KR20150135353A - 생체 분자를 격리시키기 위한 표면 산화 및 관련 방법 - Google Patents

생체 분자를 격리시키기 위한 표면 산화 및 관련 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150135353A
KR20150135353A KR1020157028744A KR20157028744A KR20150135353A KR 20150135353 A KR20150135353 A KR 20150135353A KR 1020157028744 A KR1020157028744 A KR 1020157028744A KR 20157028744 A KR20157028744 A KR 20157028744A KR 20150135353 A KR20150135353 A KR 20150135353A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
solid support
independently
polymer
substrate
reactor
Prior art date
Application number
KR1020157028744A
Other languages
English (en)
Inventor
알드리치 엔. 케이. 라우
로버트 지. 이슨
크리스티안 스카부
Original Assignee
엔브이에스 테크놀로지스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엔브이에스 테크놀로지스 인코포레이티드 filed Critical 엔브이에스 테크놀로지스 인코포레이티드
Publication of KR20150135353A publication Critical patent/KR20150135353A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F212/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an aromatic carbocyclic ring
    • C08F212/02—Monomers containing only one unsaturated aliphatic radical
    • C08F212/04—Monomers containing only one unsaturated aliphatic radical containing one ring
    • C08F212/06—Hydrocarbons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/56—Acrylamide; Methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

고체 기판에 공유 결합된 중합체를 포함하는 고체 지지체가 제공된다. 상기 중합체는 고 트로우-풋 분석 (high through-put assay)을 위해, 고체 지지체에 분석물 분자를 고정시키는 단계를 포함하는 임의의 수의 적용에서 유용성이 발견된다.

Description

생체 분자를 격리시키기 위한 표면 산화 및 관련 방법 {SURFACE OXIDATION FOR SEQUESTERING BIOMOLECULES AND RELATED METHODS}
정부 이익에 대한 진술
미국 국토안전보장성에 의해, 본 명세서에 개시되는 연구 작업의 일부에 대한 자금 지원이 계약 번호: HSHQDC-lO-C-00053 하에, 제공되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 가진다.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 산화 표면에 결합된 중합체인 신규의 중합체 및 상기 중합체의 이용 방법에 관한 것이다.
생물 분석이 생물학적 샘플에서 분석 물질의 존재 및/또는 양에 대해 조사하는데 이용되고 있다. DNA 마이크로어레이와 같은 표면-기반 분석에서, 분석물 종류는 일반적으로 고체 지지체 또는 기판 상에 포획 및 검출된다. DNA 마이크로어레이의 사용은, 동시에 다수의 유전자를 모니터링 할 수 있는 능력에 의해, 유전자 발현 및 유전자형의 연구에서 광범위하게 채용되고 있다 (Schena et al, Science 270:467-470 (1995); Pollack et al., Nat. Genet. 23:41-46 (1999)). 표면 어레이는 또한, 어레이 포맷에서 다양한 생물 분석을 용이하게 하기 위해, 탄수화물, 항체, 단백질, 합텐 또는 앱타머와 같은 모이어티에 결합하는 것을 이용하여, 제작될 수 있다.
생물 분석 적용 위한 효과적인 작용화 물질은 검출 (예를 들어, 중합효소 연쇄 반응)시, 적절한 신호를 제공하기 위하여 관련 샘플로부터 충분한 양의 분석물을 고정하는 적절한 능력을 가져야한다. 적절한 작용화 물질은 또한 특히, 샘플 및 대조군이, 예를 들어 상이한 지지체 또는 동일한 지지체 상의 상이한 위치에 결부되는 이질적인 지지체 표면에서 분석되어야 하는 분석 포맷에서, 실험 특성화에 대한 유리한 적용을 위해, 재생성이 큰 표면을 제공하여야 한다. 예를 들어, 재생성이 큰 표면 화학을 기반으로 하지 않는 지지체는, 지지체 간의 변동 사항 또는 동일한 지지체 상의 상이한 위치로 인해, 분석 (예를 들어, 비교 특성화) 착수시, 상당한 오류를 초래할 수 있다.
표면 어레이 (예를 들어, "DNA 칩")는 분석물을 고체 지지체에 부착시키기 위해 중합체를 이용하여 제조되어 왔다. 일반적으로, 중합체를 포함하는 어레이는, 고체 기판 (예를 들어, 비드, 입자, 플레이트 등) 상의 전구 단량체 또는 프리폴리머의 현장 중합 반응에 의해 생성된다. 유기 중합체를 포함하는 어레이의 선택성 및 재생성은 많은 경우, 단량체의 농도, 단량체 비율, 개시제의 농도, 용매 증발 속도, 주위 습도 (용매가 물인 경우), 가교제의 농도, 단량체/가교제/용매의 순도, 실험실 온도, 피펫 시간, 살포 조건, 반응 온도 (열중합 반응의 경우), 반응 습도, 자외선 조사의 균일성 (UV 광중합 반응의 경우) 및 주위 산소 조건을 포함한 다양한 실험 변수에 매우 의존적이다. 이러한 파라미터 중 많은 것들이 제조 환경에서 제어 될 수 있지만, 이들 파라미터 전부에 대한 제어는 불가능하지는 않으나, 어려운 일이다. 그 결과, 현장 중합 반응은, 지점 대 지점, 칩 대 칩 및 위치 대 위치에서 상대적으로 불량한 재생성을 초래한다.
또한, 상당수의 연구가 실리카계 기판, 예를 들어, 유리, 석영, 융합 실리카, 규소를 이용한 어레이 표면의 개발에 집중되고 있지만 (예를 들어, 문헌 [D. Cuschin et al., Anal. Biochem. 1997, 250, 203-211; G.M. Harbers et al., Chem. Mater. 2007, 19, 4405-4414]; 및 미국 특허 제6,790,613호 (Shi 등), 제 5,932,711호 (Boles 등), 제6,994,972호 (Bardhan 등), 제7,781,203호 (Frutos 등), 및 제7,217,512호 및 제7,541,146호 (Lewis 등)를 참조한다), 중합체 기판과 같은 더욱 용이하게 제조되는 저가의 기판을 이용함으로써, 일정한 이점이 도출된다. 그러나, 생물 분석 목적의 경우, 추가적 문제점이 이러한 기판의 선별 및 제조 양자에서 발생된다.
예를 들어, 중합체 기판은 종종, 기본적인 중합체 기판에 현장 중합된 코팅을 부착 또는 결부시키는데 있어서의 문제점뿐만 아니라, 자가 형광의 증가, 소수성의 증가와 같은 표면 작용화의 결과로서, 심각한 문제들이 발생한다.
따라서, 이 분야에서 진전이 이루어져 왔으나, DNA 마이크로어레이와 같은 다양한 분석에서 이용하기 위한 이러한 중합체를 포함하는 이들 고체 기판 및 고체 지지체에 분석물을 부착시키기 위한 개선된 작용화 고체 기판, 중합체 및 방법에 대한 요구가 당업계에 남아 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키며, 추가의 관련 이점을 제공한다.
간략하면, 본 발명은 일반적으로 고체 기판에 공유 결합된 중합체를 포함하는 고체 지지체에 관한 것이다. 임의로, 상기 중합체는 이에 공유 결합된 포획 프로브 또는 포획 프로브와의 공유 결합 형성에 이용하기 위한 작용 기를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 고체 지지체는, 분석적 분석에 이용하기 위한 것으로서, 고체 기판 상의 포획 프로브의 고정화를 포함한 임의의 수의 분야에서 적용성이 발견된다. 중합체 및 임의의 포획 프로브를 포함하는 중합체 및 고체 지지체와의 반응 또는 상호작용에 적합한 반응 기를 포함하는 고체 기판이 또한 제공된다. 본 명세서에 개시되는 중합체, 고체 기판 및 고체 지지체는, 관리 상황 (의사의 사무실, 응급실, 가정, 당업계 등), 고처리량 테스트 및 기타 분야의 각 시점에 이용하기 위한 다양한 분석 적용, 예를 들어 DNA 및 단백질 마이크로어레이에 유용하다.
고체 기판은 일반적으로, 중합체가 결합되는 알코올, 카르보닐 및/또는 아민 모이어티를 포함한다. 따라서, 본 발명의 특정 실시형태는, 중합체가, "타이 층 (타이 층)"의 매개 없이, 알코올, 카르보닐 및/또는 아민 모이어티를 통해, 고체 기판 (예를 들어, 유기 중합체)에 직접 공유 결합될 수 있으므로, 종래에 개시된 고체 지지체에 대해 이점을 제공한다.
본 명세서에 개시되는 중합체, 고체 기판, 고체 지지체 및 관련 방법은 다양한 실시형태에서, 다양한 이점을 제공한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 포획 프로브와의 중합체의 컨쥬게이팅을 위해, 본 명세서에 개시되는 반응 기는 컨쥬게이션 반응 동안, 제공되는 특이적 조건의 경우 외에는 실질적으로 불활성이며, 이로 인해, 컨쥬게이션 과정 동안 예측가능한 최적의 반응성 수준이 보장된다. 일부 실시형태는 또한, 포획 프로브 (예를 들어, DNA 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 생체 분자)와의 중합체의 컨쥬게이팅을 위해, "클릭 (click)" 화학 (예를 들어, 트리아졸의 생성을 위한 아지드 및 알킨의 반응)을 이용하며, 이러한 화학은 실질적으로 pH-무반응성이고, 반응 부산물이 생성되지 않거나 또는 그 생성이 제한적이다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서는
외부 표면을 가지는 기판; 및
기판의 외부 표면에 공유 결합된 복수의 중합체를 포함하는 고체 지지체로서, 상기 중합체 각각은 적어도 하나의 A 및 C 하위단위를 포함하고, 임의로 하나 이상의 B 하위단위를 포함하고, 여기서
상기 A 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 a), b), c)를 포함하고:
a) 제1 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제1 열화학적 반응 기는 포획 프로브 상의 알코올, 카르보닐 또는 아민 기와 공유 결합을 형성할 수 있음;
b) 제2 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제2 열화학적 반응 기는 첨가 고리화 (cycloaddition) 또는 1,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 포획 프로브 상의 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기임; 또는
c) 포획 프로브와의 공유 결합,
상기 임의의 B 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하고;
상기 C 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 기판의 외부 표면과의 공유 부착체 W를 포함하며, 여기서 W는 하기 구조식 중 하나를 가지고, 제1 및 제2 열화학적 반응 기의 반응성이 서로에 대해 직교하는 것인 고체 지지체를 제공한다:
Figure pct00001
또는
Figure pct00002
상기 식에서,
Q는 기판의 외부표면이다.
본 출원은 또한 본 발명의 고체 기판의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 상기 방법은
A) 히드록실 및 카르보닐 작용 기가 매개 링커 없이, 고체 기판에 직접 결합하고, 아민 작용 기가, 매개 링커 없이 고체 기판에 직접 결합된 이민 결합을 포함하는 링커를 통해, 고체 기판에 결합된, 그 외부 표면에 공유 결합된 복수의 히드록실, 카르보닐 또는 아민 작용 기, 또는 이들의 조합을 포함하는 고체 기판을 제공하는 단계; 및
B) 히드록실, 카르보닐 또는 아민 작용 기 중의 적어도 하나와 D 하위단위 사이에 공유 결합을 형성하기에 충분한 조건 하에, D 및 임의의 E 및 F 하위단위를 포함하는 중합체를 고체 기판과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서
D 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 제1 반응 기를 포함하고, 여기서 제1 반응 기는 고체 기판 또는 포획 프로브 상에서 알코올, 카르보닐 또는 아민 작용 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 열화학적 반응 기이고;
E 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하고;
F 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 제2 반응 기를 포함하며, 여기서 제2 반응 기는 첨가 고리화 또는 1,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 포획 프로브 상의 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기이고,
제1 반응 기 및 제2 반응 기의 반응성은 서로에 대해 직교한다.
또 다른 실시형태는 표적 분석물 분자의 존재 또는 부재를 측정하기 위한 방법으로서,
a) A 하위단위가 이에 공유 결합된 포획 프로브를 포함하는 것으로서, 본 명세서에 개시되는 바와 같은 고체 지지체를 제공하는 단계;
b) 분석물 프로브를 고체 지지체와 접촉시키는 단계; 및
c) 분석물 프로브와 포획 프로브의 상호작용에 의해 생성되는 신호의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
고체 지지체의 제조를 위한 중합체 및 작용화 고체 기판이 또한 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 명세서는 고체 기판의 외부 표면에 공유 결합된 복수의 일차 아민 작용 기를 포함하는 고체 지지체로서, 아민 작용 기가 아민 결합을 포함하는 링커를 통해, 고체 기판에 결합되는 고체 지지체를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서는 G, H 및 임의의 I 하위단위를 포함하는 중합체로서,
G 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 a), b)를 포함하고:
a) 제1 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제2 열화학적 반응 기는 상기 제1 열화학적 반응 기는 알코올, 카르보닐 또는 아민 기와 공유 결합을 형성할 수 있음;
b) 제2 열화학적 반응 기, 여기서 첨가 고리화 또는 1 ,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기임;
상기 H 하위단위는, 각각의 발생시, 하기 구조를 가지며:
Figure pct00003
;
임의의 I 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하며, 하기 구조 중 하나를 가지고,
제1 및 제2 열화학적 반응 기의 반응성은 서로에 대해 직교하는 중합체를 제공한다:
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
상기 식에서,
R4는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R8a는 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이고;
R8b는 C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이고;
R9a 및 R9b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이거나 또는 R9a 및 R9b는, 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 연합하여, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R10은 히드록실알킬이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 상세한 설명을 참조로 하여 분명할 것이다. 이러한 목적을 위해, 더욱 상세한 특정 배경 기술에 대한 정보, 절차, 화합물 및/또는 조성물에서 개시되고, 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 다양한 참조가 본 명세서에 제시된다.
도면에서, 동일한 참조 번호는 유사한 구성 요소를 식별한다. 도면의 구성 요소의 크기 및 상대적인 위치들은 반드시 일정한 비율로 도시된 것은 아니며, 이들 구성 요소 중 일부는 도면의 가독성을 향상시키기 위해 확대 및 위치된다. 또한, 도시된 바와 같은 구성 요소의 특정 형상은 특정 구성 요소의 실제 형상에 관한 정보를 전달하도록 의도되지 않으며, 오로지 도면 인식의 용이성으로 선정되어있다.
도 lA, 1B, 1C, 1D, 1E 및 1F는 고체 지지체의 예시적 실시형태 및 그의 제조를 도시한다.
도 2A, 2B 및 2C는 예시적 분석 방법을 도시한다.
도 3A 및 3B는 예시적 중합체의 19F NMR 스펙트럼이다.
도 4 A, 4B 및 4C는 여러 열순환에 배치된 고체 지지체의 결과를 보여준다.
도 5는 예시적 고체 지지체의 다중 물 접촉각에 대한 데이터를 제시한다.
도 6은 다른 시약 및 온도로의 캐핑 (capping) 전 및 후의, 다양한 고체 지지체의 물 접촉각을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 다른 용매 시스템을 이용한 다양한 고체 지지체의 물 접촉각의 전환 가능성을 도시하는 그래프이다. 중합체 D = 35.6 mol%의 DMA를 포함하는 코폴리((DMA-co-PFPA)).
하기 설명에서, 본 발명의 다양한 실시형태들의 완전한 이해를 제공하기 위해, 구체적인 특정 세부 사항들이 설명된다. 그러나, 당업자는 본 발명이 이러한 세부 사항 없이도 실시 될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 청구 범위 전반에 걸쳐, 단어 "~를 포함하다" 및 그의 변형어, 예를 들어 "~를 포함한다" 및 "~를 포함하는"은 개방적 포괄적 의미, 즉, "~를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다"로 해석되어야한다.
본 명세서의 전반에 걸쳐, "일 실시형태"에 대한 참조는 상기 실시형태와 관련하여 개시되는 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐, 여러 부분의 구절 "일 실시형태에서"는 모두 반드시 동일한 실시형태를 의미하는 것은 아니다. 또한, 특정한 특징, 구조, 또는 특성은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적절한 방식으로 결합 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "고체 지지체"는 그에 고정된 중합체 및/또는 포획 프로브를 포함하는 기판을 의미한다. 일부 실시형태에서, 중합체는 기판에 고정된 매개 링커 모이어티의 존재 또는 부재 하에, 공유 결합을 통해 기판에 고정된다. 링커는 하나 이상의 공유 결합을 통해 또는 이온 상호작용과 같은 기타 상호작용에 의해 기판에 고정될 수 있다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 특정 실시형태는 장치로서 고체 지지체를 의미한다.
"기판" 또는 "고체 기판"은 개시되는 중합체의 고정화를 위한 지지체 또는 베이스로서 사용되는 객체 또는 물질을 의미한다. 일반적으로, 기판은 고체 객체이며, 자성이 없다. 기판은 원하는 적용 분야에 따라 임의의 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 기판은 임의의 유용한 형태 또는 구조를 가질 수 있다 하더라도, 평면 기판으로서 제공될 수 있다. 예시적 기판 재료가 본 명세서의 하기에서 제공된다.
"열화학적 반응 기"는, 반응성이 반응성을 위해, UV 또는 기타 방사선 공급원을 필요로 하지 않는 반응 기를 의미한다. 예시적 열화학적 반응 기는, 이로 제한되는 것은 아니나, 첨가 고리화 및 컨쥬게이트 첨가 반응 기뿐만아니라, 활성화 에스테르 (예를 들어, 펜타플루오로페닐 에스테르, "PFP"), 에폭사이드, 아즈락톤 (azlactone), 활성화 히드록실, 말레이미드 등을 포함한다.
"첨가 고리화 반응 기"는 상보적인 작용 기와의 반응시, 시클릭 모이어티의 형성에 특이적인 열화학적 반응 기를 의미한다. 예시적 첨가 고리화 반응 기는, 이로 제한되는 것은 아니나, 첨가 고리화 반응을 통해, 트리아졸 모이어티를 형성하는 알킨 및 아지드를 포함한다. 기타 예로는, 디엘-엘더 (Diels-Alder) 유형의 첨가 고리화를 통해, 적절한 상보적 작용 기와 반응하는 디엔 및 친디엔체가 포함된다.
"컨쥬게이트 첨가 반응 기"는 컨쥬게이트 첨가 반응에서 반응에 특이적인 열화학적 반응 기를 의미한다. 예를 들어, 1,4-컨쥬게이트 첨가 반응에서, 동일한 것과 반응할 수 있는 친핵체 및 α,β 불포화 카르보닐 기를 포함하는 화합물이 컨쥬게이트 첨가 반응 기의 예이다.
기판의 "외부 표면" 또는 "표면"은 최외각 부분의 기판을 의미한다. 일부 예에서, 외부 표면은 기본 기판의 외부 표면일 것이다. 다른 예에서, 기판은 기본 기판의 외부 표면이고, 제2 표면으로서 언급되는 링커 또는 "타이 층"이 그에 고정되는 제1 표면을 포함할 것이다. 기판의 "외부 표면" 또는 "표면"에 (공유적으로 또는 다른 수단을 통해) 고정되는 중합체는 기본 기판 표면 또는 제2 표면 (링커 또는 타이 층, 등) 또는 이들의 조합으로의 중합체의 고정화를 포함한다. 외부 표면은 (1) 기판의 기본 표면, (2) 플라즈마 처리로부터 도출되는 제1 표면, 또는 (3) 링커 또는 '타이-층'을 가지는 제2 표면일 수 있다.
기판에 있어서, "고정하는" 또는 "고정되는"은 공유 컨쥬게이션, 비특이적 결착 (non-specific association), 이온 상호작용 및, 기판에 기판 (예를 들어, 중합체)를 부착시키는 기타 수단을 포함한다.
"중합체"는 하나 이상의 반복 하위 단위를 가지는 분자를 의미한다. 하위 단위 ("단량체")는 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 중합체 내의 임의의 위치 또는 순서로 발생할 수 있다. 중합체는 천연 또는 합성 기원의 것일 수 있다. 본 발명은 임의의 순서의 반복 하위 단위, 무작위 공중합체 및 블록 공중합체를 가지는 중합체를 포함한 다양한 유형의 중합체를 포함한다. 2 가지의 상이한 유형의 단량체를 가지는 중합체는 공중합체로서 언급되며, 3 가지의 상이한 유형의 단량체를 가지는 중합체는 삼중합체 등으로 언급된다.
"무작위 중합체"는 하위 단위가 중합체 사슬을 따라 무작위 순서로 연결된 중합체를 의미한다. 무작위 중합체는 임의의 수의 상이한 하위 단위를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시되는 중합체는 "무작위 공중합체" 또는 "무작위 공-삼중합체"이며, 이는 상기 중합체가 각각 무작위 순서로 연결된 2 또는 3 개의 상이한 하위 단위를 포함한다는 것을 의미한다. 각 하위 단위는 무작위 중합체 내에 임의의 몰 비율로 존재할 수 있다. 예를 들어, 각각의 하위단위는 중합체 내의 다른 하위 단위의 몰 대비, 약 0.1 mol% 내지 약 99.8 mol%로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 램덤 공중합체의 하위 단위는 하기 일반 구조식으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00006
상기 식에서, X 및 Y는 독립적으로 고유의 단량체 하위단위이고, a 및 b는 중합체 내의 각각의 하위 단위의 수를 나타내는 정수이다. 용이한 설명을 위해, 상기 구조는 X 및 Y의 선형 연결이다; 그러나, 본 발명의 랜덤 공중합체 (예를 들어, 랜덤 공중합체, 랜덤 공-삼중합체 등)는 도시된 하위단위의 연결을 가지는 중합체로 제한되는 것은 아니며, 랜덤 중합체의 하위 단위는 임의의 랜덤 서열로 연결될 수 있으며, 중합체는 분지형일 수 있다는 것을 강조한다. 따라서, 본 명세서에 도시된 중합체의 구조, 예를 들어 구조 (I)는 임의의 순서로 연결된 하위 단위를 가지는 중합체를 포함하는 것을 의미한다.
"블럭 공중합체"는 다른 하위 단위의 블럭 또는 중합 단량체의 다른 블럭을 포함하는 중합체를 의미한다.
"작용 기"는 특이적 유형의 반응성 (예를 들어, 산성, 염기성, 친핵성, 친전자성 등)을 가지는 분자의 일부이다. "반응 기"는 일 유형의 작용 기이다. 작용 기의 비제한 예에는 아지드, 알킨, 아민, 알코올이 포함된다. "표적 작용 기"는, 또 다른 작용 기가 반응할 것인 임의의 작용 기이다. "친수성 작용 기"는 친수성 특성을 가지는 작용 기이다. 친수성 작용 기는 일반적으로, 물과 같은 극성 용매에서 전체적인 분자 용해도를 증가시키는 경향이 있다.
"공유 컨쥬게이션"은 2개 이상의 작용 기의 반응에 의한 공유 결합의 형성을 의미한다.
"직교" 또는 "직교 반응성"은 작용 기 및/또는 반응 기의 반응성 특성을 의미한다. 2 개의 반응 기가 직교 반응성을 가지는 경우, 반응 기 중 하나는, 제2 반응 기가 표적 작용 기와 상당한 정도로 반응하지 않고, 그 반대의 경우도 마찬가지인 조건 하에, 표적 작용 기와 반응하는 것을 의미한다.
"개시제"는 중합 반응을 개시하는데 이용되는 분자이다. 개시되는 중합체의 제조에 사용하기 위한 개시제는 당업계에 잘 공지되어 있다. 대표적 개시제에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 현재 이용되는 중합 반응, 원자 전달 라디칼 중합 반응에 유용한 개시제, AIBN 부류의 개시제 및 벤조페논 개시제가 포함된다. "개시제 잔기"는 라디칼 또는 다른 메커니즘을 통해 중합체에 부착되는 개시제의 일부이다. 일부 실시형태에서, 개시제 잔기는 개시되는 중합체의 말단 단부에 부착된다.
"클릭 화학 (Click chemistry)"은 적어도 하기 특성을 가지는 반응을 의미한다: (1) 작용 기 직교성을 나타냄 (즉, 작용 부분이, 다른 반응성 위치와 반응하지 않고, 상기 작용 부분에 상보적인 반응성 위치에서만 반응함); 및 (2) 생성된 결합이 비가역적임 (즉, 반응물이 반응하여 생성물이 생성된 경우, 생성물의 반응물로의 분해가 어려움). 임의로, "클릭"은 하나 이상의 하기 특성을 추가로 가질 수 있다: (1) 입체 특이성; (2) 엄격한 정제, 대기 제어 등을 포함하지 않는 반응 조건; (3) 입수가 용이한 출발 물질 및 시약; (4) 양성 용매 (benign 용매)를 사용하거나 또는 용매를 사용하지 않는 능력; (5) 결정화 또는 증류에 의한 생성물 분리; (6) 생리적 안정성; (7) 큰 열역학적 구동력 (예를 들어, 10-20 kcal/mol); (8) 단일 반응 생성물; (9) 높은 (예를 들어, 50% 초과) 화학적 수율; 및 (10) 환경적으로 양성 부산물인 부산물의 부재 또는 실질적 부재.
"클릭" 작용성을 이용한 반응의 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 첨가 반응, 첨가 고리화 반응, 친핵성 치환 등이 포함된다. 첨가 고리화 반응의 예에는 Huisgen 1,3-이극성 첨가 고리화, Cu(I) 촉매 아지드-알킨 첨가 고리화, 및 디엘-엘더 반응이 포함될 수 있다. 첨가 반응의 예에는 에폭시화 및 디히드록실화와 같은 탄소 대 탄소 이중 결합으로의 첨가 반응이 포함된다. 친핵성 치환의 예에는 에폭시 및 아지리딘 화합물과 같은 소원환 (strained ring)으로의 친핵성 치환이 포함될 수 있다. 기타 예에는 요소 및 아미드의 생성이 포함될 수 있다. 클릭 화학에 대한 일부 추가적 설명은, 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 문헌 [Huisgen, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 2, No. 11, 1963, pp. 633-696; Lewis et al, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 41, No. 6, 2002, pp. 1053-1057; Rodionov et al, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 44, 2005, pp. 2210-2215; Punna et al, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 44, 2005, pp. 2215-2220; Li et al, J. Am. Chem. Soc, Vol. 127, 2005, pp. 14518-14524; Himo et al, J. Am. Chem. Soc, Vol. 127, 2005, pp. 210-216; Noodleman et al, Chem. Rev., Vol. 104, 2004, pp. 459-508; Sun et al, Bioconjugate Chem., Vol. 17, 2006, pp. 52-57; and Fleming et al, Chem. Mater., Vol. 18, 2006, pp. 2327-2334]에서 찾아볼 수 있다.
"클릭 화학"은 클릭 화학 조건 하에서 반응할 수 있는 작용 기를 의미한다.
"클릭 작용 기"는, 예를 들어 트리아졸 모이어티 등과 같은 클릭 반응성을 가지는 2 개의 작용 기의 반응으로부터 초래되는 작용 기이다.
표적 작용 기에 대해 "특이적인 반응성"을 가지는 반응 기는, 상기 반응 기가 상기 반응 조건 하에서 표적 작용 기와 우선적으로 반응하며, 다른 작용기와의 부반응이 최소화되거나 또는 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 유사하게, 프획 프로브와의 컨쥬게이션에 특이적인 반응성을 가지는 반응 기는, 상기 반응 기가 상기 반응 조건 하에서 포획 프로브와 우선적으로 컨쥬게이션하고, 다른 작용 기와의 부반응이 최소화되거나 또는 존재하지 않는 다는 것을 의미한다.
"분석물" 또는 "분석물 분자"는 분석 대상인 화합물 또는 분자를 의미하고, 예를 들어 분석물 분자는 미지의 구조일 수 있고, 분석에는 상기 구조의 확인이 포함된다. 분석물 분자에는 DNA, 단백질, 펩티드 및 탄수화물, 유기 및 무기 분자, 금속 (방사성 동위 원소 포함)을 비롯한 임의의 수의 통상의 분자가 포함된다. 분석물에는 바이러스, 세균, 변형체, 균류뿐 아니라 금속 및 바이오 전쟁, 바이오 해저드 및 화학전 물질이 포함된다. 분석물에는 또한 본 명세서에서 정의되는 바와 같은 분석물 프로브가 포함된다.
"포획 프로브"는, 예를 들어 수소 결합 (예를 들어, DNA 혼성화), 격리, 공유 결합, 이온성 상호작용에 의해, 분석물 분자와 상호작용할 수 있는 분자이다. 예시적 포획 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 플랩, 올리고당 (예를 들어 렉틴) 및 단백질과 서열 특이적 결합 (혼성화)할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 프로브는 형광단 표지를 포함한다. 예를 들어 상기 포획 프로브는 형광단 표지를 포함할 수 있고, 분석물 분자 (예를 들어, 분석물 프로브)는 소광제를 포함할 수 있으며, 분석물 분자의 존재는 포획 프로브로부터의 형광 신호의 부재에 의해 검출된다 (소광제와의 상호작용시, 형광이 퀀칭되기 때문). 관련 실시형태에서, 포획 프로브는 소광제를 포함한다. 이들 실시형태에서, 형광 표지 분석물 분자의 형광은 포획 프로브에 의해 포획시, 퀀칭된다.
"프로브" 또는 "분석물 프로브"는 분석물 분자의 간접적 확인을 위해 사용되는 분자를 의미한다. 예를 들어, 프로브는 분석물 분자를 고유하게 확인하는 서열 정보를 보유할 수 있다. 예시적 프로브는 올리고뉴클레오티드 등을 포함한다.
"플랩"은 프로브의 임의의 부분을 의미한다. 특정 실시형태에서, 플랩은 프로브 (및 따라서 분석물 분자)의 고유 확인 서열 정보를 포함한다. 플랩은 나머지 프로브 (예를 들어, PCR 조건 하에)로부터 분리될 수 있고, 고체 지지체의 포획 프로브와 혼성화될 수 있다. 고체 지지체 상의 결합 플랩의 존재는 특정 분석물의 존재를 시사한다.
"아미노"는 -NH2 라디칼을 의미한다.
"아지드"는 -N3 라디칼을 의미한다.
"아지리딘"은 3-원, 질소 포함 고리를 의미한다.
"시아노" 또는 "니트릴"은 -CN 라디칼을 의미한다.
"히드록시" 또는 "히드록실"은 -OH 라디칼을 의미한다.
"이미노"는 =NH 치환기를 의미한다.
"니트로"는 -NO2 라디칼을 의미한다.
"옥소"는 =O 치환기를 의미한다.
"티이란"은 3-원, 황 포함 고리를 의미한다.
"티올"은 -SH 치환기를 의미한다.
"티옥소"는 =S 치환기를 의미한다.
"설포"는 -SO3M 치환기를 의미하고, 여기서 M은 H이거나 또는 양이온, 예를 들어 K, Na, 또는 암모늄 (즉, N+(RaRbRcRd), 여기서 Ra, Rb, Rc 및 Rd는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬임)이다.
"알킬"은, 1 내지 12 개의 탄소 원자 (C1-C12 알킬), 바람직하게는 1 내지 8 개의 탄소 원자 (C1-C8 알킬) 또는 1 내지 6 개의 탄소 원자 (C1-C6 알킬)를 가지고, 포화 또는 불포화 (즉, 하나 이상의 이중 (즉, 알켄) 및/또는 삼중 결합 (즉, 알킨) 포함)되고, 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착된, 탄소 및 수소 원자만으로 이루어진 탄화수소 직쇄 또는 분지쇄 라디칼, 예를 들어 , 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸 (이소-프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸 (t-부틸), 3-메틸헥실, 2-메틸헥실, 에테닐, 프로프-l-에닐, 부트-l-에닐, 펜트-l-에닐, 펜타-l ,4-디에닐, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 등을 의미한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"알킬렌" 또는 "알킬렌 사슬"은, 1 내지 12 개의 탄소원자를 가지고, 포화 또는 불포화 (즉, 하나 이상의 이중 및/또는 삼중 결합 포함)인, 탄소 및 수소만으로 이루어진 것으로서, 분자의 나머지가 라디칼 기에 연결된 이가 탄화수소 직쇄 또는 분지쇄, 예를 들어, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, n-부틸렌, 에테닐렌, 프로프에닐렌, n-부트에닐렌, 프로피닐렌, n-부티닐렌, 등을 의미한다. 알킬렌 사슬은 단일 또는 이중 결합을 통해, 분자의 나머지에 부착되고, 알킬렌 사슬은 단일 또는 이중 결합을 통해, 라디칼 기에 부착된다. 분자의 나머지 및 라디칼 기로의 알킬렌 사슬의 부착점은 사슬 내의 하나의 탄소 또는 임의의 2 개의 탄소를 통해 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 알킬렌 사슬은 임의로 치환된다. "알콕시"는, Ra가 1 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는, 상기에서 정의된 바와 같은 알킬 라디칼인 화학식 -ORa의 라디칼을 의미한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 알콕시 기는 임의로 치환될 수 있다.
"알킬아미노"는, Ra가 1 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는, 상기에서 정의된 바와 같은 알킬 라디칼인 화학식 -NHRa 또는 -NRaRa의 라디칼을 의미한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 알킬아미노 기는 임의로 치환될 수 있다.
"알킬옥시카르보닐"는, Ra가 정의된 바와 같은 알킬 라디칼인 화학식 -C(=0)ORa의 라디칼을 의미한다. "히드록실알킬옥시카르보닐"은 적어도 하나의 히드록실 치환기를 포함하는 알킬옥시카르보닐이다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 알킬옥시카르보닐 및 히드록실알킬옥시카르보닐 기는 하기에서 개시되는 바와 같이, 임의로 치환될 수 있다.
"티오알킬"은, Ra가 1 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는, 상기에서 정의된 바와 같은 알킬 라디칼인 화학식 화학식 -SRa의 라디칼을 의미한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 티오알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"아릴"은 수소, 6 내지 18 개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 탄화수소 고리계 라디칼을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 아릴 라디칼은, 융합 또는 브리지된 고리계를 포함하는 모노시클릭, 비시클릭, 트리시클릭 또는 테트라시클릭 고리계일 수 있다. 아릴 라디칼은, 이로 제한되는 것은 아니나, 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페난트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 플루오란텐, 플루오렌, as-인다센, s-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 페날린, 페난트렌, 플레이아덴, 피렌, 및 트리페닐렌으로부터 유도되는 아릴 라디칼을 포함한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 용어 "아릴" 또는 접두어 "아르-" (예를 들어, "아르알킬")는 임의로 치환된 아릴 라디칼을 포함하는 것을 의미한다.
"아르알킬"은, Rb가 상기에서 정의된 바와 같은 알킬렌 사슬이고, Rc가 상기에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 아릴 라디칼인 화학식 -Rb-Rc의 라디칼, 예를 들어, 벤질, 디페닐메틸 등을 의미한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 아르알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"시클로알킬" 또는 "카르보시클릭 고리"는, 융합 또는 브리지된 고리계를 포함할 수 있고, 3 내지 15 개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 10 개의 탄소 원자를 가지며, 단일 결합에 의해, 분자의 나머지에 부착된, 탄소 및 수소 원자만으로 이루어진 안정한 비방향족 모노시클릭 또는 폴리시클릭 탄화수소 라디칼을 의미한다. 모노시클릭 라디칼은, 예를 들어, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 및 시클로옥틸을 포함한다. 폴리시클릭 라디칼은, 예를 들어, 아다만틸, 노르보르닐, 데칼리닐, 7,7-디메틸-바이시클로[2.2.1]헵타닐, 등을 포함한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 시클로알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"시클로알킬알킬"은, Rb가 상기에서 정의된 바와 같은 알킬렌 사슬이고, Rd가 상기에서 정의된 바와 같은 시클로알킬 라디칼인 화학식 -RbRd를 의미한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 시클로알킬알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"융합"은, 본 발명의 화합물에 존재하는 고리 구조에 융합된, 본 명세서에 개시되는 임의의 고리 구조를 의미한다. 융합 고리가 헤테로시클릴 고리 또는 헤테로아릴 고리인 경우, 융합 헤테로시클릴 고리 또는 융합 헤테로아릴 고리의 일부가 되는 존재하는 고리 구조의 임의의 탄소 원자가 질소 원자에 의해 대체될 수 있다.
"할로" 또는 "할로겐"은 브로모, 클로로, 플루오로 또는 요오도를 말한다.
"할로알킬"은 상기에서 정의된 바와 같이, 하나 이상의 할로 라디칼에 의해 치환된, 상기에서 정의된 바와 같은 알킬 라디칼, 예를 들어, 트리할로메틸, 예를 들어 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리클로로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 1,2-디플루오로에틸, 3-브로모-2-플루오로프로필, 1,2-디브로모에틸, 등을 말한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 할로알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭 고리"는, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 내지 6 개의 헤테로 원자 및 2 내지 12 개의 탄소 원자로 이루어진 안정한 3- 내지 18-원 비-방향족 고리 라디칼을 말한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 헤테로시클릴 라디칼은, 융합 또는 브리지된 고리계를 포함할 수 있는 모노시클릭, 비시클릭, 트리시클릭 또는 테트라시클릭 고리계일 수 있고; 헤테로시클릴 라디칼의 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며, 질소 원자는 임의로 4차화될 수 있고, 헤테로시클릴 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다. 이러한 헤테로시클릴 라디칼의 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 디옥솔라닐, 티에닐[1,3]디티아닐, 데카히드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리 디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타히드로인돌릴, 옥타히드로이소인돌릴, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐 , 피라졸리디닐, 퀴누 클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라히드로푸릴, 트리티아닐, 테트라히드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모프롤리닐, 1-옥소-티오모르폴리닐, 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐이 포함된다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 헤테로시클릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"N-헤테로시클릴"은, 적어도 하나의 질소를 포함하고, 헤테로시클릴 라디칼의 분자의 나머지와의 부착점이 헤테로시클릴 라디칼 내의 질소 원자를 통해 이루어지는, 상기에서 정의된 바와 같은 헤테로시클릴 라디칼을 말한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, N-헤테로시클릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로시클릴알킬"은, Rb가 상기에서 정의된 바와 같은 알킬렌 사슬이고, Re가 상기에서 정의된 바와 같은 헤테로시클릴 라디칼인 화학식 -RbRe의 라디칼을 의미하고, 헤테로시클릴이 질소-포함 헤테로시클릴인 경우, 헤테로시클릴은 질소 원자에서 알킬 라디칼에 부착될 수 있다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 헤테로시클릴알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로아릴"은 수소 원자, 1 내지 13 개의 탄소 원자, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 내지 6 개의 헤테로원자 및 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 5- 내지 14-원의 고리계 라디칼을 말한다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로아릴 라디칼은, 융합 또는 브리지된 고리계를 포함할 수 있는 모노시클릭, 비시클릭, 트리시클릭 또는 테트라시클릭 고리계일 수 있으며; 헤테로아릴 라디칼 내의 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있고; 질소 원자는 임의로 4차화될 수 있다. 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 아제피닐, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤진돌릴, 벤조디옥솔릴, 벤조푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조[¾][l,4]디옥세피닐, 1,4-벤조디옥사닐, 벤조나프토푸라닐, 벤즈옥사 졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥시닐, 벤조릴피라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐 (벤조티오페닐) 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[l,2-a]피리디닐, 카바졸릴, 신놀리닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티오페닐, 푸라닐, 푸라노닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 이소퀴놀릴, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 나프틸리디닐, 옥사디아 졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥시라닐, 1-옥시도피리디닐, 1-옥시도피리미디닐, 1-옥시도피라지닐, 1-옥시도피리다지닐, 1-페닐-lH-피롤릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 닐페녹사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피리 디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 퀴누클리디닐, 이소퀴놀리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐 및 티오페닐 (즉, 티에닐)이 포함될 수 있다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 헤테로아릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"N-헤테로아릴"은, 적어도 하나의 질소를 포함하고, 헤테로아릴 라디칼의 분자의 나머지와의 부착점이 헤테로아릴 라디칼 내의 질소 원자를 통해 이루어지는, 상기에서 정의된 바와 같은 헤테로아릴 라디칼을 말한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, N-헤테로아릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로아릴알킬"은, Rb가 상기에서 정의된 바와 같은 알킬렌 사슬이고, Rf가 상기에서 정의된 바와 같은 헤테로아릴 라디칼인 화학식 -RbRf의 라디칼을 의미한다. 본 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 헤테로아릴알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"히드록실알킬"은 하나 이상의 히드록실 치환기를 포함하는, 상기에서 정의된 바와 같은 알킬이다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 히드록실알킬는 임의로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치환된"은, 적어도 하나의 수소 원자가, 이로 제한되는 것은 아니나, 할로겐 원자 예를 들어 F, Cl, Br, 및 I; 히드록실 기, 알콕시 기, 및 에스테르 기와 같은 기의 산소 원자; 티올 기, 티오알킬 기, 설폰 기, 설포닐 기, 및 설폭사이드 기와 같은 기의 황 원자; 아민, 아미드, 알킬아민, 디알킬아민, 아릴아민, 알킬아릴아민, 디아릴아민, N-옥사이드, 이미드, 및 엔아민과 같은 기의 질소 원자; 트리알킬실릴 기, 디알킬아릴실릴 기, 알킬디아릴실릴 기, 및 트리아릴실릴 기와 같은 기의 규소 원자; 및 다양한 다른 기의 다른 헤테로 원자와 같은 비수소 원자로 결합에 의해 대체되는, 상기 기 (즉, 알킬, 알킬렌, 알콕시, 알킬옥시카르보닐 알킬아미노, 티오알킬, 아릴, 아르알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로시클릴, N-헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴, 히드록실알킬, 히드록실알킬옥시카르보닐, N-헤테로아릴 및/또는 헤테로아릴알킬) 중 임의의 것을 의미한다. "치환된"은 또한, 하나 이상의 수소 원자가 옥소, 카르보닐, 카르복실, 및 에스테르 기와 같은 기의 헤테로원자; 및 이민, 옥심, 히드라존, 및 니트릴과 같은 기의 질소로 고차 결합 (예를 들어, 이중- 또는 삼중-결합)에 의해 대체된, 상기 기 중 임의의 것을 의미한다. 예를 들어, "치환된"은, 하나 이상의 수소 원자가 -NRgRh, -NRgC(=0)Rh, -NRgC(=0)NRgRh, -NRgC(=0)ORh, -NRgSO2Rh, -OC(=O)NRgRh, -ORg, -SRg, -SORg, -SO2Rg, -OSO2Rg, -SO2ORg, =NSO2Rg, 및 -SO2NRgRh에 의해 대체된 상기 기 중 임의의 것을 포함한다. "치환된"은, 하나 이상의 수소 원자가 -C(=O)Rg, -C(=O)ORg, -C(=O)NRgRh, -CH2SO2Rg, -CH2SO2NRgRh에 의해 대체된 상기 기 중 임의의 것을 의미한다. 전술된 것에서, Rg 및 Rh는 동일하거나 또는 상이하고, 독립적으로 수소, 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 티오알킬, 아릴, 아르알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로시클릴, N-헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴, N-헤테로아릴 및/또는 헤테로아릴알킬이다. "치환된"은 또한, 하나 이상의 수소 원자가 아미노, 시아노, 히드록실, 이미노, 니트로, 옥소, 티옥소, 할로, 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 티오알킬, 아릴, 아르알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로시클릴, N-헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴, N-헤테로아릴 및/또는 헤테로아릴알킬 기와의 결합에 의해 대체된 상기 기 중 임의의 것을 의미한다. 또한, 전술된 각각의 치환기는 또한 하나 이상의 상기 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.
"안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는, 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로의 분리 후에도 남아 있을 만큼 충분히 강한 화합물을 나타내는 의미이다.
"임의의" 또는 "임의로"는, 추후 개시되는 상황의 사례가 발생하거나 또는 발생하지 않을 수 있고, 상기 설명이, 상기 사례 또는 상황이 발생한 예 및 발생하지 않은 예를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "임의로 치환된 아릴"은, 아릴 라디칼이 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있고, 상기 설명이, 치환된 아릴 라디칼 및 치환되지 않은 아릴 라디칼 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다.
종종, 결정화 또는 침전은 본 발명의 화합물의 용매화물을 생성한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "용매화물"은 용매의 하나 이상의 분자를 가지는 본 발명의 화합물의 하나 이상의 분자를 포함하는 응집물을 말한다. 용매는, 용매화물이 수화물일 수 있는 경우, 물일 수 있다. 대안적으로, 용매는 유기 용매일 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 일수화물, 이수화물, 반수화물, 세스퀴수화물 (sesquihydrate), 삼수화물, 사수화물 등뿐만 아니라 상응하는 용매화 형태를 포함한 수화물로서 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물은, 본 발명의 화합물이 단지 부정성 물 (adventitious water)을 보유하거나 또는 일부 부정성 용매 + 물의 혼합물일 수 있는 다른 경우, 참 용매화물 (true solvate)일 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 염 또는 호변이성질체는 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있고, 따라서, 아미노산의 (R)- 또는 (S)-로서, 또는 (D)- 또는 (L)-로서, 절대 입체화학 관점에서, 정의될 수 있는 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 기타 입체이성질체 형태로 생성될 수 있다. 본 발명은 그의 라세미 형태 및 광학적으로 순수한 형태뿐만 아니라 모든 이러한 가능한 이성질체를 포함하는 의미이다. 광학적으로 활성인 (+) 및 (-), (R)- 및 (S)-, 또는 (D)- 및 (L)-이성질체는 키랄 중간체 (chiral synthon) 또는 키랄 시약을 이용하여 제조될 수 있거나 또는 통상의 기술, 크로마토그래피 및 분별 결정을 이용하여, 분해될 수 있다. 각각의 거울상 이성질체의 제조/분리를 위한 통상의 기술은 적절한 광학적으로 순수한 전구체로부터의 키랄 합성 또는, 예를 들어, 키랄 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용한 라세미체 (또는 염 또는 유도체의 라세미체)의 분해를 포함한다. 본 명세서에 개시되는 화합물이 올레핀 이중 결합 또는 기하학적 비대칭의 다른 중심을 포함하고, 달리 언급되지 않는 한, 상기 화합물이 E 및 Z 기하 이성질체 둘 모두를 포함하는 의미이다. 달리는, 모든 호변이성질체 형태가 또한 포함되는 것이다.
"입체이성질체"는, 동일한 결합에 의해 결합된 동일한 원자에 의해 이루어지나, 호환될 수 없는 다른 3차 구조를 가지는 화합물을 의미한다. 본 발명에서는 다양한 입체이성질체 및 그의 혼합물이 고려되고, 분자가 서로 겹쳐지지 않는 거울상 (nonsuperimposeable mirror image)인 2 가지의 입체이성질체를 의미하는 "거울성이성질체"가 포함된다.
"호변이성질체"는 분자의 하나의 원자로부터 동일한 분자의 다른 원자로의 양성자 이동을 말한다. 본 발명은 임의의 상기 화합물의 호변이성질체를 포함한다.
A. 고체 지지체
상기에서 지적된 바와 같이, 본 발명의 일 측면은 고체 기판에 공유 결합된 복수의 중합체를 포함하는 고체 지지체에 관한 것이다. 상기 중합체는 일반적으로 생체 분자, 예를 들어 DNA, 또는 기타 분석물의 고정화 (예를 들어, 공유 컨쥬게이션)를 위한 반응성 작용 기를 포함한다. 상기 고체 지지체는, 고체 기판로의 중합체의 고정화를 위해, 타이 층을 필요로 하지 않는 용이한 조립과 같은, 종래 기재된 고체 지지체에 대한 다양한 이점을 제공한다. 유리한 물 접촉각은 또한 본 명세서에 개시되는 고체 지지체를 통해 실현된다. 따라서, 고체 지지체는 다양한 분석물, 예를 들어 DNA의 고해상도/고밀도 어레이 분석에서 특정의 용도가 발견된다.
플라스틱 기판 상의 PCR 마이크로어레이는 120 ℃ 초과의 높은 Tg, 1% 미만의 낮은 수분 흡수율, 400-800 nm 범위에서의 90 % 초과의 광 투과성 및 낮은 형광 배경을 필요로 한다. 상기 특성을 가지는, 상업적으로 구입가능한 소수의 중합체가 화학적으로 불활성인 경향이 있다. 이러한 유형의 중합체의 습윤 화학적 표면 변형 은 너무 길고/거나 비용 불가하다. 상기 기판 중합체는 종종 통상의 처리 용매에 대해 불안정하다. 본 발명자들은, 중합체 고정화를 위해, 기판 표면을 히드록실화하는 산소 플라즈마 처리가 간편하고, 비용 절감적이며, 효과적인 접근법이라는 것을 발견하였다.
견고한 열가소성 모노리스를 포함하는 예시적 고체 지지체는 대기압 산소 플라즈마, 또는 기타 플라즈마법에 의해 직접 화학적으로 활성화되어, 표면 상에 히드록실 (또는 산소화된 다른) 기일 수 있다. 약 1:3 내지 약 10:1의 비율로, 표면 상에 아미노 기를 생성시키는, 암모니아 플라즈마 처리, 질소 플라즈마 처리 및 질소/수소 플라즈마를 비롯한 기타 기판 표면 플라즈마 처리가 고려된다. 플라즈마 처리는 작용 층의 후속 고정화를 위해, 예비 층의 접착에 의존하는 방법에 비해, 표면 기능화를 위해, 편리하고 빠른 자동 재현 기술을 제공한다
본 명세서의 고체 지지체는 도 1A-1F를 참도로 하여 더 잘 이해될 수 있다. 도 1A에서 제시되는 바와 같이, 고체 기판은 적절한 기판의 플라즈마 처리에 의해, 히드록실, 에폭사이드, 알데하이드 및 카르복시 기를 비롯한 다양한 산화 작용 기를 이용하여 제공될 수 있다. 이와 관련하여 유용한 기판은 하기에서 더욱 상세하게 기술된다. 그후, 고체 지지체는 적절한 반응 기를 포함하는 중합체의 반응에 의해 제조된다. 예를 들어, 도 1A는 각각 히드라존, 옥심 및 이민 공유 결합의 형성을 위한 것으로서, 표면 결합 알데하이드와 히드라지드, 알콕시아민 및 아민 반응 기를 포함하는 중합체의 반응을 도시한다. 유리하게는, 중합체는 따라서, 매개 링커 또는 "타이 층" 없이 고체 기판의 표면에 직접 공유 결합된다. 용이한 설명을 위해, 도 1A는 동일한 중합체 내의 다중 반응성 작용 기를 도시한다; 그러나, 본 발명이, 상기 중합체가 단일 유형의 작용 기를 포함하는 다양한 실시형태를 포함한다는 것이 이해되어야 한다.
도 1B는 고체 지지체의 또 다른 실시형태를 도시한다. 또한, 기판의 표면 상의 다양한 산화 작용 기를 획득하기 위해, 고체 기판을 대기압 O2 플라즈마 (APOP)로 처리한다. 그후,이민 결합을 통해 기판에 결합된 유리 아민 모이어티를 혼입시키기 위해, 기판을 디아민 (예를 들어, 에틸렌 디아민)에 의해 세척한다. 적절한 반응 기, 예를 들어 활성화 에스테르를 포함하는 중합체는 그후, (새로운 에스테르의 형성을 위해) 기판 표면에서 알코올과의 반응 및/또는 (아미드의 형성을 위해) 아민과의 반응에 의해 고체 기판에 공유 결합될 수 있다. 도 1A는 중합체에 아미드 및 에스테르 결합 둘 모두를 포함하느 고체 지지체를 도시하고, 당업자는, 특정 실시형태가 에스테르 또는 아미드 결합을 가지는 기판을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 디아민 처리 없이, 중합체가 활성화 에스테르를 포함하는 경우, 고체 지지체는 주로 에스테르 결합을 포함할 것이다. 반대로, 디아민 세척 과정 동안 이용되는 조건은, 기판 표면이 주로 아민을 포함하고, (중합체가 활성화 에스테르를 포함하는 경우) 주로 아미드 결합을 통해 기판에 결합되도록, 제어될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 고체 지지체는
외부 표면을 가지는 기판; 및
기판의 외부 표면에 공유 결합된 복수의 중합체을 포함하며, 상기 중합체 각각은 적어도 하나의 A 및 C 하위단위를 포함하고, 임의로 하나 이상의 B 하위단위를 포함하는 복수의 중합체를 포함하고, 여기서 A 하위단위는, 각각의 발생시, 독립적으로 하기 a), b), c)를 포함하며:
a) 제1 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제1 열화학적 반응 기는 포획 프로브 상의 알코올, 카르보닐 또는 아민 기와 공유 결합을 형성할 수 있음;
b) 제2 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제2 열화학적 반응 기눈 첨가 고리화 (cycloaddition) 또는 1 ,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 포획 프로브 상의 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기임; 또는
c) 포획 프로브와의 공유 결합,
상기 임의의 B 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하고;
C 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 기판의 외부 표면과의 공유 부착 W를 포함하며, 여기서 W는 하기 구조 중 하나를 가지고, 제1 및 제2 열화학적 반응 기의 반응성이 서로에 대해 직교한다:
Figure pct00007
또는
Figure pct00008
상기 식에서, Q는 기판의 외부표면이다.
일부 실시형태에서, W는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00009
또는
Figure pct00010
다른 특정 실시형태에서, 상기 중합체는 하기 화학식 (I)을 갖는다:
T1-(A)x(B)y(C)z-T2 (I)
상기 식에서,
A, B 및 C는 각각 A, B 및 C 하위단위를 나타내고; T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택되는 중합체 말단 기이고;
x 및 z는 독립적으로 1 내지 50,000의 정수이고;
y는 0 내지 50,000의 정수이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 하기 화학식 (II)을 가진다:
Figure pct00011
상기 식에서,
R1은, 각각의 경우에, 독립적으로 제1 열화학적 반응 기, 제2 열화학적 반응 기 또는 포획 프로브와의 공유 결합이고;
R2는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하고;
W는, 각각의 경우에, 독립적으로 기판의 외부표면과의 공유 결합이고;
Q는 기판의 외부표면이고;
R3, R4 및 R5는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
L1, L2 및 L3은, 각각의 경우에, 독립적으로 직접 결합 또는 최대 100 개의 원자 길이인 링커이고;
T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택되는 중합체 말단 기이고;
x 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 50,000의 정수이고; 및 y는 0 내지 50,000의 정수이다.
상기 실시형태 중 임의의 하나에서, 적어도 하나의 A 하위단위는 제1 열화학적 반응 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 열화학적 반응 기는 활성화 에스테르이고, 예를 들어 일부 측면에서, 제1 열화학적 반응 기는, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00012
상기 식에서,
R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e는 각각 독립적으로 H, 할로, 트리할로메틸, 설포 (즉, -SO3H 및/또는 그의 염), -CN, C1-C6 알킬옥시카르보닐, C1-C6 히드록실알킬옥시카르보닐, 니트로 또는 폴리에틸렌 글리콜이고, 여기서 폴리에틸렌 글리콜은 산소 (에테르) 또는 카르복실 (아미드 또는 에스테르) 연결을 통해 페닐 모이어티에 연결된다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e는 독립적으로 be -C02R이고, 여기서 R은 알킬, 히드록실알킬 또는 알콕시(폴리에톡시)에틸이다. 특정 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 50 내지 3,000 개의 에틸렌 옥사이드 하위단위를 포함한다.
전술된 다양한 실시형태에서, 할로는 플루오로이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e는 플루오로이다. 다른 실시형태에서, 각각의 R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e는 플루오로이다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 R7a, R7b, R7d 및 R7e는 플루오로이고, R7c는 설포이다. 다른 전술된 특정 실시형태에서, 제1 열화학적 반응 기는 4-설포테트라플루오로페닐 에스테르 (즉, 각각의 R7a, R7b, R7d 및 R7c는 플루오로이고, R7c는 설포임)를 포함한다. 유리하게는, 플루오르화된 반응성 모이어티를 포함하는 중합체는, 중합체 내의 반응성 단량체 및 희석제 단량체 사이의 비율의 정확한 결정을 위해, 19F 및/또는 1H NMR 기술에 의해 분석될 수 있다. 몰 공급 비율이 최종 중합체로 혼입된 하위단위의 mol%를 항상 정확히 예측하는 것은 아니다; 그러나, 본 발명의 중합체의 특정 실시형태에서, 하나 이상의 F 원자의 존재는 상기 중합체의 실제 몰 조성의 정확한 결정을 가능하게 한다. 이러한 결정을 위한 방법은 실시예에서 제공된다.
다른 특정 실시형태에서, R7a, R7b, R7c, R7d 또는 R7e 중 하나는 니트로이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, R7a, R7b, R7c, R7d 또는 R7e 중 하나는 니트로이고, 나머지 치환기는 H이다.
본 명세서에 개시되는 고체 지지체 중 하나의 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 A 하위단위는 제2 열화학적 반응 기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 알킨, 알킬실릴-보호 알킨, 아지드, 니트릴, 티올, 알켄, 말레이미드, 부타디엔, 시클로펜타디엔, 아지리딘, 티이란, 디엔, 친디엔체 또는 1 ,4-불포화 카르보닐 작용 기.
다른 실시형태에서, 제2 열화학적 반응성은 첨가 고리화 반응 기를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 첨가 고리화 반응 기는, 각각의 경우에, 독립적으로 알킨 또는 아지드 작용 기를 포함한다. 예시적 첨가 고리화 반응 기는, 각각의 발생시, 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00013
또는
Figure pct00014
상기 식에서,
β 및 χ는 각각 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수이다.
일부 예에서, β는 1 또는 3이다. 다른 예에서, χ는 1이다.
다른 특정 실시형태에서, 첨가 고리화 반응 기는, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00015
또는
Figure pct00016
다른 실시형태에서, 첨가 고리화 반응 기는, 각각의 경우에, 독립적으로 디엔 또는 친디엔체 작용 기를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 첨가 고리화 반응 기는, 각각의 경우에, 독립적으로 α,β-불포화 카르보닐, 말레이미딜, 아세틸렌 디카르복실릭 에스테르, 시클로펜틸디에닐, 푸라닐 또는 N-알킬피롤릴 모이어티를 포함한다. 이와 관련된 예시적 첨가 고리화 반응 기는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
또는
Figure pct00018
상기 식에서, Ra는 C1-C6 알킬이고, L1은 직접 결합 또는 최대 100 개의 원자 길이인 링커이다.
도 1C는 고체 지지체의 또 다른 실시형태를 도시한다. 또한, 고체 기판은 외부 표면에 히드록실 작용 기를 얻기 위해, 대기압 02 플라즈마 (APOP)로 처리된다. 그후, 적절한 반응 기, 예를 들어 활성화 에스테르를 포함하는 중합체는 고체 기판에 공유 결합 (고정)되어, 새로운 에스테르를 형성할 수 있다. 활성화 에스테르의 반응성의 증가를 위해, 촉매 (예를 들어, 트리에틸아민)가 사용될 수 있다.
도 1D는 고체 지지체의 또 다른 실시형태를 도시한다. 도 1D에 제시된 바와 같이, 고체 기판은, 적절한 기판의 산소 플라즈마 처리에 의해, 히드록실, 에폭사이드, 알데하이드 및 카르복시 기를 비롯한 다양한 산화 작용 기에 의해 제공될 수 있다. 그후, 작용화 표면은 적절한 반응 기를 포함하는 중합체에 노출시킨다. 예를 들어, 도 1D는 각각 히드라존, 옥심 및 이민 공유 결합의 형성을 위해, 표면 결합 알데하이드와 히드라지드, 알콕시아민 및 아민 반응 기를 포함하는 중합체의 반응을 도시한다. 유리하게는, 중합체는 따라서, 매개 링커 또는 "타이 층" 없이, 고체 기판의 표면에 직접 공유 결합된다. 용이한 설명을 위해, 도 1D는 동일한 중합체 내의 다중 유형의 반응성 작용 기를 도시한다; 그러나, 본 발명이, 상기 중합체가 단일 유형의 작용 기를 포함하는 다양한 실시형태를 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 그후, 포획 프로브는, 이로 제한되는 것은 아니나, 아지드, 알킨, 디엔, 친디엔체 또는 반응성 에스테르 기를 비롯한 적어도 하나의 직교-반응 기 A와의 바이오컨쥬게이션에 의해 작용화 중합체 표면에 스포팅 (spotting)된다. 그후, 고체 지지체는, 바이오분자 및 공기 거품의 비특이적 흡착을 감소시키기 위해, 나머지 직교 반응 기 A를 친수성 작용 기 B로 전환시켜, 물 접촉각이 작은 친수성 표면 (예를 들어, 15 도 미만)을 생성시키는 암모니아 캡핑에 적용된다. 다양한 실시형태에서, 반응 기 A는 히드라지드, 알콕시아민 및 아민 반응 기로부터 선택된다.
도 1E는 고체 지지체의 또 다른 실시형태를 도시한다. 또한, 고체 기판 표면은 히드록실, 에폭사이드, 알데하이드 및 카르복시 기를 비롯한 다양한 산화 작용 기를 얻기 위해, 대기압 02 플라즈마 (APOP)로 처리된다. 당업자에 공지된 바와 같은 다른 기판이 또한 구상중이나, 히드록실 및 알데하이드 기판의 혼합물이 도시된다. 작용화 표면은 그후 디아민 사전 세척에 배치되어, 혼합 히드록시 아미노 표면이 생성된다. 그후, 적절한 반응 기, 예를 들어 활성화 에스테르를 포함하는 중합체는, 기판 표면에 중합체를 결합시키기 위한 새로운 에스테르 및 아미드 연결의 형성을 위해, 임의의 아민 촉매의 존재 하에, 작용화 고체 기판에 공유 결합된다. 특정 실시형태에서, 2 가지 유형의 하위단위를 포함하는 공중합체인 중합체의 적어도 하나의 반응 기는 적어도 하나의 표면 반응 기와 반응한다. 중합체 내의 적어도 하나의 나머지 반응 기는 공유 아미드 결합의 형성을 위한 후속 스포팅 단계에서, 포획 프로브와 반응한다. 그후, 고체 지지체는 아미드 기에 의한, 중합체 상의 에스테르 기의 대체에 의해, 표면 친수성을 증가시키기 위해, 암모니아 캡핑에 적용된다.
도 1F는 고체 지지체의 또 다른 실시형태를 도시한다. 고체 기판 표면은 아미노 작용기를 얻기 위해, 대기압 NH3 또는 (N2 + H2) 플라즈마로 처리된다. 그후, 고체 지지체는 적절한 반응 기를 포함하는 중합체의 반응에 의해 제조된다. 예를 들어, 도 1F는 아미드 공유 결합의 형성을 위한, 표면 결합 아미노 기와 에스테르 반응 기를 포함하는 중합체의 반응을 도시한다. 일부 실시형태에서, 2 가지 유형의 하위단위를 포함하는 공중합체인 중합체의 적어도 하나의 반응 기는 적어도 하나의 표면 반응 기와 반응한다. 중합체의 적어도 하나의 나머지 반응 기는 공유 아미드 결합 형성을 위해, 후속 스포팅 단계에서 포획 프로브와 반응한다. 그후 고체 지지체는 아미드 기에 의한, 중합체의 에스테르 기의 대체에 의해, 표면 친수성을 증가시키기 위해, 암모니아 캡핑에 적용된다. 유리하게는, 중합체는 따라서, 매개 링커 또는 "타이 층" 없이, 고체 기판의 표면에 직접 공유 결합된다. 용이한 설명을 위해, 그후, 포획 프로브는 스포팅되고, 에스테르 기와의 상호작용에 의해, 작용화 중합체 표면에 공유 결합된다. 그후, 고체 지지체는 아미드 기에 의한, 중합체의 에스테르 기의 대체에 의해, 표면 친수성을 증가시키기 위해, 암모니아 캡핑에 적용된다.
특정 실시형태에서, 고체 지지체는 그에 고정된 포획 프로브를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 A 하위단위는 포획 프로브와의 공유 결합을 포함한다. 공유 결합은 일반적으로, 포획 프로브 상에서, 적절한 반응 기와 제1 또는 제2 열화학적 반응 기 중 하나의 사이에 형성된다. 예를 들어, 제1 열화학적 반응 기가 에스테르인 경우, 포획 프로브와 중합체 사이에 형성된 공유 결합은 에스테르 또는 아미드 (포획 프로브 상의 알코올 또는 아민의 반응에 의한 것)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 공유 결합은 포획 프로브와의 아미딜 또는 아민 결합이다. 특정 실시형태에서, 상기 공유 결합은 포획 프로브와의 아미딜 또는 티오에스테르 결합이다.
다른 실시형태에서, (존재하는 경우) 중합체와 포획 프로브 사이의 공유 결합은 포획 프로브 상의 상보적 반응 기와 중합체 상의 첨가 고리화 반응 기 사이에 형성된다. "클릭" 화학은 이러한 관점에서 특히 유리할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 첨가 고리화 반응 기는 알킨 또는 아지드이다. 다른 실시형태에서, 포획 프로브와의 공유 결합은 트리아졸 모이어티를 포함한다.
다른 관련 실시형태에서, 적어도 하나의 A 하위단위는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00019
Figure pct00020
또는
Figure pct00021
상기 식에서,
R5는 H 또는 C1-C6알킬이고;
L4는 임의의 링커이고;
Z는 포획 프로브 또는 그의 단편이다.
상기 고체 지지체는 임의의 수의 분석물의 분석에 있어서, 유용성이 발견된다. 이와 관련하여, 포획 프로브의 정체성은 특별히 제한되지 않으며, 당업자는 당해 고체 지지체의 맥락에 유용한 다양한 포획 프로브를 예상할 수 있을 것이다. 제한되는 것은 아니나, 특정 실시형태는 펩티드, 단백질, 글리코실화 단백질, 글리코컨쥬게이트, 앱터머, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리펩티드로부터 선택되는 포획 프로브에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, 포획 프로브는 DNA이다.
상기에서 지적된 바와 같이, 당해 고체 지지체는 유리하게는 고체 기판의 표면에 공유 결합된 중합체를 포함한다. 따라서, 고체 기판의 제조 방법은 더욱 상업적으로 실행가능하며, 생성된 고체 지지체는 전술된 바와 같이, 유리한 WCA 변환 특성을 포함하는 것으로서, 종래에 개시된 고체 지지체에 대해 많은 작용 이점을 갖는다. 특정 실시형태에서, 중합체와 고체 기판 사이의 공유 부착 ("W")은, 각각의 발생시, 독립적으로 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00022
또는
Figure pct00023
상기 식에서, Q는 고체 기판이다.
일부 실시형태에서, W는
Figure pct00024
이다.
다른 실시형태에서, W는
Figure pct00025
이다.
다른 실시형태에서, W는
Figure pct00026
이다.
다른 실시형태에서, W는
Figure pct00027
이다.
또 다른 실시형태에서, W는
Figure pct00028
이다.
다른 실시형태에서, W는
Figure pct00029
이다.
또 다른 실시형태에서, W는
Figure pct00030
이다.
전술된 W 구조의 임의의 조합을 포함하는 고체 지지체가 또한 본 발명의 다른 실시형태의 범위 내에 포함된다.
다른 실시형태에서, C 하위단위는, 각각의 발생시, 독립적으로 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00031
또는
Figure pct00032
상기 식에서,
R5는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
Q는 고체 지지체의 외부 표면이고;
n은 2 내지 10의 정수이다.
B 하위단위는 친수성 모이어티를 포함한다. B 하위단위의 수 및 정체성은 바람직한 소수성 물 접촉각, 등을 가지는 고체 지지체를 제공하기 위해 제어된다. 특정 실시형태에서, 본 발명자들은 B 하위단위를 가지지 않는 중합체가 특정 이점을 제공한다는 것을 발견하였다. 따라서, 특정 실시형태는 B 하위단위를 포함하지 않는 중합체를 가지는 고체 지지체에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 하나의 B 하위단위를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 친수성 모이어티는, 각각의 발생시, 독립적으로 아미도, 에스테르 또는 히드록실 작용 기, 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 실시형태에서, B 하위단위는, 각각의 발생시, 독립적으로 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00033
또는
Figure pct00034
상기 식에서,
R4는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R8a 및 R8b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이고;
R9a 및 R9b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이거나 또는 R9a 및 R9b는, 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 연합하여, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R10은 히드록실알킬이다.
상기의 특정 변형에서, R8a 및 R8b는 각각 H이다. 일부 실시형태에서, R8a 또는 R8b 중 하나는 H이고, R8a 또는 R8b 중 다른 하나는 C1-C6 알킬이다. 또 다른 실시형태에서, R8a는 H이고, R8b는 메틸이다.
다른 특정 실시형태에서, 각각의 친수성 모이어티는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00035
또는
Figure pct00036
예를 들어, 일부 실시형태에서, 각각의 친수성 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00037
다른 실시형태에서, 각각의 친수성 모이어티는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00038
또 다른 실시형태에서, R8a 또는 R8b 중 하나는 H이고, R8a 또는 R8b 중 다른 하나는 히드록실알킬이다. 다른 실시형태에서, R8a는 H이고, R8b는 -CH2OH이다.
다른 실시형태에서, 적어도 하나의 친수성 모이어티는 하기 구조 중 하나를 갖는다:
Figure pct00039
또는
Figure pct00040
또 다른 실시형태에서, R10는 -CH2CH2OH이다.
중합체의 나머지에 제1 또는 제2 열화학적 반응 기, 친수성 모이어티 또는 "W"를 연결시키는 연결 모이어티는 제한되지 않으며, 바람직한 특성을 가지는 고체 지지체를 제공하기 위해, 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서, L1, L2 및 L3은 각각 독립적으로 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 L1, L2 또는 L3은 직접 결합이다. 다른 실시형태에서, 각각의 L1, L2 및 L3은 직접 결합이다.
전술된 다양한 실시형태에서, 적어도 하나의 R3, R4 또는 R5는 H이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 각각의 R3, R4 및 R5는 H이다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 R3, R4 또는 R5는 메틸이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 각각의 R3, R4 및 R5는 메틸이다.
상기에서 지적된 바와 같이, 중합체 내의 B 하위단위의 양 (및 반대로, A 하위단위의 양)은 일반적으로 생성되는 고체 지지체의 바람직한 친수성 (및 물 접촉 각)을 제공하기 위해, 제어된다. 중합체 내의 하위 단위의 양은 몰 공급 비율의 백분율 (MFR %) 또는 mol%로서 표현될 수 있다. 일반적으로, 몰 공급 비율 %는 중합체의 제조에 이용된 단량체의 실제 비율을 근거로 할 것이다. 하위 단위의 mole %는 NMR (예를 들어, 본 명세서에 개시된 19F NMR)과 같은 다른 기술을 이용하여 결정될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 상기 중합체는 약 40 mol% 미만의 B 하위단위를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 0 mol% 내지 약 40 mol% 초과의 B 하위단위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 약 35 mol%의 B 하위단위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 30 mol%의 B 하위단위를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 0 mol% 내지 약 15 mol% 초과의 B 하위단위를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 75 mol%의 A 하위단위를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 90 mol%의 A 하위단위를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 95 mol%의 A 하위단위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 99.9 mol%의 A 하위단위를 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 상기 중합체는 약 40 MFR % 미만의 B 하위단위를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 0 MFR % 내지 약 40 MFR % 초과의 B 하위단위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 약 35 MFR %의 B 하위단위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 30 MFR %의 B 하위단위를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 0 MFR % 내지 약 15 MFR % 초과의 B 하위단위를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 75 MFR %의 A 하위단위를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 90 MFR %의 A 하위단위를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 95 MFR %의 A 하위단위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 적어도 약 99.9 MFR %의 A 하위단위를 포함한다.
중합체가 단지 하나의 유형의 반응 기를 포함하는 실시형태가 본 발명의 범위 내에서 예상된다. 따라서, 일 실시형태에서, 각각 A 하위단위는 제1 열화학적 반응 기 또는 포획 프로브와의 공유 결합을 포함한다. 전술된 구체적 실시형태에서, 중합체는 B 하위단위를 포함하지 않는다. 전술된 더욱 구체적인 실시형태에서, 제1 열화학적 반응 기는 상기에서 정의된 바와 같은 반응성 에스테르, 예를 들어 펜타플루오로페닐 에스테르이다.
특정 실시형태에서, 상기 중합체는 랜덤 중합체이다.
다른 특정 실시형태에서, 스포팅 (및 공유 생체분자/포획 프로브 부착) 후, 화학적으로 안정할뿐만 아니라, 친수성을 가지도록, 나머지 전체 반응성 중합체 표면 (비스포팅 및 비포획 프로브 영역)을 화학적으로 변형시키는 것이 바람직하다.
본 출원인들은, 당해 고체 지지체가 현재 구입가능한 고체 지지체와 비교하여, 물 접촉각을 변환시킬 수 있는 예기치 않은 능력을 가진다는 것을 발견하였다. 즉, 상기 고체 지지체는, (예를 들어, 스팟 크기의 감소를 가능하게 함으로써) 더욱 근접한 스팟 간격을 가능하게 하는 것으로서, 바이오컨쥬게이션 전에 큰 WCA를 갖는다. 바이오컨쥬게이션 후, WCA는, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 "캡핑"에 의해 현저하게 감소될 수 있다. 바이오컨쥬게이션 후 이러한 감소된 WCA는 구입가능한 고체 지지체에 의해 실현될 수 없는 특정 이점을 갖는다. 를 들어, 더욱 친수성이 큰 표면은 동결건조 전의 PCR 시약 수용액의 분배 및 분산 및 기타 관련 이점을 촉진시킨다. 상기 고체 지지체의 WCA 변환 능력은 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
본 출원인들은 예기치 않게, 상기 개시된 기판 상부의 중합체 표면이 상업적으로 시판되는 마이크로어레이 보다 더욱 소수성이라는 것을 발견하였다. 도 5는 68.3 mol%의 PFPA 및 31.7 mol%의 DMA를 포함하는 폴리(PFPA-co-DMA)와 공유적으로 고정된 시클릭 올레핀 기판 표면의 WCA를 도시한다. 73 도 미만의 WCA는 관찰되지 않았다. 상대적으로 큰 소수성은, 근접 간격의 마이크로어레이의 제작을 가능하게 하는 것으로서, 습윤성으로 인한 직경의 감소에 의한, 표면 상의 포획 프로브 용액의 스포팅 수성 액적을 예방한다.
마이크로어레이의 스포팅 후, 표면 상에서, 소수성 (예를 들어, PFPA)일 수 있는 나머지 반응 기는, 특정 실시형태의 전체 표면에서, WCA ≤ 12°를 초래하는 것으로서, "캡핑"에 의해 친수성 모이어티로 전환될 필요가 있다. 이러한 친수성 표면을 가지는 이점은 (1) 큰 신호대잡음비를 초래하는 것으로서, 비특이적 흡착의 감소, (2) 분산된 동결건조 시약 수용액을 동결건조 전에 표면 상에 균일하게 분포될 수 있도록 함, (3) 수성 완충액에 의한 동결건조 시약의 재구성 과정 동안, 포착된 공기 거품의 이탈을 포함한다.
수성 트리에틸아민 (TEA), 수성 암모니아, 암모니아 증기, 짧은 PEG 디아민을 이용한 침수 (immersion)에 의한 캡핑, 긴 PEG 아민 (MW 2000)에 의한 캡핑, 40℃ 및 60℃에서, 아세톤 대 물, 염 대 무염 (no salt)에서, 1 시간의 침수 시간 동안 짧은 PEG 디아민 대 암모니아에 의한 캡핑, 1 시간 동안 20℃, 60℃ 및 95℃에서 lOOmM 트리에틸아민 (TEA)을 이용한 짧은 PEG 디아민 대 암모니아에 의한 캡핑, 60℃ 대 75℃에서 1 시간 동안 50 mM TEA 대 무TEA를 포함하는 물 중에서, 3 가지 농도 (50, 150, 및 500 mM)의 디메틸아민에 의한 캡핑, 및 4 개의 각각의 온도 (20℃, 60℃, 75℃ 및 95℃)에서 1 시간 동안 4 가지 농도 (0, 50, 100, 500 mM)의 암모니아에 의한 캡핑을 포함한, 캡핑을 야기하는 다양한 표면 처리를 시험하였다.
표 1 (실시예 12 참조)은 대기압 산소 플라즈마에 의해 사전 처리된 기판 표면 상에서, 65 mol% PFPA 및 35 mol% DMA를 가지는 공중합체의 공유적 고정화에 의해 제조된 고체 지지체의 예시적 캡핑 결과를 제시한다. 암모니아 캡핑은, 소수성의 과플루오르화 에스테르 기를 가지는 PFPA 단량체 반복 단위를 친수성의 화학적으로 안정한 아크릴아미드 기로 전환시킨다. 표 1에 제시된 바와 같이, 60℃에서, 1-2 시간 동안 50-500 mM 수성 암모니아, 100 mM 트리에틸아민에서 스포팅 마이크로어레이의 침수에 의한 캡핑 후, 10 도 이하의 물 접촉각이 생성된다.
본 출원인들은 예기치 않게, 암모니아가 약 85 도 내지 < 20 도, 또는 심지어 15 도 미만 또는 10 도 미만의 물 접촉각 WCA를 변환하는데 유일하게 잘 적용된다는 것을 발견하였다. 본 출원인들은 예기치 않게, 상기 캡핑 프로토콜이 약 80° 내지 ≤ 15°지의 스포팅 (즉, 포획 프로브 결합) 고체 지지체의 물 접촉각을 변환하는 하나의 방법이라는 것을 발견하였다. ≤ 15°의 작은 물 접촉각은 비특이적 흡착을 감소시키고, 신호대잡음비를 증가시켜, 이에 따라, 프로브 신호의 검출시, 민감성 및 특이성이 증가된다. 캡핑된 표면의 고 수성 습윤성은 미세유동 장치로의 통합에 유용한 친수성 표면을 제공하며, 다양한 생물 분석 성분 및 공기 거품의 비특이적 흡착의 감소를 돕는다.
다른 실시형태에서, 물 접촉각은 (예를 들어, 상기 고체 지지체가 큰 다중화도를 위해, 어레이-유형 분석에 사용되는 경우) 소 스팟 크기를 얻기 위해, 최적화된다. 일부 실시형태에서, 상기 고체 지지체는 40° 내지 95°, 예를 들어 40° 내지 90°, 60° 내지 95° 또는 70°내지 90°범위의 물 접촉각을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 고체 지지체는 50° 내지 85° 또는 60° 내지 85°범위의 물 접촉각을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 고체 지지체는 60° 내지 80° 범위의 물 접촉각을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 고체 지지체는 61° 내지 95°, 예를 들어 70° 내지 90°범위의 물 접촉각을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 고체 지지체는 75° 내지 85°의 범위의 물 접촉각을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 고체 지지체는 78° 내지 83° 범위의 물 접촉각을 갖는다.
일부 실시형태에서, 임의의 캡핑 단계 (예를 들어, 암모니아에 의한 처리) 후, WCA는 캡핑 전 보다 더욱 작다. 일부 실시형태에서, 캡핑 후 WCA는 25° 미만, 20° 미만, 15° 미만 또는 심지어 10° 미만이다. 일부 실시형태에서, 임의의 캡핑 단계 전 및 후의 WCA의 차이는 적어도 50°, 적어도 60° 또는 적어도 70°이다.
본 명세서의 고체 지지체에서 사용되는 고체 기판은 제한되지 않으며, 일반적으로 원하는 최종 목적을 토대로 선택된다. 그러나, 본 발명자들은, 고체 지지체의 특정 실시형태가 유기 중합체 기판으로 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 일부 실시형태에서, 기판은 폴리(스티렌), 폴리(카보네이트), 폴리(에테르설폰), 폴리(케톤), 폴리(지방족 에테르), 폴리(에테르 케톤), 폴리(에테르 에테르 케톤), 폴리(아릴 에테르), 폴리(아미드) 폴리(이미드), 폴리(에스테르) 폴리(아크릴레이트), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(올레핀), 폴리(시클릭 올레핀), 폴리(비닐 알코올), 중합체 블렌드 또는 폴리 알킬 중합체 또는 할로겐화 유도체, 가교 유도체 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 할로겐화 유도체는 할로겐화 폴리(아릴 에테르), 할로겐화 폴리(올레핀) 또는 할로겐화 폴리(시클릭 올레핀)이다. 구체적인 특정 예에서, 기판은 시클릭 폴리(올레핀)을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 기판은 실질적으로 광학적으로 투명한다. 이러한 기판은, 형광 또는 광학적 검출 방법을 이용한 분석에서 이용되는 고체 지지체에서 유용성이 발견된다. 일부 실시형태에서, 기판은 약 400 nm 내지 약 800 nm로서 실질적으로 광학적으로 투명하다. 또 다른 실시형태에서, 기판은 적어도 약 90% 광학적으로 투명한다.
상기에서 지적된 바와 같이, 상기 고체 지지체는 다양한 분석물, 예를 들어 DNA의 어레이 분석을 위한 방법에서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상기 고체 지지체는, 각각의 개별 위치가 독립적으로 기판의 외부표면에 공유 결합된 적어도 하나의 중합체를 포함하는 개별 위치의 체계적 어레이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 각각의 개별 위치는 독립적으로 그에 공유 결합된 복수의 중합체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 개별 위치의 적어도 하나의 중합체는 이에 공유 결합된 포획 프로브를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 각각의 개별 위치는 그에 결합된 구조적으로 개별적인 복수의 포획 프로브를 포함한다.
종래에 개시된 고체 지지체와 반대로, 본 명세서에 개시되는 고체 지지체의 실시형태는 복수의 중합체 사이의 실질적으로 비 화학적 가교 (중합체간 및 중합체내 가교 (inter and intra polymer cross-links))를 포함한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 본 발명자들은, 이러한 중합체간 및 중합체내 가교가 (UV-유도 라디칼 메커니즘을 통한) 기판과의 광활성 중합체의 UV 유도 결합 과정 동안 형성된다고 생각한다. 당해 중합체의 실시형태가 열화학적 반응성 작용 기 (즉, UV 반응성 작용 기가 아님)를 통해, 고체 지지체에 공유 결합되기 때문에, 생성되는 고체 지지체는 일반적으로 실질적으로 중합체간 및 중합체내 가교를 포함하지 않는다.
따라서, 일부 실시형태에서, 복수의 중합체는 그들 사이에 가교가 실질적으로 존재하지 않는다. 다른 실시형태에서, 복수의 중합체는 95%, 98%, 99% 또는 심지어 99.9%가 그들 사이에 가교가 존재하지 않는다.
본 명세서는 또한, 전술된 고체 지지체의 제조에서 유용성이 발견된 특정 고체 기판을 제공한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 명세서는, 아민 작용 기가 이민 결합을 포함하는 링커를 통해, 고체 기판에 결합되는 것으로서, 고체 기판의 외부 표면에 공유 결합된 복수의 일차 아민 작용 기를 포함하는 고체 지지체를 제공한다.
상기 고체 지지체의 특정 실시형태에서, 상기 고체 지지체의 외부 표면은 하기 구조 또는 그의 염, 호변이성질체 또는 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00041
상기 식에서,
Q는 고체 지지체의 외부 표면이고;
n은 2 내지 10의 정수이다.
본 명세서에서 제시되는 바와 같은 화합물 및/또는 중합체의 임의의 실시형태 및 본 명세서에 개시되는 화합물 및/또는 중합체에서 본 명세서에 개시되는 임의의 특이적 치환기가, 구체적으로 상기에서 제시되지 않은 본 발명의 실시형태를 생성하기 위해, 본 명세서에 개시되는 화합물 및/또는 중합체의 기타 실시형태 및/또는 치환기기와 독립적으로 조합될 수 있다는 것이 이해된다. 또한, 치환기 리스트가 특정 실시형태 및/또는 청구범위에서 임의의 특정 R 기에 있어서 제시되는 경우, 각각의 개별 치환기가 특정 실시형태 및/또는 청구범위로부터 생략될 수 있고, 치환기의 나머지 리스트가 본 발명의 범위 내로 고려될 수 있다.
본 명세서에서, 치환기의 조합 및/또는 도시된 화학식의 변형은 단지, 이러한 이유로 안정한 화합물이 초래되는 경우에만, 허용될 수 있다는 것이 이해된다.
또한, 유리 염기 또는 산 형태로 존재하는 본 발명의 모든 화합물 및/또는 중합체는 당업자에 공지된 방법을 이용하여, 적절한 무기 또는 유기 염기에 의한 처리에 의해 염으로 전환될 수 있다. 본 발명의 화합물의 염은 표준 기술에 의해, 그의 유리 염기 또는 산으로 전환될 수 있다.
B. 고체 지지체 및 중합체의 제조 방법
본 발명의 실시형태는 고체 지지체의 제조 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 상기 방법은
A) 히드록실 및 카르보닐 작용 기가 매개 링커 없이, 고체 기판에 직접 결합하고, 아민 작용 기가, 매개 링커 없이 고체 기판에 직접 결합된 이민 결합을 포함하는 링커를 통해, 고체 기판에 결합된, 그 외부 표면에 공유 결합된 복수의 히드록실, 카르보닐 또는 아민 작용 기, 또는 이들의 조합을 포함하는 고체 기판을 제공하는 단계; 및
B) 적어도 하나의 히드록실, 카르보닐 또는 아민 작용 기 및 D 하위단위 사이에 공유 결합을 형성하기에 충분한 조건 하에, D 및 임의의 E 및 F 하위단위를 포함하는 중합체를 고체 기판과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서
D 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 제1 반응 기를 포함하고, 여기서 제1 반응 기는 고체 기판 또는 포획 프로브 상에서 알코올, 카르보닐 또는 아민 작용 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 열화학적 반응 기이고;
E 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하고;
F 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 제2 반응 기를 포함하며, 여기서 제2 반응 기는 첨가 고리화 또는 1,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 포획 프로브 상의 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기이고,
제1 반응 기 및 제2 반응 기의 반응성은 서로에 대해 직교한다.
전술된 특정 실시형태에서, 히드록실 및 카르보닐 작용 기는 매개 링커 없이 기판 표면에 직접 결합되고, 아민 작용 기는, 매개 링커 없이 기판 표면에 직접 결합된 이민 결합을 포함하는 링커를 통해, 기판 표면에 결합된다. 일부 실시형태에서, 아민 작용 기는 매개 링커 없이 고체 기판에 결합된다.
특정 실시형태에서, 고체 지지체의 제조 방법은, 히드록실, 에폭사이드, 알데하이드, 산, 아민 또는 기타 작용 기를 포함하는 것으로서, 전술된 바와 같이 활성화된 기판 표면과 반응성 중합체를 반응시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응성 중합체는 전술된 바와 같은 A 하위단위 및 임의의 B 하위단위를 포함한다. 기판 표면 상에서, 작용 기와의 반응시, 상기 하위단위는 C 하위단위로 전환된다. 남아 있는 비반응 A 하위단위는 포획 프로브와의 바이오컨쥬게이션에 적용될 수 있다.
전술된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 방법은 캡핑 단계를 추가로 포함한다. 상기 캡핑 단계는 고체 지지체의 포획 프로브의 컨쥬게이션 후, 수행될 수 있고, 일반적으로, 상기에서 논의된 바와 같은, 현저하게 작은 WCA를 가지는 고체 지지체를 생성시킨다. 임의의 캡핑 단계에 유용한 시약에는 염기, 예를 들어 아민 염기 (예를 들어, NH4OH)가 포함된다. 상기 반응을 촉진시키기 위해, 아민-포함 촉매가 사용될 수 있다. 유용한 용매에는, 무수물일 수 있거나 또는 저비율의 물을 포함하는 극성 용매, 예를 들어 아세토니트릴 및/또는 아세톤이 포함된다. 캡핑은 실온에서 수행될 수 있으나, 일반적으로 상승된 온도, 예를 들어 약 60 ℃, 75 ℃ 또는 95 ℃에서 수행될 것이다. 임의로, 현 방법은 고체 기판과 중합체의 반응을 향상시키기 위해, 촉매 (예를 들어, 염기 촉매)의 사용을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 반응 기는 고체 기판 상에서, 케톤 또는 알데하이드 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 친핵성 기이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 반응 기는 히드라지드, 아민 또는 알콕시 아민이다.
다른 실시형태에서, 제1 반응 기는상기 고체 기판 상에서 알코올 또는 아민 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 친전자성 기. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 반응 기는 아릴 에스테르 또는 에폭사이드이다.
일부 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 하기 구조식 (III)를 갖는다:
Figure pct00042
상기 식에서,
D, E 및 F는 각각 D, E 및 F 하위단위를 나타내고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택되는 중합체 말단 기이고;
a는 1 내지 50,000의 정수이고;
b 및 c는 독립적으로 0 내지 50,000의 정수이다.
전술된 방법의 다른 실시형태에서, 상기 중합체는 하기 화학식 (IV )를 갖는다:
Figure pct00043
상기식에서,
R11은, 각각의 경우에, 독립적으로 제1 반응 기를 포함하는 치환기이고;
R12는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R13은, 각각의 경우에, 독립적으로 제2 반응 기를 포함하는 치환기이고;
R14, R15 및 R16은, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
L5, L6 및 L7은, 각각의 경우에, 독립적으로 직접 결합 또는 최대 100 개의 원자 길이인 링커이고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택되는 중합체 말단 기이고;
q는 1 내지 50,000의 정수이고;
r 및 s는 독립적으로 0 내지 50,000의 정수이다.
일부 다른 예시적 실시형태에서, R11은, 각각의 발생시, 독립적으로 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00044
상기 식에서, R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e는 각각 독립적으로 H, 할로, 트리할로메틸, 또는 니트로이다.
상기 실시형태의 특정 경우, r 및 s는 각각 0이다.
일부 실시형태에서, 열화학적 반응 기는 상기 본 명세서의 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같다.
또 다른 실시형태에서, F 하위단위가 존재한다. 다른 실시형태에서, 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기는 상기 본 명세서의 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같다.
다른 실시형태에서, E 하위단위가 존재한다. 일부 이들 실시형태에서, 친수성 모이어티는 상기 본 명세서의 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같다.
다른 특정 예에서, 공유 결합은 적어도 하나의 히드록실, 아민 또는 카르보닐 모이어티와 제1 반응 기와의 반응에 의해 형성되는 에테르, 에스테르, 히드라존, 옥심, 아미드 또는 이민 결합이다. 다른 예에서, W는 적어도 하나의 히드록실 또는 카르보닐 모이어티와 제1 반응 기의 반응에 의해 형성되는 에테르, 에스테르, 히드라존, 옥심 또는 이민 결합이다.
또 다른 실시형태에서, 고체 기판은 주위 공기 플라즈마, 대기압 산소 플라즈마, (APOP), 질소 플라즈마, 암모니아 플라즈마 또는 질소 + 수소 플라즈마의 혼합물에 의한 고체 기판의 처리 또는 코로나 처리에 의해 제조된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 방법은 고체 기판의 카르보닐과 디아민의 제1 아민 기 사이의 공유 이민 결합을 형성하기에 충분한 조건 하에서, 디아민 화합물과 고체 기판을 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 포획 프로브와 중합체 사이에 공유 결합을 형성하기에 충분한 조건 하에서, 고체 지지체를 포획 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 공유 결합은 D 하위단위의 아릴 에스테르 또는 에폭사이드 모이어티와 포획 프로브의 아민 모이어티의 반응에 의해 형성된다. 다른 실시형태에서, 상기 공유 결합은 F 하위단위의 알킨 모이어티와 포획 프로브의 아지드 모이어티의 반응에 의해 형성된다. 다른 실시형태에서, 상기 공유 결합은 F 하위단위의 아지드 모이어티와 포획 프로브의 알킨 모이어티의 반응에 의해 형성된다. 예를 들어, 상기 방법의 특정 실시형태는 아지드의 존재 하에, 고체 지지체와 Cu(I) 촉매를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
개시된 고체 지지체 및 중합체의 제조 방법은 당업자에 쉽게 분명할 것이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 발명의 중합체는 바람직한 비율의 하위단위 및 임의의 활성화제 (예를 들어, 열 중합을 위한 AIBN 또는 ATRP를 위한 촉매)를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 클릭 작용 기, 예를 들어 아지드 또는 알킨을 포함하는 하위단위 및 중합체는 당업자에 공지된 방법에 따라 제조되거나 또는 상업적 공급원 (예를 들어, 프로파길 아크릴레이트 또는 3-아지도프로필아크릴레이트)으로부터 구입할 수 있다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 문헌 [S.R. Gondi, el at., Macromolecules 2007, 40, 474-481; P.J. Roth, el at., J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2009, 47, 3118-3130; 및 C. Li, et al, Macromolecules, 2009, 42, 2916-2924]을 참조한다. 예시적 방법이 실시예에서 제공된다.
또한, 본 명세서에 개시되는 과정에서, 중간 화합물의 작용 기가 적절한 보호 기에 의해 보호될 필요가 있을 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 작용 기에는 히드록시, 아미노, 메르캅토 및 카르복실산이 포함된다. 히드록시의 적절한 보호 기에는 트리알킬실릴 또는 디아릴알킬실릴 (예를 들어, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 또는 트리메틸실릴), 테트라디히드라피라닐, 벤질, 등이 포함된다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노의 적절한 보호 기에는 t-부트옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 등이 포함된다. 메르캅토의 적절한 보호 기에는 -C(0)-R" ("R"은 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등이 포함된다. 카르복실산의 적절한 보호 기에는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스테르가 포함된다. 본 명세서에서 개시된 바와 같고, 당업자에 공지된 표준 기술에 따라, 보호 기가 첨가되거나 또는 제거될 수 있다. 보호 기의 사용은 문헌 [Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wiley]에 상세히 개시되어 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 보호 기는 또한 중합체 수지 예를 들어 Wang 수지, Rink 수지 또는 2-클로로트리틸-클로라이드 수지일 수 있다.
C. 중합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 신규의 중합체에 관한 것이다. 상기 중합체는 개시된 고체 지지체의 제조를 위해 또는 다른 목적을 위해 이용될 수 있다. 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 일반적으로 단지 수성상에서만 용해되는 것으로 생각된다. 그러나, 당업계의 일반적 교시 내용과는 반대로, 본 발명자들은 예기지 않게, 아크릴아미드 및 소수성 아크릴레이트 단량체의 공중합체가 유기 용매에 상당히 용해된다는 것을 발견하였다. 이와 관련하여, 본 발명자들은, 소수성 단량체, 예를 들어 PFPA의 공중합체에 소분율의 아크릴아미드의 혼입은 유리한 특성을 가지는 공중합체를 생성시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 공중합체의 하나의 이점은, 다양한 용매 (물 포함) 중의 용해도가 아크릴아미드 단량체의 함량을 조정함으로써, 작용 표면 적용에 따라 조율될 수 있다는 것이다. 이것은 또한, 후속 수계 분석에서 이용하기 위한 것으로서, 충분한 친수성 작용성을 보유하는 고백분율의 반응성 작용 기를 가지는 공중합체를 제공할 수 있다. 놀랍게도, 특정 실시형태에서, 35% 미만의 아크릴아미드 MFR을 가지는 예시적 중합체가 아세톤, 아세토니트릴, THF, 클로로포름 및 기타 유기 용매에서 쉽게 용해된다는 것이 발견되었다.
일 실시형태에서, 상기 중합체는 G, H 및 임의의 I 하위단위를 포함하고, 여기서
G 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 a), b)를 포함하며:
a) 제1 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제1 열화학적 반응 기는 알코올, 카르보닐 또는 아민 기와 공유 결합을 형성할 수 있음;
b) 제2 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제2 열화학적 반응 기는 첨가 고리화 또는 1 ,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기임;
상기 H 하위단위는, 각각의 경우에, 하기 구조를 가지며:
Figure pct00045
;
임의의 I 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하며, 하기 구조 중 하나를 가지고,
제1 및 제2 열화학적 반응 기의 반응성은 서로에 대해 직교한다:
Figure pct00046
또는
Figure pct00047
상기 식에서,
R4는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R8a는 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이고;
R8b는 C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이고;
R9a 및 R9b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이거나 또는 R9a 및 R9b는, 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 결합하여, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R10은 히드록실알킬이다.
특정 실시형태에서, 임의의 I 하위단위는 존재하지 않는다. 다른 실시형태에서, 임의의 I 하위단위가 존재한다.
일부 실시형태에서, 친수성 모이어티는 상기 본 명세서의 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같다.
다른 실시형태에서, G 하위단위는 A 하위단위와 관련하여 상기 본 명세서에의 임의의 실시형태에서 정의된 바와 같은 제1 및/또는 제2 열화학적 반응 기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 각각의 G 하위단위는 제1 열화학적 반응 기를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 상기 중합체는 0 mol% 내지 약 15 mol% 초과의 H 하위단위를 포함한다. 다른 다양한 실시형태에서, 중합체는 0 MFR % 내지 약 15 MFR % 초과의 H 하위단위를 포함한다.
D. 고체 기판의 이용 방법
본 발명의 특정 실시형태는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 이로 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에 개시되는 중합체, 활성화 고체 기판 및 고체 지지체 의 제조 방법을 포함한다. 분석적 분석에서 고체 지지체의 이용 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 고체 지지체는 임의의 수의 분석물, 예를 들어 바이러스, 세균, 변형체, 균류뿐만 아니라, 금속 및 미지의 바이오 전쟁, 바이오 해저드 및 화학전 물질의 검출을 위한 분석에서 사용될 수 있다.
다양한 분석물의 분석에서 상기 고체 지지체의 이용 방법은 당업자에게 분명할 것이다. 이러한 방법은, 예를 들어 모든 목적을 위해, 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 미국 가특허 출원 제 61/463,580호, 호제 61/561,198호, 제 1/684,104호, 제 61/600,569호, 미국 특허 출원 제 13/399,872 호 및 미국 공보 제 2012/0214686호에 개시되어 있다. 본 발명의 개시 고체 지지체의 예시적 이용 방법이 도 2에 개략적으로 도시되어 있다.
도 2A에 도시된 바와 같이, 일 실시형태에서,상기 방법의 분석물 프로브는 섹션 A 및 B를 포함한다. A 섹션은 임의로 소광제 모이어티를 포함하고, 소광제는 A 섹션의 3' 말단 또는 A 섹션 내의 임의의 다른 지점에 존재할 수 있다. A 섹션은 표적 분석물 서열 (예를 들어, 병원균 DNA, 등)의 적어도 일부에 대해 상보적이다. 상기 분석물 프로브는 또한 섹션 B ("플랩")를 포함한다. 상기 플랩은 고체 지지체에 결합된 포획 프로브의 서열의 적어도 일부에 상보적인 서열 및 형광단을 포함한다. 임의로, 분석물 프로브의 서열은, 소광제 및 형광단이 근접하여, 비결합 분석물 프로브와 연계된 형광 신호가 감소되고, 분석의 전체 민감도가 증가되도록, A 섹션 및 플랩이 적어도 일부의 상보성을 가지도록 선택된다.
분석 조건은 일반적으로, 다른 표적 분석물에 대해 특이적인 고유의 서열을 가지는 복수의 분석물 프로브를 포함한다. PCR 조건 및 상보적 (또는 적어도 부분적으로 상보적인) 표적 분석물의 존재 하에, 플랩을 분석물 프로브로부터 분리한다. 분리된 플랩을 그후 상기 플랩에 상보적인 (또는 적어도 부분적으로 상보적인) 고체 지지체-결합 포획 프로브에 혼성화한다. 포획 프로브가 결합된 위치의 형광 신호의 존재 (또는 증가)는 표적 분석물 서열의 존재를 시사한다.
대안적 실시형태가 도 2B에 도시된다. 이 예시적 실시형태에서, 플랩은 소광제를 포함하고, 지지체 결합 포획 프로브는 형광단을 포함한다. 또한, 플랩 또는 포획 프로브의 소광제 또는 형광단의 정확한 위치는 각각 다양할 수 있다. 표적 분석물 서열의 존재 하의 PCR 조건에서, 플랩을 프로브로부터 분리한다. 그후, 플랩을 포획 프로브에 혼성화하고, 그리하여 포획 프로브의 형광단을 ?칭한다. 따라서, 포획 프로브가 결합되는 위치의 형광의 부재 (또는 감소)는 표적 분석물 서열의 존재를 시사한다.
또 다른 예시적 방법이 도 2C에서 제공된다. 여기서, 프로브는, 표적 분석물 서열에 적어도 부분적으로 상보적이고, 분리가능한 플랩을 포함하지 않는 서열을 포함한다. 이 실시형태의 프로브는 소광제를 포함하고, 지지체-결합 포획 프로브는 형광단을 포함한다. 프로브를 포획 프로브와 혼성화하면, 포획 프로브가 결합되는 위치에서 ?칭 신호가 발생한다. 그후, 고체 지지체를 PCR 조건에 배치한다. 표적 분석물 서열의 존재 하에, 프로브 소광제를 분리하면, 포획 프로브의 형광 신호가 증가한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 일반적으로, 표적 분석물 분자의 존재 또는 부재를 측정하기 위한 방법으로서,
a) A 하위단위가 이에 공유 결합된 포획 프로브를 포함하는, 본 명세서에 개시되는 고체 지지체를 제공하는 단계;
b) 분석물 프로브 또는 그의 단편을 상기 고체 지지체와 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 분석물 프로브와 상기 포획 프로브의 상호작용에 의해 생성되는 신호의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 특정 실시형태에서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, 표적 분석물 분자는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질이다.
다른 실시형태에서, 신호는 형광 신호이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 형광 신호는 포획 프로브와 분석물 프로브의 특이적 혼성화의 결과로서 생성 또는 감소된다.
다른 실시형태에서, 분석물 프로브는 형광단 또는 형광단 소광제를 포함한다.
다른 관련 실시형태에서, 본 발명은 표적 핵산의 검출 방법으로서,
A) 본 명세서에 개시되는 적어도 하나의 고체 지지체를 포함하는 검출 챔버를 제공하는 단계로서, 고체 지지체가 포획 프로브의 어레이를 포함하는 단계;
B) 검출 챔버로 샘플을 부하하는 단계로서, 샘플이 검출될 표적 핵산의 하나 이상의 복제물을 포함하는 단계;
C) 상기 하나 이상의 복제물에 증폭 프라이머 및 프로브를 혼성화하는 단계;
D) 증폭 프라이머 의존적 증폭 반응에서 하나 이상의 표적 핵산 복제물의 적어도 일부를 증폭시키는 단계로서, 상기 증폭 반응이 프로브의 분리 및 제1 프로브 단편의 방출을 초래하는 단계;
E) 고효율 어레이에 제1 프로브 단편을 혼성화하는 단계; 및,
F) 어레이에 제1 프로브 단편을 결합시킴으로써 생성된 신호를 검출하여, 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 검출 단계 (들)는 어레이에 근접한 배경 신호를 감소시키는 조건 하에서 실시된다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 복수의 표적 핵산 서열을 위한 샘플을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 방법은
A) 복수의 제1 표지 프로브가 각각 제1 표적 핵산 서열 패널에서 관심 대상인 다른 표적 서열에 상보적인 제1 부분 및, 고 효율 프로브 어레이 상의 다른 포획 프로브에 상보적인 제2 부분으로서, 고 효율 프로브 어레이가 본 명세서에 개시되는 고체 지지체를 포함하는 제2 부분을 포함하는 복수의 제1 표지 프로브와 샘플을 접촉시키는 단계로서, 제2 부분이 이에 부착된 표지를 가지며, 관심 대상 표적 서열에 상보적이지 않은 단계;
B) 증폭 프라이머 의존적 증폭 반응에서, 샘플에 존재하는 표적 핵산 서열의 제1 패널의 임의의 표적 서열을 증폭시키는 단계로서, 증폭 반응이 표적 서열에 혼성화된 표지 프로브의 분리 및 표지를 보유하는 표지 프로브의 제2 부분의 방출을 초래하는 단계;
C) 고 효율 어레이에 방출된 표지 프로브의 제2 부분을 혼성화하는 단계;
D) 고 효율 어레이에서, 표지 프로브의 제2 부분의 포획 프로브와의 결합의을 검출하는 단계; 및
E) 고 효율 어레이에 혼성화된 표지 프로브의 제2 부분으로부터 샘플에 존재하는 표적 서열을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 단계로서,
A) 표적 핵산 서열의 증폭시, 제2 부분이 제1 부분으로부터 분리되도록 하기 위해, 제1 표적 핵산 서열에 상보적인 제1 부분 및, 제1 표적 핵산 서열에 상보적이지 않은 제2 표지 부분을 포함하는 제1 표지 프로브의 존재 하에, 뉴클레아제 활성을 보유하는 중합 효소를 이용하여, 샘플 상에서 증폭 반응을 수행하는 단계;
B) 제2 부분에 상보적인 포획 프로브에 제2 표지 부분을 혼성화하는 단계로서; 상기 포획 프로브가 본 명세서에 개시되는 고체 지지체에 공유 결합된 단계; 및
C) 기판 상에서 포획 프로브에 혼성화된 제2 표지 부분의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 방법의 또 다른 실시형태는 샘플에서, 표적 핵산 서열을 검출하는 방법으로서,
A) 표적 핵산 서열의 증폭시, 제2 부분이 제1 프로브 단편으로서 제1 부분으로부터 분리되도록 하기 위해, 표적 핵산 서열에 상보적인 제1 부분 및, 제1 위치에서 제2 부분에 커플링된 제1 소광제 모이어티를 포함하는 것으로서, 제1 표적 핵산 서열에 상보적이지 않은 제2 부분을 포함하는 제1 프로브를 포함하는 시약의 존재 하에, 뉴클레아제 활성을 보유하는 중합 효소를 이용하여, 샘플 상에서 증폭 반응을 수행하는 단계;
B) 포획 프로브로의 프로브 단편의 혼성화시, 형광단이 소광제에 의해 적어도 부분적으로 ?칭되도록 하기 위해, 본 명세서에 개시되는 고체 지지체에 고정된 포획 프로브에 제1 프로브 단편을 혼성화하는 단계로서, 포획 프로브가, 포획 프로브 상의 제2 위치에 커플링된 형광단으로서, 제1 소광제 모이어티에 의해 적어도 부분적으로 ?칭되는 형광단을 포함하는 단계; 및
C) 포획 프로브 상에서, 형광단의 ?칭을 토대로, 표적 서열의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 샘플에서 적어도 제1 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법으로서,
A) 표적 특이적 프로브가 포획 프로브에 혼성화되는 경우, 소광제가 형광단의 형광을 ?칭하도록 하기 위해, 본 명세서에 개시되는 고체 지지체의 존재 하에, 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 증폭 반응에 샘플을 적용시키는 단계로서, 고체 지지체가, 이에 부착된 소광제를 포함하며, 표적 핵산 서열 및 포획 프로브의 적어도 일부에 상보적인 표적 특이적 핵산 프로브 및 이에 부착된 형광단을 포함하는 포획 프로브를 포함하는 제1 핵산 프로브 세트로서, 적어도 제1 핵산 프로브 세트를 포함하는 단계;
B) 중합 효소 연쇄 반응의 하나 이상의 사이클 후, 샘플로부터 형광을 검출하는 단계로서, 형광의 증가가 표적 핵산 서열의 존재를 시사하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 명세서에 개시되는 고체 지지체 및 고체 기판을 포함하는 장치 및 소비재를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은
A) 적어도 하나의 챔버 표면 상에, 적어도 하나의 고효율 핵산 검출 어레이를 포함하는 검출 챔버로서, 상기 핵산 검출 어레이가 본 명세서에 개시되는 고체 지지체를 포함하고, 상기 챔버가 상기 어레이로부터 검출되는 신호의 신호 배경을 감소시키도록 설정된 검출 챔버;
B) 검출 챔버에 작동적으로 커플링된 열-조절 모듈로서, 모듈이 상기 장치의 작동 동안, 챔버 내의 온도를 조절하는 열-조절 모듈; 및
C) 상기 장치의 작동 동안, 상기 어레이에서 생성되는 신호를 검출하는 광학 트레인 (optical train)을 포함하는 핵산 검출 장치를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은, 그 깊이가 약 500μm 미만인 얇은 챔버를 포함하는 핵산 검출 소비재로서, 챔버가, 윈도우의 내부 표면에 배치된 고 효율 포획 핵산 어레이를 포함하는 광학적으로 투명한 윈도우를 포함하고, 챔버에 유동적으로 커플링된 적어도 하나의 시약 전달 포트를 추가로 포함하며, 상기 소비재가 상기 챔버 내에서 유체의 열순환을 가능하게 하도록 설정되고, 고 효율 포획 핵산 어레이가 본 명세서에 개시되는 고체 지지체를 포함하는 핵산 검출 소비재를 제공한다.
특정 실시형태에서, 표적 분석물 분자는, 병원균, 예를 들어 바이러스, 세균, 변형체 또는 균류의 존재를 시사하는 서열을 가지는 DNA 서열이다.
일부 실시형태에서, 분석물 프로브는 플랩이다. 일부 다른 실시형태에서, 분석물 프로브는 소광제를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 분석물 프로브는 형광단을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 포획 프로브는 형광단을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 프로브는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
고체 지지체는 본 명세서에 개시되는 고체 지지체 중 하나일 수 있다. 또한, 특정 실시형태에서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드이고, 다른 실시형태에서, 표적 분석물 분자는 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, 표적 분석물 분자는 중합 효소 연쇄 반응을 통해 제조된다.
일부 다른 실시형태에서, 신호는 형광 신호이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 형광 신호는 포획 프로브와 표적 분석물 분자의 특이적 혼성화의 결과로서 생성된다.
다른 관련 실시형태에서, 본 발명은 샘플에서, 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 본 발명의 고체 지지체의 포획 프로브에 의한 분석물의 포획을 가능하게 하는 본 발명의 고체 지지체와 분석물을 접촉시키는 단계 및 분석물의 포획을 검출하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 분석물은 생체 분자, 예를 들어 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 그의 혼성체이다. 다른 실시형태에서, 분석물은 유기 분자, 예를 들어 약제, 약제 후보, 보조인자 또는 대사물이다. 또 다른 실시형태에서, 분석물은 유기 분자, 예를 들어 금속 착물 또는 보조인자이다. 예시적 실시형태에서, 분석물은 표지 프로브인 핵산이다. 또 다른 예시적 실시형태에서, 본 발명은, 후속 단계에서, 분석물의 포획 및 검출에 이용할 수 있는 것으로서, 단백질, 효소, 항체, 항원, 호르몬, 탄수화물, 글리코컨쥬게이트 또는 합성적으로 생성된 에피토프와 같은 합성적으로 생성된 분석물 표적을 공유적으로 고정시키는 반응성 표면을 제공한다.
다양한 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 고체 지지체를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 고체 지지체의 중합체에 고정된 상보적 서열의 핵산에 검출성의 표지 핵산 프로브 단편을 결합시키는 단계를 포함한다. 예시적 방법은
A) 증폭 프라이머 및 검출성의 표지 프로브를 표적 핵산에 혼성화하는 단계;
B) 프라이머 의존적 증폭 반응에서, 표적 핵산의 적어도 일부를 증폭시키는 단계로서, 상기 증폭 반응이 표지 프로브의 분리 및 표지 프로브 단편의 방출을 초래하는 단계; 및
C) 고정 분석 성분에 표지 프로브 단편을 혼성화하는 단계로서, 상기 성분이 상기 표지 프로브 단편에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산인 단계를 포함한다.
분석물의 검출은 임의의 업계-인지 방법 또는 장치에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 분석물은 고체 지지체에 고정된 분석물 또는 프로브로부터 발생된 형광 신호에 의해 검출된다. 예시적 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 핵산 어레이이며, 고체 지지체의 중합체 상에 고정된 분석 성분에 혼성화된 형광 표지 핵산으로부터 신호가 발생된다.다양한 실시형태에서, 고정된 분석 성분은 형광 표지 핵산의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 가지는 핵산이다. 분석물이 형광 표지되는 선택 실시형태에서, CCD 어레이와 같은 형광 검출기에 의해 검출이 이루어진다. 특정 실시형태에서, 상기 발명은, 고체 지지체의 하나 이상의 고려가능한 위치에 샘플을 적용하여, 샘플에서, 특정 종류의 분석물 (예를 들어, 핵산과 같은 생체 분자)을 특성화하는 단계 및 상기 고려가능한 위치 또는 위치들에서 포획된 분석물을 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 구현에 유용한 방법의 예에는, 모든 목적을 위해, 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 미국 가특허 출원 제 61/561,198, 및 USSN 13/399,872에 개시된 것들이 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 분석 혼합물에서, 분석물의 분리 및 검출에 유용하다. 특히, 본 발명의 고체 지지체는, 이로 제한되는 것은 아니나, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR), 크로마토그래프 포획, 면역분석, 경쟁적 분석, DNA 또는 RNA 결합 분석, 형광 인 시튜 혼성화 (FISH), 단백질 및 핵산 특성화 분석, 샌드위치 분석 등을 포함한 실질적으로 임의의 포맷의 분석의 수행에 유용하다. 하기 논의는 예시적 분석의 실시를 위해, 본 발명의 고체 지지체의 이용에 집중된다. 이러한 집중은 단지 분명한 설명을 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 정의하거나 또는 제한하기 위한 것이 아니다. 당업자는, 본 발명의 방법이 분석물의 존재 및/또는 양의 검출을 위해, 임의의 분석 기술에 광범위하게 적용가능하다는 것을 이해할 것이다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 고체 지지체를 이용하여, 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 고체 지지체의 반응성 중합체 상에 고정된 상보적 서열의 핵산에, 검출성의 표지 핵산 프로브 단편을 결합시키는 단계를 포함한다. 예시적 방법은
A) 증폭 프라이머 및 검출성의 표지 프로브를 표적 핵산에 혼성화시키는 단계;
B) 프라이머 의존적 증폭 반응에서, 표적 핵산의 적어도 일부를 증폭시키는 단계로서, 상기 증폭 반응이 표지 프로브의 분리 및 표지 프로브 단편의 방출을 초래하는 단계; 및
C) 성분이 상기 표지 프로브 단편에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산인 단계로서, 고정 분석 성분에 표지 프로브 단편을 혼성화하여, 상기 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.
샘플은 임의의 공급원의 것일 수 있으며, 동일하거나 또는 다른 종류의 유기체 또는 유기체의 그룹의 샘플과 같은 생물학적 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 체액 샘플, 예를 들어 혈액 샘플, 혈청 샘플, 림프 샘플, 골수 샘플, 복수 , 흉수, 골반 세척 유체, 안구액, 소변, 정액, 가래, 또는 침일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한, 코, 목, 또는 생식기 표본 (genital swab)의 추출물 또는 분변 물질의 추출물일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한, 종양을 비롯한 기관 또는 조직의 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한, 원핵 생물 및 진핵 생물 세포 양자의 세포주 및 일차 배양액 둘 모두를 포함하여, 배양액의 샘플일 수 있다.
샘플은 체액 또는 토양 또는 음식, 음료, 또는 수원, 산업 소스, 직장 지역, 공공 장소 또는 거주 지역과 같은 환경의 것일 수 있다. 샘플은 추출물, 예를 들어 토양 또는 음식 샘플의 액체 추출물일 수 있다. 샘플은 가공품, 예를 들어 도구, 의류, 가공품 또는 기타 물질의 표본의 세척 또는 소킹 (soaking) 또는 현탁에 의해 제조되는 용액일 수 있다. 샘플은 또한 바이오 전쟁 약제, 예를 들어 인지 또는 미지의 기원의 분말 또는 액체의 샘플의 확인을 위한 샘플을 포함한다.
샘플은 비처리 또는 처리 샘플일 수 있다; 처리는 샘플의 분석을 용이하게 하기 위해, 샘플의 성분의 순도, 농도 또는 접근성을 증가시키는 단계를 포함할 수 있다. 비제한 예로서, 가공은 샘플 부피의 감소, 샘플 성분의 제거 또는 분리, 샘플 또는 하나 이상의 샘플 성분의 용해 또는 샘플 성분의 파괴, 변형, 노출, 방출 또는 분리의 단계들을 포함할 수 있다. 이러한 절차의 비제한 예에는 원심분리, 침전, 여과, 균질화, 세포 용균, 항체 결합, 세포 분별 등이 있다. 예를 들어, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 샘플은, 예를 들어 적혈구 세포의 제거, 하나 이상의 세포 또는 바이러스 유형 (예를 들어, 백혈구 세포 또는 병원균 세포)의 선별, 농축 또는 세포의 용균 등에 의해, 적어도 부분적으로 처리된 샘플이다.
예시적 샘플에는 적어도 부분적으로 정제된 핵산 분자의 용액이 포함된다. 핵산 분자는 단일 공급원 또는 다중 공급원의 것일 수 있으며, DNA, RNA, 또는 양자 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자의 용액은 세포 용균, 농축, 추출, 침전, 핵산 선택 (예를 들어, 폴리 A RNA 선택 또는 Alu 요소를 포함하는 DNA 서열의 선택) 또는 하나 이상의 효소에 의한 처리의 단계 중 임의의 것에 적용된 샘플일 수 있다. 샘플은 합성 핵산 분자를 포함하는 용액일 수 있다.
예시적 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체를 핵산의 검출 및/또는 특성화에 이용하는 경우, 본 발명의 고체 지지체는 상기 고체 지지체의 인지 위치에서 표면-결합 중합체에 공유 결합된 다른 서열의 복수의 핵산을 가지는 핵산 어레이이다. 다양한 실시형태에서, 고체 지지체는, PCR이 분석 혼합물에 포함된 표적 핵산 샘플에서 수행되는 반응 용기의 성분이다. 예시적 방법에서, 하나 이상의 핵산 프라이머 및 검출성 표지 핵산 프로브는 표적 핵산에 혼성화된다. PCR 주형 연장 과정 동안, 프로브는 분리되어, 프로브 단편이 생성된다. 프로브 단편은 표면 결합 중합체에서, 핵산인 고정 분석물 성분에 의해 포획된다. 프로브 서열은 어레이에서 결합 위치에 의해 결정된다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 분석 혼합물에서, 하나 이상의 종류의 검출을 위한 다중 분석의 성분으로서 이용된다. 본 발명의 고체 지지체는 복합형 검정 및 분석의 수행시, 특히 유용하다. 예시적 다중 검정에서, 2 이상의 개별 종류 (또는 하나 이상의 종류의 영역)가 2 이상의 프로브에 의해 검출되고, 여기서 각각의 프로브는 다른 형광단에 의해 표지된다. 본 발명의 고체 지지체는, 하나 이상의 검출성 표지 프로브 구조가 분석에 이용되는 다중 분석의 설계를 가능하게 한다. 본 발명의 고체 지지체를 이용한 다양한 상이한 다중 분석이 당업자에게 분명할 것이다. 하나의 예시적 분석에서, 각각의 적어도 2 개의 개별 형광단이 표면 고정 핵산으로의 핵산 프로브 단편의 단일 혼성화에 이용된다.
본 발명의 방법의 실시에 이용되는 예시적 표지 프로브에는 핵산 프로브가 있다. 유용한 핵산 프로브에는, 액체상 또는 고체상 (예를 들어, 어레이) 분석에서, 표적의 직접적 검출뿐만 아니라, 5'-뉴클레아제 분석, 가닥 변위 증폭 (SDA), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 롤링 서클 증폭 (RCA)을 비롯한 다양한 DNA 증폭/정량화 전략에서 검출제의 성분으로서 이용될 수 있는 것들이 포함된다. 또한, 고체 지지체 및 올리고머는, 예를 들어 분자 비콘 (molecular beacon), Scorpion 프로브™, Sunrise 프로브™, 입체 형태 지원 프로브 (conformationally assisted probe), 라이트 업 프로브 (light up probe), 인베이더 검출 프로브 (Invader Detection probe) 및 TaqMan™ 프로브로부터 선택되는 포맷을 비롯한 실질적으로 임의의 포맷의 프로브에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 모든 목적을 위해, 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 문헌 [Cardullo, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8790-8794 (1988); Dexter, D.L., J. Chem. Physics, 21 :836-850 (1953); Hochstrasser, R.A., et al, Biophysical Chemistry, 45:133-141 (1992) ; Selvin, P., Methods in Enzymology, 246:300-334 (1995); Steinberg, I., Ann. Rev. Biochem., 40:83-114 (1971); Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47:819-846 (1978); Wang, G., et al, Tetrahedron Letters, 31 :6493-6496 (1990); Wang, Y., et al, Anal. Chem., 67:1197-1203 (1995); Debouck, C, et al, in supplement to nature genetics, 21 :48-50 (1999); Rehman, F.N., et al, Nucleic Acids Research, 27:649-655 (1999); Cooper, J.P., et al, Biochemistry, 29:9261-9268 (1990); Gibson, E.M., et al, Genome Methods, 6:995-1001 (1996); Hochstrasser, R.A., et al, Biophysical Chemistry, 45:133-141 (1992); Holland, P.M., et al, Proc Natl. Acad. Sci USA, 88:7276-7289 (1991); Lee, L.G., et al, Nucleic Acids Rsch., 21 :3761-3766 (1993); Livak, K.J., et al, PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Press (1995); Vamosi, G., et al, Biophysical Journal, 71 :972-994 (1996); Wittwer, C.T., et al, Biotechniques, 22:176-181 (1997); Wittwer, C.T., et al, Biotechniques, 22:130-38 (1997); Giesendorf, B.A.J., et al, Clinical Chemistry, 44:482-486 (1998); Kostrikis, L.G., et al, Science, 279:1228-1229 (1998); Matsuo, T., Biochemica et Biophysica Acta, 1379:178-184 (1998); Piatek, A.S., et al, Nature Biotechnology, 16:359-363 (1998); Schofield, P., et al, Appl. Environ. 마이크로biology, 63:1143-1147 (1997); Tyagi S., et al, Nature Biotechnology, 16:49-53 (1998); Tyagi, S., et al, Nature Biotechnology, 14:303-308 (1996); Nazarenko, I.A., et al, Nucleic Acids Research, 25:2516-2521 (1997); Uehara, H., et al, Biotechniques, 26:552-558 (1999); D. Whitcombe, et al, Nature Biotechnology, 17:804-807 (1999); Lyamichev, V., et al, Nature Biotechnology, 17:292 (1999); Daubendiek, et al, Nature Biotechnology, 15:273-277 (1997); Lizardi, P.M., et al, Nature Genetics, 19:225-232 (1998); Walker, G., et al, Nucleic Acids Res., 20:1691-1696 (1992); Walker, G.T., et al, Clinical Chemistry, 42:9-13 (1996); and Compton, J., Nature, 350:91-92 (1991)]을 참조한다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 표적 핵산 서열에서, 다형성 (polymorphism)의 검출 방법을 제공한다. 다형성은 집단에서, 2 이상의 유전적으로 결정된 대안적 서열 또는 대립 유전자의 발생을 의미한다. 다형성 마커 또는 자리는 분기 (divergence)가 발생하는 좌 (locus)이다. 예시적 마커는, 선택 집단의 각각 1% 초과 및 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 초과의 빈도로 발생하는 적어도 2 개의 대립 유전자를 가진다. 다형성 좌는 하나의 염기쌍의 길이일 수 있다. 다형성 마커는 제한 단편 길이 다형성, 가변수의 텐덤 반복 (VNTR), 초가변 영역, 미소부수체 (minisatellite), 디뉴클레오티드 반복, 트리뉴클레오티드 반복, 테트라뉴클레오티드 반복, 단순 서열 반복 및 삽입 요소, 예를 들어 Alu를 포함한다. 확인된 제1 대립 형은 참조 형으로서 임의로 지정되고, 다른 대립 형은 대안적 또는 변이 대립 유전자로서 지정된다. 선택 집단에서, 가장 빈번하게 발생하는 대립 형은 때때로 야생형으로 언급된다. 이배체 유기체는 대립 형의 동형 접합 또는 이형 접합일 수 있다. 이대립 다형성은 2 가지 형을 가진다. 삼대립 다형성은 3 가지 형을 가진다.
예시적 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 단일 뉴클레오티드 다형성의 검출에 이용된다. 단일 뉴클레오티드 다형성은, 대립 서열 사이의 변이 자리인 단일 뉴클레오티드에 의해 발생하는 다형성 자리에서 발생된다. 상기 자리는 일반적으로, 대립 유전자의 고보존 서열 (highly conserved sequences) (1/100 또는 1/1000 미만의 집단원에서 변동되는 서열)의 전 및 후에 존재한다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 일반적으로 다형성 자리의 다른 것의 하나의 뉴클레오티드의 치환에 의해 유발된다. 전이 (transition)는 다른 퓨린에 의한 하나의 퓨린의 대체 또는 또 다른 피리미딘에 의한 하나의 피리미딘의 대체이다. 전환 (transversion)은 피리미딘에 의한 퓨린의 대체 또는 그 역의 경우이다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 또한 참조 대립 유전자에 대해, 뉴클레오티드의 결실 또는 뉴클레오티드의 삽입에 의해 유발될 수 있다.
다형성이 검출되는 실시형태에서, 다형성 핵산은 고려 대상 위치에서, 고체 지지체에 결합된다. 특정 위치에서, 검출성 신호의 발생은 표적 핵산 서열에서 다형성의 존재를 시사한다.
예시적 실시형태에서, 프로브는 형광단 모이어티에 의해 검출가능하도록 표지된다. 하기 참조에 의해 예시되는 바와 같이, 특정 프로브의 적절한 형광단의 선택을 위해, 문헌에서 입수가능한 많은 실질적 지침이 존재한다: 문헌 [Pesce et al, Eds., FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al, FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); 등]. 상기 문헌에는 또한 형광단 선별을 위한, 형광 및 발색 분자 및 그의 관련 광학 특성의 완전한 목록을 제공하는 참조가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, Ed., INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992) Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); 등]을 참조한다). 또한, 하기 참조에 의해 예시되는 바와 같이, 핵산에 첨가되는 통상의 반응 기를 통해, 공유 부착을 위한 형광단 분자의 유도체화를 위한 문헌의 광범위한 지침이 존재한다; 문헌 [Haugland (supra); Ullman et al, U.S. Pat. No. 3,996,345; Khanna et al, U.S. Pat. No. 4,351,760]. 따라서, 예를 들어, 핵산, 펩티드 또는 다른 중합체와 같은 프로브 분자와 이러한 쌍의 구성원의 컨쥬게이션 및 특정 적용을 위한 에너지 교환 쌍의 선택은 당업자의 능력 내이다.
핵산과 소분자의 컨쥬게이션에 관련된 문헌의 잘 발전된 체계의 관점에서, 핵산에 공여체/수용체 쌍을 부착하는 많은 다른 방법은 당업자에 분명할 것이다. 예를 들어, 포스포라미디트 모이어티에 의해 유도체화된 염료 방식에 의한 고체상 합성의 결과, 로다민 및 형광 염료가 핵산의 5'-히드록실에 용이하게 부착된다 (예를 들어, 문헌 [Woo et al, U.S. Pat. No. 5,231,191; and Hobbs, Jr., U.S. Pat. No. 4,997,928]을 참조한다.
더욱 구체적으로, 하기 참조에 의해 예시되는 바와 같이, 핵산의 5'- 또는 3'-말단과 기의 부착을 위한 다양한 링커 모이어티 및 방법론이 존재한다: 문헌 [Eckstein, editor, Nucleic acids and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al, Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321 (1987) (3'-thiol group on nucleic acid); Sharma et al, Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3*-sulfhydryl); Giusti et al, PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) and Fung et al, U.S. Pat. No. 4,757,141 (5'-phosphoamino group via Aminolink TM II available from P.E. Biosystems, CA.) Stabinsky, U.S. Pat. No. 4,739,044 (3-aminoalkylphosphoryl group); Agrawal et al, Tetrahedron Letters, 31 : 1543-1546 (1990) (attachment via phosphoramidites linkages); Sproat et al., Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (5-mercapto group); Nelson et al, Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (3'-amino group) 등].
형광 표지의 검출 수단은 당업자에 잘 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 형광 표지는 적절한 파장의 광에 의한 형광단의 여기 및 생성된 형광의 검출에 의해 검출될 수 있다. 형광은, 사진 필름, 전자 감지기, 예를 들어 전하 커플링 고체 지지체 (CCD) 또는 광전자증배관 등을 이용하여, 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소 표지는 효소의 적절한 기질의 제공 및 생성된 반응 생성물의 검출에 의해 검출될 수 있다.
형광 표지 핵산의 검출에 대한 참조에 의해 예시된다할지라도, 본 발명의 고체 지지체는 분석물 분자의 검출에 유용하다. 중합체가 결합 기에 작용화되는 경우, 고체 지지체는 특정 기에 결합하는 표면 분석물 상에 포획될 것이다. 비결합 물질은 세척될 수 있고, 분석물은, 예를 들어 기체상 이온 스펙트럼법, 광학 방법, 전기화학적 방법, 원자력 현미경 및 무선 주파수 방법을 비롯한 임의의 수의 방법으로 검출될 수 있다. 예시적 광학 방법은, 예를 들어, 검출의 형광, 발광, 화학 발광 (chemiluminescence), 흡광도, 반사율, 투과율, 복굴절률 또는 굴절률 (예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 타원편광법, 수정 진동자 마이크로밸런스, 공진 거울법, 격자 커플러 도파로 방법 (예를 들어, 파장 심문 광 센서 ( "WIOS") 또는 간섭계법 (interferometry))의 검출을 포함한다. 광학 방법은 현미경 (촛점 및 비촛점 둘 모두), 이미징 방법 및 비이미징 방법을 포함한다. 다양한 포맷의 면역분석 (예를 들어, ELISA)은 고체상에 포획된 분석물의 검출을 위한 일반적인 방법이다. 전기화학적 방법은 전압 전류 및 전류 (voltammetry and amperometry) 방법을 포함한다. 무선 주파수 방법은 다극 공명 분광법 또는 간섭계법을 포함한다. 광학 방법 현미경 (촛점 및 비촛점 둘 모두), 이미징 방법과 비이미징 방법을 포함한다. 다양한 포맷의 면역분석 (예를 들어, ELISA)은 고체상에 포획된 분석물의 검출을 위한 일반적인 방법이다. 전기화학적 방법은 전압 전류 및 전류 방법을 포함한다. 무선 주파수 방법은 다극 공명 분광법을 포함한다.
본 발명의 올리고머와 표적 핵산 분자 사이의 혼성화에서 유리한 조건은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있고, 최적의 인큐베이션 온도, 염 농도, 길이 및 올리고뉴클레오티드 유사 프로브의 염기 조성 및 샘플의 핵산 분자 및 올리고머의 농도를 포함한다. 바람직하게는, 혼성화는 6.0 pH 이상에서, 적어도 하나의 밀리몰 마그네슘 이온의 존재 하에 수행된다. 일부 실시형태에서, 혼성화 전에, 핵산 분자가 샘플 단일-가닥이 되도록 샘플을 처리하는 것이 필요하거나 또는 바람직할 수 있다. 이러한 처리의 예에는, 이로 제한되는 것은 아니나, 염기 처리 (바람직하게는 중화 이전), 고온 배양, 또는 뉴클레아제 처리가 포함된다.
또한, 핵산과의 혼성화의 염 의존성이 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 유사체의 골격의 전하 밀도에 의해 주로 결정되므로, 본 발명의 HypNA-pPNA 올리고머 또는 SerNA-pPNA 올리고머에서, pPNA 단량체 비율이 증가되면, 혼성화의 염 의존성이 증가될 수 있다. 이것은, 일부 측면에서, 염 농도의 변화에 의해 혼성화의 엄격성을 증가시키거나, 예를 들어 또는 염 농도를 감소시킴으로써, 혼성화 핵산을 방출시키는 것이 바람직한 본 발명의 방법에 유리하게 이용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 극소량의 염의 존재 하에, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체의 핵산과의 고친화도 결합을 가지는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체에서, HypNA 대 pPNA 단량체대의 비율을 약 1:1로 유지시키는 것이 유리하다.
본 발명의 올리고머의 표적 핵산 분자와의 결합에서의 고도의 특이성은 실행자로 하여금, 실질적으로 상보적 서열 내에 소량의 비상보적 염기를 포함하는 서열 스트레취를 포함하는 표적 핵산 분자 및 하나 이상의 올리고머의 적어도 일부에 완전히 상보적인 서열 스트레취를 포함하는 핵산 서열 사이의 차별화가 유리할 수 있는 혼성화 조건의 선택을 가능하게 한다. 예를 들어, 상보적 서열의 스트레취를 따라 하나 또는 두 개의 염기 미스매치를 포함하는 것을 포함하여, 완전히 상보적이지 않은 표적 핵산 분자 및 본 발명의 올리고머 사이의 혼성체의 해리를 촉진시키나, 서열 스트레취를 따라 완전히 상보적인 표적 핵산 분자 및 본 발명의 올리고머 사이의 안정한 혼성체를 가능하게 하는 혼성화 또는 세척 온도가 선택될 수 있다. 혼성화 및 세척 온도의 선택은 적어도 부분적으로, 기타 조건, 예를 들어 염 농도, 올리고머 및 표적 핵산 분자의 농도, 올리고머 대 표적 핵산 분자대의 상대적 비율, 혼성화되는 올리고머의 길이, 올리고머 및 표적 핵산 분자의 염기 조성, 올리고뉴클레오티드 유사 분자의 단량체 조성에 의존적일 수 있다.
또한, 하나 이상의 염기에 의한 미스매치된 표적 핵산 분자와 올리고머 사이의 안정한 혼성체의 경우 유리하지 않고, 완전히 상보적인 분자의 안정한 혼성체의 경우 유리한 조건의 선택시, 이로 제한되는 것은 아니나, 혼성화되는 율리고뉴클레오티드 유사체의 길이, 올리고머와 표적 핵산 분자 사이의 상보성 서열의 스트레취의 길이, 상보성 서열의 스트레취 내의 비상보적 염기의 수, 미스매치 염기의 정체, 미스매치 염기 주위의 염기의 정체 및 상보성 스트레취를 따라 임의의 미스매치 염기의 상대적 위치를 포함하여, 추가적 조건이 고려될 수 있고, 바람직한 경우, 변경될 수 있다. 핵산 혼성화 분야의 당업자는, 특정 적용에 따라, 표적 핵산 분자와의 혼성화를 위해, 본 발명의 올리고머를 사용하는, 유리한 혼성화 및 세척 조건을 결정할 수 있을 것이다. "유리한 조건"은, 하나 이상의 미스매치를 포함하는 것을 포함하여, 적어도 부분적으로 실질적으로 상보적인 표적 핵산 분자와 올리고머 사이의 유리하고 안정한 혼성체의 조건일 수 있다.
"유리한 조건"은 적어도 부분적으로 완전히 상보적인 표적 핵산 분자와 올리고머 사이의 유리하고 안정한 혼성체의 조건일 수 있으며, 완전히 상보적이지 않은 분자 사이의 혼성체의 경우, 유리하지 않거나 또는 불안정화된다.
본 명세서에 개시되는 것과 같은 방법을 이용하여, 상이한 서열의 표적 핵산 분자에 혼성화된 본 발명의 올리고머의 용융 온도는 주어진 적용에 유리한 조건을 결정하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체에 부착되는 올리고머와 표적 핵산 분자의 혼성화 및 혼성화된 복합체의 검출에 의해, 유리한 혼성화 조건의 경험적 결정이 또한 가능하다.
본 발명의 고체 지지체 또는 올리고머 프로브에 결합되는 표적 핵산 분자는 고체 지지체와 올리고머 프로브의 직접적 또는 간접적 부착에 의해 연구 집단의 비결합 핵산 분자와 편의적이고 효과적으로 분리될 수 있다. 고체 지지체는, 올리고머 프로브에 결합되지 않은 핵산 분자를 고 엄격도로 제거하기 위해 세척될 수 있다. 그러나, 올리고머 프로브의 고체 지지체와의 부착은 본 발명에서 불필요하다. 예를 들어, 일부 적용가능한 결합 및 비결합 핵산 분자는, 올리고머 프로브로의 혼입된 화학 기에 의해 임의로 보조될 수 있는 것으로서, 메트릭스를 통한 원심분리 또는 상분리 또는 일부 기타 분리 형태 (예를 들어, 분별 침전 (differential precipitation))에 의해 분리될 수 있다 (예를 들어, Nie 등에 의한 것으로서, 2000년 5월 9일자로 허여된 미국 특허 제 6,060,242호를 참조한다).
예시적 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 공동 소유된 미국 계류 특허 출원 제 13/399,872호에 개시된 것과 같은 실시간 PCR 분석에서 이용된다.
본 발명의 다른 방법에서, 본 발명은, 본 명세서에서 전술된 A, B 및 C 하위단위를 포함하는 중합체와, (본 명세서에서 전술된 바와 같은) 고체 지지체의 외부 표면에 공유 결합된 아지드 또는 알킨 모이어티를 포함하는 고체 지지체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 그에 결합된 프로브 분자를 가지는 고체 지지체의 제조 방법에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 고체 지지체 및 중합체와 Cu(I) 촉매를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가적 실시형태는, 그에 결합된 프로브 분자를 포함하는 고체 지지체를 제조하기 위해, 그에 결합된 중합체를 포함하는 고체 지지체와 아민 작용 기를 가지는 프로브 분자를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 임의의 수의 적용, 예를 들어 DNA 마이크로어레이의 제조 등에 유용하다.
하기 실시예는 예시 목적으로 제공되는 것으로서, 제한하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
35% DMA의 몰 공급 비에서의 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드-공-펜타플루오로페닐 아크릴레이트), 폴리(DMA-공-PFPA)의 제조 - 일반적 과정
150-mL 둥근 바닥 유리 플라스크에서, 30 mL의 무수 아세토니트릴 중의 2.24 g (22.58 mmol, 35 mol%)의 디메틸아크릴아미드 (DMA), 10.01 g (42.03 mmol, 65 mol%)의 펜타플루오로페닐 아크릴레이트 (PFPA) 및 10.1 mg (0.041 mmol)의 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)의 용액을 약 60 mL/min의 유속에서 초순수 아르곤을 이용하여 퍼징 (거품화)하고, 200 rpm에서 45 분 동안 자기 교반하였다. 그후, 상기 반응 플라스크를 55 ℃의 오일 욕조에서 냉각시켰다. 아르곤 유속을 약 25 mL/min로 감소시키고, 자기 교반을 120 rpm으로 감소시켰다. 중합 반응을 이러한 조건 하에서 19 시간 동안 수행하였다. 점성 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 정밀 검사 전에 주위 대기에 노출시켰다.
아세토니트릴을 30 분 동안 ~55℃의 물 욕조에서 감압 (Rotavap) 하에 제거하고, 잔여 단량체를 59 ℃에서 3 시간 동안 0.5 밀리바의 진공 오븐에서 제거하였다. 중합체 생성물을 공기 중에서, 55 ℃의 오일 욕조에서 교반하면서, 40 mL의 무수 THF에 재용해시켰다. 자기 교반하면서, 용액이 조금 흐려질 때 까지, 약 50 mL의 n-헥산을 적가하였다. 2-L 폴리(프로필렌) Erlenmeyer 플라스크의 1400-mL의 n-헥산에, 건조 질소를 계속하여 쏟아붓고, 탁한 현탁액을 2" PTFE 교반 블레이드를 이용하여 활발하게 교반하면서, 미세 스트림에서, 22-게이지를 통해 첨가하였다. 침전된 중합체를 추가로 5 분 동안 교반한 다음, 추가로 5 분 동안 부드럽게 교반하면서, 600 mL의 새로운 n-헥산으로 옮겼다. 상기 중합체를 또 다른 600 mL의 새로운 n-헥산으로 옮기고, 15 분 동안 담가두었다. 침전된 중합체는 거친 섬유 모양이었다. 이것을 입구가 넓은 500-mL 유리 병으로 옮기고, 55 ℃에서 22 시간 동안 진공 건조하여, 10.6792 g (87.1 % 수율)의 폴리(DMA-공-PFPA)를 제공하였다. 정량 19F-NMR에 의해, PFPA의 몰 혼입 비율이 67% (추정상 DMA 33%)이고, 에스테르 가수분해 정도가 1.4%인 것으로 나타났다.
중합 반응을 위한 이러한 일반적 과정은 임의의 바람직한 비율의 희석제 및 반응성 단량체를 가지는 동종중합체, 공중합체 및 삼중합체의 제조에 적용할 수 있다.
실시예 2
39% DMA의 몰 공급 비율에서, 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드-코-펜타플루오로페닐 아크릴레이트), 폴리(DMA-코-PFPA)의 제조
상기 일반적 과정을 따랐다. 150-mL 둥근 바닥 유리 플라스크에서, 30 mL의 무수 아세토니트릴 중의 2.5816 g (26.043 mmol, 39 mol%)의 DMA, 9.7003 g (40.740 mmol, 61 mol%)의 PFPA 및 10.6 mg (0.043 mmol)의 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)의 용액을 초순수 아르곤을 이용하여 약 60 mL/min의 유속에서 퍼징 (거품화)하고, 200 rpm에서 45 분 동안 자기 교반하였다. 그후, 상기 반응 플라스크를 55 ℃의 오일 욕조에서 냉각시켰다. 아르곤 유속을 약 25 mL/min로 감소시키고, 자기 교반을 120 rpm으로 감소시켰다. 중합 반응을 이러한 조건 하에서 19 시간 동안 수행하여, 10.42 g (84.8 % 수율)의 폴리(DMA-코-PFPA)를 제공하였다. 정량 19F-NMR에 의해, PFPA의 몰 혼입 비율이 58% (추정상 DMA 42%)이고, 에스테르 가수분해가 1.9%인 것으로 나타났다.
실시예 3
15% DMA의 몰 공급 비율에서, 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드-코-펜타플루오로페닐 아크릴레이트), 폴리(DMA-코-PFPA)의 제조
상기 일반적 과정을 따랐다. 150-mL 둥근 바닥 유리 플라스크에서, 30 mL의 무수 아세토니트릴 중의 0.6090 g (6.143 mmol, 15 mol%)의 DMA, 8.2395 g (34.605 mmol, 85 mol%)의 PFPA 및 10.6 mg (0.043 mmol)의 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)의 용액을 초순수 아르곤을 이용하여 약 60 mL/min의 유속에서 퍼징 (거품화)하고, 200 rpm에서 45 분 동안 자기 교반하였다. 그후, 상기 반응 플라스크를 55 ℃의 오일 욕조에서 냉각시켰다. 아르곤 유속을 약 25 mL/min로 감소시키고, 자기 교반을 120 rpm으로 감소시켰다.
중합 반응을 이러한 조건 하에서 6 시간 동안 수행하여, 7.908 g (89.4 % 수율)의 폴리(DMA-코-PFPA)를 제공하였다. 정량 19F-NMR에 의해, PFPA의 몰 혼입 비율이 87% (추정상 DMA 13%)이고, 에스테르 가수분해가 1.7%인 것으로 나타났다.
실시예 4
34% DMA 몰 공급 비율에서, 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드-코-아크릴아미드-공- 펜타플루오로페닐 아크릴레이트), 폴리(DMA-코-AAM-코-PFPA)의 제조
상기 일반적 과정을 따랐다. 150-mL 둥근 바닥 유리 플라스크에서, 30 mL의 무수 아세토니트릴 중의 2.1500 g (21.689 mmol, 34 mol%)의 DMA, 2304 g (3.241 mmol, 5 mol%)의 AAm, 9.2504 g (38.851 mmol, 61 mol%)의 PFPA 및 9.9 mg (0.040 mmol)의 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)의 용액을 초순수 아르곤을 이용하여 약 60 mL/min의 유속에서 퍼징 (거품화)하고, 200 rpm에서 45 분 동안 자기 교반하였다. 그후, 상기 반응 플라스크를 55 ℃의 오일 욕조에서 냉각시켰다. 아르곤 유속을 약 25 mL/min로 감소시키고, 자기 교반을 120 rpm으로 감소시켰다. 중합 반응을 이러한 조건 하에서 23 시간 동안 수행하여, 10.351 g (88.9 % 수율)의 터폴리(DMA-공-AAm-공-PFPA)를 제공하였다. 정량 19F-NMR에 의해, PFPA의 몰 혼입 비율이 59% (추정상 DMA+아크릴아미드 41%)이고, 에스테르 가수분해가 3.5%인 것으로 나타났다.
실시예 5
15% AAM의 몰 공급 비율에서, 폴리(아크릴아미드-코-펜타플루오로페닐 아크릴레이트, 폴리(AAM- CO-PFPA)의 제조
상기 일반적 과정을 따랐다. 150-mL 둥근 바닥 유리 플라스크에서, 20 mL의 무수 아세토니트릴 중의 0.2123 g (2.987 mmol, 14.8 mol%)의 아크릴아미드 (AAm), 4.0921 g (17.186 mmol, 85.2 mol%)의 PFPA 및 4.7 mg (0.019 mmol)의 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)의 용액을 초순수 아르곤을 이용하여 약 60 mL/min의 유속에서 퍼징 (거품화)하고, 200 rpm에서 45 분 동안 자기 교반하였다. 그후, 상기 반응 플라스크를 55 ℃의 오일 욕조에서 냉각시켰다. 아르곤 유속을 약 25 mL/min로 감소시키고, 자기 교반을 120 rpm으로 감소시켰다. 중합 반응을 이러한 조건 하에서 19 시간 동안 수행하였다. 용매 및 잔여 PFPA를 30 분 동안 ~55℃ 물 욕조 온도에서 감압 (Rotavap) 하에 및 55 ℃에서 3 시간 동안 0.5 밀리바의 진공 오븐에서, 제거하였다. 중합체 생성물을, 55 ℃의 오일 욕조에서 자기 교반 막대를 이용하여 계속적으로 교반하면서, 20 mL의 무수 THF 중에 재용해시켰다. 계속적으로 교반하면서, 45 mL의 n-헥산을 적가하여, 조금 탁한 용액을 제공하였다. 2-L 유리 Erlenmeyer 플라스크의 1200-mL의 n-헥산에, 건조 질소를 계속하여 쏟아붓고, 탁한 현탁액을 2" PTFE 교반 블레이드를 이용하여 활발하게 교반하면서, 미세 스트림에서, 22-게이지를 통해 첨가하였다. 침전된 중합체를 흡입 여과하고, 충분한 양의 n-헥산 (~400 mL)으로 세정한 후, 흡입 공기 건조하고, 55 ℃에서 밤새 진공 건조하여, 3.24 g (75.1 % 수율)의 폴리(AAm-코-PFPA)를 제공하였다. 공중합체는 아세토니트릴, 아세톤, THF 및 클로로포름에 용해된다.
실시예 6
폴리(펜타플루오로페닐 아크릴레이트) (폴리(PFPA))의 제조
상기 일반적 과정을 따랐다. 150-mL 둥근 바닥 유리 플라스크에서, 30 mL의 무수 아세토니트릴 중의 12.0033 g (50.413 mmol)의 PFPA 및 9.9 mg (0.040 mmol)의 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)의 용액을 초순수 아르곤을 이용하여 약 60 mL/min의 유속에서 퍼징 (거품화)하고, 200 rpm에서 45 분 동안 자기 교반하였다. 그후, 상기 반응 플라스크를 55 ℃의 오일 욕조에서 냉각시켰다. 아르곤 유속을 약 25 mL/min로 감소시키고, 자기 교반을 120 rpm으로 감소시켰다. 중합 반응을 이러한 조건 하에서 18 시간 동안 수행하였다.
18 시간 마지막에, 용매 및 잔여 단량체를 30 분 동안 ~55℃ 물 욕조에서 감압 (Rotavap) 하에 및 55 ℃에서 5 시간 동안 제거하였다. 중합체 생성물을, 55 ℃의 오일 욕조에서 공기 중에서 교반하면서, 30 mL의 무수 THF 중에 재용해시켰다. 자기 교반하면서, 용액이 조금 탁해질때 따지, 약 15 mL의 n-헥산 적가하였다. 2-L 폴리(프로필렌) Erlenmeyer 플라스크의 1200-mL의 n-헥산에, 건조 질소를 계속하여 쏟아붓고, 탁한 현탁액을 2" PTFE 교반 블레이드를 이용하여 활발하게 교반하면서, 미세 스트림에서, 22-게이지를 통해 첨가하였다. 침전된 중합체를 500 mL의 새로운 n-헥산으로 옮기고, 추가로 10 분 동안 교반하였다. 그후 상기 중합체를 또 다른 500 mL의 새로운 n-헥산으로 옮긴 후, 15 분 동안 담가두었다. 침전된 중합체는 거친 섬유 모양이었다. 이것을 입구가 넓은 500-mL 유리 병으로 옮기고, 55 ℃에서 22 시간 동안 진공 건조하여, 9.96 g (83.0 % 수율)의 폴리(PFPA)를 제공하였다. 동종중합체는 물에 불용성이고, 아세토니트릴에는 조금 용해되나, THF, 아세톤 및 클로로포름에는 쉽게 용해된다.
정량 19F-NMR에 의해, PFPA의 몰 혼입 비율이 100.9%의 계산치 (NMR 감도 범위 내)인 것으로 나타났, 에스테르 가수분해는 검출되지 않았다.
실시예 7
플라스틱 기판 표면 상으로의 중합체의 공유적 고정화 - 일반적 과정
플라스틱 기판 표면 상에 산소화된 작용 기를 도입하기 위해, 1" 선형 플라즈마 공급원 (Surfx Technologie, Culver, CA), 및 X-Y Robot, F4200N, (Fisnar, Wayne, NJ)이 장착된 대기압 산소 플라즈마 발생기, ATOMFLO™ 모델 400을 이용한다. 최대 4 mm 이상의 플라즈마 공급원에 직면 처리될 표면을 가지는 로봇의 알루미늄 스캐닝 플랫폼 상에, 플라스틱 샘플을 배치한다. 60 W, 각각 15 L/min 및 0.05 L/min의 헬륨 및 산소 유속에서 플라즈마를 발생시킨다. 플라즈마 공급원은 20 mm/초의 속도로 기판 표면을 가로질러 스캐닝한다. 히드록실, 카르보닐, 및 카르복실 작용 기의 표면 밀도를 조정하기 위해, 스캐닝 수를 1 내지 10배로 변동시킨다.
플라즈마-처리 기판 샘플을 코팅 중합체 및 염기 촉매의 아세토니트릴 또는 아세톤 용액에 담가 두고, 주위 온도에서, 2 내지 20 시간 동안 부드럽게 텀블링시킨다. 기판 샘플을 충분한 양의 아세토니트릴 또는 아세톤에 의해 세정하여 제거하고, 질소를 이용하여, 바람 건조시킨다.
실시예 8
COP 기판 상의 폴리(DMA-코-PFPA), 35:65 MOL%의 DMA:PFPA의 공유적 고정화
중합체의 공유적 고정화를 위한 일반적 과정 후, 플라즈마 스캐닝을 3 회 실시한다. 4 개의 플라즈마-처리 COP 기판 샘플 (칩), 67 mm x 25 mm x 1.0 mm을 15.0μL의 트리에틸아민 및 87.3 mg의 35:65 mol% DMA:PFPA 공중합체를 포함하는 25 mL의 무수 아세토니트릴 용액에 담가 둔다. 19 시간 동안 부드럽게 텀블링시킨 후, COP 기판을 충분한 양의 아세토니트릴에 의해 세정하여 제거하고, 바람 건조시킨다. 중합체 고정 표면은 69.4 ± 0.8 도 (n=9)의 물 접촉각을 나타낸다.
유사한 조건 하에서, 4 개의 플라즈마-처리 COP 기판 칩을 16.2μL의 N,N-디메틸벤질아민, 및 87.3 mg의 35:65 mol% DMA:PFPA 공중합체를 포함하는 25 mL의 무수 아세토니트릴 용액에 담가 둔다. 아세토니트릴에 의한 세정 및 바람 건조 후, 중합체-고정 표면은 89.5 ± 0.6 도 (n=8)의 물 접촉각을 나타낸다.
실시예 9
COP 기판 칩 상의 폴리(PFPA)의 공유적 고정화
중합체의 공유적 고정화를 위한 일반적 과정 후, 플라즈마 스캐닝을 3 회 실시한다. 4 개의 플라즈마-처리 COP 기판 샘플 (칩), 67 mm x 25 mm x 1.0 mm을 15.0μL의 트리에틸아민 및 86.7 mg의 PFPA 동종중합체를 포함하는 25 mL의 아세톤 용액에 담가 둔다. 기타 용매, 예를 들어 아세토니트릴을 사용할 수 있다. 17 시간 동안 부드럽게 텀블링시킨 후, COP 기판 칩을 제거하고, 충분한 양의 아세톤으로 세정한 후, 바람 건조한다. 중합체-고정 표면은 78.8 ± 0.8 도 (n=10)의 물 접촉각을 나타낸다.
유사한 조건 하에서, 4 개의 플라즈마-처리 COP 기판 칩을 16.2 μL의 N,N-디메틸벤질아민, 및 86.7 mg의 PFPA 동종중합체를 포함하는 25 mL의 아세톤 용액에 담가 둔다. 아세톤에 의한 세정 및 바람 건조 후, 중합체-고정 표면은 86.7 ± 0.5 도 (n=6)의 접촉각을 나타낸다.
유사한 조건 하에서, 12 개의 플라즈마-처리 COP 기판 칩을 팔라즈마에 의해 1 회만 사전 처리한다. 1 세트의 4 개의 이들 사전 처리 COP 기판 칩을 16.2 μL의 N,N-디메틸벤질아민 및 86.0 mg의 PFPA 동종중합체를 포함하는 25 mL의 아세톤 용액에 담가 둔 후, 16 시간 동안 주위 온도에서 턴블링시킨다. 아세톤에 의한 세정 및 바람 건조 후, 중합체-고정 표면은 83.6 ± 0.4 도 (n=18)의 접촉각을 나타낸다.
실시예 10
COP 기판 칩 상의 터폴리(AC YL아미드-코-DMA-공-PFPA), 5:34:61 MOL%의 AAM:DMA:PFPA의 공유적 고정화
중합체의 공유적 고정화를 위한 일반적 과정 후, 플라즈마 스캐닝을 3 회 실시한다. 4 개의 플라즈마-처리 COP 기판 샘플 (칩), 67 mm x 25 mm x 1.0 mm을 15.0μL의 트리에틸아민 및 87.3 mg의 터폴리(AAm-공-DMA-공-PFPA)를 포함하는 25 mL의 무수 아세토니트릴 용액에 담가 둔다. 기타 용매, 예를 들어 아세토니트릴을 사용할 수 있다. 17 시간 동안 부드럽게 텀블링시킨 후, COP 기판 칩을 제거하고, 충분한 양의 아세토니트릴로 세정한 후, 바람 건조한다. 중합체-고정 표면은 76.7 ± 0.6 도 (n=7)의 물 접촉각을 나타낸다.
유사한 조건 하에서, 4 개의 플라즈마-처리 COP 기판 칩을 16.2μL의 N,N-디메틸벤질아민, 및 87.3 mg의 터폴리(AAm-코-DMA-코-PFPA)를 포함하는 25 mL의 무수 아세토니트릴 용액에 담가 두어, 77.5 ± 0.2 도 (n=6)의 물 접촉각을 가지는 중합체-고정 표면을 제공한다.
실시예 11
COP 기판 칩 상의 폴리(아크릴아미드-코-PFPA), 15:65 MOL%의 AAM:PFPA의 공유적 고정화
중합체의 공유적 고정화를 위한 일반적 과정 후, 플라즈마 스캐닝을 3 회 실시한다. 4 개의 플라즈마-처리 COP 기판 샘플 (칩), 67 mm x 25 mm x 1.0 mm을 16.2μL의 트리에틸아민 및 85.8 mg의 폴리(AAm-코-PFPA)를 포함하는 25 mL의 아세톤 용액에 담가 둔다. 기타 용매, 예를 들어 아세토니트릴을 사용할 수 있다. 20 시간 동안 부드럽게 텀블링시킨 후, COP 기판 칩을 제거하고, 충분한 양의 아세톤으로 세정한 후, 바람 건조한다. 중합체-고정 표면은 82.5 ± 0.5 도 (n=18)의 물 접촉각을 나타낸다.
실시예 12
반응성 중합체-코팅 고체 지지체의 암모니아 캡핑 과정
과정:
50mM 암모늄 히드록사이드 및 lOOmM 트리에틸아민을 포함하는 수용액을 제조하였다. 상기 용액 (25mL)의 일부를 4 조각의 중합체 지지체 슬라이드, 1" x 3" x 0.04" 중합체-코팅 COP (시클릭 올레핀 중합체) 슬라이드를 포함하는 30mL 나사 상부 폴리프로필렌 슬라이드 튜브에 부었다. 기판 표면 상에 반응성 중합체를 히드록실 기에 공유 결합시킴으로써 (에스테르 결합 형성을 위해), 전술된 바와 같이, 슬라이드를 제조하고, 포획 프로브 마이크로어레이를 이용하여 사전 스포팅 (spotting)한 후, 세척하지 않았다. 튜브를 밀봉하고, 1 시간 동안 60℃의 물 욕조에 배치한 후, 암모니아 용액을 옮겨 붓고, 물로 교체하였다. 1 분 후, 슬라이드를 제거하고, 추가적 물에 의해 세정한 후, 질소 스트림 하에서 바람 건조하였다. 캡핑된 슬라이드 표면에서, 약 8 도의 평균 물 접촉각 (WCA) 측정치가 획득되었다. 캡핑 전 중합체-코팅 슬라이드 지지체의 평균 물 접촉각 (WCA)은 86 도이었다. 각각의 4 조각의 고체 지지체 슬라이드에서, 3 회 측정의 평균으로서 각각의 물 접촉각을 얻었다.
암모니아 캡핑의 최적화:
추가적 캡핑을 위한 파라미터를 결정하기 위해, 각각 lOOmM 트리에틸아민을 포함하는, lOOmM 또는 500mM 암모늄 히드록사이드를 포함하는 용액을 제조하였다. 4 개의 다른 온도 20℃, 60℃, 75℃, 및 95℃에서, 1 시간 동안만 물이 포함된 튜브의 각각의 이들 용액 중에서, 고체 지지체 슬라이드를 캡핑하였다. 표 1은 1 시간 동안 4 개의 침수 온도에서, 일정 범위의 시약 농도에서, 65 mol% PFPA 및 35 mol% DMA를 가지는 공중합체를 이용하여 제조된 고체 지지체 슬라이드의 데이터를 제시한다.
캡핑 전 물 접촉각은 86 도이었다. 임의의 온도에서, 500mM 암모니아에 의해, 최종 물 접촉각에서 미세한 차이가 얻어졌다 (8 도 내지 10 도). 20℃에서, 시약 농도 의존성이 관찰되며, 50mM 암모니아는 물 접촉각에 거의 영향이 없고, 500mM은 최대 변화 (최소 물 접촉각)에 영향을 주며, lOOmM은 중간 물 접촉각 (50 도)을 생성시킨다. 60℃ 이상의 온도에서, 암모니아 농도에 무관하게, 최대 물 접촉각 변화가 얻어진다. 물 처리 단독의 경우, 최고 온도 (T = 95℃, 물 접촉각 = 55 도)의 경우를 제외하고, 물 접촉각을 현저히 변화시키지 않는다. 표 1에 제시된 각각의 물 접촉각은 각각의 4 개의 고체 지지체 슬라이드의 3 회의 개별 측정치의 평균이다. 표 1의 데이터 (도 6에 그래프로 제시됨)는 일정한 범위의 시약 농도 및 침수 온도에서, 폴리(PFPA-공-DMA), 67.5 % PFPA 및 32.5% DMA에 의해 고정된 COP 슬라이드를 이용하여 캡핑된 암모니아의 최종 WCA에 대한 영향을 제시한다. 캡핑 전의 WCA는 86°이었다.
표 1
Figure pct00048
캡핑 후 당해 고체 지지체의 WCA는 캡핑 후 현재 알고 있는 고체 지지체의 WCA 보다 현저하게 작다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 당해 고체 지지체의 작은 WCA는 적어도 부분적으로, 캡핑 조건 하의 공유 연결 (W)의 안정성에 관련된 것으로 생각된다. 현재 입수 가능한 고체 지지체는 불안정한 상이한 연결 (예를 들어, UV 활성화에 의해 형성됨)을 포함하고, 이러한 지지체의 캡핑은 기판으로부터 중합체의 분리를 초래하고, 따라서, (더 많은 기판 표면 영역이 노출되므로) WCA가 증가할 것으로 생각된다. 상기에서 지적된 바와 같이, 당해 고체 지지체와 관련된 WCA의 감소는 PCR의 용해 및/또는 고체 지지체와 조합하여 사용되는 기타 분석 시약을 포함하여, 다양한 관점에서 유리하다.
실시예 13
중합체의 NMR 분석
공중합체 또는 삼중합체에서 단량체의 공급 비율은 중량 또는 부피 측정에 의해 알 수 있고, 생성물에 혼합된 단량체의 실제 비율은 변동될 수 있으며, 합성 후 결정되어야 한다. 각각의 중합체 배취를 1H, 13C, 및 정량 19F NMR에 의해 특성화한다; 각각의 NMR 방법은 최종 생성물에 대한 주요 정보를 제공한다. 실험적 파라미터, 스펙트럼의 예 및 얻어진 정보는 하기에서 논의된다. 펜타플루오로페닐 아크릴레이트-포함 중합체는 일반적으로 클로로포름-d (CDCl3)에 잘 용해되고, 일반적으로, 화학 이동의 예측이 가능하고, 실온 선폭이 최적이기 때문에, 이러한 용매가 바람직하다.
1 H-NMR
양성자 스펙트럼을 400MHz에서 수집한다. 디메틸아크릴아미드 (또는 아크릴아미드)와 펜타플루오로페닐 아크릴레이트의 공중합체를 넓은 피크에 의해 유형화되며, 중합체 골격 및 아미드 신호가 생성되는 δ1-4 ppm 영역에서의 신호 중첩으로인해, 배정될 수 없다. 또한 플루오르화 단량체는 아릴 고리 상에 양성자를 보유하지 않으며, 따라서 단지 골격 신호에만 기여한다. 그러나, 양성자 스펙트럼은, 이들이 만약 존재한다면, δ5-7 ppm 영역에서, 가는 피크로서, 비반응 단량체의 존재를 밝히기 때문에 유용하다. 샘플 내의 물은 δ1.6 ppm에서 클로로포름의 가는 피크로서 관찰될 수 있다. 미량의 처리 용매, 예를 들어 헥산에 의한 중합체의 오염이 또한 가는 신호로서 관찰될 수 있다. 오염물로부터 발생하는 모든 신호는 공중합체의 전제 순도의 평가를 위해, 통합 (incorporation)될 수 있다. 허용가능한 중합체는 0.5 mol% 미만의 총 단량체 함량을 포함할 것이다. 미량의 용매, 예를 들어 헥산은 후속 사용 과정 동안, 중합체 농도의 정확한 평가시 외에는 고려되지 않는다.
13 C-NMR
30 도의 4.4 μsec의 펄스 폭의 소해폭 (소해폭) 및 1.5 초 펄스 지연으로, 양성자 탈커플링된 것으로서, 100MHz에서 탄소 스펙트럼을 얻는다. 500uL 용매 중의 50mg 중합체의 통상의 샘플은 각각의 단량체 (δ165-175 ppm)의 카르보닐 탄소 (아미드 및 에스테르)의 반정량적 관찰을 가능하게 하는 것으로서, 16K 스캔을 필요로 할 것이다. 양성자 스펙트럼과 달리, 중합체의 13C 선폭은 또한 3 가지 유형의 플루오르화 탄소의 배열을 가능하게 하고, 골격 탄소의 아미드에서 메틸 피크를 차별화하기에 충분히 좁다.
19 F-NMR
플루오르 스펙트럼을 45 도에서 비양성자 탈커플링된 것으로서, 소해폭 90K, 및 펄스 폭 7.8 μsec, 376MHz에서 수집한다. 정량적 분석을 위해, 60 초의 펄스 지연의 32 스캔이 필요하다. 일반적인 샘플은 내부 표준으로서, 2-3 mg의 플루오로벤젠을 포함하는 500 uL CDCl3 중에 20-30 mg 중합체로 이루어진다. 공급 비율을 토대로, 단위 평균 단량체 FW (Mc)는 Mc = a(Mp) + b(Md) (Mp는 반응성 공단량체 단편의 FW이고 (PFPA의 경우, 238.11), Md는 희석제 공단량체 단편의 FW이고 (DMA의 경우, 99.13), a 및 b는 중합 반응 용액의 몰 분율이다 (a + b = 1))에 의해 계산된다. 알고 있는 샘플 중량 (및 첨가된 플루오로벤젠의 중량) 및 특정 PEPA 공급 비율의 계산된 단위 FW를 토대로, 중합체에 혼입된 실제 플루오르가 측정될 수 있다. 중합체가 삼중합체 포함 아크릴아미드뿐만 아니라, 디메틸아크릴아미드인 경우, 소 단위 FW 보정 계수 (correction factor)가 적용된다; 그러나, 단지 PFPA 혼입 백분율만이 NMR에 의해 추론될 수 있다. 또한, 플루오르 스펙트럼은, 유리 펜타플루오로페놀 공명이 일반적으로 가늘고, 중합체 플루오르 신호로부터 잘 분리되며, 따라서 나머지 활성 에스테르 함량의 정량적 평가를 가능하게 하므로, 임의의 에스테르 가수분해의 관찰시 유용하다. PFPA 중합체의 경우, 19F 신호는 넓으나, 용이한 통합 피크로서, δ -152 (2F), -157 (IF), 및 -162 (2F) ppm 주위에서 발생하고, 펜타플루오로페놀 피크는 가는 다중으로서, δ -161 (2F), -165 (2F), 및 -171 (IF) 주위에서 나타난다. 내부 플루오로벤젠 표준은 δ -112 ppm 주위에서, 좁은 복합 다중으로서 나타난다.
예시적 분석
예로서, 몰 공급 비율 85:15의 PFPA-DMA 공중합체는 91.7 μmol PFP 기에 해당하는 총 통합 플루오르 신호를 제공한다 (알고 있는 양의 플루오로벤젠의 첨가를 토대로 함). 이 조성의 공중합체의 경우, 평균 단량체 FW=217.5, 및 23.2 mg의 샘플은 106.7 μmol의 단량체 단위를 나타낸다. 계산된 단위 FW에 의해 mol PFP를 나누어, (91.7/106.7) = 0.86, 또는 86% PFPA가 통합된다. 그러나, 공중합체 조성이 87% PFPA라고 가정한다면, 약간 높은 평균 단량체 단위 FW는 NMR 관찰된 플루오르 함량에 정확히 일치하는 통합 %, 즉 (91.68/105.5) = 87% PFPA를 제공한다; 따라서, 실제 통합율은 87% PFPA이다.
이 실시예의 19F NMR가 도 3에 제시된다.
실시예 14
올리고뉴클레오티드 어레이 및 장치의 제조
50 mM 인산 나트륨 (pH 8.5) 중의 20 μΜ 아민-변형 올리고뉴클레오티드 스포팅 용액을 384-웰 플레이트에 준비한다. 그후, 원하는 스팟 크기를 위해 선택된 적절한 스포팅 핀을 이용하여, 어레이 스포터 (Arrary-it SpotBot3)에 의해, 원하는 패턴의 상기에서 제조된 고체 지지체에 올리고를 스포팅한다. 2개의 어레이를 슬라이드 길이의 ¼ 및 ¾, 슬라이드 폭에 있어서 중앙 지점에서 슬라이드 당 스포팅한다. 스포팅 후, 슬라이드를 4-18 시간 동안, 75% 상대 습도에서 인큐베이션시키고, DI 물 스트림으로 세정한 후, 아르곤으로 바람 건조한다.
건조 후, 슬라이드를 그 절반을 절단하여, 각각의 중앙의 스포팅 어레이를 가지는 2 개의 1" x 1.5" 칩을 생성시킨다. 스포팅 슬라이드가 기저부에 형성되는 소 단일-챔버 장치를 조립한다. 적절한 치수의 사전-절단 이중-측면 PSA 개스킷 (gasket)을 슬라이드에 배치하고, 어레이-스포팅 부분을 그 주위에 고정 치수의 거친 원형 영역을 따라 노출시킨다. 이 개스킷의 상부에서, 2 개의 예비-드릴 충전 포트 (pre-drilled filling port)가 구비된 폴리카보네이트 뚜껑을 배치한다. 열순환 과정 동안, 적절한 부착을 보장하기 위해, 생성된 조립체를 실온에서 적층시킨다.
프라이머 및 프로브 믹스, 완충액, 효소 및 표적 DNA를 포함하는 다중 PCR 용액을 튜브에 사전혼합한 다음, 전술된 챔버에 첨가한다. 일반적인 반응 챔버의 용적은 25-40 μL이다. PCR 반응 용액의 첨가 후, 칩 폴리카보네이트의 포트 내의 포트를 광학적으로 투명한 필름으로 밀봉한다.
PCR 반응 용액으로 충전된 장치를, 열순환 과정 동안 형광 현미경이나, 디지털 카메라를 이용한 표면의 이미지화를 가능하게 하는 커스텀 열순환 기구 (custom thermocycling apparatu)에서 시험한다. 분리된 형광 DNA-플랩 (및 전체 프로브)의 일반적 혼성화 시간은, 그 혼성화 온도 (Tm) 이하로 냉각되는 시간인 2 분 미만이다. 포획 프로브 어레이에 혼성화되는 분리 플랩 (또는 전체 프로브)의 형광 강도의 측정에 의해, 표면을 특성화한다. 이러한 방식으로, 표면 안정성을 일반적 열순환 조건 하의 완충액에서 측정한다. 또한, 일반적으로 그 구동이 원하는 시간 동안 95℃에서의 활성화, 95℃ 내지 60℃의 40 사이클의 열순환, 95℃에서 15 초 체류 시간, 60℃에서 60초의 체류 시간을 포함하는, 이 장치의 PCR을 실시한다. 특정의 선택된 사이클에서, 60℃ 확장 단계 (extension step) 후 혼성화를 가능하게 하는 것으로서, 챔버를 프로브의 Tm 이하로 냉각시킨다.
어레이 스팟를 위치화하고, 픽셀 강도의 측정에 의해 신호를 정량화하기 위해, 자동 영상 분석 소프트웨어를 이용한다. 실제 스팟 영역 밖의 평균 픽셀 강도는 스팟 내부의 평균 픽셀 강도로부터 제외하면, 스팟 지역의 배경-제외 픽셀 강도가 생성된다. 이러한 강도를 포획 프로브에 특이적인 분리 DNA-플랩의 검출을 위한 열순환 과정 동안 모니터링한다.
실시예 15
고체 지지체의 열순환
그에 공유 결합된 폴리(DMA-공-PFPA) 중합체를 포함하는 시클릭 폴리(올레핀) (COP) 슬라이드를 상기 과정을 따라 제조하였다. 고체 지지체 상에 표지 올리고의 스포팅에 의해, 마이크로어레이를 제작하는데, 이들 고체 지지체를 사용하였다. 이들 마이크로어레이를 완충액의 존재 하에, 40 사이클 (64 내지 95 ℃)의 열 순환에 배치하고, 스팟의 형태 및 밝기를 모니터링한다. 도 4A-C는 각각 저, 중 및 고 플라즈마 전원에 의해 제조된 어레이의 결과를 나타낸다. 도 4A-C에서 제시된 바와 같이, 스팟은, 플라즈마 (APOP)-처리 COP 슬라이드 상의 폴리(DMA-공-PFPA) 중합체의 비특이적 흡착 대신에, 공유 부착을 나타내는 것으로서, 40 사이클 후, 그대로 남아 있었다.
전술된 다양한 실시형태는 추가의 실시형태를 제공하기 위해, 조합될 수 있다. 이로 제한되는 것은 아니나, 2013년 3월 14일자로 제출된 미국 특허 출원 제 61/785,987호를 포함하여, 출원 데이터 시트에 제시되고/거나 본 명세서에 참조된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 문헌은 그 전문이 본 명세서에서 참조로서 포함된다. 상기 실시형태의 측면은, 추가의 실시형태를 제공하기 위해, 다양한 특허, 출원 및 공보의 내용을 이용할 필요가 있는 경우, 변형될 수 있다. 상기 상세한 설명의 관점에서, 상기 실시형태에, 이러한 변화 및 기타 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용되는 용어는 본 명세서 및 특허청구범위에서 개시되는 특정 실시형태로 특허청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안되나, 이러한 청구범위에 부여되는 균등물의 전 범위에 따라 가능한 모든 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 하기 특허청구범위는 본 명세서에 의해 제한되지 않는다.
전술된 것으로부터, 본 발명의 특정 실시형태가 본 명세서에 예시 목적으로 개시되었으나, 다양한 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다.

Claims (121)

  1. 외부 표면을 가지는 기판; 및
    기판의 외부 표면에 공유 결합된 복수의 중합체를 포함하는 고체 지지체로서,
    상기 중합체 각각은 적어도 하나의 A 및 C 하위단위를 포함하고, 임의로 하나 이상의 B 하위단위를 포함하며, 여기서
    상기 A 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 a), b), c)를 포함하며:
    a) 제1 열화학적 반응 기로, 여기서 상기 제1 열화학적 반응 기는 포획 프로브 상의 알코올, 카르보닐 또는 아민 기와 공유 결합을 형성할 수 있음;
    b) 제2 열화학적 반응 기, 여기서 제2 열화학적 반응 기는 첨가 고리화 (cycloaddition) 또는 1,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 포획 프로브 상의 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기임; 또는
    c) 포획 프로브와의 공유 결합,
    상기 임의의 B 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하고;
    상기 C 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 기판의 외부 표면과의 공유 부착체 W를 포함하며, 여기서 W는 하기 구조식 중 하나를 가지며, 제1 및 제2 열화학적 반응 기의 반응성은 서로에 대해 직교하는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00049

    또는
    Figure pct00050

    상기 식에서, Q는 기판의 외부표면이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중합체가 하기 화학식 (I)을 가지는 것인 고체 지지체:
    T1-(A)x(B)y(C)z-T2
    (I)
    상기 식에서,
    A, B 및 C는 각각 A, B 및 C 하위단위를 나타내고;
    T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택되는 중합체 말단 기이고;
    x 및 z는 독립적으로 1 내지 50,000의 정수이고;
    y는 0 내지 50,000의 정수이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 고체 지지체가 하기 화학식 (II)을 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00051

    상기 식에서,
    R1은, 각각의 경우에, 독립적으로 제1 열화학적 반응 기, 제2 열화학적 반응 기 또는 포획 프로브와의 공유 결합이고;
    R2는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티이고;
    W는, 각각의 경우에, 독립적으로 기판의 외부표면과의 공유 결합이고;
    Q는 기판의 외부표면이고;
    R3, R4 및 R5는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    L1, L2 및 L3은, 각각의 경우에, 독립적으로 직접 결합 또는 길이 최대 100 개 원자의 링커이고;
    T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택되는 중합체 말단 기이고;
    x 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 50,000의 정수이고;
    y는 0 내지 50,000의 정수이다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 A 하위단위가 제1 열화학적 반응 기를 포함하는 것인 고체 지지체.
  5. 제4항에 있어서, 제1 열화학적 반응 기가 활성화 에스테르인 고체 지지체.
  6. 제5항에 있어서, 제1 열화학적 반응 기가, 각각의 경우에, 하기 화학식을 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00052

    상기 식에서,
    R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e는 각각 독립적으로 H, 할로, 트리할로메틸, 설포, -CN, C1-C6 알킬옥시카르보닐, C1-C6 히드록실알킬옥시카르보닐, 니트로 또는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이다.
  7. 제6항에 있어서, 할로가 플루오로인 고체 지지체.
  8. 제6항에 있어서, R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e 중의 적어도 하나가 플루오로인 고체 지지체.
  9. 제6항에 있어서, R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e가 각각 플루오로인 고체 지지체.
  10. 제6항에 있어서, R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e 중 하나가 니트로인 고체 지지체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 A 하위단위가 제2 열화학적 반응 기를 포함하는 것인 고체 지지체.
  12. 제11항에 있어서, 제2 열화학적 반응 기가, 각각의 경우에, 독립적으로 알킨, 알킬실릴-보호 알킨, 아지드, 니트릴, 티올, 알켄, 말레이미드, 부타디엔, 아지리딘, 티이란, 디엔, 친디엔체 또는 1,4-불포화 카르보닐 작용 기를 포함하는 것인 고체 지지체.
  13. 제11항에 있어서, 제2 열화학적 반응 기가 첨가 고리화 반응 기를 포함하는 것인 고체 지지체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 첨가 고리화 반응 기가, 각각의 경우에, 독립적으로 알킨 또는 아지드 작용 기를 포함하는 것인 고체 지지체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 첨가 고리화 반응 기가, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 화학식 중 하나를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00053

    또는
    Figure pct00054

    상기 식에서,
    β 및 χ는 각각 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수이다.
  16. 제15항에 있어서, β가 1 또는 3인 고체 지지체.
  17. 제15항에 있어서, χ가 1인 고체 지지체.
  18. 제15항에 있어서, 상기 첨가 고리화 반응 기가, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 화학식 중 하나를 가지는 고체 지지체:
    Figure pct00055

    또는
    Figure pct00056
  19. 제13항에 있어서, 상기 첨가 고리화 반응 기가, 각각의 경우에, 독립적으로 디엔 또는 친디엔체 작용 기를 포함하는 것인 고체 지지체.
  20. 제13항에 있어서, 상기 첨가 고리화 반응 기가, 각각의 경우에, 독립적으로 α,β-불포화 카르보닐, 말레이미딜, 아세틸렌 디카르복실릭 에스테르, 시클로펜틸디에닐, 푸라닐 또는 N-알킬피롤릴 모이어티를 포함하는 것인 고체 지지체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 첨가 고리화 반응 기가 하기 구조식 중 하나를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00057

    또는
    Figure pct00058

    상기 식에서,
    Ra는 C1-C6 알킬이고,
    L1은 직접 결합 또는 길이 최대 100 개 원자의 링커이다.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 A 하위단위가 포획 프로브와의 공유 결합을 포함하는 것인 고체 지지체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 공유 결합이 포획 프로브와의 아미딜 또는 아민 결합인 고체 지지체.
  24. 제22항에 있어서, 상기 공유 결합이 트리아졸 모이어티를 포함하는 것인 고체 지지체.
  25. 제22항에 있어서, 적어도 하나의 A 하위단위가 하기 구조식 중 하나를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00059

    Figure pct00060
    또는
    Figure pct00061

    상기 식에서,
    R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    L4는 임의의 링커이고;
    Z는 포획 프로브 또는 그의 단편이다.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브가 펩티드, 단백질, 글리코실화 단백질, 글리코컨쥬게이트, 앱터머, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드인 고체 지지체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브가 폴리뉴클레오티드인 고체 지지체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브가 DNA인 고체 지지체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, W가, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 구조식 중 하나를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00062

    또는
    Figure pct00063

    상기 식에서,
    Q는 고체 기판이다.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C 하위단위가, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 구조식 중 하나를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00064
    또는
    Figure pct00065

    상기 식에서,
    R5는, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    Q는 고체 지지체의 외부 표면이고;
    n은 2 내지 10의 정수이다.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 모이어티가, 각각의 경우에, 독립적으로 아미도, 에스테르 또는 히드록실 작용 기, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 고체 지지체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 B 하위단위를 포함하지 않는 고체 지지체.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 하나 이상의 B 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 B 하위단위가, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 화학식 중 하나를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00066
    또는
    Figure pct00067

    상기 식에서,
    R4 는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;
    R8a 및 R8b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이고;
    R9a 및 R9b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이거나 또는 R9a 및 R9b는, 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 결합하여, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
    R10은 히드록실알킬이다.
  35. 제34항에 있어서, R8a 및 R8b가 각각 H인 고체 지지체.
  36. 제34항에 있어서, R8a 또는 R8b 중 하나가 H이고, R8a 또는 R8b 중 다른 하나가 C1-C6 알킬인 고체 지지체.
  37. 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R8a이 H이고, R8b가 메틸인 고체 지지체.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 친수성 모이어티가 하기 구조식 중 하나를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00068
    또는
    Figure pct00069
  39. 제38항에 있어서, 각각의 친수성 모이어티가 하기 구조식을 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00070
  40. 제38항에 있어서, 각각의 친수성 모이어티가 하기 구조를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00071
  41. 제34항에 있어서, R8a 또는 R8b 중 하나가 H이고, R8a 또는 R8b 중 다른 하나가 히드록실알킬인 고체 지지체.
  42. 제41항에 있어서, R8a가 H이고, R8b가 -CH2OH인 고체 지지체.
  43. 제34항에 있어서, 적어도 하나의 친수성 모이어티가 하기 구조 중 하나를 가지는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00072
    또는
    Figure pct00073
  44. 제34항에 있어서, R10이 -CH2CH2OH인 고체 지지체.
  45. 제3항에 있어서, L1, L2 및 L3이 각각 독립적으로 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 모이어티, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 고체 지지체.
  46. 제3항에 있어서, L1, L2 또는 L3중의 적어도 하나가 직접 결합인 고체 지지체.
  47. 제3항에 있어서, L1, L2 및 L3가 각각 직접 결합인 고체 지지체.
  48. 제3항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R3, R4 또는 R5중 적어도 하나가 H인 고체 지지체.
  49. 제3항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R3, R4 및 R5가 각각 H인 고체 지지체.
  50. 제3항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R3, R4 또는 R5중 적어도 하나가 메틸인 고체 지지체.
  51. 제3항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, R3, R4 및 R5가 각각 메틸인 고체 지지체.
  52. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 약 40 mol% 미만의 B 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  53. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 0 mol% 내지 약 40 mol% 초과의 B 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  54. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 약 35 mol%의 B 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  55. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 적어도 약 30 mol%의 B 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  56. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 0 mol% 내지 약 15 mol% 초과의 B 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  57. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 적어도 약 75 mol%의 A 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  58. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 적어도 약 90 mol%의 A 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  59. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 적어도 약 95 mol%의 A 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  60. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 적어도 약 99.9 mol%의 A 하위단위를 포함하는 것인 고체 지지체.
  61. 제1항에 있어서, 각각 A 하위단위가 제1 열화학적 반응 기 또는 포획 프로브와의 공유 결합을 포함하는 것인 고체 지지체.
  62. 제61항에 있어서, 상기 중합체가 B 하위단위를 포함하지 않는 것인 고체 지지체.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 제1 열화학적 반응 기가 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 고체 지지체.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 랜덤 중합체인 고체 지지체.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 40° 내지 90° 범위의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.
  66. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 50° 내지 85° 범위의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.
  67. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 60° 내지 80°범위의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기판이 유기 중합체를 포함하는 것인 고체 지지체.
  69. 제68항에 있어서, 상기 기판이 폴리(스티렌), 폴리(카보네이트), 폴리(에테르설폰), 폴리(케톤), 폴리(지방족 에테르), 폴리(에테르 케톤), 폴리(에테르 에테르 케톤), 폴리(아릴 에테르), 폴리(아미드) 폴리(이미드), 폴리(에스테르) 폴리(아크릴레이트), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(올레핀), 폴리(시클릭 올레핀), 폴리(비닐 알코올), 중합체 블렌드 또는 폴리 알킬 중합체 또는 할로겐화 유도체, 가교 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 고체 지지체.
  70. 제69항에 있어서, 상기 할로겐화 유도체가 할로겐화 폴리(아릴 에테르), 할로겐화 폴리(올레핀) 또는 할로겐화 폴리(시클릭 올레핀)인 고체 지지체.
  71. 제69항에 있어서, 상기 기판이 시클릭 폴리(올레핀)을 포함하는 것인 고체 지지체.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기판이 실질적으로 광학적으로 투명한 것인 고체 지지체
  73. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기판이 약 400 nm 내지 약 800 nm에서 실질적으로 광학적으로 투명한 것인 고체 지지체.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기판이 적어도 약 90% 광학적으로 투명한 것인 고체 지지체.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 개별 위치의 체계적 어레이를 포함하고, 각각의 개별 위치가 독립적으로 기판의 외부표면에 공유 결합된 적어도 하나의 중합체를 포함하는 것인 고체 지지체.
  76. 제75항에 있어서, 각각의 개별 위치가 독립적으로 그에 공유 결합된 복수의 중합체를 포함하는 것인 고체 지지체.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 각각의 개별 위치의 적어도 하나의 중합체가 독립적으로 이에 공유 결합된 포획 프로브를 포함하는 것인 고체 지지체.
  78. 제77항에 있어서, 각각의 개별 위치가 그에 결합된 복수의 구조적으로 별개의 포획 프로브를 포함하는 것인 고체 지지체.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 중합체가 그들 사이에 가교가 실질적으로 존재하지 않는 것인 고체 지지체.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 고체 지지체의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    A) 히드록실 및 카르보닐 작용 기가 매개 링커 없이, 고체 기판에 직접 결합하고, 아민 작용 기가, 매개 링커 없이 고체 기판에 직접 결합된 이민 결합을 포함하는 링커를 통해, 고체 기판에 결합된, 그 외부 표면에 공유 결합된 복수의 히드록실, 카르보닐 또는 아민 작용 기, 또는 이들의 조합을 포함하는 고체 기판을 제공하는 단계; 및
    B) 적어도 하나의 히드록실, 카르보닐 또는 아민 작용 기 및 D 하위단위 사이에 공유 결합을 형성하기에 충분한 조건 하에, D 및 임의의 E 및 F 하위단위를 포함하는 중합체를 고체 기판과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서
    D 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 제1 반응 기를 포함하고, 여기서 제1 반응 기는 고체 기판 또는 포획 프로브 상에서 알코올, 카르보닐 또는 아민 작용 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 열화학적 반응 기이고;
    E 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하고;
    F 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 제2 반응 기를 포함하며, 여기서 제2 반응 기는 첨가 고리화 또는 1,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 포획 프로브 상의 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기이고,
    제1 반응 기 및 제2 반응 기의 반응성은 서로에 대해 직교하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 제1 반응 기가 고체 기판 상에서 케톤 또는 알데하이드 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 친핵성기인 반응.
  82. 제81항에 있어서, 제1 반응 기가 히드라지드, 아민 또는 알콕시아민인 방법.
  83. 제80항에 있어서, 제1 반응 기가 상기 고체 기판 상에서 알코올 또는 아민 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 친전자성 기인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 제1 반응 기가 아릴 에스테르 또는 에폭사이드인 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 하기 구조 (III)를 가지는 방법:
    Figure pct00074

    상기 식에서,
    D, E 및 F는 각각 D, E 및 F 하위단위를 나타내고;
    T3 및 T4는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택되는 중합체 말단 기이고;
    a는 1 내지 50,000의 정수이고;
    b 및 c는 독립적으로 0 내지 50,000의 정수이다.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 하기 화학식 (IV)를 가지는 방법:
    Figure pct00075

    상기식에서,
    R11은, 각각의 경우에, 독립적으로 제1 반응 기를 포함하는 치환기이고;
    R12는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하는 치환기이고;
    R13은, 각각의 경우에, 독립적으로 제2 반응 기를 포함하는 치환기이고;
    R14, R15 및 R16은, 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    L5, L6 및 L7은, 각각의 경우에, 독립적으로 직접 결합 또는 최대 100 개의 원자 길이인 링커이고;
    T3 및 T4는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택되는 중합체 말단 기이고;
    q는 1 내지 50,000의 정수이고;
    r 및 s는 독립적으로 0 내지 50,000의 정수이다.
  87. 제86항에 있어서, R11이, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 화학식 중 하나를 가지는 방법:
    Figure pct00076
    또는
    Figure pct00077

    상기 식에서,
    R7a, R7b, R7c, R7d 및 R7e는 각각 독립적으로 H, 할로, 트리할로메틸, 또는 니트로이다.
  88. 제87항에 있어서, 상기 열화학적 반응 기가 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 방법.
  89. 제80항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 F 하위단위가 존재하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기가 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 방법.
  91. 제80항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E 하위단위가 존재하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 친수성 모이어티가 제31항 또는 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에서 정의되는 바와 같은 것인 방법.
  93. 제80항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공유 결합이 적어도 하나의 히드록실 또는 카르보닐 모이어티의 제1 반응 기와의 반응에 의해 형성되는 에테르, 에스테르, 히드라존, 옥심 또는 이민 결합인 방법.
  94. 제80항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판이 주위 공기 플라즈마 또는 대기압 산소 플라즈마를 이용한 상기 고체 기판의 처리 또는 코로나 처리에 의해 제조되는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 방법이, 상기 고체 기판 상의 카르보닐과 디아민의 제1 아민 기 사이에, 공유 이민 결합을 형성하기에 충분한 조건 하에서, 상기 고체 기판을 디아민 화합물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  96. 제80항에 있어서, 포획 프로브와 중합체 사이에 공유 결합을 형성하기에 충분한 조건 하에서, 상기 고체 지지체를 포획 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 공유 결합이 D 하위단위 상의 아릴 에스테르 또는 에폭사이드 모이어티 및 상기 포획 프로브 상의 아민 모이어티의 반응에 의해 형성되는 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 공유 결합이 F 하위단위 상의 알킨 모이어티 및 상기 포획 프로브 상의 아지드 모이어티의 반응에 의해 형성되는 방법.
  99. 제96항에 있어서, 상기 공유 결합이 F 하위단위 상의 아지드 모이어티 및 상기 포획 프로브 상의 알킨 모이어티의 반응에 의해 형성되는 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 아지드의 존재 하에, Cu(I) 촉매를 상기 고체 지지체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  101. 표적 분석물 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서,
    a) A 하위단위가 이에 공유 결합된 포획 프로브를 포함하는, 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 고체 지지체를 제공하는 단계;
    b) 분석물 프로브를 상기 고체 지지체와 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 분석물 프로브와 상기 포획 프로브의 상호작용에 의해 생성되는 신호의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 포획 프로브가 폴리뉴클레오티드인 방법.
  103. 제101항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분석물 분자가 폴리뉴클레오티드 또는 단백질인 방법.
  104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호가 형광 신호인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 형광 신호가 포획 프로브와 분석물 프로브의 특이적 혼성화의 결과로서 생성 또는 감소되는 방법.
  106. 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물 프로브가 형광단 또는 형광단 소광제를 포함하는 방법.
  107. 상기 고체 지지체의 외부 표면에 공유 결합된 복수의 일차 아민 작용 기를 포함하는 고체 기판으로서, 상기 아민 작용 기가 이민 결합을 포함하는 링커를 통해 상기 고체 지지체에 결합되는 고체 기판.
  108. 제107항에 있어서, 상기 고체 지지체의 외부 표면이 하기 구조식 또는 그의 염, 호변이성질체 또는 입체이성질체를 가지는 고체 기판:
    Figure pct00078

    상기 식에서,
    Q는 고체 지지체의 외부 표면이고;
    n은 2 내지 10의 정수이다.
  109. G, H 및 임의의 I 하위단위를 포함하는 중합체로서,
    G 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 하기 a), b)를 포함하며:
    a) 제1 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제1 열화학적 반응 기는 알코올, 카르보닐 또는 아민 기와 공유 결합을 형성할 수 있음;
    b) 제2 열화학적 반응 기, 여기서 상기 제2 열화학적 반응 기는 첨가 고리화 또는 1,4-컨쥬게이트 첨가 반응을 통해, 표적 작용 기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 가지는 첨가 고리화 또는 컨쥬게이트 첨가 반응 기임;
    상기 H 하위단위는, 각각의 경우에, 하기 구조식을 가지며:
    Figure pct00079
    ;
    상기 임의의 I 하위단위는, 각각의 경우에, 독립적으로 친수성 모이어티를 포함하며, 하기 구조 중 하나를 가지고,
    상기 제1 및 제2 열화학적 반응 기의 반응성은 서로에 대해 직교하는 것인 중합체:
    Figure pct00080
    또는
    Figure pct00081

    상기 식에서,
    R4는 각각의 경우에, 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    R8a는 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이고;
    R8b는 C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이고;
    R9a 및 R9b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 히드록실알킬이거나 또는 R9a 및 R9b는, 이들이 결합된 질소 원자와 함께, 결합하여, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
    R10은 히드록실알킬이다.
  110. 제109항에 있어서, 상기 임의의 I 하위단위는 존재하지 않는 중합체.
  111. 제109항에 있어서, 상기 임의의 I 하위단위가 존재하는 중합체.
  112. 제111항에 있어서, 상기 친수성 모이어티가 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 중합체.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 G 하위단위가 제5항 내지 제10항 또는 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 중합체.
  114. 제109항에 있어서, 각각 G 하위단위가 제1 열화학적 반응 기를 포함하는 중합체.
  115. 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 0 mol% 내지 약 15 mol% 초과의 H 하위단위를 포함하는 중합체.
  116. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 61° 내지 95°범위의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.
  117. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 70° 내지 90°범위의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.
  118. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 75° 내지 85°의 범위의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.
  119. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 78° 내지 83°의 범위의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.
  120. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 15° 이하의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.
  121. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 10° 미만의 물 접촉각을 가지는 고체 지지체.









KR1020157028744A 2013-03-14 2014-03-14 생체 분자를 격리시키기 위한 표면 산화 및 관련 방법 KR20150135353A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361785987P 2013-03-14 2013-03-14
US61/785,987 2013-03-14
PCT/US2014/028247 WO2014152921A2 (en) 2013-03-14 2014-03-14 Surface oxidation for sequestering biomolecules and related methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150135353A true KR20150135353A (ko) 2015-12-02

Family

ID=50487187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157028744A KR20150135353A (ko) 2013-03-14 2014-03-14 생체 분자를 격리시키기 위한 표면 산화 및 관련 방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20140287945A1 (ko)
EP (1) EP2970541A2 (ko)
JP (1) JP2016517465A (ko)
KR (1) KR20150135353A (ko)
CN (1) CN105189583A (ko)
AU (1) AU2014236495A1 (ko)
BR (1) BR112015023069A2 (ko)
CA (1) CA2905521A1 (ko)
MX (1) MX2015012204A (ko)
SG (1) SG11201507084TA (ko)
WO (1) WO2014152921A2 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10934408B2 (en) * 2014-04-09 2021-03-02 Shanghai Institute Of Ceramics, Chinese Academy Of Sciences Surface modification method for polyether-ether-ketone material
EP3277845B1 (en) * 2015-03-30 2021-07-07 Genapsys Inc. Beads for nucleic acid sequencing
JP2022523362A (ja) * 2019-02-21 2022-04-22 ストラトス ゲノミクス インコーポレイテッド 単一分子配列決定における使用のための拡張可能ポリマーの固体合成のための方法、組成物、およびデバイス
US20200347443A1 (en) * 2019-05-01 2020-11-05 Element Biosciences, Inc. Nucleic acid hybridization methods
US11718032B2 (en) * 2019-07-31 2023-08-08 The Boeing Company Plasma-treated powders for additive manufacturing
US11725073B2 (en) 2020-12-29 2023-08-15 Hongene Biotech Corporation Compositions and methods for liquid phase oligonucleotide synthesis
US11851454B2 (en) 2021-12-30 2023-12-26 Hongene Biotech Corporation Compositions and methods for liquid phase oligonucleotide synthesis

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3861918A (en) * 1973-03-09 1975-01-21 Polaroid Corp Synthetic silver halide emulsion binder
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4351760A (en) 1979-09-07 1982-09-28 Syva Company Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates
US4739044A (en) 1985-06-13 1988-04-19 Amgen Method for derivitization of polynucleotides
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US5231191A (en) 1987-12-24 1993-07-27 Applied Biosystems, Inc. Rhodamine phosphoramidite compounds
US4997928A (en) 1988-09-15 1991-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US6060242A (en) 1997-02-27 2000-05-09 Lorne Park Research, Inc. PNA diagnostic methods
US5932711A (en) 1997-03-05 1999-08-03 Mosaic Technologies, Inc. Nucleic acid-containing polymerizable complex
US6994972B2 (en) 1999-09-02 2006-02-07 Corning Incorporated Porous substrates for DNA arrays
US6790613B1 (en) 1999-11-12 2004-09-14 Amersham Biosciences Ab Method of preparing an oligonucleotide array
US7217512B2 (en) 2002-05-09 2007-05-15 Corning Incorporated Reagent and method for attaching target molecules to a surface
US20040076961A1 (en) 2002-10-21 2004-04-22 Lewis Mark A. Biomolecule retaining material and methods for attaching biomolecules to a surface
US7309593B2 (en) * 2003-10-01 2007-12-18 Surmodics, Inc. Attachment of molecules to surfaces
US7781203B2 (en) 2005-12-29 2010-08-24 Corning Incorporated Supports for assaying analytes and methods of making and using thereof
WO2012024695A1 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 Life Technologies Corporation Magnetic beads having surface glycoconjugates and use thereof
BR112013021144A2 (pt) 2011-02-18 2016-11-22 Nvs Technologies Inc detecção quantitativa altamente multiplexada de ácidos nucléicos
WO2012170936A2 (en) * 2011-06-09 2012-12-13 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
EP2814857A1 (en) * 2012-02-17 2014-12-24 NVS Technologies Inc. Polymer scaffolds for assay applications
MX2015004620A (es) * 2012-10-12 2015-10-22 Nvs Technologies Inc Polimeros que tienen grupos reactivos ortogonales y usos de los mismos.

Also Published As

Publication number Publication date
EP2970541A2 (en) 2016-01-20
SG11201507084TA (en) 2015-10-29
US20140287945A1 (en) 2014-09-25
MX2015012204A (es) 2016-01-14
WO2014152921A9 (en) 2015-02-26
AU2014236495A1 (en) 2015-11-05
CN105189583A (zh) 2015-12-23
CA2905521A1 (en) 2014-09-25
JP2016517465A (ja) 2016-06-16
WO2014152921A2 (en) 2014-09-25
BR112015023069A2 (pt) 2017-07-18
WO2014152921A3 (en) 2014-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150135353A (ko) 생체 분자를 격리시키기 위한 표면 산화 및 관련 방법
JP7358415B2 (ja) ポリマー粒子
KR101559983B1 (ko) 중합체 코팅
KR20140137366A (ko) 분석 적용용 고분자 스카폴드
RU2636465C2 (ru) Способ конъюгирования полимерной частицы
JP2015533903A (ja) 直交性反応基を有するポリマーおよびその使用
JP2015513666A5 (ko)
JP2015507063A (ja) 親水性ポリマー粒子およびその製造方法
EP1928925B1 (en) Crosslinked polymers with amine binding groups
JP5427408B2 (ja) 目的の生体分子、特に核酸を含む生体試料を標識又は処理する方法
JP4534818B2 (ja) バイオマテリアル用高分子化合物およびそれを用いた高分子溶液

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid