781,203号美国专利，Lewis等人的第7,217,512和7,541,146号美国专利)，但是在使用较便宜的、更易制造的基底(例如聚合物基底)中取得了某些优势。然而，选择和制备这类用于生物测定目的的基底遇到了其他挑战。例如，聚合物基底不但经受由额外的表面官能化如增强的自发荧光、增强的疏水性带来的更严重的问题，还要经受将原位聚合的涂层连接或结合至下方的聚合物基底的挑战。

因此，虽然本领域已取得进步，但在本领域中仍然需要改进的官能化固体基底、聚合物、和将分析物连接到这些固体基底和含有此类聚合物的固体支撑物上的方法，以用于各种测定中，例如DNA微阵列。本发明满足了这一需求并还提供了相关优势。

发明概述

简言之，本发明通常涉及含有与固体基底共价结合的聚合物的固体支撑物。任选地，聚合物可包含与其共价结合的捕获探针，或包含用来与捕获探针形成共价键的官能团。因此所述固体支撑物在很多应用中获得实用性，包括将捕获探针固定在固体基底上，用于分析测定。还提供了包含适合与聚合物反应或相互作用的反应基团的固体基底，以及包含聚合物和任选的捕获探针的固体支撑物。本文公开的聚合物、固体基底和固体支撑物可用于各种分析应用，例如用于单独治疗点(医生办公室、急诊室、家中、现场等)、高通量测试和其他应用中的DNA和蛋白质微阵列中。

固体基底通常包含与聚合物结合的醇、羰基和/或胺部分。因此，相对于先前描述的固体支撑物，本发明的某些实施方案提供了优势，因为聚合物可以通过醇、羰基和/或胺部分与固体基底(例如，有机聚合物)直接共价结合而不需要中间的“连接层”。

在各种实施方案中，本文描述的聚合物、固体基底、固体支撑物和相关方法提供了许多优势。例如，在某些实施方案中，除了在缀合反应中提供的特定条件下之外，本文描述的用于使聚合物与捕获探针缀合的反应基团基本上是惰性的，确保在缀合过程中可预测的和最佳水平的反应性。一些实施方案也使用“点击”化学(例如，叠氮化物和炔烃形成三唑的反应)来使聚合物与捕获探针(例如DNA或寡核苷酸的生物分子)缀合，并且这类化学基本上是pH不敏感的并生产出有限的反应副产物或无反应副产物。

因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了固体支撑物，其包含：

具有外表面的基底；以及

与基底外表面共价结合的多个聚合物，每个聚合物包含至少一个A和C亚基，并任选地包含一个或多个B亚基，其中：

A亚基，每次出现时，独立地包含：

a)第一热化学反应基团，其中第一热化学反应基团能够与捕获探针上的醇、羰基或胺基团形成共价键。

b)第二热化学反应基团，其中第二热化学反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对通过环加成或1,4-共轭加成反应与捕获探针上的目标官能团形成共价键特异的反应性；或者

c)与捕获探针的共价键，

任选的B亚基，每次出现时，独立地包含亲水部分；以及

C亚基，每次出现时，独立地包含与基底外表面的共价连接W，其中W具有以下结构之一：

其中Q为基底的外表面，且其中第一热化学反应基团和第二热化学反应基团的反应性是相互正交的。

本申请也提供了制备所公开的固体基底的方法。例如，在一个实施方案中，所述方法包括：

A)提供固体基底，其包含多个与其外表面共价结合的羟基、羰基或胺官能团、或其组合，其中所述羟基和羰基官能团与固体基底直接结合而不需要中间的连接物，且所述胺官能团通过含有亚胺键的连接物与固体基底结合，亚胺键与固体基底直接结合而不需要中间的连接物；以及

B)在足以使羟基、羰基或胺官能团中的至少一种与D亚基之间形成共价键的条件下，使包含D亚基和任选的E和F亚基的聚合物与固体基底接触，其中：

D亚基，每次出现时，独立地包含第一反应基团，其中第一反应基团为热化学反应基团，其能够与固体基底或捕获探针上的醇、羰基或胺官能团形成共价键；

E亚基，每次出现时，独立地包含亲水部分；以及

F亚基，每次出现时，独立地包含第二反应基团，其中第二反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对于通过环加成或1,4-共轭加成反应与捕获探针上的目标官能团形成共价键特异的反应性，

其中第一反应基团与第二反应基团的反应性是相互正交的。

其他实施方案提供测定目标分析物分子的存在或不存在的方法，该方法包括：

a)提供本文描述的固体支撑物，其中A亚基包含与其共价结合的捕获探针；

b)使分析物探针与固体支撑物接触；以及

c)检测由捕获探针与分析物探针相互作用产生的信号的存在或不存在。

也提供了制备固体支撑物的聚合物和官能化固体基底。例如，在一个实施方案中，本公开内容提供了包含多个与固体基底外表面共价结合的伯胺官能团的固体支撑物，其中所述胺官能团通过包含亚胺键的连接物与固体基底结合。

在其他实施方案中，本公开内容涉及包含G、H和任选的I亚基的聚合物，其中：

G亚基，每次出现时，独立地包含：

a)第一热化学反应基团，其中第一热化学反应基团能够与醇、羰基或胺基团形成共价键；

b)第二热化学反应基团，其中第二热化学反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对于通过环加成或1,4-共轭加成反应与目标官能团形成共价键特异的反应性；

H亚基，每次出现时，具有以下结构：

以及

任选的I亚基，每次出现时，独立地包含亲水部分，并具有以下结构之一：

其中：

R⁴每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

R^8a为H、C₁-C₆烃基或羟烃基；

R^8b为C₁-C₆烃基或羟烃基；

R^9a和R^9b各自独立地为H、C₁-C₆烃基或羟烃基，或者R^9a和R^9b连同与其结合的氮原子一起连接形成杂环；以及

R¹⁰为羟烃基，

其中第一热化学反应基团和第二热化学反应基团的反应性是相互正交的。

通过参考下文的详细描述，本发明的这些方面和其他方面将会是显而易见的。为此，本文示出了多篇参考文献，这些参考文献更详细地描述了某些背景信息、步骤、化合物和/或组合物，并每一篇在此通过引用整体并入本文中。

附图简述

附图中，同一参考编号确定为相似的元件。在图中不必按比例绘出元件的尺寸和相对位置，且一些元件被任意地放大和定位，来改善附图的易读性。此外，所绘制元件的特定形状并非意在传达有关所述特定元件的实际形状的任何信息，并仅被选择为在附图中易于识别。

图1A、1B、1C、1D、1E和1F示出固体支撑物及其制备的示例性实施方案。

图2A、2B和2C说明了示例性的分析方法。

图3A和3B为示例性聚合物的¹⁹FNMR谱。

图4A、4B和4C示出固体支撑物经多次热循环的结果。

图5示出示例性固体支撑物的多个水接触角分析的数据。

图6示出各种固体支撑物在用不同试剂和温度在加帽前后的水接触角的柱状图。

图7示出使用不同溶剂体系的各种固体支撑物的水接触角转变能力的图表。聚合物D＝含35.6mol％DMA的(DMA-PFPA)共聚物。

发明详述

在下文描述中，阐述了某些具体细节以提供对本发明的各种实施方案的充分理解。然而，本领域技术人员理解，不需要这些细节本发明也可以实施。

除非上下文中另外要求，否则在整个说明书和权利要求中，词语“包含(comprise)”及其变型，例如“包括(comprises)”和“包含(comprising)”，解释为开放、包括的意义，如同“包括，但不限于”。

在通篇本说明书中，参考“一(one)实施方案”或“一(an)实施方案”意指本发明的至少一个实施方案中包括结合实施方案所描述的具体的特征、结构或特性。因此，在通篇本说明书中，不同处出现的短语“在一个(one)实施方案中”或“在一(an)实施方案中”未必所有都指相同的实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，具体的特征、结构或特性可以按任何适合的方式组合。

本文使用的“固体支撑物”指包含固定于其上的聚合物和/或捕获探针的基底。在某些实施方案中，聚合物通过共价键固定在基底上，需要或不需要将其固定在基底上的中间连接物。连接物可通过一个或多个共价键或通过诸如离子相互作用的其他的相互作用固定在基底上。在通篇说明书中，某些实施方案涉及装置形式的固体支撑物。

“基底”或“固体基底”指为固定所描述的聚合物而用作支撑物或底物的物体或物质。基底通常是固态物体，且无磁性。根据期望的应用，基底可以具有任何形状，例如，可以将基底提供为平面的基底，虽然基底可以具有任何有用的形状或结构。下文中提供了基底的示例性材料。

“热化学反应基团”指其反应性不需要UV或其他用于反应的辐射源的反应基团。示例性的热化学反应基团包括，但不限于：活化的酯(例如，五氟苯基酯，“PFP”)、环氧化物、二氢唑酮、活化的羟基、马来酰亚胺等，以及环加成和共轭加成反应基团。

“环加成反应基团”指对与互补官能团反应形成环状部分特异的的热化学反应基团。示例性的环加成反应基团包括，但不限于：通过环加成反应形成三唑部分的炔烃和叠氮化物。其他实例包括通过Diels-Alder型环加成与适当的互补官能团反应的二烯和亲二烯体。

“共轭加成反应基团”指对共轭加成反应中的反应特异的热化学反应基团。例如，含α,β不饱和羰基的化合物和在1,4-共轭加成反应中能够与该化合物反应的亲核试剂为共轭加成反应基团的实例。

基底的“外表面”或“表面”指基底的最外层部分。在某些实例中，所述外表面为基底本身的外表面。在其他实例中，基底包含第一表面，其为基底本身的外表面，以及固定于其上的是连接物或“连接层”，其被称为第二表面。聚合物固定(共价地或通过其他方式)在基底的“外表面”或“表面”包括聚合物固定在基底本身的表面或固定在第二表面(连接部分或连接层等)，或其组合。外表面可以是(1)基底本身的表面，(2)源于等离子体处理的第一表面，或(3)具有连接物或“连接层”的第二表面。

关于支撑物的“固定(immobilizing)”或“固定的(immobilized)”包括共价缀合、非特异性缔合、离子相互作用以及其他将物质(例如，聚合物)附着于基底的方式。

“聚合物”指含有一个或多个重复亚基的分子。亚基(“单体”)可以相同也可以不同，且可以按任何位置或顺序存在于聚合物中。聚合物可以是天然来源或合成来源。本发明包括各种类型的聚合物，包括含有有序的重复亚基的聚合物、无规共聚物和嵌段共聚物。含有两种不同单体类型的聚合物被称为共聚物，而含有三种不同类型单体的聚合物被称为三元共聚物，等等。

“无规聚合物”指亚基沿聚合物链以无规顺序连接的聚合物。无规聚合物可包含多种不同亚基。在某些实施方案中，本文描述的以无规顺序连接的聚合物为“无规共聚物”或“无规三元共聚物”，分别意指该聚合物包含两种或三种不同的亚基。在无规聚合物中单个的亚基可以以任何的摩尔比率存在，例如相对于聚合物中其他亚基的摩尔数，每个亚基可以以约0.1摩尔百分比至约99.8摩尔百分比存在。在某些实施方案中，无规共聚物的亚基可以由以下的一般结构表示：

其中X和Y为独立的独特单体亚基，而a和b为表示聚合物中每个亚基数目的整数。为便于示例说明，上述结构描述了X和Y的线性连接；然而，需强调的是，本发明的无规共聚物(例如，无规共聚物、无规三元共聚物等)不限于具有所述的亚基连接形式的聚合物，并且无规聚合物中的亚基可以按任何无规的序列连接，且聚合物可以被支化。因此，本文描述的聚合物结构，例如结构(I)，意指包括含有按任何顺序连接的亚基的聚合物。

“嵌段共聚物”指包含不同亚基的嵌段或聚合单体的不同嵌段的聚合物。

“官能团”是具有特定类型的反应性(例如，酸性的、碱性的、亲核的、亲电的等)的分子的一部分。“反应基团”是官能团的类型。官能团的非限定性实例包括叠氮化物、炔烃、胺、醇等。“目标官能团”是其他官能团旨在与其反应的任何官能团。“亲水官能团”是具有亲水性质的官能团。亲水官能团一般趋于增大整个分子在诸如水的极性溶剂中的溶解度。

“共价结合”指通过两种或多种官能团的反应形成共价键。

“正交的”或“正交反应性”指官能团和/或反应基团的反应性质。如果两种反应基团具有正交反应性，意指反应基团之一在另一反应基团很大程度上不与目标官能团反应的条件下会与目标官能团反应，反之亦然。

“引发剂”是用于引发聚合反应的分子。用于制备所公开聚合物的引发剂为本领域所熟知。代表性引发剂包括，但不限于：用于原子转移自由基聚合反应、活性聚合反应的引发剂，AIBN族的引发剂和二苯甲酮引发剂。“引发剂残基”是通过自由基或其他机理连接到聚合物上的引发剂的部分。在一些实施方案中，引发剂残基连接到所公开聚合物的末端。

“点击化学”指至少具有以下特点的反应：(1)表现出官能团正交性(即，官能化的部分仅和与该官能化的部分互补的反应性位点反应，不与其他的反应性位点反应)；和(2)所得的键是不可逆的(即，一旦反应物反应形成产物，很难将该产物分解为反应物)。任选地，“点击”化学还可以具有一个或多个下述特点：(1)立体定向性；(2)不涉及严格的纯化、大气控制等的反应条件；(3)容易获得的起始材料和试剂；(4)使用温和试剂或无溶剂的能力；(5)通过结晶或蒸馏分离产物；(6)生理稳定性；(7)大的热力学驱动力(例如，10-20kcal/mol)；(8)单一的反应产物；(9)高(例如，高于50％)的化学产率；以及(10)基本无副产物，或副产物是环境友好型副产物。

使用“点击”官能性的反应的实例可以包括，但不限于：加成反应、环加成反应、亲核取代等。环加成反应的实例可包括Huisgen1,3-偶极环加成反应、Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成反应和Diels-Alder反应。加成反应的实例包括对碳-碳双键的加成反应，例如环氧化反应和双羟基化反应。亲核取代反应的实例可包括对诸如环氧化合物和氮杂环丙烷化合物的张力环的亲核取代反应。其他实例可包括尿素和酰胺的形成。点击化学的另一些描述可得自Huisgen，Angew.Chem.Int.Ed.,Vol.2,No.11,1963,pp.633-696；Lewis等人，Angew.Chem.Int.Ed.,Vol.41,No.6,2002,pp.1053-1057；Rodionov等人，Angew.Chem.Int.Ed.,Vol.44,2005,pp.2210-2215；Punna等人，Angew.Chem.Int.Ed.,Vol.44,2005,pp.2215-2220；Li等人，J.Am.Chem.Soc.,Vol.127,2005,pp.14518-14524；Himo等人，J.Am.Chem.Soc.,Vol.127,2005,pp.210-216；Noodleman等人，Chem.Rev.,Vol.104,2004,pp.459-508；Sun等人，BioconjugateChem.,Vol.17,2006,pp.52-57；以及Fleming等人，Chem.Mater.,Vol.18,2006,pp.2327-2334，其内容在此通过引用将其整体并入本文。

“点击反应性”指官能团能够在点击化学条件下反应。

“点击官能团”是由两个具有点击反应性的官能团反应得到的官能团，例如三唑部分等。

具有对目标官能团“特异的反应性”的反应基团意指在反应条件下该反应基团会优先与目标官能团反应，且与其他官能团的副反应减至最低或不存在副反应。类似的，具有对与捕获探针缀合特异的反应性的反应基团意指在反应条件下该反应基团会优先与捕获探针缀合，且与其他官能团的副反应减至最低或不存在副反应。

“分析物”或“分析物分子”指作为分析对象的化合物或分子，例如，分析物分子可以是未知的结构，而分析包括结构的鉴定。分析物分子包括多种常见分子，包括DNA、蛋白质、肽和糖类、有机和无机分子、金属(包括放射性同位素)等。分析物包括病毒、细菌、疟原虫、真菌以及金属和生物-战争材料、生物-危害材料和化学战争材料。分析物也包括本文定义的分析物探针。

“捕获探针”是能够与分析物分子相互作用的分子，例如通过氢键结合(例如，DNA杂交)、螯合、共价键结合、离子相互作用等。示例性的捕获探针包括能够与寡核苷酸探针或翼(flap)、低聚糖(例如凝集素(lechtins))和蛋白质序列特异性结合(杂交)的寡核苷酸。在一些实施方案中，捕获探针包含荧光团标记。例如，捕获探针可以包含荧光团标记，且分析物分子(例如，分析物探针)可包含淬灭剂，并且通过捕获探针的荧光信号的消失(因为荧光与淬灭剂相互作用而被淬灭)来检测分析物分子的存在。在相关实施方案中，捕获探针包含淬灭剂。在这些实施方案中，被荧光标记的分析物分子的荧光通过被捕获探针捕获而淬灭。

“探针”或“分析物探针”指用于间接识别分析物分子的分子。例如，探针可以承载独特地识别分析物分子的序列信息。示例性的探针包括寡核苷酸等。

“翼”指探针的任选部分。在某些实施方案中，翼包含序列信息以独特地识别探针(由此识别分析物分子)。可将翼从探针的其余部分切割(例如在PCR条件下)并与固体支撑物上的捕获探针杂交。在固体支撑物上存在结合的翼表明存在特定的分析物。

“氨基”指-NH₂自由基。

“叠氮化物”指-N₃自由基。

“氮杂环丙烷”指三元含氮环。

“氰基”或“腈”指-CN自由基。

“羟基”或“羟基(hydroxyl)”指-OH自由基。

“亚氨基”指＝NH取代基。

“硝基”指-NO₂自由基。

“氧代”指＝O取代基。

“硫杂丙环”指三元含硫环。

“硫醇基”指-SH取代基。

“硫代”指＝S取代基。

“磺基”指-SO₃M取代基，其中M为H或诸如K、Na、或铵(即，N⁺(R^aR^bR^cR^d)，其中R^a、R^b、R^c和R^d独立地为H或C₁-C₆烃基)的阳离子。

“烃基”指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链的烃链基，其为饱和的或不饱和的(即，含一个或多个双键(即，烯烃)和/或三键(即，炔烃))，含有一至十二个碳原子(C₁-C₁₂烃基)，优选为一至八个碳原子(C₁-C₈烃基)或一至六个碳原子(C₁-C₆烃基)，并通过单键与分子的其余部分相连，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。在本说明书中，除非另外具体说明，否则烃基可被任选地取代。

“亚烃基”或“亚烃基链”指将分子的其余部分连接到自由基基团的直链或支链二价烃链，仅由碳和氢组成，其为饱和的或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或三键)，且含有一至十二个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基、亚丙炔基、亚正丁炔基等。亚烃基链通过单键或双键与分子的其余部分相连并通过单键或双键与自由基基团相连。亚烃基链与分子其余部分和自由基基团的连接点可以是通过链中的一个碳或任两个碳。在本说明书中，除非另外具体说明，否则亚烃基链可以被任选地取代。

“烃氧基”指式-OR_a的自由基，其中R_a为上文定义的含一至十二个碳原子的烃基自由基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则烃氧基可被任选地取代。

“烃氨基”指式-NHR_a或-NR_aR_a的自由基，其中每个R_a独立地为上文定义的含一至十二个碳原子的烃基自由基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则烃氨基可被任选地取代。

“烃氧羰基”指式-C(＝O)OR_a的自由基，其中R_a为定义的烃基自由基。“羟基烃氧羰基”为包含至少一个羟基取代基的烃氧羰基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则烃氧羰基和羟基烃氧羰基可如下文所描述的被任选地取代。

“硫代烃基”指式-SR_a的自由基，其中R_a为上文定义的含一至十二个碳原子的烃基自由基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则硫代烃基可被任选地取代。

“芳基”指包含氢、6至18个碳原子和至少一个芳香环的烃环系统自由基。为了本发明的目的，芳基自由基可以是单环的、二环的、三环的或四环的环系统，其可以包括稠环或桥环系统。芳基自由基包括，但不限于：衍生于醋蒽烯、苊、醋菲烯、蒽、薁、苯、荧蒽、芴、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯、芘和苯并菲的芳基自由基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则术语“芳基”或前缀“芳”(例如“芳烃基”)意为包含被任选取代的芳基自由基。

“芳烃基”指式-R_b-R_c的自由基，其中R_b为上文定义的亚烃基链，且R_c为一个或多个如上文定义的芳基自由基，例如，苄基、二苯甲基等。在本说明书中，除非另外具体说明，否则芳烃基可被任选地取代。

“环烃基”或“碳环”指仅由碳原子和氢原子组成的稳定的非芳香单环或多环的烃自由基，其可包括稠环或桥环系统，含有三至十五个碳原子，优选地含有三至十个碳原子，以及其是饱和的或是不饱和的，并通过单键与分子的其余部分相连。单环自由基包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环自由基包括，例如，金刚烷基、降冰片基、十氢化萘基、7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。在本说明书中，除非另外具体说明，否则环烃基可被任选地取代。

“环烃基烃基”指式-R_bR_d的自由基，其中R_b为上文定义的亚烃基链，且R_d为上文定义的环烃基自由基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则环烃基烃基基团可被任选地取代。

“稠合”指稠合到本发明化合物中现有的环结构中的本文描述的任何环结构。当稠环为杂环或芳杂环时，成为稠合杂环或稠合芳杂环一部分的现有环结构上的任何碳原子可以被氮原子代替。

“卤代”或“卤素”指溴、氯、氟或碘。

“卤代烃基”指被一个或多个上文定义的卤代自由基取代的上文定义的烃基自由基，诸如三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等的三卤代甲基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则卤代烃基可被任选地取代。

“杂环基”或“杂环”指稳定的3至18元非芳香环自由基，其由二至十二个碳原子和一至六个选自氮、氧和硫的杂原子组成。在本说明书中，除非另外具体说明，否则杂环基自由基可以是单环、二环、三环或四环的环系统，其可包括稠环或桥环系统；且杂环基自由基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化；且杂环基自由基可以是部分或完全饱和的。这类杂环基自由基的实例包括，但不限于：二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫杂吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则杂环基可被任选地取代。

“N-杂环基”指含至少一个氮的上文定义的杂环基自由基，并且其中杂环基自由基与分子其余部分的连接点是通过该杂环基自由基中的氮原子来实现。在本说明书中，除非另外具体说明，否则N-杂环基可被任选地取代。

“杂环基烃基”指式-R_bR_e的自由基，其中R_b为上文定义的亚烃基链，且R_e为上文定义的杂环基自由基，并且如果该杂环基是含氮的杂环基，则该杂环基可以在氮原子处与烃基自由基连接。在本说明书中，除非另外具体说明，否则杂环基烃基可被任选地取代。

“杂芳基”指5至14元的环系统自由基，其包含氢原子、一至十三个碳原子、一至六个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳环。为了本发明的目的，杂芳基自由基可以是单环、二环、三环或四环的环系统，其可包括稠环或桥环系统；且杂芳基自由基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化。实例包括，但不限于：吖庚因基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并茚基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂庚基(dioxepinyl)、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并二噁英基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并噻吩基)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、中氮茚基(indolizinyl)、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、2-氧代吖庚因基、噁唑基、环氧乙烷基、1-氧吡啶基、1-氧嘧啶基、1-氧吡嗪基、1-氧哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和噻吩基(即噻吩基)。在本说明书中，除非另外具体说明，否则杂芳基可被任选地取代。

“N-杂芳基”指含至少一个氮的上文定义的杂芳基自由基，并且其中杂芳基自由基与分子其余部分的连接点是通过杂芳基自由基中的氮原子来实现。在本说明书中，除非另外具体说明，否则N-杂芳基可被任选地取代。

“杂芳基烃基”指式-R_bR_f的自由基，其中R_b为上文定义的亚烃基链，且R_f为上文定义的杂芳基自由基。在本说明书中，除非另外具体说明，否则杂芳基烃基可被任选地取代。

“羟烃基”为包含一个或多个羟基取代基的如上文定义的烃基。除非另外具体说明，否则羟烃基可被任选地取代。

本文使用的术语“取代”意指任何上述基团(即，烃基、亚烃基、烃氧基、烃氧羰基、烃氨基、硫代烃基、芳基、芳烃基、环烃基、环烃基烃基、卤代烃基、杂环基、N-杂环基、杂环基烃基、杂芳基、羟烃基、羟基烃氧羰基、N-杂芳基和/或杂芳基烃基)，其中至少一个氢原子被与非氢原子的键取代，所述非氢原子例如，但不限于：诸如F、Cl、Br和I的卤素原子；诸如羟基、烃氧基和酯基团中的氧原子；诸如硫醇基、硫代烃基、砜基团、磺酰基和亚砜基团中的硫原子；诸如胺、酰胺、烃基胺、二烃基胺、芳胺、烃芳胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺的基团中的氮原子；诸如三烃基硅基、二烃基芳基硅基、烃基二芳基硅基和三芳基硅基的基团中的硅原子；和各种其他基团中的其他杂原子。“取代”也意指任何上述基团，其中一个或多个氢原子被与杂原子(诸如氧代、羰基、羧基和酯基团中的氧；诸如亚胺、肟、腙和腈的基团中的氮)的更高等级的键(例如双键或三键)取代。例如，“取代”包括其中一个或多个氢原子被-NR_gR_h、-NR_gC(＝O)R_h、-NR_gC(＝O)NR_gR_h、-NR_gC(＝O)OR_h、-NR_gSO₂R_h、-OC(＝O)NR_gR_h、-OR_g、-SR_g、-SOR_g、-SO₂R_g、-OSO₂R_g、-SO₂OR_g、＝NSO₂R_g和-SO₂NR_gR_h替代的任何上述基团。“取代”也意指，其中一个或多个氢原子被-C(＝O)R_g、-C(＝O)OR_g、-C(＝O)NR_gR_h、-CH₂SO₂R_g、-CH₂SO₂NR_gR_h替换的任何上述基团。在上述中，R_g和R_h为相同的或不同的且独立地为氢、烃基、烃氧基、烃氨基、硫代烃基、芳基、芳烃基、环烃基、环烃基烃基、卤代烃基、杂环基、N-杂环基、杂环基烃基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烃基。“取代”进一步意指其中一个或多个氢原子被与基团(例如氨基、氰基、羟基、亚氨基、硝基、氧代、硫代、卤素、烃基、烃氧基、烃氨基、硫代烃基、芳基、芳烃基、环烃基、环烃基烃基、卤代烃基、杂环基、N-杂环基、杂环基烃基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烃基)的键取代的任何上述基团。此外，每个上述的取代基也可任选地被一个或多个上述取代基取代。

“稳定的化合物”和“稳定的结构”的含义为表示足够稳定从而可在从反应混合物中分离至有用的纯度后保留下来的化合物。

“任选的(optional)”或“任选地(optionally)”意指之后描述的情况事件可发生或可不发生，且该描述包括所述事件或情况发生的实例和所述事件或情况不发生的实例。例如，“任选取代的芳基”意味着芳基自由基可被取代或可未被取代，且该描述包括被取代的芳基自由基和无取代基的芳基自由基。

通常，结晶或沉淀得到本发明化合物的溶剂化物。如本文使用的，术语“溶剂化物”指包含一个或多个本发明化合物的分子与一个或多个溶剂分子的集合体。溶剂可以是水，这种情况下溶剂化物可以是水合物。可选地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以以水合物(包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等)，以及相应的溶剂化形式存在。本发明的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其他情况下，本发明的化合物可仅保留外来的水或可以是水加上一些外来溶剂的混合物。

本发明的化合物，或者其盐或互变异构体可以含有一个或多个不对称中心，并由此可产生对映异构体、非对映异构体和其他的立体异构形式，根据绝对立体化学可将它们定义为(R)-或(S)-，或对于氨基酸可定义为(D)-或(L)-。本发明意为包括所有此类可能的异构体，以及其外消旋和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或使用传统技术(例如，色谱法和分步结晶)将其解析。制备/分离单个对映异构体的常规技术包括从适合的光学纯前体手性合成，或使用例如手性高压液相色谱(HPLC)来拆分外消旋体(或者盐或衍生物的外消旋体)。当本文描述的化合物含烯烃双键或其他几何不对称中心时，且除非另外指明，其目的是，所述化合物包括E和Z几何异构体。同样地，还预期包括所有互变异构形式。

“立体异构体”指由同样的原子组成，且通过同样的键结合但具有不同三维结构(其不可互换)的化合物。本发明涵盖了各种立体异构体和其混合物，且包括“对映异构体”，所述“对映异构体”指分子互为非重叠的镜像的两个立体异构体。

“互变异构体”指从分子的一个原子至相同分子的另一个原子的质子移动。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。

A.固体支撑物

如上文所示，本公开内容的一个方面涉及包含多种与固体基底共价结合的聚合物的固体支撑物。所述聚合物通常包含用于固定(例如，共价结合)诸如DNA或其他分析物的生物分子的反应官能团。与之前描述的固体支撑物相比，该固体支撑物具有很多优势，例如易于组装，不需要连接层将聚合物固定在固体基底上。通过本文描述的固体支撑物也实现了有利的水接触角。因此，在各种分析物例如DNA的高分辨率/高密度阵列分析中，所述固体支撑物具有特殊的功效。

在塑料基底上的PCR微阵列需要高于120℃的高Tg，小于1％的低吸水率，在400-800nm高于90％的光透明度，以及低荧光背景。一些具有上述特点的市售聚合物趋于为化学惰性的。此类聚合物的湿化学表面改性繁琐和/或成本高昂。通常基底聚合物对常用的处理溶剂不稳定。本发明人发现，氧气等离子处理以羟化基底表面来固定聚合物是简单、低成本且有效的方法。

包含刚性热塑性整块材料的示例性的固体支撑物可以通过大气压氧气等离子体或者通过其他等离子体方法直接将其化学活化，以在表面生成羟基(或其他氧化基团)。还涵盖了其他的基底表面等离子体处理方法，包括氨等离子体处理、氮气等离子体处理以及比例为约1:3至约10:1的氮气/氢气等离子体，以在表面上生成氨基。相比依赖于将功能层随后固定在初级层上的粘附性的方法，等离子体处理提供了方便、快速、可自动、以及可重现的表面官能化技术。

参考图1A-1F，可以更好地理解本公开内容的固体支撑物。如图1A所示，通过适当的基底的等离子体处理可以提供具有不同的被氧化的官能团的固体基底，所述官能团包括羟基、环氧化物、醛和羧基。在下文中更详细地描述了用于这方面的基底。然后通过含有适当反应基团的聚合物的反应来制备固体支撑物。例如，图1A描述了包含酰肼、烃氧胺和胺反应基团的聚合物与表面结合的醛的反应分别形成腙、肟和亚胺共价键。有利的是，聚合物由此与固体基底的表面共价结合而不需要中间连接物或“连接层”。为便于示例说明，图1A描述了同一聚合物中的多种反应官能团；然而，应理解，本发明包括其中聚合物包含单一类型官能团的各种实施方案。

图1B描述了固体支撑物的另一种实施方案。再次地，用大气压O₂等离子体(APOP)处理固体基底以在基底表面得到各种被氧化的官能团。然后用二胺(例如，乙二胺)洗涤基底以并入通过亚胺键与基底结合的游离胺部分。然后包含诸如活化的酯的适当的反应基团的聚合物，可通过与基底表面的醇反应(形成新的酯)和/或与胺反应(形成酰胺)使其与固体基底共价结合。虽然图1A描述了包含与聚合物的酰胺键和酯键两者的固体支撑物，但本领域的普通技术人员应理解，某些实施方案包括含有酯键或酰胺键的基底。例如，当聚合物包含活化的酯时，若未经二胺处理则固体支撑物主要包含酯键。相反，可以控制二胺洗涤过程中使用的条件以使得基底表面主要包含胺，且聚合物主要通过酰胺键与基底结合(当聚合物包含活化的酯时)。

因此，在一个实施方案中，固体支撑物包含：

具有外表面的基底；以及

与基底外表面共价结合的多个聚合物，聚合物各自包含至少一个A和C亚基，并任选地包含一个或多个B亚基，其中：

A亚基，每次出现时，独立地包含：

a)第一热化学反应基团，其中第一热化学反应基团能够与捕获探针上的醇、羰基或胺基团形成共价键。

b)第二热化学反应基团，其中第二热化学反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对于通过环加成或1,4-共轭加成反应与捕获探针上的目标官能团形成共价键特异的反应性；或者

c)与捕获探针的共价键，

任选的B亚基，每次出现时，独立地包含亲水部分；以及

C亚基，每次出现时，独立地包含与基底外表面的共价连接W，其中W具有以下结构之一：

其中Q为基底的外表面，且其中第一热化学反应基团和第二热化学反应基团的反应性是相互正交的。

在某些实施方案中，W具有以下结构之一：

在某些其他实施方案中，聚合物具有下式(I)：

T¹-(A)_x(B)_y(C)_z-T²

(I)

其中：

A、B和C分别表示A、B和C亚基；

T¹和T²各自独立地不存在，或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物末端基团；

x和z独立地为1至50,000的整数；以及

y为0至50,000的整数。

例如，在一些实施方案中，固体支撑物具有下式(II)：

其中：

R¹，每次出现时，独立地为第一热化学反应基团、第二热化学反应基团或与捕获探针的共价键；

R²，每次出现时，独立地为亲水部分；

W，每次出现时，独立地为与基底外表面的共价连接；

Q为基底的外表面；

R³、R⁴和R⁵，每次出现时，独立地为H或C₁-C₆烃基；

L¹、L²和L³，每次出现时，独立地为直接键或至多100个原子长度的连接物；

T¹和T²各自独立地不存在，或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物末端基团；

x和z各自独立地为1至50,000的整数；以及

y为0至50,000的整数。

在任一项上述实施方案中，至少一个A亚基包含第一热化学反应基团。在一些实施方案中，第一热化学反应基团为活化的酯，例如在一些方面中，第一热化学反应基团每次出现时独立地为下式：

其中R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e各自独立地为H、卤素、三卤代甲基、磺基(即，-SO₃H和/或其盐)、-CN、C₁-C₆烃氧羰基、C₁-C₆羟基烃氧羰基、硝基或聚乙二醇，其中聚乙二醇通过氧(醚)或羧基(酰胺或酯)键与苯基部分相连。例如，在某些实施方案中，R^7a、R^7b、R^7c、R^7d或R^7e中至少一个可以独立地为-CO₂R，其中R为烃基、羟烃基或烃氧(聚乙氧基)乙基。在某些实施方案中，聚乙二醇部分包含50至3,000个环氧乙烷亚基。

在上述各种实施方案中，卤素为氟。例如，在一些实施方案中，R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e中至少一个为氟。在其他实施方案中，每个R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e为氟。在另一个实施方案中，每个R^7a、R^7b、R^7d和R^7e为氟，且R^7c为磺基。在某些其他的上述实施方案中，第一热化学反应基团包含4-磺基四氟苯基酯(即，其中每个R^7a、R^7b、R^7d和R^7e为氟，且R^7c为磺基)。有利的是，包含这类氟化反应部分的聚合物可以通过¹⁹F和/或¹HNMR技术分析以准确地测定聚合物中反应单体和稀释单体的比例。摩尔进料比不是总能准确预测并入最终聚合物中的亚基的mol％；然而，本聚合物的某些实施方案中，存在一个或多个F原子使得准确测定该聚合物的实际摩尔组分。这类测定的方法在实施例中提供。

在某些其他实施方案中，R^7a、R^7b、R^7c、R^7d或R^7e中的一个为硝基。例如，在一些实施方案中，R^7a、R^7b、R^7c、R^7d或R^7e中的一个为硝基且其余的取代基为H。

在任何本文描述的固体支撑物的其他实施方案中，至少一个A亚基包含第二热化学反应基团。

在一些实施方案中，官能团为炔烃、烃硅基保护的炔烃、叠氮化物、腈、硫醇基、烯烃、马来酰亚胺、丁二烯、环戊二烯、氮杂环丙烷、硫杂丙环、二烯、亲二烯体或1,4-不饱和羰基官能团。

在其他实施方案中，第二热化学反应基团包含环加成反应基团。例如，在一些实施方案中，环加成反应基团，每次出现时，独立地包含炔烃或叠氮化物官能团。示例性的环加成反应基团，每次出现时，独立地具有下式之一：

其中β和χ各自独立地为1至5的整数。

在一些实施例中，β为1或3。在其他实施例中，χ为1。

在某些其他实施方案中，环加成反应基团，每次出现时，独立地具有下式之一：

在其他实施方案中，环加成反应基团，每次出现时，独立地包含二烯或亲二烯体官能团。例如，在一些实施方案中，环加成反应基团，每次出现时，独立地包含α,β-不饱和羰基、马来酰亚胺基、乙炔二羧酸酯、环戊基二烯基、呋喃基或N-烃基吡咯基部分。在此方面，示例性的环加成反应基团具有以下结构之一：

其中R^a为C₁-C₆烃基且L¹为直接键或至多100个原子长度的连接物。

图1C描述了固体支撑物的另一个实施方案。再次地，用大气压O₂等离子体(APOP)处理固体基底以在外表面得到羟基官能团。然后，可以使包含适当活性基团(例如活化的酯)的聚合物与固体基底共价结合(固定)以形成新的酯。也可以使用催化剂(例如，三乙胺)来提高活化的酯的反应性。

图1D描述了固体支撑物的另一个实施方案。如图1D所示，通过氧气等离子体处理适当的基底，可以提供具有各种被氧化的官能团的固体基底，所述被氧化的官能团包括羟基、环氧化物、醛和羧基。然后，将官能化的表面暴露于包含适当反应基团的聚合物。例如，图1D描述了包含酰肼、烃氧胺和胺反应基团的聚合物与表面结合的醛反应，分别形成腙、肟和亚胺共价键。有利的是，聚合物由此与固体基底的表面直接共价结合而不需要中间连接物或“连接层”。为便于说明，图1D描述了同一聚合物中的多种类型的反应官能团；然而，应理解，本发明包括其中聚合物包含单一类型官能团的多种实施方案。然后，通过捕获探针与至少一个正交反应基团A的生物缀合，将该捕获探针点样至官能化的聚合物表面，其中所述正交反应基团A包括，但不限于：叠氮化物、炔烃、二烯、亲二烯体或反应酯基团。然后，固体支撑物经历氨加帽，将其余的正交反应基团A转变为亲水的官能团B，得到具有低水接触角(例如，小于15度)的亲水表面以减少生物分子和气泡的非特异性吸附。在各种实施方案中，反应基团A选自酰肼、烃氧胺和胺反应基团。

图1E描述了固体支撑物的另一个实施方案。再次地，用大气压O₂等离子体(APOP)处理固体基底表面以得到各种被氧化的官能团，包括羟基、环氧化物、醛和羧基。图示了羟基和醛混合的基底，虽然也预计了本领域技术人员已知的其他基底。然后，使官能化的表面经历二胺预洗涤，得到羟基氨基混合的表面。然后，在存在任选的胺催化剂的情况下，使包含适当反应基团(例如活化的酯)的聚合物与官能化的固体基底共价结合，形成新的酯和酰胺键，以将聚合物连接到基底表面。聚合物(在某些实施方案中其是包含两种亚基的共聚物)中的至少一个反应基团与至少一个表面反应基团反应。在随后的点样步骤中，聚合物中的其余的反应基团中的至少一个与捕获探针反应以形成共价的酰胺键。然后固体支撑物进行氨加帽以便通过将聚合物上的酯基替换为酰氨基来提高固体支撑物表面的亲水性。

图1F描述了固体支撑物的另一个实施方案。用大气压NH₃或(N₂+H₂)等离子体处理固体基底表面得到氨基官能团。然后，通过包含适当反应基团的聚合物的反应来制备固体支撑物。例如，图1F描述了包含酯反应基团的聚合物与表面结合的氨基反应形成酰胺共价键。聚合物(在一些实施方案中是包含两种类型亚基的共聚物)中的至少一个反应基团与至少一个表面反应基团反应。在随后的点样步骤中，聚合物中其余的反应基团中的至少一个与捕获探针反应形成共价的酰胺键。然后固体支撑物进行氨加帽，以便通过将聚合物上的酯基替换为酰氨基来提高固体支撑物表面的亲水性。有利的是，聚合物由此与固体基底的表面直接共价结合而不需要中间连接物或“连接层”。为便于说明，之后点样捕获探针，并通过与酯基的相互作用使其与官能化的聚合物表面共价结合。然后，固体支撑物进行氨加帽，以便通过将聚合物上的酯基替换为酰氨基来提高固体支撑物表面的亲水性。

在某些实施方案中，固体支撑物还包含固定于其上的捕获探针。例如，在一些实施方案中，至少一个A亚基包含与捕获探针的共价键。通常在第一热化学反应基团或第二热化学反应基团中的一个与捕获探针上的适当的反应基团之间形成共价键。例如，当第一热化学反应基团为酯时，在捕获探针与聚合物之间形成的共价键可以是酯或酰胺(来自与捕获探针上的醇或胺的反应)。在某些实施方案中，共价键是与捕获探针的酰氨基或胺键。在某些实施方案中，共价键是与捕获探针的酰氨基或硫酯键。

在其他实施方案中，聚合物与捕获探针(当存在时)之间的共价键是在聚合物上的环加成反应基团与捕获探针上的互补反应基团之间形成的。在此方面“点击”化学可以是特别有用的。因此，在一些实施方案中，环加成反应基团为炔烃或叠氮化物。在其他实施方案中，与捕获探针的共价键包含三唑部分。

在其他相关实施方案中，至少一个A亚基具有以下结构之一：

其中：

R⁵为H或C₁-C₆烃基；

L⁴为任选的连接物；以及

Z为捕获探针或其片段。

在许多分析物的分析中固体支撑物具有功效。在此方面，捕获探针的特性不会受到特别限制，且本领域的普通技术人员应能够预想到用于本固体支撑物的全文中的捕获探针。虽然未加以限定，但某些实施方案涉及选自肽、蛋白质、糖基化蛋白质、糖缀合物、核酸适体(aptomer)、糖类、多核苷酸、寡核苷酸和多肽的捕获探针。在某些实施方案中，捕获探针为多核苷酸。在其他实施方案中，捕获探针为DNA。

如上文所示，有利的是，本固体支撑物包含与固体基底表面共价结合的聚合物。因此，制备固体基底的方法在商业上更加可行，且得到的固体支撑物相比以前描述的固体支撑物具有许多功能优势，包括上文描述的良好的WCA转变性质。在某些实施方案中，聚合物与固体基底之间的共价连接(“W”)，每次出现时，独立地具有以下结构之一：

其中Q为固体基底。

在一些实施方案中，W为

在其他实施方案中，W为

在其他实施方案中，W为

在更多实施方案中，W为

在其他实施方案中，W为

在其他实施方案中，W为

在其他实施方案中，W为

本发明不同实施方案的范围内也包括含有上述W结构的任何组合的固体支撑物。

在其他实施方案中，C亚基，每次出现时，独立地具有以下结构之一：

其中：

R⁵，每次出现时，独立地为H或C₁-C₆烃基；

Q为固体支撑物的外表面；以及

n为2至10的整数。

B亚基包含亲水部分。控制B亚基的个数和特性以提供固体支撑物具有期望的疏水性和水接触角等的固体支撑物。在某些实施方案中，本发明人发现无B亚基的聚合物具有某些优势。因此，某些实施方案涉及含有不包含B亚基的聚合物的固体支撑物。

在其他实施方案中，聚合物包含至少一个B亚基。例如，在一些实施方案中，亲水部分每次出现时独立地为酰氨基、酯或羟基官能团，或其组合。

在其他实施方案中，B亚基每次出现时独立地具有下式之一：

其中：

R⁴每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

R^8a和R^8b各自独立地为H、C₁-C₆烃基或羟烃基；

R^9a和R^9b各自独立地为H、C₁-C₆烃基或羟烃基，或R^9a和R^9b连同与它们结合的氮原子一起结合形成杂环；以及

R¹⁰为羟烃基。

在某些上述的变型中，R^8a和R^8b各自为H。在一些实施方案中，R^8a或R^8b中的一个为H，且R^8a或R^8b中的另一个为C₁-C₆烃基。在其他实施方案中，R^8a为H，且R^8b为甲基。

在某些其他实施方案中，每个亲水部分具有以下结构之一：

例如，在一些实施方案中，每个亲水部分具有以下结构；

在其他实施方案中，每个亲水部分具有以下结构：

在更多的实施方案中，R^8a或R^8b中的一个为H，且R^8a或R^8b中的另一个为羟烃基。在其他实施方案中，R^8a为H，且R^8b为-CH₂OH。

在其他实施方案中，至少一个亲水部分具有以下结构之一：

在其他实施方案中，R¹⁰为-CH₂CH₂OH。

将第一热化学反应基团或第二热化学反应基团、亲水部分或“W”连接到聚合物其余部分的连接部分未受到限制，并可以被改性以得到具有期望性质的固体基底。在某些实施方案中，L¹、L²和L³各自独立地包含亚烃基、酯、烯化氧、酰胺、酰亚胺、醚或二硫部分，或其组合。

在一些实施方案中，L¹、L²或L³中的至少一个为直接键。在其他实施方案中，每个L¹、L²和L³为直接键。

在各种上述实施方案中，R³、R⁴或R⁵中的至少一个为H。例如，在一些实施方案中，每个R³、R⁴和R⁵为H。在其他实施方案中，R³、R⁴或R⁵中的至少一个为甲基。例如，在一些实施方案中，每个R³、R⁴和R⁵为甲基。

如上文所示，通常控制聚合物中B亚基的量(以及相反地控制A亚基的量)以便提供得到的固体支撑物的期望的亲水性(和水接触角)。聚合物中亚基的量可以用摩尔进料比(MFR％)或用摩尔百分比来表示。通常，摩尔进料比基于用于制备聚合物的单体的实际比例。可以使用其他技术，例如NMR(例如，本文描述的¹⁹FNMR)来测定亚基的摩尔％。

因此，在一些实施方案中，聚合物包含少于约40mol％的B亚基。在其他实施方案中，聚合物包含多于0mol％至约40mol％的B亚基。在其他实施方案中，聚合物包含约35mol％的B亚基。在更多的一些实施方案中，聚合物包含至少约30mol％的B亚基。在其他实施方案中，聚合物包含多于0mol％至约15mol％的B亚基。

在其他实施方案中，聚合物包含至少约75mol％的A亚基。例如，在一些实施方案中，聚合物包含至少约90mol％的A亚基。在其他实施方案中，聚合物包含至少约95mol％的A亚基。在其他实施方案中，聚合物包含至少约99.9mol％的A亚基。

因此，在一些实施方案中，聚合物包含少于约40MFR％的B亚基。在其他实施方案中，聚合物包含大于0MFR％至约40MFR％的B亚基。在其他实施方案中，聚合物包含35MFR％的B亚基。在一些更多的实施方案中，聚合物包含至少约30MFR％的B亚基。在其他实施方案中，聚合物包含大于0MFR％至约15MFR％的B亚基。

在其他实施方案中，聚合物包含至少约75MFR％的A亚基。例如，在一些实施方案中，聚合物包含至少约90MFR％的A亚基。在其他实施方案中，聚合物包含至少约95MFR％的A亚基。在其他实施方案中，聚合物包含至少约99.9MFR％的A亚基。

预期其中聚合物仅包含一种类型反应基团的实施方案也在本发明的范围内。因此，在一个实施方案中，每个A亚基包含第一热化学反应基团或与捕获探针的共价键。在上述特定的实施方案中，聚合物不包含B亚基。在更多上述特定的实施方案中，第一热化学反应基团是上文定义的反应性酯，例如五氟苯基酯。

在某些实施方案中，聚合物是无规聚合物。

在另外某些实施方案中，在点样(以及共价连接生物分子/捕获探针)之后，期望化学改性全部其余的反应性聚合物表面(未点样且无捕获探针的区域)，以便使其亲水性以及化学性稳定。

申请人发现，相对于目前可用的固体支撑物，本固体支撑物具有意料之外的转变水接触角的能力。即，该固体支撑物在生物缀合之前具有高的WCA，使得点间隔更近(例如，通过使点尺寸减小)。生物缀合之后，可通过本文解释的“加帽”来大幅减小WCA。在生物缀合后减小的WCA具有某些未被可用的固体支撑物实现的优点。例如，在冻干法之前，更加亲水的表面促进PCR试剂的水溶液的分配和分散，以及其他相关优点。下文更详细地讨论了固体支撑物的WCA转变的能力。

申请人意外地发现了所公开基底顶部的聚合物表面比目前市售的商用微阵列更具有疏水性。图5说明了环烯烃基底表面的WCA，该基底共价固定有包含68.3mol％PFPA和31.7mol％DMA的PFPA-DMA共聚物。未观测到小于73度的WCA。相对高的疏水性防止了在其表面上的捕获探针溶液的点样水滴因为润湿而直径增大，能够制造间隔近的微阵列。

点样微阵列之后，表面上其余的反应基团(其可以是疏水的(例如，PFPA))需要通过“加帽”来转变为亲水的部分，使得某些实施方案中整个表面的WCA≤12°。具有这种亲水表面的优势包括(1)减少非特异性吸附，得到高的信噪比，(2)使分配的冻干试剂水溶液在冻干之前均匀分散在表面上，(3)在冻干试剂与缓冲水溶液复溶中排出包埋的气泡。

对实现加帽的多种表面处理进行了检测，包括三乙胺(TEA)水溶液、氨水，氨蒸汽，通过浸入短PEG二胺中加帽；用长PEG胺(MW2000)加帽；用短PEG二胺/氨在丙酮/水中浸渍1小时在有盐/无盐时并且在40℃和60℃情况下加帽；用短PEG二胺/氨用100mM三乙胺(TEA)在20℃、60℃和95℃下于1小时来加帽；用三种浓度(50mM、150mM和500mM)的二甲胺在60℃/75℃下在含50mATEA/无TEA的水中于1小时来加帽；以及在四种温度(20℃、60℃、75℃和95℃)中的每一种情况下用四种浓度(0、50mM、100mM、500mM)的氨于1小时来加帽。

表1(见实施例12)示出了固体支撑物的示例性加帽结果，该固体支撑物是通过在预先用大气压氧气等离子体处理的基底表面上共价固定含65mol％PFPA和35mol％DMA的共聚物来制备的。氨加帽将具有疏水全氟化酯基的PFPA单体重复单元转变为亲水性且化学稳定性的丙烯酰氨基团。如表1所示，在60℃下将点样的微阵列浸人50mM-500mM的氨水、100mM三乙胺中于1-2小时来进行加帽，得到小于10度的水接触角。

申请人意外地发现氨独特地非常适合将WCA水接触角从85度转变为<20度，或者甚至小于15度或小于10度。申请人意外地发现上述加帽方案是将被点样的(即，捕获探针结合的)固体支撑物的水接触角从约80°度转变为≤15°度的一种方式。≤15°的低水接触角减少了非特异性吸附，并增大了信噪比，由此提高了检测探针信号时的灵敏度和特异性。被加帽表面的高度水润湿性提供了用于整合到微流体装置中的亲水表面并有助于减少各种生物测定组分的非特异性吸附和气泡。

在其他实施方案中，优化了水接触角以得到小的点样尺寸(例如，当固体支撑物用于高级多路复用的阵列型分析时)。在一些实施方案中，固体支撑物的水接触角为40°至95°，例如40°至90°、60°至95°或70°至90°。例如，在一些实施方案中，固体支撑物具有50°至85°或60°至85°的水接触角。在其他实施方案中，固体支撑物具有60°至80°的水接触角。在其他实施方案中，固体支撑物的水接触角为61°至95°，例如70°至90°。例如，在一些实施方案中，固体支撑物具有75°至85°的水接触角。在其他实施方案中，固体支撑物具有78°至83°的水接触角。

在一些实施方案中，在任选的加帽步骤后(例如，用氨处理)，WCA相比加帽之前大幅降低。在一些实施方案中，加帽之后的WCA小于25°、小于20°、小于15°或甚至小于10°。在一些实施方案中，在任选的加帽步骤前后的WCA差值为至少50°、至少60°或至少70°。

本文固体支撑物中使用的固体基底未受限制，并且通常根据需要的最终用途来选择。然而，本发明人发现固体支撑物的某些实施方案中可使用有机聚合物基底。在一些实施方案中，基底包括聚(苯乙烯)、聚(碳酸酯)、聚(醚砜)、聚(酮)、聚(脂肪醚)、聚(醚酮)、聚(醚醚酮)、聚(芳醚)、聚(酰胺)、聚(酰亚胺)、聚(酯)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(烯烃)、聚(环烯烃)、聚(乙烯醇)、共混聚合物、聚烃基聚合物、或它们的卤代衍生物、交联衍生物或组合。例如，在一些实施方案中卤代衍生物为卤代聚(芳醚)、卤代聚(烯烃)或卤代聚(环烯烃)。在某些具体的实施例中，基底包括环状聚(烯烃)。

在更多的一些实施方案中，基底为基本上光学透明的。这种基底在用荧光或光学检测方法的分析中使用的固体支撑物中具有功效。在一些实施方案中，基底在约400nm至约800nm是基本上光学透明的。在其他实施方案中，基底为至少约90％光学透明的。

如上文所示，固体支撑物可用于各种分析物(例如DNA)的阵列分析的方法中。因此，在一些实施方案中，固体支撑物包含不同位点的系统阵列，每个不同位点独立地包含至少一个与所述基底外表面共价结合的聚合物。在其他实施方案中，每个不同位点独立地包含多个与其共价结合的聚合物。在其他实施方案中，在每个不同位点上的至少一个聚合物独立地包含与其共价结合的捕获探针。例如，在一些实施方案中，每个不同位点包含多个与其结合的结构上不同的捕获探针。

与之前描述的固体支撑物相对比，本文描述的固体支撑物的实施方案基本上不包含多个聚合物之间的化学交联(聚合物间和聚合物内的交联)。虽然不希望被理论约束，但是本发明人相信光敏聚合物与基底的由UV引发的结合过程中(通过UV引发的自由基机理)会形成这类聚合物间交联和聚合物内交联。因为本聚合物的实施方案通过热化学反应官能团(即，非UV反应官能团)与固体基底共价结合，通常得到的固体支撑物基本上不包含聚合物间交联或聚合物内交联。

因此，在一些实施方案中，多种聚合物之间基本上无交联。在其他实施方案中，多种聚合物之间的95％、98％、99％或甚至99.9％无交联。

本公开内容也也提供了某些被发现用于制备上述固体支撑物的固体基底。例如，在一个实施方案中，本公开内容提供了固体支撑物，其包含多个与固体基底外表面共价结合的伯胺官能团，其中胺官能团通过包含亚胺键的连接物与固体基底结合。

在上述固体支撑物的某些实施方案中，固体基底的外表面具有以下结构：

或其盐、互变异构体或立体异构体，其中：

Q为固体基底的外表面；以及

n为2至10的整数。

应理解，本文阐述的任何化合物和/或聚合物的任何实施方案，以及本文所述的化合物和/或聚合物中的任何具体取代基(本文所示出的)，可独立地与本文描述的化合物和/或聚合物的其他实施方案和/或取代基结合，形成上文未具体阐述的发明实施方案。此外，在具体的实施方案和/或权利要求中任何具体的R基团列出了一系列取代基的情况下，应理解，每种独立的取代基可从具体的实施方案和/或权利要求中删除，且认为其余的取代基列表是在本发明的范围内。

应理解，在本文描述中，仅当所述式的取代基的取代基和/或变量的组合得到稳定化合物时才被允许此类组合。

此外，通过本领域技术人员已知的方法，本发明所有以游离碱或游离酸的形式存在的化合物和/或聚合物可以通过用适当的无机或有机碱或酸处理来转化为盐。可通过标准技术将本发明化合物的盐转化为其游离碱或游离酸的形式。

B.制备固体支撑物和聚合物的方法

本发明的实施方案涉及制备固体支撑物的方法。例如，在一个实施方案中，所述方法包括：

A)提供包含多个与其外表面共价结合的羟基、羰基、胺官能团或其组合的固体基底；以及

B)在足以使D亚基与羟基、羰基或胺官能团中的至少一个之间形成共价键的条件下，使包含D亚基和任选的E亚基以及F亚基的聚合物与固体基底接触，其中：

D亚基每次出现时独立地包含第一反应基团，其中第一反应基团为热化学反应基团，其能够与固体基底或捕获探针上的醇、羰基或胺官能团形成共价键；

E亚基每次出现时独立地包含亲水部分；以及

F亚基每次出现时独立地包含第二反应基团，其中第二反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对于通过环加成或1,4-共轭加成反应与捕获探针上的目标官能团形成共价键特异的反应性，

其中第一反应基团与第二反应基团的反应性是相互正交的。

在上述某些实施方案中，羟基和羰基官能团直接与基底表面结合而不需要中间连接物，而胺官能团通过包含亚胺键的连接物与基底表面结合，亚胺键直接与基底表面结合而不需要中间连接物。在一些实施方案中，胺官能团与固体基底结合而不需要中间连接物。

在某些实施方案中，制备固体支撑物的方法包括，使反应性聚合物与如上文描述的被活化的含羟基、环氧化物、醛、酸、胺或其他的官能团的基底表面反应。在一些实施方案中，反应性聚合物包含上文描述的A亚基和任选的B亚基。通过与基底表面的官能团反应，将A亚基转化为C亚基。其余的未反应的A亚基可用于与捕获探针生物缀合。

在上述方法的其他实施方案中，所述方法还包括加帽步骤。可以在捕获探针与固体支撑物缀合之后进行加帽步骤，且通常得到具有大幅降低的上文讨论的WCA的固体支撑物。用于任选加帽步骤的试剂包括碱，例如胺碱(例如，NH₄OH)。也可以使用含胺催化剂来促进反应。有用的溶剂包括极性溶剂，例如可以为无水的或含少部分水的乙腈和/或丙酮。可以在室温下进行加帽，但通常在诸如约60℃、75℃或95℃的高温下进行。

任选地，本方法可包括使用催化剂(例如，碱性催化剂)来改善聚合物与固体基底的反应。

在一些实施方案中，第一反应基团为亲核基团，其能够与固体基底上的酮或醛基形成共价键。例如，在一些实施方案中，第一反应基团为酰肼、胺或烃氧胺。

在其他实施方案中，第一反应基团为亲电子基团，其能够与固体基底上的醇或胺基团形成共价键。例如，在一些实施方案中，第一反应基团为芳基酯或环氧化物。

在另一些实施方案中，聚合物具有以下结构(III)：

T³-(D)_a(E)_b(F)_c-T⁴

(III)

其中：

D、E和F分别表示D、E和F亚基；

T³和T⁴各自独立地不存在，或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物末端基团；

a为1至50,000的整数：以及

b和c独立地为0至50,000的整数。

在上述方法的其他实施方案中，聚合物具有下式(IV)：

其中：

R¹¹每次出现时独立地为包含第一反应基团的取代基；

R¹²每次出现时独立地为包含亲水部分的取代基；

R¹³每次出现时独立地为包含第二反应基团的取代基；

R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

L⁵、L⁶和L⁷每次出现时独立地为直接键或至多100个原子长度的连接物；

T³和T⁴各自独立地不存在或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物末端基团；

q为1至50,000的整数；以及

r和s独立地为0至50,000的整数。

在另一些示例性的实施方案中，R¹¹每次出现时独立地具有下式之一：

其中R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e各自独立地为H、卤素、三卤代甲基或硝基。

在某些上述实施方案中，r和s各自为0。

在一些实施方案中，热化学反应基团为如任何上文实施方案中所定义的。

在更多的一些实施方案中，存在F亚基。在其他实施方案中，环加成反应基团或共轭加成反应基团为如任何上文实施方案中定义的。

在其他实施方案中，存在E亚基。在一些这类实施方案中，亲水部分为如任何上文实施方案中定义的。

在另一些实施例中，共价键为由羟基、胺或羰基部分中的至少一种与第一反应基团反应形成的醚、酯、腙、肟、酰胺或亚胺键。在其他实施例中，W包含由羟基或羰基部分中的至少一种与第一反应基团反应形成的醚、酯、腙、肟或亚胺键。

在更多的一些实施方案中，固体基底由以下来制备：通过电晕处理，或者用环境空气等离子体、大气压氧气等离子体(APOP)、氮气等离子体、氨等离子体、或氮气+氢气等离子体的混合物处理固体基底。例如，在一些实施方案中，方法还包括在固体基底上的羰基与二胺中第一胺基团之间足以形成共价亚胺键的条件下，使固相基底接触二胺化合物。

在其他实施方案中，方法还包括在捕获探针与聚合物之间足以形成共价键的条件下，使固体支撑物与捕获探针接触。

在更多的实施方案中，通过D亚基上的芳基酯或环氧化物部分与捕获探针上的胺部分的反应形成共价键。

在其他实施方案中，通过F亚基上的炔烃部分与捕获探针上的叠氮化物部分的反应形成共价键。在其他实施方案中，通过F亚基上的叠氮化物部分与捕获探针上的炔烃部分的反应形成共价键。例如，所述方法的某些实施方案还包括在叠氮化物存在时，使Cu(I)催化剂与固体支撑物接触。

制备所公开的固体支撑物和聚合物的方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。例如，在某些实施方案中，本发明的聚合物可通过掺混所期望比例的亚基与任选的活化剂(例如，热聚合反应的AIBN或用于ATRP的催化剂)来制备。包含诸如叠氮化物或炔烃的点击官能团的亚基和聚合物可以根据本领域已知的方法制备，或从商业来源购得(例如，丙烯酸丙炔酯或3-叠氮丙烯酸丙酯)。参见例如，S.R.Gondi等人，Macromolecules2007,40,474-481；P.J.Roth等人，J.Polym.Sci.PartA:Polym.Chem.2009,47,3118-3130；以及C.Li等人，Macromolecules,2009,42,2916-2924，所述公开内容通过引用将其整体并入本文。实施例中提供了示例性的方法。

本领域的技术人员应认识到，在本文描述的方法中，中间体化合物的官能团需要由适合的保护基保护。这类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的适合的保护基包括三烃基硅基或二芳基烃基硅基(例如，叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基或三甲基硅基)、四氢吡喃基、苄基等。氨基、脒基和胍基的适合的保护基包括叔丁氧羰基、苄氧羰基等。巯基的适合的保护基包括-C(O)-R”(其中R”为烃基、芳基或芳烃基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。羧酸的适合的保护基包括烃基、芳基或芳烃基酯。可根据本领域技术人员所知的和如本文所描述的标准技术添加或移除保护基。保护基的使用在Green,T.W.和P.G.M.Wutz，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(1999),第3版,Wiley中详细描述。本领域技术人员应认识到，保护基也可以是聚合物树脂，例如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基-氯树脂。

C.聚合物

在另一方面，本发明涉及新颖的聚合物。聚合物可用于制备所描述的固体支撑物或用于其他目的。通常认为含丙烯酰胺的聚合物仅在水相中可溶。然而，与本领域的一般教导相反，本发明人意外地发现丙烯酰胺和疏水性丙烯酸酯单体的共聚物明显溶于有机溶剂。在这方面，本发明人发现在含有疏水性单体(例如PFPA)的共聚物中掺入小部分的丙烯酰胺产生了具有优越性质的共聚物。这类共聚物的一个优势在于可以通过调节丙烯酰胺单体的含量继而在官能化表面应用中可以调整在各种溶剂(包括水)中的溶解度。这也可以提供含有最高百分比的反应性官能团的共聚物，同时其为随后的水基测定中的应用保留有足够的亲水功能。出人意料地，在某些实施方案中，发现含有少于35％的丙烯酰胺MFR的示例性聚合物易溶于丙酮、乙腈、THF、氯仿和其他有机溶剂中。

在一个实施方案中，聚合物包含G、H和任选的I亚基，其中：

G亚基每次出现时独立地包含；

a)第一热化学反应基团，其中第一热化学反应基团能够与醇、羰基或胺基形成共价键；

b)第二热化学反应基团，其中第二热化学反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对于通过环加成或1,4-共轭加成反应与目标官能团形成共价键特异的反应性；

H亚基每次出现时具有以下结构：

以及

任选的I亚基每次出现时独立地包含亲水部分并具有以下结构之一：

其中：

R⁴每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

R^8a为H、C₁-C₆烃基或羟烃基；

R^8b为C₁-C₆烃基或羟烃基；

R^9a和R^9b各自独立地为H、C₁-C₆烃基或羟烃基，或者R^9a和R^9b连同与其结合的氮原子一起连接形成杂环；以及

R¹⁰为羟烃基，

其中第一热化学反应基团和第二热化学反应基团的反应性是相互正交的。

在某些实施方案中，不存在任选的I亚基。在其他实施方案中，存在任选的I亚基。

在一些实施方案中，亲水部分如任何上文实施方案中定义的。

在其他实施方案中，G亚基包含在上文任何关于A亚基的实施方案中定义的第一热化学反应基团和/或第二热化学反应基团。在某些实施方案中，每个G亚基包含第一热化学反应基团。

在各种实施方案中，聚合物包含多于0mol％至约15mol％的H亚基。在其他的各种实施方案中，聚合物包含多于0MFR％至约15MFR％的H亚基。

D.使用固体基底的方法

本发明的某些实施方案涉及方法。这类方法包括但不限于：制备本文描述的聚合物、活化的固体基底和固体支撑物的方法。也提供了在分析测定中使用固体支撑物的方法。例如，所述固体支撑物可以用于很多分析物的检测测定中，例如病毒、细菌、疟原虫、真菌、以及金属材料和未知生物-战争材料、生物-危害材料和化学战争材料。

用于分析各种分析物的固体支撑物的使用方法对本领域普通技术人员来说是显而易见的。例如，这类方法在第61/463,580号、第61/561,198号、第1/684,104号、第61/600,569号的美国临时专利申请中，第13/399,872号美国专利申请中和第2012/0214686号美国公开中进行描述，全部公开内容为了所有目的在此通过引用整体并入本文。图2中图示描述了使用所公开的固体支撑物的示例性方法。

如图2A所描述，在方法的一个实施方案中，分析物探针包含A部分和B部分。A部分任选地包含淬灭剂部分，淬灭剂可位于A部分的3’末端，或位于A部分中的任何其他位点。A部分与目标分析物序列(例如，病原体DNA等)的至少一部分互补。分析物探针也包含B部分(“翼”)。翼包含荧光团和与固体支撑物结合的捕获探针序列的至少一部分互补的序列。任选地，选择分析物探针的序列使得A部分和翼具有至少一些互性，使淬灭剂和荧光团紧密接近，由此减小了与未结合分析物探针有关的荧光信号，并提高了测定的整体灵敏度。

通常，测定条件包括含有对不同目标分析物特异的独特序列的多种分析物探针。在PCR条件下，且存在互补(或至少部分互补)的目标分析物情况下，翼从分析物探针上切割。然后，切割的翼和与该翼互补(或至少部分互补的)的与固体支撑物结合的捕获探针杂交。荧光信号在与捕获探针结合的位点处存在(或增强)表明存在目标分析物序列。

图2B描述了替代的实施方案。在该示例性的实施方案中，翼包含淬灭剂，且与支撑物结合的捕获探针包含荧光团。再次地，翼或捕获探针上的淬灭剂或荧光团的确切位点可分别改变。在PCR条件下，存在目标分析物序列的情况下，翼从探针上切割。然后，翼与捕获探针杂交，从而捕获探针上的荧光团由此淬灭。因此，荧光在与捕获探针结合的位点处不存在(或减弱)表明存在目标分析物序列。

然而图2C提供了另一个示例性方法。在此，探针包含与目标分析物序列至少部分互补的序列，且不包含可切割的翼。该实施方案中的探针包含淬灭剂，且与支撑物结合的捕获探针包含荧光团。所述探针与捕获探针杂交，使与捕获探针结合的位点处的信号淬灭。然后固体支撑物经历PCR条件。在存在目标分析物序列的情况下，探针淬灭剂切割下来，且来自捕获探针的荧光信号增强。

因此，在一个实施方案中，本发明通常涉及测定目标分析物分子存在或不存在的的方法，所述方法包括：

a)提供本文描述的固体支撑物，其中A亚基包含与其共价结合的捕获探针；

b)使分析物探针或其片段与固体支撑物接触；以及

c)检测由捕获探针与分析物探针相互作用产生的信号存在或不存在。

在上述某些实施方案中，捕获探针为多核苷酸。在更多的一些实施方案中，目标分析物分子为多核苷酸或蛋白质。

在其他实施方案中，信号为荧光信号。例如，在一些实施方案中，荧光信号是由分析物探针与捕获探针的特异性杂交而产生或减弱。

在其他实施方案中，分析物探针包含荧光团或荧光团淬灭剂。

在其他相关实施方案中，本发明提供检测目标核酸的方法，所述方法包括：

A)提供包含至少一个本文描述的固体支撑物的检测腔，该固体支撑物包含捕获探针的阵列；

B)将样品装载至检测腔内，其中该样品包含待检测目标核酸的一个或多个拷贝；

C)使扩增引物和探针与一个或多个拷贝杂交；

D)在依赖扩增引物的扩增反应中，扩增一个或多个目标核酸拷贝的至少一部分，其中扩增反应使探针切割并施放第一探针片段；

E)使第一探针片段与高效阵列杂交；以及

F)检测由第一探针片段与阵列结合产生的信号，由此检测目标核酸。

在某些实施方案中，在降低邻近阵列的背景信号的条件下进行检测步骤。

在其他实施方案中，方法包括分析多种目标核酸序列的样品，所述方法包括：

A)使样品接触第一多个被标记的探针，该第一多个被标记的探针中的每一个包含：与第一组目标核酸序列中感兴趣的不同目标序列互补的第一部分，以及与高效探针阵列上的不同捕获探针互补的第二部分，所述高效探针阵列包含本文描述的固体支撑物，其中第二部分具有与其连接的标记，且第二部分不与感兴趣的目标序列互补；

B)在依赖扩增引物的扩增反应中，扩增存在于样品中的第一组目标核酸序列的任何目标序列，其中扩增反应使与目标序列杂交的被标记的探针切割，并释放含标记的被标记探针的第二部分；

C)使释放的被标记探针的第二部分与高效阵列杂交；

D)检测被标记探针的第二部分与高效阵列中的捕获探针的结合；以及

E)从与高效阵列杂交的被标记探针的第二部分识别样品中存在的目标序列。

在其他实施方案中，本发明提供了检测样品中目标核酸序列存在的方法，该方法包括：

A)在存在第一被标记的探针的情况下，该第一被标记的探针包含与第一目标核酸序列互补的第一部分和不与第一目标核酸序列互补的第二被标记部分，用具有核酸酶活性的聚合酶在样品上进行扩增反应，从而当目标核酸序列扩增时，使得第二部分从第一部分切割；

B)使第二被标记部分和与第二部分互补的捕获探针杂交；该捕获探针与本文描述的固体支撑物共价结合；以及

C)检测与基底上的捕获探针杂交的第二被标记部分的存在。

所述方法的其他实施方案包含检测样品中目标核酸序列的方法，该方法包括：

A)在存在包含第一探针的试剂的情况下，所述第一探针包含与目标核酸序列互补的第一部分和不与第一目标核酸序列互补的第二部分，该第二部分包含在第一位点处与该第二部分偶联的第一淬灭剂部分，用具有核酸酶活性的聚合酶在样品上进行扩增反应，从而当目标核酸序列扩增时，使得第二部分从第一部分切割，作为第一探针片段。

B)使第一探针片段与固定在本文描述的固体支撑物上的捕获探针杂交，其中该捕获探针包含被第一淬灭剂部分至少部分淬灭的荧光团，该荧光团与捕获探针上的第二位点偶联，从而通过探针片段与捕获探针的杂交，使得该荧光团被淬灭剂至少部分淬灭；以及

C)基于捕获探针上荧光团的淬灭，检测目标序列的存在。

在另一个实施方案中，本发明涉及检测样品中至少第一目标核酸序列存在的方法，该方法包括：

A)在本文描述的固体支撑物存在的情况下，使样品经历能够固体支撑物扩增目标核酸序列的扩增反应，其中所述固体支撑物包含至少第一组核酸探针，该第一组核酸探针包含捕获探针和与捕获探针的至少一部分以及目标核酸序列互补的目标特异性核酸探针，该捕获探针包含与其连接的荧光团，该目标特异性核酸探针包含与其连接的淬灭剂，从而当目标特异性探针与捕获探针杂交时，使得淬灭剂淬灭来自荧光团的荧光；以及

B)在聚合酶链式反应的一次或多次周期后，检测来自样品的荧光，荧光增强表明存在目标核酸序列。

本发明也提供了包含本文描述的固体支撑物和固体基底的装置和耗材。在一个实施方案中，本发明提供了核酸检测装置，该核酸检测装置包括：

A)检测腔，其包含在腔的至少一个表面上的至少一种高效核酸检测阵列，该核酸检测阵列包含本文描述的固体支撑物，其中，将腔配置为对阵列检测到的信号减弱信号背景；

B)热调节模块，其可操作地与检测腔偶联，在装置操作中该模块调节腔内的温度；以及

C)光学系统，其在装置操作中检测由阵列产生的信号。

在其他实施方案中，本发明提供了核酸检测耗材，该核酸检测耗材包括：深度小于约500μm的薄的腔，所述腔包括光学透明的窗，所述窗包括设置在窗内表面的高效捕获核酸阵列，所述腔另外包括与腔流体地偶联的至少一个试剂递送口，其中，配置耗材以允许流体在腔内热循环，其中高效捕获核酸阵列包含本文描述的固体支撑物。

在某些实施方案中，目标分析物分子为DNA序列，该DNA序列含有表明病原体存在的序列，所述病原体例如为病毒、细菌、疟原虫或真菌。

在一些实施方案中，分析物探针为翼。在另一些实施方案中，分析物探针包含淬灭剂。在另一些实施方案中，分析物探针包含荧光团。在其他实施方案中，捕获探针包含荧光团。在其他实施方案中，探针包含寡核苷酸。

固体支撑物可以是本文描述的任何固体支撑物。此外，在某些实施方案中，捕获探针为多核苷酸，且在其他实施方案中，目标分析物分子为多核苷酸。在其他实施方案中，通过聚合酶链式反应来制备目标分析物分子。

在另一些实施方案中，信号为荧光信号。例如，在一些实施方案中，荧光信号是由目标分析物分子与捕获探针特异性杂交而产生的。

在其他相关实施方案中，本发明提供了检测样品中的分析物的方法。该方法包括：使分析物接触本发明的固体支撑物以使分析物被本发明固体支撑物的捕获探针捕获，以及检测分析物的捕获。在某些实施方案中，分析物为生物分子，例如多肽、核酸、糖类、脂类或其杂化物。在其他实施方案中，分析物为有机分子，例如药物、药物候选物、辅因子或代谢物。在另一个实施方案中，分析物为无机分子，例如金属络合物或金属辅因子。在示例性的实施方案中，分析物是为被标记探针的核酸。在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了反应性表面，其共价固定蛋白质、酶、抗体、抗原、激素、糖、糖缀合物、或合成产生的分析物目标，例如在后续步骤中可用于捕获和检测分析物的合成产生的表位。

在各种其他实施方案中，本发明提供了使用本发明的固体支撑物来检测目标核酸的方法。该方法包括将可检测的被标记的核酸探针片段连接到固定在本发明固体支撑物聚合物上的互补序列的核酸上。示例性的方法包括：

A)使扩增引物和可检测的被标记的探针与目标核酸杂交；

B)在依赖引物的扩增反应中，扩增目标核酸的至少一部分，其中扩增反应使被标记的探针切割，并释放被标记的探针片段；以及

C)使被标记的探针片段与被固定的测定组分杂交，其中所述组分是与所述被标记的探针片段至少部分互补的的核酸，由此检测所述核酸。

可以通过任何本领域公认的方法或装置完成分析物的检测。在某些实施方案中，通过由固定在固体支撑物上的分析物或探针产生的荧光信号来检测分析物。在示例性的实施方案中，本发明的固体支撑物为核酸阵列，且由与固定在固体支撑物的聚合物上的测定组分杂交的被荧光标记的核酸产生信号。在各种实施方案中，被固定的测定组分是具有与被荧光标记的核酸序列至少部分互补的序列的核酸。在其中分析物被荧光标记的选定的实施方案中，通过诸如CCD阵列的荧光检测器来检测。在某些实施方案中，所述方法涉及通过将样品施加在固体支撑物的一个或多个可寻址位置处，并检测在一个或多个可寻址位置处捕获的分析物，来图谱表征样品中某一类型的分析物(例如，生物分子，例如，核酸)。用于实施本发明的方法的实例包括在第61/561,198号美国临时专利申请和第13/399,872号美国申请中描述的内容，全部公开的内容为了所有目的在此通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本发明的固体支撑物用于分离和检测测定混合物中的分析物。具体地，本发明的固体支撑物用于进行基本上任何形式的测定，所述试验包括，但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、色谱法捕获、免疫测定、竞争性测定、DNA或RNA结合测定，荧光原位杂交(FISH)、蛋白质和核酸图谱表征测定、三明治测定等。下文着重于讨论本发明的固体支撑物来实施示例性的测定的用途。该侧重仅为了说明清楚，且并非有意定义或限制本发明的范围。本领域的技术人员应认识到，本发明方法广泛用于检测分析物的存在和/或量的任何测定技术。

在各种实施方案中，本发明提供了使用本发明的固体支撑物来检测目标核酸的方法。该方法包括使可检测的被标记的核酸探针片段与固定在本发明固体支撑物的反应性聚合物上的互补序列的核酸相连。示例性的方法包括：

A)使扩增引物和可检测的被标记的探针与目标核酸杂交；

B)在依赖引物的扩增反应中，扩增目标核酸的至少一部分，其中扩增反应使被标记的探针切割，并释放被标记的探针片段；以及

C)使被标记的探针片段与被固定的测定组分杂交，其中所述组分是与所述被标记的探针片段至少部分互补的核酸，由此检测所述核酸。

样品可来自任何来源，并可以是生物样品，例如来自一个有机体或来自相同或不同物种的一组有机体的样品。生物样品可以是体液样品，例如，血液样品、血清样品、淋巴液样品，骨髓样品、腹水液、胸膜液、盆腔洗液、眼内液、尿液、精液、痰液或唾液。生物样品也可以是皮肤、鼻腔、咽喉或生殖器拭子的提取物，或是排泄物的提取物。生物样品也可以是器官或组织的样品，包括肿瘤。生物样品也可以是细胞培养物的样品，包括原核和真核细胞的细胞系和原代培养物。

样品可以来自环境，例如来自水体或来自土壤、或来自食物、饮料、或水源、工业来源、工作场所区域、公共区域或生活区域。样品可以是提取物，例如土壤或食物样品的液体提取物。样品可以是从例如工具、衣物、人工制品或其他材料的物品中由洗涤或浸渍或悬浮拭子得到的溶液。样品也包括用于识别生物战试剂的样品，例如已知或未知来源的粉状或液体样品。

样品可以是未处理的样品或处理过的样品；处理过程可以涉及以下步骤：提高样品的组分的纯度、浓度或可得性以有助于样品的分析。作为非限定性的实例，处理过程可包括以下步骤：减小样品的体积、去除或分离样品的组分、溶解样品或溶解一种或多种样品组分、或者破坏、改性、暴露、释放或隔离样品的组分。这些步骤的非限定性实例为离心、沉淀、过滤、均质化、细胞溶解、结合抗体、细胞分离等。例如，在一些本发明的优选实施方案中，样品为至少部分被处理的血液样品，所述处理例如为通过去除红细胞、通过浓缩、通过选择一种或多种细胞或病毒类型(例如，白细胞或病原性细胞)或通过溶解细胞等。

示例性的样品包括至少部分纯化的核酸分子溶液。核酸分子可以得自单一来源或多种来源，并且可以包含DNA、RNA或两者皆有。例如，核酸分子的溶液可以是经历了以下任何步骤的样品：细胞溶解、浓缩、提取、沉淀、核酸选择(例如，多聚腺苷酸RNA选择或含Alu元件的DNA序列的选择)、或用一种或多种酶处理。样品也可以是包含合成的核酸分子的溶液。

在示例性的实施方案中，当本发明的固体支撑物用于检测和/或表征核酸时，本发明的固体支撑物为含有不同序列的多个核酸的核酸阵列，该核酸在固体支撑物的已知位置与表面结合的聚合物共价结合。在各种实施方案中，固体支撑物是反应容器的组分，在该反应容器中在测定混合物中包含的目标核酸样品上进行PCR固体支撑物。在示例性的方法中，使一个或多个核酸引物和可检测的被标记的核酸探针与目标核酸杂交。在PCR模板延伸中，探针切割，生成探针片段。该探针片段从目标核酸释放，并被表面结合的聚合物上的固定的分析物组分捕获，所述分析物组分为核酸。探针序列通过其在阵列上的结合位置来测定。

在各种实施方案中，为了检测测定混合物中的一个或多个种类，本发明的固体支撑物作为多重测定的组件使用。本发明的固体支撑物具体用于进行多重类型的分析和测定。在示例性的多重分析中，使用两种或更多种探针来检测两个或更多个不同的种类(或者一个或多个种类的区域)，其中每种探针用不同的荧光团标记。本发明的固体支撑物允许多重测定的设计，其中测定中使用多于一种的可检测的被标记的探针结构。使用本发明固体支撑物的许多不同的多重测定对本领域的技术人员来说是显而易见的。在一个示例性的测定中，至少两种不同的荧光团的每一种用于发出核酸探针片段与表面固定的核酸杂交的信号。

用于实施本发明方法的示例性的被标记的探针为核酸探针。有用的核酸探针包括可在多种DNA扩增/定量策略中用作检测试剂组分的那些核酸探针，其中所述DNA扩增/定量策略包括，例如，5’-核酸酶测定、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、以及溶液相或固体(例如阵列)测定中对目标物的直接检测。此外，固体支撑物和低聚物能在基本上任何形式的探针中使用，所述探针包括，例如选自分子信标、Scorpion探针^TM、Sunrise探针^TM、构象协助探针、点亮探针、入侵探针和TaqMan^TM探针的形式。参见，例如，Cardullo,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.，J.Chem.Physics,21:836-850(1953)；Hochstrasser,R.A.等人，BiophysicalChemistry,45:133-141(1992)；Selvin,P.，MethodsinEnzymology,246:300-334(1995)；Steinberg,I.，Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.，Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang,G.等人，TetrahedronLetters,31:6493-6496(1990)；Wang,Y.等人，Anal.Chem.,67:1197-1203(1995)；Debouck,C.等人，SupplementtoNatureGenetics,21:48-50(1999)；Rehman,F.N.等人，NucleicAcidsResearch,27:649-655(1999)；Cooper,J.P.等人，Biochemistry,29:9261-9268(1990)；Gibson,E.M.等人GenomeMethods,6:995-1001(1996)；Hochstrasser,R.A.等人，BiophysicalChemistry,45:133-141(1992)；Holland,P.M.等人，ProcNatl.Acad.SciUSA,88:7276-7289(1991)；Lee,L.G.等人，NucleicAcidsRsch.,21:3761-3766(1993)；Livak,K.J.等人，PCRMethodsandApplications,ColdSpringHarborPress(1995)；Vamosi,G.等人，BiophysicalJournal,71:972-994(1996)；Wittwer,C.T.等人，Biotechniques,22:176-181(1997)；Wittwer,C.T.等人，Biotechniques,22:130-38(1997)；Giesendorf,B.A.J.等人，ClinicalChemistry,44:482-486(1998)；Kostrikis,L.G.等人，Science,279:1228-1229(1998)；Matsuo,T.，BiochemicaetBiophysicaActa,1379:178-184(1998)；Piatek,A.S.等人，NatureBiotechnology,16:359-363(1998)；Schofield,P.等人，Appl.Environ.Microbiology,63:1143-1147(1997)；TyagiS.等人，NatureBiotechnology,16:49-53(1998)；Tyagi,S.等人，NatureBiotechnology,14:303-308(1996)；Nazarenko,I.A.等人，NucleicAcidsResearch,25:2516-2521(1997)；Uehara,H.等人，Biotechniques,26:552-558(1999)；D.Whitcombe等人，NatureBiotechnology,17:804-807(1999)；Lyamichev,V.等人，NatureBiotechnology,17:292(1999)；Daubendiek等人，NatureBiotechnology,15:273-277(1997)；Lizardi,P.M.等人，NatureGenetics,19:225-232(1998)；Walker,G.等人，NucleicAcidsRes.,20:1691-1696(1992)；Walker,G.T.等人，ClinicalChemistry,42:9-13(1996)；以及Compton,J.，Nature,350:91-92(1991)，公开的内容为了所有目的在此各自通过引用整体并入本文。

在各种实施方案中，本发明提供了检测在目标核酸序列中多态性的方法。多态性指种群中出现两种或更多种遗传上决定的可选序列或等位基因。多态性标记物或多态性位点是出现分歧的基因座。示例性的标记物含有至少两种等位基因，各自出现的频率为大于选择种群的1％，且更优选为大于选择种群的10％或大于20％。多态性基因座可以和一个碱基对一样小。多态性标记物包括限制片段长度多态性、可变数目串联重复序列(VNTR's)、高变区、小卫星、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复、以及如Alu的插入元件。将第一识别的等位基因型任意地指定为参考型，而其他等位基因型被指定为可选的等位基因或变异型等位基因。有时，在选择的种群中最经常出现的等位基因型被称为野生型。二倍体有机体可以是等位基因型的纯合子或杂合子。双等位基因的多态性具有两种形式。三等位基因的多态性具有三种形式。

在示例性的实施方案中，使用本发明的固体支撑物来检测单核苷酸多态性。单核苷酸多态性在由单核苷酸占据的多态性位点出现，该位点是等位基因序列之间的变异位点。通常，该位点位于等位基因的高度保守序列(例如，小于种群的1/100或1/1000成员中变化的序列)之前和之后。通常，由于在多态性位点处将一个核苷酸替换为另一个核苷酸而产生单核苷酸多态性。转换是一个嘌呤被另一个嘌呤替换或一个嘧啶被另一个嘧啶替换。颠换是嘌呤被嘧啶替换，反之亦然。与参考等位基因相对的核苷酸的删除或者核苷酸的插入也会产生单核苷酸多态性。

在检测多态性的实施方案中，多态性核酸与固体支撑物在可寻址的位置处结合。在具体的位置出现可测信号说明在目标核酸序列中存在多态性。

在示例性的实施方案中，用荧光团部分来可测地标记探针。为具体的探针选择适当的荧光团，在文献中可得到大量的实践指导，例如以下参考文献所例证的：Pesce等人，Eds.,FLUORESCENCESPECTROSCOPY(MarcelDekker，纽约，1971)；White等人，FLUORESCENCEANALYSIS:APRACTICALAPPROACH(MarcelDekker，纽约，1970)；等等。为选择荧光团的文献还提供了详细的荧光分子和发色分子系列，以及它们的相关光学性质的参考内容(参见，例如Berlman，HANDBOOKOFFLUORESCENCESPECTRAOFAROMATICMOLECULES，第二版(AcademicPress，纽约，1971)；Griffiths，COLOURANDCONSTITUTIONOFORGANICMOLECULES(AcademicPress，纽约，1976)；Bishop，Ed.,INDICATORS(PergamonPress，牛津，1972)；Haugland，HANDBOOKOFFLUORESCENTPROBESANDRESEARCHCHEMICALS(MolecularProbes，Eugene，1992)；Pringsheim，FLUORESCENCEANDPHOSPHORESCENCE(IntersciencePublishers，纽约，1949)；等等)。此外，对于通过可加到核酸上的常见反应基团来共价连接的衍生荧光团分子在文献中有着广泛的指导，例如以下参考文献所例证的：Haugland(上文中的)；Ullman等人，第3,996,345号美国专利；Khanna等人，第4,351,760号美国专利。因此，为具体应用选择能量交换对，并使该对中的成员与探针分子(例如核酸、肽或其他聚合物)缀合完全在本领域的技术人员的能力范围内。

考虑到关于将小分子与核酸缀合的文献的完善的正文，将供体/受体对连接到核酸上的许多其他方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。例如，完成固体合成后，通过用亚磷酰胺部分衍生的染料，将罗丹明和荧光素染料可方便地连接到核酸的5’-羟基(参见，例如，Woo等人，第5,231,191号美国专利；以及Hobbs,Jr.，第4,997,928号美国专利)。

更加具体地，存在许多将基团连接到核酸的5’-或3’-端的连接物部分和方法，例如以下参考文献所例证：Eckstein，编辑，NucleicacidsandAnalogues:APracticalApproach(IRLPress，牛津，1991)；Zuckerman等人，NucleicAcidsResearch,15:5305-5321(1987)(核酸上的3’-硫醇基)；Sharma等人，NucleicAcidsResearch,19:3019(1991)(3’-巯基)；Giusti等人，PCRMethodsandApplications,2:223-227(1993)和Fung等人，第4,757,141号美国专利(经得自P.E.Biosystems的氨基连接臂(Aminolink)TMII的5’-磷氨基，CA.)Stabinsky，第4,739,044号美国专利(3-氨烃基磷酰基)；Agrawal等人，TetrahedronLetters,31:1543-1546(1990)(通过亚磷酰胺键连接)；Sproat等人，NucleicAcidsResearch,15:4837(1987)(5-巯基)；Nelson等人，NucleicAcidsResearch,17:7187-7194(1989)(3’-氨基)，等等。

检测荧光标记的方法为本领域的技术人员所熟知。因此，例如，可以通过用适当波长的光刺激荧光团，并检测得到的荧光来检测荧光标记。通过感光胶片的方法、通过使用诸如电荷偶联固体支撑物(CCDs)或光电倍增管等的电检测器可以视觉上检测荧光固体支撑物。类似地，可以通过为酶提供适当的底物并检测得到的反应产物来检测酶促标记。

虽然通过参考文献例证了被荧光标记的核酸的检测，但是本发明的固体支撑物还用于分析物分子的检测。当聚合物被结合基团官能化时，固体支撑物将捕获与特定基团结合的表面分析物。可以洗掉未结合的材料，且可以用许多方法来检测分析物，所述方法包括，例如气相离子谱法、光学方法、电化学方法、原子力显微技术和射频方法。示例性的光学方法包括，例如检测荧光、发光、化学发光、吸光度、反射度、透射度、双折射或折射率(例如，表面等离子体共振、椭圆偏振、石英晶体微天平、共振镜方法、光栅耦合器波导法(例如，波长询问的光学传感器(“WIOS”)或干扰量度法)。光学方法包括显微技术(共焦和非共焦的)、成像方法和非成像方法。各种类型的免疫测定(例如，ELISA)是检测固体上捕获的分析物的常用方法。电化学方法包括伏安法和电流法。射频方法包括多极共振谱法或干扰量度法。光学方法包括显微镜术(共焦和非共焦的)、成像方法和非成像方法。各种类型的免疫测定(例如，ELISA)是检测固体上捕获的分析物的常用方法。电化学方法包括伏安法和电流法。射频方法包括多极共振谱法。

有利于本发明的低聚物与目标核酸分子杂交的条件可以由本领域的技术人员凭经验决定，并且可以包括最优孵育温度、盐浓度、寡核苷酸类似物探针的长度和碱基组成、以及样品的低聚物的浓度和核酸分子的浓度。优选地，在存在至少1毫摩尔镁离子和pH值6.0以上的情况下进行杂交。在一些实施方案中，有必要或期望在杂交前处理样品，以使样品中的核酸分子成为单链。这类处理的实例包括，但不限于：用碱处理(优选地在之后中和)、在高温下孵育、或用核酸酶处理。

此外，因为核酸杂交对盐的依赖性主要由杂交寡核苷酸类似物骨架的电荷密度决定，提高在本发明的HypNA-pPNA低聚物或SerNA-pPNA低聚物中的pPNA单体的比例能够提高杂交的盐依赖性。这可用于本发明的方法以获利，其中，这种方法在一些方面可期望能够通过改变盐条件来增加杂交的严格度，例如，或通过降低盐的浓度来释放杂交的核酸。在本发明的其他方面中，可期望在极低的盐浓度下，本发明的寡核苷酸类似物与核酸具有高亲和力结合。在这种情况下，在本发明的寡核苷酸类似物中，保持接近1:1的HypNA单体与pPNA单体的比例是有利的。

本发明的低聚物在结合目标核酸分子中的高度特异性使从业者可选择有利于辨别核酸序列与目标核酸分子的杂交条件，所述核酸序列包含与一种或多种低聚物的至少一部分完全互补的序列段，所述目标核酸分子包含在基本上互补的序列中包含少数非互补的碱基的序列段。例如，可以选择杂交或洗涤温度以使本发明的低聚物与沿序列段完全互补的目标核酸分子稳定杂交，但促进本发明的低聚物与不完全互补的目标核酸分子的杂交体分解，所述不完全互补的目标核酸分子包括在互补序列段上有一个或两个碱基错配的目标核酸分子。杂交和洗涤温度的选择可以是取决于、至少是部分取决于其他条件的，例如：盐浓度、低聚物和目标核酸分子的浓度、低聚物与目标核酸分子的相对比例、待杂交的低聚物长度、低聚物和目标核酸分子的碱基组成、寡核苷酸类似物分子的单体组成等。此外，当选择的条件有利于完全互补的分子的稳定杂交，且不利于低聚物与一个或多个碱基错配的目标核酸分子的稳定杂交时，还可以将其他的条件考虑在内，并且在需要时改变条件，包括但不限于：待杂交的寡核苷酸类似物的长度、在低聚物与目标核酸分子之间互补的序列段的长度、互补序列段中非互补碱基的数量、错配碱基的特性、错配碱基附近碱基的特性、以及互补段上任何错配碱基的相对位置。核酸杂交领域的技术人员能够根据具体应用来确定在使用本发明的低聚物与目标核酸分子杂交时的有利的杂交和洗涤条件。“有利的条件”可以是有利于低聚物与目标核酸分子之间稳定杂交的条件，所述目标核酸分子至少部分是基本互补的，包括含有一个或多个错配的目标核酸分子。

“有利的条件”可以是有利于低聚物与(至少部分)完全互补的目标核酸分子稳定杂交，并且不利于不完全互补的分子间的杂交体的条件或使其不稳定的条件。

使用如本文所公开的方法，与不同序列的目标核酸分子杂交的本发明的低聚物的熔融温度能够决定，且该温度可用于决定所给定应用的有利条件。也可能通过例如，使目标核酸分子与连接在固体支撑物上的低聚物杂交，并检测杂交的络合物来凭经验决定有利的杂交条件。

通过低聚物探针与固体支撑物的直接连接或间接连接，与固体支撑物或本发明的低聚物探针结合的目标核酸分子可以方便有效地从调查的种群中未结合的核酸分子中分离。可以高严格度地洗涤固体支撑物，以除去未与低聚物探针结合的核酸分子。然而，低聚物探针与固体支撑物相连并非本发明的必要条件。例如，在一些应用中，可以通过基质离心、或通过相分离或通过一些其他类型的分离(例如，示差沉淀)来分离结合与未结合的核酸分子，所述其他类型的分离任选地通过在低聚物探针中并入化学基团来辅助(参见，例如，于2000年5月9日提交的第6,060,242号美国专利，Nie等人)。

在示例性的实施方案中，在实时PCR测定中使用本发明的固体支撑物，如第13/399,872号共有的、共同待决的美国专利申请中所描述的固体支撑物。

在本发明的其他方法中，本发明涉及制备固体支撑物的方法，所述固体支撑物含有与其结合的探针分子，该方法包括使固体支撑物(如上文描述的)与聚合物接触，所述固体支撑物包含与其外表面共价结合的叠氮化物或炔烃部分，所述聚合物包含上文描述的A、B和C亚基。

在其他实施方案中，所述方法还包括使固体支撑物和聚合物接触Cu(I)催化剂。进一步的实施方案包括使含有胺官能团的探针分子与结合有聚合物的固体支撑物接触，以制备结合有探针分子的固体支撑物。这种方法在许多应用中具有功效，比如制备DNA微阵列等。

下文提供的实施例的目的在于说明，而非限制。

实施例

实施例1

制备(N,N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酸五氟苯酯)共聚物，35％DMA摩尔进料比的(DMA-PFPA)共聚物—一般步骤

将2.24g二甲基丙烯酰胺(DMA)(22.58mmol，35mol％)、10.01g丙烯酸五氟苯酯(PFPA)(42.03mmol，65mol％)和10.1mg2,2’-偶氮(2,4-二甲基戊腈)(0.041mmol)在30mL无水乙腈中的溶液置于150mL圆底玻璃烧瓶中，用流速约60mL/min的超纯氩气净化(鼓泡)，并在200rpm下磁力搅拌45min。然后将反应烧瓶降至55℃的油浴中。氩气流速和磁力搅拌分别降低至约25mL/min和120rpm。在该条件下，聚合反应进行19小时。将粘稠的反应混合物冷却至环境温度并在后处理之前将其暴露于环境气氛中。

在～55℃的水浴中减压(旋转蒸发仪)30分钟除去乙腈，并在0.5毫巴和59℃的真空烘箱中3小时除去残留的单体。将聚合物产物再次溶于40mL无水THF中，同时在55℃的油浴中开放搅拌。在磁力搅拌下，逐滴加入约50mL的正己烷，直到溶液变得略微浑浊。向2L的聚(丙烯)锥形烧瓶(Erlenmeyerflask)中的1400mL正己烷中，连续充入干燥的氮气，通过22量规的注射针以微流形式添加浑浊的悬浮液，同时用2”PTFE搅拌桨叶强力搅拌。将沉淀的聚合物另外搅拌5分钟，然后移入600mL新的正己烷中，再缓慢地搅拌5分钟。将聚合物移入另600mL新的正己烷中，并浸渍15分钟。沉淀的聚合物为粗纤维的形状。将沉淀的聚合物移入500mL的大口玻璃瓶中，并在55℃的真空中干燥22小时，以得到10.6792g(DMA-PFPA)共聚物(产率87.1％)。通过定量的¹⁹F-NMR，发现PFPA的摩尔掺入百分比为67％(推断DMA为33％)，且酯水解的程度为1.4％。

聚合反应的一般步骤用于制备具有任何期望的稀释单体与反应单体比例的均聚物、共聚物和三元共聚物。

实施例2

制备(N,N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酸五氟苯酯)共聚物，39％DMA摩尔进料比的(DMA-PFPA)共聚物

进行上述一般步骤。将2.5816gDMA(26.043mmol，39mol％)、9.7003gPFPA(40.740mmol，61mol％)和10.6mg2,2’-偶氮(2,4-二甲基戊腈)(0.043mmol)在30mL无水乙腈中的溶液置于150mL的圆底玻璃烧瓶中，用流速约60mL/min的超纯氩气净化(鼓泡)，并在200rpm下磁力搅拌45分钟。然后将反应烧瓶降至55℃的油浴中。氩气流速和磁力搅拌分别降低至约25mL/min和120rpm。在该条件下，聚合反应进行19小时，以得到10.42g(DMA-PFPA)共聚物(产率84.8％)。通过定量的¹⁹F-NMR，发现PFPA的摩尔掺入百分比为58％(推断DMA为42％)，且酯水解为1.9％。

实施例3

制备(N,N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酸五氟苯酯)共聚物，15％DMA摩尔进料比的(DMA-PFPA)共聚物

进行一般步骤。将0.6090gDMA(6.143mmol，15mol％)、8.2395gPFPA(34.605mmol，85mol％)和10.6mg2,2’-偶氮(2,4-二甲基戊腈)(0.043mmol)在30mL无水乙腈中的溶液置于150mL圆底玻璃烧瓶中，用流速约60mL/min的超纯氩气净化(鼓泡)，在200rpm下磁力搅拌45分钟。然后将反应烧瓶降至55℃的油浴中。氩气流速和磁力搅拌分别降低至约25mL/min和120rpm。在该条件下，聚合反应进行6小时，以得到7.908g(DMA-PFPA)共聚物(产率89.4％)。通过定量的¹⁹F-NMR，发现PFPA的摩尔掺入百分比为87％(推断DMA为13％)，且酯水解为1.7％。

实施例4

制备(N,N-二甲基丙烯酰胺-丙烯酰胺-丙烯酸五氟苯酯)共聚物，34％DMA摩尔进料比的(DMA-AAM-PFPA)共聚物

进行一般步骤。将2.1500gDMA(21.689mmol，34mol％)、2304gAAm(3.241mmol，5mol％)、9.2504gPFPA(38.851mmol，61mol％)和9.9mg2,2’-偶氮(2,4-二甲基戊腈)(0.040mmol)在30mL无水乙腈中的溶液置于150mL圆底玻璃烧瓶中，用流速约60mL/min的超纯氩气净化(鼓泡)，并在200rpm下磁力搅拌45分钟。然后将反应烧瓶降至55℃的油浴中。氩气流速和磁力搅拌分别降低至约25mL/min和120rpm。在该条件下，聚合反应进行23小时，以得到10.351g(DMA-AAm-PFPA)三元共聚物(产率88.9％)。通过定量的¹⁹F-NMR，发现PFPA的摩尔掺入百分比为59％(推断DMA+丙烯酰胺为41％)，且酯水解为3.5％。

实施例5

制备(丙烯酰胺-丙烯酸五氟苯酯)共聚物，15％AAM摩尔进料比的(AAM-PFPA)共聚物

进行一般步骤。将0.2123g丙烯酰胺(AAm)(2.987mmol，14.8mol％)、4.0921gPFPA(17.186mmol,85.2mol％)和4.7mg2,2’-偶氮(2,4-二甲基戊腈)(0.019mmol)在20mL无水乙腈中的溶液置于150mL圆底玻璃烧瓶中，用流速约60mL/min的超纯氩气净化(鼓泡)，并在200rpm下磁力搅拌45分钟。然后将反应烧瓶降至55℃的油浴中。氩气流速和磁力搅拌分别降低至约25mL/min和120rpm。在该条件下，聚合反应进行19小时。在～55℃的水浴温度下减压(旋转蒸发仪)30分钟，并在0.5毫巴和55℃的真空烘箱中3小时除去溶剂和残留的PFPA。聚合物产物再次溶于20mL无水THF中，同时在55℃的油浴中用磁力搅拌子连续搅拌。在连续搅拌下，逐滴加入45mL正己烷，以得到略微浑浊的溶液。向2L玻璃锥形烧瓶中的1200mL正己烷中，连续通入干燥的氮气，通过22-量规的注射针微流加入浑浊溶液，同时用2”PTFE搅拌桨叶强力搅拌。抽滤沉淀的聚合物，用大量正己烷(～400mL)冲洗，抽气干燥，并在55℃真空中干燥过夜，以得到3.24g(AAm-PFPA)共聚物(产率75.1％)。该共聚物可溶于乙腈、丙酮、THF和氯仿。

实施例6

制备聚(丙烯酸五氟苯酯)(聚(PFPA))

进行一般步骤。将12.0033gPFPA(50.413mmol)和9.9mg2,2’-偶氮(2,4-二甲基戊腈)(0.040mmol)在30mL无水乙腈中的溶液置于150mL圆底玻璃烧瓶中，用流速约60mL/min的超纯氩气净化(鼓泡)，并在200rpm下磁力搅拌45分钟。然后将反应烧瓶降至55℃的油浴中。氩气流速和磁力搅拌分别降低至约25mL/min和120rpm。在该条件下，聚合反应进行18小时。

18小时结束时，在～55℃的水浴下减压(旋转蒸发仪)30分钟，并在55℃的高度真空中5小时除去溶剂和残留的单体。聚合物产物再次溶于30mL无水THF中，同时在55℃的油浴中开放搅拌。在磁力搅拌下，逐滴加入约15mL正己烷，直到溶液变得略微浑浊。向2L聚(丙烯)锥形烧瓶中的1200mL正己烷，连续通入干燥的氮气，通过22-量规的注射针微流加入浑浊的悬浮液，同时用2”PTFE搅拌桨叶强力搅拌。将沉淀的聚合物移入500mL新的正己烷中，并再搅拌10分钟。然后将聚合物移入另500mL新的正己烷中，并浸渍15分钟。沉淀的聚合物为粗纤维的形状。将沉淀的聚合物移入500mL的大口玻璃瓶中，并在55℃的真空中干燥22小时，以得到9.96g聚(PFPA)(产率83.0％)。该均聚物不溶于水，微溶于乙腈，但易溶于THF、丙酮和氯仿。通过定量的¹⁹F-NMR，发现PFPA的摩尔掺入百分比为计算值的100.9％(在NMR的灵敏度范围内)，且未检测到酯水解。

实施例7

聚合物在塑料基底表面上的共价固定—一般步骤

使用装配有1”线性等离子体源的ATOMFLO^TMModel400(SurfxTechnologies，Culver，CA)的大气压氧气等离子体发生器和X-YRobot,F4200N(Fisnar，Wayne，NJ)将氧化的官能团引入塑料基底的表面。将塑料样品置于自动设备的铝扫描平台上，所述自动设备具有面对等离子体源且在等离子体源上方4mm处的待处理表面。用流速分别为15L/min和0.05L/min的氦气和氧气在60W下生成等离子体。等离子体源以20mm/秒的速度扫过基底表面。扫描次数在1次至10次间进行改变，以便调整羟基、羰基和羧基官能团的表面密度。

使等离子体处理的基底样品浸没在涂层聚合物和碱性催化剂的乙腈或丙酮溶液中，并在环境温度下缓慢地翻滚2至20小时。取出基底样品，用大量乙腈或丙酮冲洗，并用氮气吹干。

实施例8

(DMA-PFPA)共聚物的共价固定，35:65mol％的DMA:PFPA在COP基底芯片上

共价固定聚合物的一般步骤是用3次等离子体扫描进行的。将四个67mmx25mmx1.0mm的被等离子体处理的COP基底样品(芯片)浸没在25mL含有15.0μL三乙胺和87.3mg35:65mol％DMA:PFPA共聚物的无水乙腈溶液中。在缓慢翻滚19小时后，取出COP基底芯片，用大量乙腈冲洗，并吹干。固定有聚合物的表面显示出69.4±0.8度(n＝9)的水接触角。

在类似的条件下，将4个被等离子体处理的COP基底芯片浸没在25mL含有16.2μLN,N-二甲基苄胺和87.3mg35:65mol％DMA:PFPA的共聚物的无水乙腈溶液中。用乙腈冲洗并吹干后，固定有聚合物的表面显示出89.5±0.6度(n＝8)的水接触角。

实施例9

在COP基底芯片上共价固定聚(PFPA)

共价固定聚合物的一般步骤是用3次等离子体扫描进行的。将四个67mmx25mmx1.0mm的被等离子体处理的COP基底样品(芯片)浸没在25mL含有15.0μL三乙胺和86.7mgPFPA均聚物的丙酮溶液中。也可以使用其他溶剂，例如乙腈。在缓慢翻滚17小时后，取出COP基底芯片，用大量丙酮冲洗，并吹干。固定有聚合物的表面显示出78.8±0.8度(n＝10)的水接触角。

在类似的条件下，将4个被等离子体处理的COP基底芯片浸没在25mL含有16.2μLN,N-二甲基苄胺和86.7mgPFPA均聚物的丙酮溶液中。用丙酮冲洗并吹干后，固定有聚合物的表面显示出86.7±0.5度(n＝6)的接触角。

在类似的条件下，通过仅用1次的等离子体预处理12个COP基底芯片。这些被预处理的COP基底芯片以4个为一组浸没在25mL含有16.2μLN,N-二甲基苄胺和86.0mgPFPA均聚物的丙酮溶液中，并在环境温度下翻滚16小时。用丙酮冲洗并吹干后，固定有聚合物的表面显示出83.6±0.4度(n＝18)的水接触角。

实施例10

(丙烯酰胺-DMA-PFPA)三元共聚物的共价固定，5:34:61mol％的AAM:DMA:PFPA在COP基底芯片上

共价固定聚合物的一般步骤是用3次等离子体扫描进行的。将四个67mmx25mmx1.0mm的被等离子体处理的COP基底样品(芯片)浸没在25mL含有15.0μL三乙胺和87.3mg(AAm-DMA-PFPA)三元共聚物的无水乙腈溶液中。也可以使用其他溶剂，例如乙腈。在缓慢翻滚17小时后，取出COP基底芯片，用大量乙腈冲洗，并吹干。固定有聚合物的表面显示出76.7±0.6度(n＝7)的水接触角。

在类似的条件下，将4个被等离子处理的COP基底芯片浸没在25mL含有16.2μLN,N-二甲基苄胺和87.3mg(AAm-DMA-PFPA)三元共聚物的无水乙腈溶液中，以得到固定有聚合物的表面，其具有77.5±0.2度(n＝6)的水接触角。

实施例11

(丙烯酰胺-PFPA)共聚物的共价固定，15:65mol％的AAM:PFPA在COP基底芯片上

共价固定聚合物的一般步骤是用1次等离子体扫描进行的。将四个67mmx25mmx1.0mm的被等离子体处理的COP基底样品(芯片)浸没在含有16.2μL三乙胺和85.8mg(AAm-PFPA)共聚物的丙酮溶液中。也可以使用其他溶剂，例如乙腈。在缓慢翻滚20小时后，取出COP基底芯片，用大量丙酮冲洗，并吹干。固定有聚合物的表面显示出82.5±0.5度(n＝18)的水接触角。

实施例12

反应性聚合物涂覆的固体支撑物的氨加帽步骤

步骤：

制备含有50mM氢氧化铵和100mM三乙胺的水溶液。将部分溶液(25mL)倒入30mL的带螺旋盖的聚丙烯滑动管中，其中含有4块聚合物支撑物玻片、1”x3”x0.04”的聚合物涂覆的COP(环烯烃聚合物)玻片。如上文描述，通过使反应性聚合物与基底表面上的羟基共价结合(形成酯键)来制备玻片，并用捕获探针微阵列预先点样但未洗涤。将管密封，并置于60℃的水浴中1小时，这段时间之后将氨溶液倒出，并替换为水。1分钟后，取出玻片，用另外的水冲洗，并在氮气流下吹干。对加帽的玻片表面测量得到了约8度的平均水接触角(WCA)。加帽之前时，聚合物涂覆的玻片支撑物的平均水接触角(WCA)为86度。对4块固体支撑物玻片中的每一块取三次测量值的平均值作为每个水接触角。

氨加帽的优化

为确定另外加帽的参数，制备了溶液，其含有100mM或500mM的氢氧化铵，各含有100mM三乙胺。在4个不同的温度，20℃、60℃、75℃和95℃下，固体支撑物玻片在这些溶液的每一种中和在单独含水的管内加帽1小时。表1示出了固体支撑物玻片的数据，该固体支撑物玻片是用含有65mol％PFPA和35mol％DMA的共聚物、在一系列试剂浓度和四种浸没温度下1小时来制备的。

加帽前的水接触角为86度。用500mM的氨在任何温度下得到了差值可忽略的最终水接触角(8度至10度)。在20℃下，观察到了对试剂浓度的依赖性，其中50mM的氨对水接触角几乎没有影响，500mM影响最大的变化(最小的水接触角)，而100mM产生了中等的水接触角(50度)。在60℃和60℃以上的温度下，不依赖氨的浓度得到了最大的水接触角变化。单独的水处理不能明显改变水接触角，除了在最高温度下(T＝95℃，水接触角＝55度)。表1中列出的每个水接触角为对4块固体支撑物玻片中的每一块的3次单独测量的平均值。表1的数据(在图6中用图例示出)说明了：用67.5％PFPA和32.5％DMA的(PFPA-DMA)共聚物来固定的COP玻片、一系列试剂浓度和浸没温度来进行氨加帽对最终WCA的影响。加帽前的WCA为86°。

表1

本固体支撑物在加帽后的WCA明显低于目前已知的固体支撑物在加帽后的WCA。虽然不希望被理论约束，但是应相信，本固体支撑物的较低的WCA至少部分与加帽条件下的共价键(W)的稳定性有关。目前可用的固体支撑物包含不同的、较不稳定的键(例如，通过UV活化形成的)，并且相信，这类支撑物的加帽会导致聚合物从基底上切割，并由此增大WCA(由于暴露的基底表面面积更大)。如上文所示，与本固体支撑物有关的WCA的减小在许多方面是有利的，包括用于结合所述固体支撑物的PCR和/或其他分析试剂的溶解。

实施例13

聚合物的NMR分析

虽然共聚物或三元共聚物中单体的进料比通过质量或体积测量得知，但是并入产物的单体的实际比例是可变的，并且必须在合成后进行测定。每一批聚合物通过¹H、¹³C和定量的¹⁹FNMR表征；每种NMR方法提供了关于最终产物的关键信息。下文讨论了试验参数、谱图实例和得到的信息。含丙烯酸五氟苯酯的聚合物通常在氘代氯仿(CDCl₃)中完全溶解，并且因为化学位移是可预测的，且室温下谱线宽度最优，所有通常优选这种溶剂。

¹ H-NMR

在400MHz下收集质谱。丙烯酸五氟苯酯与二甲基丙烯酰胺(或丙烯酰胺)的共聚物由宽峰代表且不能标定，因为在其中聚合物骨架和酰胺信号出现的δ1-4ppm的区域内有信号重叠。此外，氟化的单体在芳环上不具有质子，并因此仅有助于骨架信号。然而，质谱是有用的，因为其揭示了未反应单体的存在(如果存在的话)，如δ5-7ppm的区域内的尖峰。样品中的水可以观测为在氯仿中δ1.6ppm处的尖峰。痕量加工溶剂(例如己烷)对聚合物的污染也可以观察为尖锐的信号。可以对所有由污染物产生的信号进行积分以评估共聚物的整体纯度。可接受的聚合物将含有小于0.5摩尔百分比的单体总含量。不关注痕量的溶剂，例如己烷，除在后续使用中对聚合物的浓度进行准确评估之外。

¹³ C-NMR

在100MHz下，质子解耦，25K扫描宽度，在30度下4.4微秒脉冲宽度和1.5秒脉冲延迟情况下获取碳谱。50mg聚合物在500μL溶剂中的典型样品需要16K扫描，允许半定量观察来自每种单体(δ165-175ppm)的羰基碳(酰胺和酯)。与质谱不同，聚合物的¹³C谱线宽度也窄至足以允许标定三种类型的氟化碳，并足以区分骨架碳和酰胺上的甲基峰。

¹⁹ F-NMR

在376MHz下，非质子解耦，90K扫描宽度和45度下7.8微秒脉冲宽度的情况下收集氟谱。为定量分析，需要在60秒脉冲延迟下进行32次扫描。典型的样品由500μLCDCl₃中的20-30mg聚合物组成，所述CDCl₃含有2-3mg氟化苯作为内标。根据进料比，单元平均的单体FW(Mc)通过Mc＝a(M_p)+b(M_d)来计算，其中M_p为反应性共聚单体片段的FW(PFPA为238.11)，M_d为稀释性共聚单体片段的FW(DMA为99.13)，且a和b是在聚合溶液中的摩尔分数(a+b＝1)。根据对特定PFPA进料比计算得到的单元FW和样品的已知质量(和加入的氟化苯的质量)，可以确定并入聚合物中的实际的氟。当聚合物为含有丙烯酰胺以及二甲基丙烯酰胺的三元共聚物时，使用了小的单元FW校正因子；然而，通过NMR仅能推断PFPA的并入百分比。氟谱也用于观察任何酯的水解，因为游离的五氟苯酚共振通常是尖锐的，且与聚合氟信号很好地分离，因此允许定量评估剩余活化酯的含量。对于PFPA聚合物，¹⁹F信号以宽的但易积分的峰在δ-152(2F)、-157(1F)和-162(2F)ppm附近出现，同时五氟苯酚的峰以尖锐的多重峰在δ-161(2F)、-165(2F)和-171(1F)ppm附近出现。氟化苯内标以窄的复杂多重峰在δ-112ppm附近出现。

示例性分析

作为示例，摩尔进料比为85:15的PFPA-DMA共聚物产生了完全整合的氟信号，相当于91.7μmolPFP基团(基于加入的已知量的氟化苯)。对于这种组分的共聚物，平均单体FW＝217.5和23.2mg的样品表示106.7μmol单体单元。PFP摩尔数除以计算所得的单元FW，即，(91.7/106.7)＝0.86或86％的所并入的PFPA。然而，如果假设了共聚物的组分为87％PFPA，稍高的单体单元FW产生了与由NMR观察到的氟含量恰好匹配的并入百分比，即(91.68/105.5)＝87％PFPA；因此实际并入比例为87％PFPA。

图3示出了该实施例的¹⁹FNMR。

实施例14

寡核苷酸阵列的制备及装置

在384孔板中制备20μM胺改性的寡核苷酸在50mM磷酸钠(pH8.5)中的点样溶液。然后通过阵列点样器(Array-itSpotBot3)，按需要的点样尺寸选择适当的点样针，按需要的模式在上文制备的固体支撑物上点样寡核苷酸。每块玻片上点样两组阵列，位于玻片长的1/4和3/4点处，且相对于载玻片宽度居中处。在点样后，所述玻片在75％的相对湿度下孵育4-18小时，然后用DI水流冲洗，并用氩气吹干。

干燥后，将玻片切割成两半，得到两块1”x1.5”的芯片，经点样的阵列在每块芯片的中心。装配了小型的单腔装置，其中经点样的玻片形成底部。将尺寸适当的预切割的双面PSA垫片置于玻片上，留下阵列被点样的部分连同在其周围固定尺寸的大致为环形的区域暴露。在垫片上放置聚碳酸酯的盖，盖上带有两个预先钻好的填料口。将得到的组件在室温下层进行压，确保其在热循环中有适当的附着力。

包含引物和探针混合物、缓冲液、酶和目标DNA的多元PCR溶液在管内预先混合然后加入到上文描述的腔内。典型反应腔容积为25-40μL。加入PCR反应溶液后，用光学透明的膜密封芯片的聚碳酸酯盖中的口。

在定制的热循环设备中检测填有PCR反应溶液的装置，其允许在热循环过程中，通过落射荧光显微镜用数码相机对表面成像。对于切割的荧光DNA翼(和全长探针)，当冷却至其杂交温度(T_m)以下时，典型杂交时间少于2分钟。通过测量与捕获探针阵列杂交的切割的翼(或全长探针)的荧光强度来表征表面。以这种方式，在典型的热循环条件下的缓冲液中测量了表面的稳定性。也在装置中用通常包含以下的运行进行了PCR：在95℃下活化需要的时间，从95℃至60℃热循环40个周期，95℃时的滞留时间为15秒，而60℃时的滞留时间为60秒。在选定的某些循环中，腔被冷冻至探针T_m以下，使60℃的延长步骤之后进行杂交。

使用自动成像分析软件来定位阵列点样，并通过测量像素强度来对信号进行定量。从点样内的平均像素强度扣除实际点样区域外的平均像素强度，得到点样区域扣除背景的像素强度。在热循环中监测这些强度，用于检测特异于捕获探针的切割的DNA翼。

实施例15

固体支撑物的热循环

根据上述步骤制备包含(DMA-PFPA)共聚物的聚合物的环聚(烯烃)(COP)玻片，所述聚合物与玻片共价结合。通过将被标记的寡核苷酸点样在固体支撑物上，将这些固体支撑物用于制造微阵列。存在缓冲液时，使微阵列经历40个周期的热循环(64至95℃)，并监测点样形状和亮度。图4A-C分别示出了用低、中和高的等离子体功率处理的玻片来制备的阵列的结果。图4A-C中可见，在循环40次后，点样保持不变，说明(DMA-PFPA)共聚聚合物共价连接(代替了非特异性吸附)在等离子体(APOP)处理的COP玻片上。

上文描述的各种实施方案可以组合以提供另外的实施方案。本说明书中引用的和/或应用数据页中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开，包括但不限于：于2013年3月14日提交的第61/785,987号美国专利申请，通过引用将其整体并入本文。如果需要使用多种专利、申请和公开的概念来提供进一步的实施方案，则可以修改实施方案的方面。根据上文的详细描述，可以对实施方案做出这些和其他的改变。通常，在下文的权利要求中，使用的术语不应被解释为将权利要求限定于本说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案，以及与这些权利要求要求的范围等同的全部范围。因此，权利要求不被公开内容限定。

从上述内容中应明白，虽然为了示例说明的目的在本文中描述本发明的具体实施方案，但是在不背离本发明的主旨和范围的情况下，可以做出各种改变。因此，本发明除受所附权利要求限制外不受限制。

Claims (121)

1.固体支撑物，其包含：

具有外表面的基底；以及

与所述基底外表面共价结合的多个聚合物，所述聚合物各自包含至少一个A和C亚基，并任选地包含一个或多个B亚基，其中：

所述A亚基每次出现时独立地包含：

a)第一热化学反应基团，其中所述第一热化学反应基团能够与捕获探针上的醇、羰基或胺基团形成共价键；

b)第二热化学反应基团，其中所述第二热化学反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对于通过环加成或1,4-共轭加成反应与捕获探针上的目标官能团形成共价键特异的反应性；或者

c)与捕获探针的共价键，

所述任选的B亚基每次出现时独立地包含亲水部分；以及

所述C亚基每次出现时独立地包含与所述基底外表面的共价连接W，其中W具有以下结构之一：

其中Q为所述基底外表面，且其中所述第一热化学反应基团和所述第二热化学反应基团的反应性是相互正交的。

2.如权利要求1所述的固体支撑物，其中所述聚合物具有下式(I)：

T¹-(A)_x(B)_y(C)_z-T²

(I)

其中：

A、B和C分别代表所述A、B和C亚基；

T¹和T²各自独立地不存在，或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物末端基团；

x和z独立地为1至50,000的整数；以及

y为0至50,000的整数。

3.如权利要求1-2中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有下式(II)：

其中：

R¹每次出现时独立地为所述第一热化学反应基团、所述第二热化学反应基团、或与所述捕获探针的共价键；

R²每次出现时独立地为所述亲水部分；

W每次出现时独立地为与所述基底外表面的共价键；

Q为所述基底外表面；

R³、R⁴和R⁵每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

L¹、L²和L³每次出现时独立地为直接键或至多100个原子长度的连接物；

T¹和T²各自独立地不存在，或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物末端基团；

x和z各自独立地为1至50,000的整数；以及

y为0至50,000的整数。

4.如权利要求1-3中任一项所述的固体支撑物，其中至少一个A亚基包含第一热化学反应基团。

5.如权利要求4所述的固体支撑物，其中所述第一热化学反应基团为活化的酯。

6.如权利要求5所述的固体支撑物，其中所述第一热化学反应基团每次出现时独立地具有下式：

其中R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e各自独立地为H、卤素、三卤代甲基、磺基、-CN、C₁-C₆烃氧羰基、C₁-C₆羟基烃氧羰基、硝基或聚乙二醇部分。

7.如权利要求6所述的固体支撑物，其中卤素为氟。

8.如权利要求6所述的固体支撑物，其中R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e中至少一个为氟。

9.如权利要求6所述的固体支撑物，其中R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e中每一个为氟。

10.如权利要求6所述的固体支撑物，其中R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e中的一个为硝基。

11.如权利要求1-10中任一项所述的固体支撑物，其中至少一个A亚基包含所述第二热化学反应基团。

12.如权利要求11所述的固体支撑物，其中所述第二热化学反应基团每次出现时独立地包含炔烃、烃硅基保护的炔烃、叠氮化物、腈、硫醇、烯烃、马来酰亚胺、丁二烯、氮杂环丙烷、硫杂丙环、二烯、亲二烯体或1,4-不饱和羰基官能团。

13.如权利要求11所述的固体支撑物，其中所述第二热化学反应基团包含环加成反应基团。

14.如权利要求13所述的固体支撑物，其中所述环加成反应基团每次出现时独立地包含炔烃或叠氮化物官能团。

15.如权利要求14所述的固体支撑物，其中所述环加成反应基团每次出现时独立地具有下式之一：

其中β和χ各自独立地为1至5的整数。

16.如权利要求15所述的固体支撑物，其中β为1或3。

17.如权利要求15所述的固体支撑物，其中χ为1。

18.如权利要求15所述的固体支撑物，其中所述环加成反应基团每次出现时独立地具有下式之一；

19.如权利要求13所述的固体支撑物，其中所述环加成反应基团每次出现时独立地包含二烯或亲二烯体官能团。

20.如权利要求13所述的固体支撑物，其中所述环加成反应基团每次出现时独立地包含α,β-不饱和羰基、马来酰亚胺基、乙炔二羧酸酯、环戊基二烯基、呋喃基或N-烃基吡咯基部分。

21.如权利要求20所述的固体支撑物，其中所述环加成反应基团具有以下结构之一；

其中R^a为C₁-C₆烃基且L¹为直接键或至多100个原子长度的连接物。

22.如权利要求1-21中任一项所述的固体支撑物，其中至少一个A亚基包含与所述捕获探针的共价键。

23.如权利要求22所述的固体支撑物，其中所述共价键为与所述捕获探针的酰氨基键或胺键。

24.如权利要求22所述的固体支撑物，其中所述共价键包含三唑部分。

25.如权利要求22所述的固体支撑物，其中所述至少一个A亚基具有以下结构之一：

其中：

R⁵为H或C₁-C₆烃基；

L⁴为任选的连接物；以及

Z为所述捕获探针或其片段。

26.如权利要求1-25中任一项所述的固体支撑物，其中所述捕获探针为肽、蛋白质、糖基化蛋白质、糖缀合物、核酸适体、糖类、多核苷酸、寡核苷酸或多肽。

27.如权利要求1-26中任一项所述的固体支撑物，其中所述捕获探针为多核苷酸。

28.如权利要求1-27中任一项所述的固体支撑物，其中所述捕获探针为DNA。

29.如权利要求1-28中任一项所述的固体支撑物，其中W每次出现时独立地具有以下结构之一：

其中Q为所述固体基底。

30.如权利要求1-29中任一项所述的固体支撑物，其中所述C亚基每次出现时独立地具有以下结构之一：

其中：

R⁵每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

Q为所述固体支撑物外表面；以及

n为2至10的整数。

31.如权利要求1-30中任一项所述的固体支撑物，其中所述亲水部分每次出现时独立地包含酰氨基、酯或羟基官能团或其组合。

32.如权利要求1-31中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物不包含B亚基。

33.如权利要求1-31中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含一个或多个B亚基。

34.如权利要求33所述的固体支撑物，其中所述B亚基每次出现时独立地具有下式之一：

其中：

R⁴每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

R^8a和R^8b各自独立地为H、C₁-C₆烃基或羟烃基；

R^9a和R^9b各自独立地为H、C₁-C₆烃基、或羟烃基，或R^9a和R^9b连同与其结合的氮原子一起连接形成杂环；以及

R¹⁰为羟烃基。

35.如权利要求34所述的固体支撑物，其中R^8a和R^8b各自为H。

36.如权利要求34所述的固体支撑物，其中R^8a或R^8b中一个为H，且R^8a或R^8b中另一个为C₁-C₆烃基。

37.如权利要求36所述的固体支撑物，其中R^8a为H，且R^8b为甲基。

38.如权利要求33-37中任一项所述的固体支撑物，其中每个亲水部分具有以下结构之一：

39.如权利要求38所述的固体支撑物，其中每个亲水部分具有以下结构：

40.如权利要求38所述的固体支撑物，其中每个亲水部分具有以下结构：

41.如权利要求34所述的固体支撑物，其中R^8a或R^8b中一个为H，且R^8a或R^8b中另一个为羟烃基。

42.如权利要求41所述的固体支撑物，其中R^8a为H，且R^8b为-CH₂OH。

43.如权利要求34所述的固体支撑物，其中至少一个亲水部分具有以下结构之一：

44.如权利要求34所述的固体支撑物，其中R¹⁰为-CH₂CH₂OH。

45.如权利要求3所述的固体支撑物，其中L¹、L²和L³各自独立地包含亚烃基、酯、烯化氧、酰胺、酰亚胺、醚或二硫部分或其组合。

46.如权利要求3所述的固体支撑物，其中L¹、L²或L³中至少一个为直接键。

47.如权利要求3所述的固体支撑物，其中L¹、L²和L³中每一个为直接键。

48.如权利要求3-47中任一项所述的固体支撑物，其中R³、R⁴或R⁵中至少一个为H。

49.如权利要求3-47中任一项所述的固体支撑物，其中R³、R⁴和R⁵中每一个为H。

50.如权利要求3-47中任一项所述的固体支撑物，其中R³、R⁴或R⁵中至少一个为甲基。

51.如权利要求3-47中任一项所述的固体支撑物，其中R³、R⁴和R⁵中每一个为甲基。

52.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含少于约40mol％的B亚基。

53.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含多于0mol％至约40mol％的B亚基。

54.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含约35mol％的B亚基。

55.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含至少约30mol％的B亚基。

56.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含多于0mol％至约15mol％的B亚基。

57.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含至少约75mol％的A亚基。

58.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含至少约90mol％的A亚基。

59.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含至少约95mol％的A亚基。

60.如权利要求33-51中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物包含至少约99.9mol％的A亚基。

61.如权利要求1所述的固体支撑物，其中每个A亚基包含所述第一热化学反应基团或与所述捕获探针的共价键。

62.如权利要求61所述的固体支撑物，其中所述聚合物不包含B亚基。

63.如权利要求61或62中任一项所述的固体支撑物，其中所述第一热化学反应基团为如权利要求5-10中任一项定义的。

64.如权利要求1-63中任一项所述的固体支撑物，其中所述聚合物为无规聚合物。

65.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有40°至90°的水接触角。

66.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有50°至85°的水接触角。

67.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有60°至80°的水接触角。

68.如权利要求1-67中任一项所述的固体支撑物，其中所述基底包含有机聚合物。

69.如权利要求68所述的固体支撑物，其中所述基底包含聚(苯乙烯)、聚(碳酸酯)、聚(醚砜)、聚(酮)、聚(脂肪醚)、聚(醚酮)、聚(醚醚酮)、聚(芳醚)、聚(酰胺)、聚(酰亚胺)、聚(酯)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(烯烃)、聚(环烯烃)、聚(乙烯醇)、共混聚合物、聚烃基聚合物、或它们的卤代衍生物、交联衍生物或组合。

70.如权利要求69所述的固体支撑物，其中所述卤代衍生物为卤代聚(芳醚)、卤代聚(烯烃)或卤代聚(环烯烃)。

71.如权利要求69所述的固体支撑物，其中所述基底包含环状聚(烯烃)。

72.如权利要求1-71中任一项所述的固体支撑物，其中所述基底是基本上光学透明的。

73.如权利要求1-71中任一项所述的固体支撑物，其中所述基底在约400nm至约800nm是基本上光学透明的。

74.如权利要求1-73中任一项所述的固体支撑物，其中所述基底为至少约90％光学透明的。

75.如权利要求1-74中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物包含不同位点的系统阵列，每个不同位点独立地包含至少一个与所述基底外表面共价结合的所述聚合物。

76.如权利要求75所述的固体支撑物，其中每个不同位点独立地包含多个与其共价结合的所述聚合物。

77.如权利要求75或76中任一项所述的固体支撑物，其中在每个不同位点上的至少一个聚合物独立地包含与其共价结合的捕获探针。

78.如权利要求77所述的固体支撑物，其中每个不同位点包含多个与其结合的结构上不同的捕获探针。

79.如权利要求1-78中任一项所述的固体支撑物，其中所述多个聚合物之间基本上无交联。

80.制备权利要求1-79中任一项所述的固体支撑物的方法，所述方法包含：

A)提供固体基底，其包含多个与其外表面共价结合的羟基、羰基、胺官能团或其组合，其中所述羟基和羰基官能团与所述固体基底直接结合而不需要中间连接物，且所述胺官能团通过含有亚胺键的连接物与所述固体支撑物结合，所述亚胺键与所述固体基底直接结合而不需要中间连接物；以及

B)在足以使所述羟基、羰基或胺官能团中的至少一个与所述D亚基之间形成共价键的条件下，使包含D亚基以及任选的E和F亚基的聚合物与所述固体基底接触，其中：

所述D亚基每次出现时独立地包含第一反应基团，其中所述第一反应基团为能够与固体基底或捕获探针上的醇、羰基或胺官能团形成共价键的热化学反应基团；

所述E亚基每次出现时独立地包含亲水部分；以及

所述F亚基每次出现时独立地包含第二反应基团，其中所述第二反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对于通过环加成或1,4-共轭加成反应与捕获探针上的目标官能团形成共价键特异的反应性，

其中所述第一反应基团与所述第二反应基团的反应性是相互正交的。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述第一反应基团为亲核基团，其能够与所述固体基底上的酮或醛基团形成共价键。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述第一反应基团为酰肼、胺或烃氧胺。

83.如权利要求80所述的方法，其中所述第一反应基团为亲电子基团，其能够与所述固体基底上的醇或胺基团形成共价键。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述第一反应基团为芳基酯或环氧化物。

85.如权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述聚合物具有以下结构(III)：

T³-(D)_a(E)_b(F)_c-T⁴

(III)

其中：

D、E和F分别代表所述D、E和F亚基；

T³和T⁴各自独立地不存在，或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物末端基团；

a为1至50,000的整数：以及

b和c独立地为0至50,000的整数。

86.如权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述聚合物具有下式(IV)：

其中：

R¹¹每次出现时独立地为包含所述第一反应基团的取代基；

R¹²每次出现时独立地为包含所述亲水部分的取代基；

R¹³每次出现时独立地为包含所述第二反应基团的取代基；

R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

L⁵、L⁶和L⁷每次出现时独立地为直接键或至多100个原子长度的连接物；

T³和T⁴各自独立地不存在，或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物末端基团；

q为1至50,000的整数；以及

r和s独立地为0至50,000的整数。

87.如权利要求86所述的方法，其中R¹¹每次出现时独立地具有下式之一：

其中R^7a、R^7b、R^7c、R^7d和R^7e各自独立地为H、卤素、三卤代甲基、或硝基。

88.如权利要求87所述的方法，其中所述热化学反应基团为如权利要求5-10中任一项定义的。

89.如权利要求80-88中任一项所述的方法，其中存在所述F亚基。

90.如权利要求89所述的方法，其中所述环加成反应基团或共轭加成反应基团为如权利要求12-21中任一项定义的。

91.如权利要求80-88中任一项所述的方法，其中存在所述E亚基。

92.如权利要求91所述的方法，其中所述亲水部分为如权利要求31或34-44中任一项定义的。

93.如权利要求80-92中任一项所述的方法，其中所述共价键为由所述羟基或羰基部分中的至少一种与所述第一反应基团反应形成的醚键、酯键、腙键、肟键或亚胺键。

94.如权利要求80-93中任一项所述的方法，其中所述固体基底通过电晕处理或者用环境空气等离子体或大气压氧气等离子体处理所述固体基底制备。

95.如权利要求94所述的方法，其中所述方法还包括在足以使所述固体基底上的羰基与二胺中的第一胺基团之间形成共价亚胺键的条件下，使所述固体基底接触二胺化合物。

96.如权利要求80所述的方法，其还包括在足以使捕获探针与所述聚合物之间形成共价键的条件下，使所述固体支撑物与所述捕获探针接触。

97.如权利要求96所述的方法，其中通过所述D亚基上的芳基酯或环氧化物部分与所述捕获探针上的胺部分的反应形成所述共价键。

98.如权利要求96所述的方法，其中通过所述F亚基上的炔烃部分与所述捕获探针上的叠氮化物部分的反应形成所述共价键。

99.如权利要求96所述的方法，其中通过所述F亚基上的叠氮化物部分与所述捕获探针上的炔烃部分的反应形成所述共价键。

100.如权利要求98或99中任一项所述的方法，其还包括在叠氮化物的存在下，使Cu(I)催化剂接触所述固体支撑物。

101.测定目标分析物分子存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)提供权利要求1-79中任一项所述的固体支撑物，其中所述A亚基包含与其共价结合的捕获探针；

b)使分析物探针与所述固体支撑物接触；以及

c)检测由所述捕获探针与所述分析物探针相互作用产生的信号的存在或不存在。

102.如权利要求101所述的方法，其中所述捕获探针为多核苷酸。

103.如权利要求101-102中任一项所述的方法，其中所述目标分析物分子为多核苷酸或蛋白质。

104.如权利要求101-103中任一项所述的方法，其中所述信号为荧光信号。

105.如权利要求104所述的方法，其中所述荧光信号是由所述分析物探针与捕获探针的特异性杂交而产生或减弱的。

106.如权利要求101-105中任一项所述的方法，其中所述分析物探针包含荧光团或荧光团淬灭剂。

107.包含多个与所述固体支撑物外表面共价结合的伯胺官能团的固体基底，其中所述胺官能团通过包含亚胺键的连接物与所述固体支撑物结合。

108.如权利要求107所述的固体基底，其中所述固体支撑物外表面具有以下结构：

或其盐、互变异构体或立体异构体，其中：

Q为所述固体支撑物外表面；以及

n为2至10的整数。

109.包含G、H和任选的I亚基的聚合物，其中：

所述G亚基每次出现时独立地包含：

a)第一热化学反应基团，其中所述第一热化学反应基团能够与醇、羰基或胺基团形成共价键；

b)第二热化学反应基团，其中所述第二热化学反应基团为环加成反应基团或共轭加成反应基团，其具有对于通过环加成或1,4-共轭加成反应与目标官能团形成共价键特异的反应性；

所述H亚基每次出现时具有以下结构：

以及

所述任选的I亚基每次出现时独立地包含亲水部分并具有以下结构之一：

其中：

R⁴每次出现时独立地为H或C₁-C₆烃基；

R^8a为H、C₁-C₆烃基或羟烃基；

R^8b为C₁-C₆烃基或羟烃基；

R^9a和R^9b各自独立地为H、C₁-C₆烃基或羟烃基，或者R^9a和R^9b连同与其结合的氮原子一起连接形成杂环；以及

R¹⁰为羟烃基，

其中所述第一热化学反应基团和第二热化学反应基团的反应性是相互正交的。

110.如权利要求109所述的聚合物，其中不存在所述任选的I亚基。

111.如权利要求109所述的聚合物，其中存在所述任选的I亚基。

112.如权利要求111所述的聚合物，其中所述亲水部分为如权利要求40-44中任一项定义的。

113.如权利要求109-112中任一项所述的聚合物，其中所述G亚基为如权利要求5-10或12-21中任一项定义的。

114.如权利要求109所述的聚合物，其中每个G亚基包含所述第一热化学反应基团。

115.如权利要求109-114中任一项所述的聚合物，其中所述聚合物包含多于0mol％至约15mol％的H亚基。

116.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有61°至95°的水接触角。

117.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有70°至90°的水接触角。

118.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有75°至85°的水接触角。

119.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有78°至83°的水接触角。

120.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有小于15°的水接触角。

121.如权利要求1-64中任一项所述的固体支撑物，其中所述固体支撑物具有小于10°的水接触角。