JP2015533903A - 直交性反応基を有するポリマーおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
直交性反応基を有するポリマー、およびポリマーを含む固体支持体(この固体支持体にポリマーが固定されている)が提供される。このポリマーは、ハイスループットアッセイ用の固体支持体に分析物分子を固定することを含むいくつもの用途において実用性があることがわかっている。本願発明はまた、ポリマーとの反応または相互作用に適した反応基を含む固体基材、ならびにポリマーおよび任意選択の捕捉プローブを含む固体支持体も提供する。
Description
政府支援の陳述
本明細書に記載される研究の部分的基金は、契約番号HSHQDC−10−C−00053の下、アメリカ合衆国国土安全保障省により提供された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本明細書に記載される研究の部分的基金は、契約番号HSHQDC−10−C−00053の下、アメリカ合衆国国土安全保障省により提供された。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
背景
発明の分野
本発明は一般に、新規ポリマー、そのポリマーを含む固体支持体、およびそれらを使用する方法を対象とする。
発明の分野
本発明は一般に、新規ポリマー、そのポリマーを含む固体支持体、およびそれらを使用する方法を対象とする。
関連技術の説明
生物学的試料中の分析物材料の存在および/または量をプローブするために、バイオアッセイが使用されている。表面に基づくアッセイ(例えば、DNAマイクロアレイなど)では、分析物種は一般的に、固体支持体または基材上に捕捉され、検出される。DNAマイクロアレイの使用は、多数の遺伝子を同時にモニタすることができるので、遺伝子発現および遺伝子型解析の研究に広く採用されてきた(Schenaら、Science 270号:467〜470頁(1995年);Pollackら、Nat. Genet. 23号:41〜46頁(1999年))。表面アレイは、アレイフォーマットの多種多様なバイオアッセイを容易にするために、炭水化物、抗体、タンパク質、ハプテンまたはアプタマーなどの他の結合部分を使用して製造することもできる。
生物学的試料中の分析物材料の存在および/または量をプローブするために、バイオアッセイが使用されている。表面に基づくアッセイ(例えば、DNAマイクロアレイなど)では、分析物種は一般的に、固体支持体または基材上に捕捉され、検出される。DNAマイクロアレイの使用は、多数の遺伝子を同時にモニタすることができるので、遺伝子発現および遺伝子型解析の研究に広く採用されてきた(Schenaら、Science 270号:467〜470頁(1995年);Pollackら、Nat. Genet. 23号:41〜46頁(1999年))。表面アレイは、アレイフォーマットの多種多様なバイオアッセイを容易にするために、炭水化物、抗体、タンパク質、ハプテンまたはアプタマーなどの他の結合部分を使用して製造することもできる。
バイオアッセイ用途に有効な官能化材料は、検出(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)されるときに適切な信号を出すために、関連試料に由来する十分な量の分析物を固定するのに適した能力を備えていなければならない。また、特に試料および対照が会合する異種の支持体表面、例えば異なる支持体または同じ支持体上の異なる位置上で、それらの試料および対照を分析しなければならないアッセイフォーマットのプロファイリング実験に、適切な官能化材料を利益が得られるように適用するには、その材料は、非常に再現性の高い表面を提供しなければならない。例えば、非常に再現性の高い表面の化学的性質に基づいていない支持体は、支持体間で、または同じ支持体上の異なる位置間で変動が生じるため、アッセイ(例えば、プロファイリング比較)を行うときに著しい誤差を生じるおそれがある。
表面アレイ(例えば、「DNAチップ」)は、固体支持体に分析物を付着させるためのポリマーを用いて調製されてきた。一般に、ポリマーを含むアレイは、固体基材(例えばビーズ、粒子、プレート等)の上で、前駆体モノマーまたはプレポリマーをその場重合させることによって形成される。有機ポリマーを含むアレイの選択性および再現性は、しばしば、モノマー濃度、モノマー比、開始剤の種類および濃度、溶媒蒸発速度、周囲湿度(溶媒が水である場合)、架橋剤の種類および濃度、モノマー/架橋剤/溶媒の純度、実験室温度、ピペット操作時間、散布条件、反応温度(熱重合の場合)、反応湿度、紫外線放射線の均一性(UV光重合の場合)、および周囲酸素条件を含めた、いくつかの実験的変数にかなり依存する。これらのパラメータの多くは、製造設定により制御することができるが、これらのパラメータのすべてを制御することは、不可能ではないとしても困難である。結果として、その場重合では、スポット間、チップ間およびロット間の再現性が相対的に低い。さらに、残留モノマー/架橋剤/開始剤および副生成物に起因して、容易に実行され得ないさらなる精製工程が必要とされる。
さらに、シリカベースの基材、例えばガラス、石英、溶融シリカおよびケイ素を使用するアレイ表面の開発には、著しく多量の労力が費やされてきたが(例えば、D. Cuschinら、Anal. Biochem. 1997年、250巻、203〜211頁;G.M. Harbersら、Chem. Mater. 2007年、19巻、4405〜4414頁;ならびにShiらの米国特許第6,790,613号、Bolesらの同第5,932,711号、Bardhanらの同第6,994,972号、Frutosらの同第7,781,203号、およびLewisらの同第7,217,512号および同第7,541,146号を参照)、ポリマー基材などの、より容易に製造されるより安価な基材を使用することにより、特定の利点が得られる。しかし、このような基材をバイオアッセイ目的で選択し、調製するには、さらなる課題に直面しなければならなかった。例えば、ポリマー基材には、追加の表面官能化の結果として、自己蛍光性が高くなったこと、疎水性が高くなったこと、ならびに下層ポリマー基材へのその場重合されたコーティングの付着または会合に課題が生じることなどの、さらに厄介な問題があることが多い。
したがって、この分野では進展が見られてきたが、当技術分野では、分析物をこれらの固体基材に付着させるための改善された官能化固体基材、ポリマーおよび方法、ならびにDNAマイクロアレイなどの様々なアッセイに使用するためのこのようなポリマーを含む固体支持体が依然必要である。本発明によって、この必要性が満たされ、関連するさらなる利点が得られる。
Schenaら、Science 270号:467〜470頁(1995年)
Pollackら、Nat. Genet. 23号:41〜46頁(1999年)
D. Cuschinら、Anal. Biochem. 1997年、250巻、203〜211頁
G.M. Harbersら、Chem. Mater. 2007年、19巻、4405〜4414頁
簡単な要旨
手短には、本発明は一般に、直交性反応基を有するポリマーを対象とする。ポリマーは、分析アッセイで使用するために、捕捉プローブを固体基材上に固定することを含めて、いくつもの用途において実用性があることがわかっている。ポリマーとの反応または相互作用に適した反応基を含む固体基材、ならびにポリマーおよび任意選択の捕捉プローブを含む固体支持体も提供する。ここに開示のポリマー、固体基材および固体支持体は、様々な分析用途、例えば、介護状況の個々の地点(診療所、緊急治療室、自宅、野外等)、ハイスループット試験、および他の用途で使用するためのDNAおよびタンパク質マイクロアレイに有用である。
手短には、本発明は一般に、直交性反応基を有するポリマーを対象とする。ポリマーは、分析アッセイで使用するために、捕捉プローブを固体基材上に固定することを含めて、いくつもの用途において実用性があることがわかっている。ポリマーとの反応または相互作用に適した反応基を含む固体基材、ならびにポリマーおよび任意選択の捕捉プローブを含む固体支持体も提供する。ここに開示のポリマー、固体基材および固体支持体は、様々な分析用途、例えば、介護状況の個々の地点(診療所、緊急治療室、自宅、野外等)、ハイスループット試験、および他の用途で使用するためのDNAおよびタンパク質マイクロアレイに有用である。
ここに記載のポリマー、固体基材、固体支持体および関連方法は、様々な実施形態において多くの利点を提供する。例えば、特定の実施形態では、固体基材にポリマーを固定するための本明細書に記載の反応基は、固定化反応中に提供される特定条件下以外では実質的に不活性であり、それにより、表面コーティングプロセス中に、予測可能な最適レベルの反応性が確保される。また、いくつかの実施形態では、ポリマーを固体基材に固定するためにクリックケミストリーが用いられ、このようなケミストリーは、実質的にpH非感受性であり、反応副生成物の生成を制限するか、または全く生成しない。クリックケミストリーを介してポリマーを捕捉プローブ(例えば、DNAまたはオリゴヌクレオチドなどの生体分子)にコンジュゲートするために、クリック反応性を有する官能基が用いられる特定の実施形態では、関連する利点が得られる。
ポリマーは、直交性反応基を含むので、さらなる利点が実現される。例えば、ポリマーの実施形態は、固体基材へのポリマーの固定に対して特異的な一つまたは複数の反応基(「固定化基」)、およびポリヌクレオチドまたは抗体などの捕捉プローブとのコンジュゲーションに対して特異的な一つまたは複数の官能基(「コンジュゲーション基(conjugation group)」)を有するポリマーを含む。したがって、アレイスポット中に、ただ一つのタイプの反応基が、捕捉プローブ(例えば、アミン修飾生体分子)と反応することができる。ポリマーでコーティングされた表面上に存在するいずれの未反応固定化基(例えば、第1の反応基)も、コンジュゲーションに使用される条件下では不活性であり、バイオアッセイの性能に影響を及ぼさない。また、本発明の特定の実施形態では、ほとんど定量的であり、ほぼ即時的な(数分)カップリング反応を用いるが、従来の方法は、時間がかかる場合があり、競合する加水分解に起因して、反応基の一部しかカップリングできないことがある。
一実施形態では、A、BおよびCサブユニットを含むポリマーが提供され、
Aサブユニットは、出現するごとに独立に、標的官能基との反応に対して特異的な反応性を有する第1の反応基を含み、
Bサブユニットは、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
Cサブユニットは、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する第2の反応基を含み、
第1の反応基および第2の反応基の反応性は、互いに直交性である。
Aサブユニットは、出現するごとに独立に、標的官能基との反応に対して特異的な反応性を有する第1の反応基を含み、
Bサブユニットは、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
Cサブユニットは、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する第2の反応基を含み、
第1の反応基および第2の反応基の反応性は、互いに直交性である。
標的官能基は、固体基材の外表面および/または内表面上、例えば多孔質モノリスの表面上に位置する官能基であり得る。
別の実施形態では、本発明は、固体基材に固定されたポリマーを含む固体支持体を提供し、該ポリマーは、B、DおよびEサブユニットを含み、
Bサブユニットは、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
Dサブユニットは、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する反応基を含むか、またはDサブユニットは、捕捉プローブとの共有結合を含み、
Eサブユニットは、出現するごとに独立に、クリック官能基を含み、固体基材との共有結合、またはDサブユニットと固体基材の間に配置された任意選択のリンカー(L4)との共有結合を含む。
Bサブユニットは、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
Dサブユニットは、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する反応基を含むか、またはDサブユニットは、捕捉プローブとの共有結合を含み、
Eサブユニットは、出現するごとに独立に、クリック官能基を含み、固体基材との共有結合、またはDサブユニットと固体基材の間に配置された任意選択のリンカー(L4)との共有結合を含む。
また、ポリマーを固体基材に固定するための反応基を含む固体基材、このような固体支持体を調製するための化合物(例えば、ポリマー)および方法、ならびに関連する分析方法が提供される。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照すると明らかになろう。この目的を達成するために、本明細書では、特定の背景情報、手順、化合物および/または組成物をより詳細に説明している様々な参考文献を記載しており、これらの文献はそれぞれ、その全体が参考として本明細書に援用される。
図では、同一の参照番号は、類似の要素を識別するものである。図の要素のサイズおよび相対的な位置は、必ずしも一定の縮小比で描かれておらず、これらの要素のいくつかは、図の視認性を改善するために恣意的に拡大され、配置されている。さらに、図示されている要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関する任意の情報を伝達するものではなく、単に図による認識を容易にするために選択されている。
発明の詳細な説明
以下の説明において、本発明の種々の実施形態の充分な理解をもたらすために特定の具体的かつ詳細な説明を示す。しかしながら、当業者には、本発明がこれらの詳細な説明を伴わずに実施され得ることが理解されよう。
以下の説明において、本発明の種々の実施形態の充分な理解をもたらすために特定の具体的かつ詳細な説明を示す。しかしながら、当業者には、本発明がこれらの詳細な説明を伴わずに実施され得ることが理解されよう。
文脈からそうでないことが必要とされない限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、文言“含む(comprise)”およびその語尾変化形、例えば、“含む(comprises)”および“含んでいる(comprising)”は、非限定で包含的な意味、すなわち“含むが、それらに限定されない(including、but not limited to)”と解釈されたい。
本明細書全体を通して、“一実施形態(one embodimemt)”または“一実施形態(an embodimemt)”に対する言及は、該実施形態に関して記載した特定の特性、構造または特徴が本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体における種々の箇所での語句“一実施形態において(in one embodimemt)”または“一実施形態において(in an embodimemt)”の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に言及している訳ではない。さらに、具体的な特性、構造または特徴は、一つ以上の実施形態において任意の適当な手法で組み合わされ得る。
「アミノ」は−NH2基を指す。
「シアノ」は−CN基を指す。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は−OH基を指す。
「イミノ」は=NH置換基を指す。
「ニトロ」は−NO2基を指す。
「オキソ」は=O置換基を指す。
「チオキソ」は=S置換基を指す。
「アルキル」は、炭素原子と水素原子のみからなり、飽和または不飽和であり(すなわち、一つ以上の二重結合および/または三重結合を含む)、1〜12個の炭素原子(C1〜C12アルキル)、好ましくは1〜8個の炭素原子(C1〜C8アルキル)または1〜6個の炭素原子(C1〜C6アルキル)を有し、かつ分子の残部に単結合よって結合する直鎖または分枝鎖状炭化水素鎖基を指し、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、1−メチルエチル(イソ−プロピル)、n−ブチル、n−ペンチル、1,1−ジメチルエチル(t−ブチル)、3−メチルヘキシル、2−メチルヘキシル、エテニル、プロパ−1−エニル、ブタ−1−エニル、ペンタ−1−エニル、ペンタ−1,4−ジエニル、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなどを指す。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、アルキル基は場合により置換されていてよい。
「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、分子の残部を原子団基(radical group)に連結させ、炭素と水素のみからなり、飽和または不飽和であり(すなわち、一つ以上の二重結合および/または三重結合を含む)、かつ1〜12個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖状の二価の炭化水素鎖を指し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、n−ブチレン、エテニレン、プロペニレン、n−ブテニレン、プロピニレン、n−ブチニレンなどを指す。アルキレン鎖は分子の残部に単結合または二重結合によって結合し、該原子団基に単結合または二重結合によって結合する。分子の残部および該原子団基へのアルキレン鎖の結合点は該鎖内の1個の炭素を介する結合点であっても、任意の2個の炭素を介する結合点であってもよい。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、アルキレン鎖は場合により置換されていてよい。
「アルコキシ」は式−ORaの基を指し、式中、Raは、1〜12個の炭素原子を含む上に定義されるアルキル基である。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、アルコキシ基は場合により置換されていてよい。
「アルキルアミノ」は式−NHRaまたは−NRaRaの基を指し、式中、各Raは、独立して、1〜12個の炭素原子を含む上に定義されるアルキル基である。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、アルキルアミノ基は場合により置換されていてよい。
「チオアルキル」は式−SRaの基を指し、式中、Raは、1〜12個の炭素原子を含む上に定義されるアルキル基である。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、チオアルキル基は場合により置換されていてよい。
「アリール」は、水素、6〜18個の炭素原子および少なくとも一つの芳香環を含む炭化水素環系基を指す。本発明の目的に対して、アリール基は単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得、それらは、縮合環系または架橋型環系(bridged ring system)を含み得る。アリール基としては、限定されないが、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、フルオランテン、フルオレン、as−インダセン、s−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナントレン、プレイアデン、ピレン、およびトリフェニレンに由来するアリール基が挙げられる。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、用語「アリール」または接頭辞「アル(ar−)」(例えば、「アラルキル(aralkyl)」の)は、場合により置換されているアリール基を包含していることを意図する。
「アラルキル」は式−Rb−Rcの基を指し、式中、Rbは上に定義されるアルキレン鎖であり、Rcは、上に定義される一つ以上のアリール基であり、例えば、ベンジル、ジフェニルメチルなどである。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、アラルキル基は場合により置換されていてよい。
「シクロアルキル」または「炭素環式の環」は、炭素原子と水素原子のみからなり、縮合環系または架橋型環系を含み得、3〜15個の炭素原子を有し、好ましくは3〜10個の炭素原子を有し、飽和または不飽和であり、分子の残部に単結合によって結合する安定な非芳香族単環式または多環式炭化水素基を指す。単環式の基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられる。多環式の基としては、例えば、アダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、7,7−ジメチル−ビシクロ[2.2.1]ヘプタニルなどが挙げられる。本明細書において具体的にそうでないと記載していない限り、シクロアルキル基は場合により置換されていてよい。
「シクロアルキルアルキル」は式−RbRdの基を指し、式中、Rbは上に定義されるアルキレン鎖であり、Rdは上に定義されるシクロアルキル基である。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、シクロアルキルアルキル基は場合により置換されていてよい。
「縮合(した)」とは、本明細書に記載の任意の環構造が本発明の化合物の既に存在する環構造と縮合していることを指す。縮合環がヘテロシクリル環またはヘテロアリール環である場合、該縮合ヘテロシクリル環または該縮合ヘテロアリール環の一部となる既に存在する該環構造上のいずれかの炭素原子が窒素原子で置き換えられていてもよい。
「ハロ」または「ハロゲン」はブロモ、クロロ、フルオロまたはヨードを指す。
「ハロアルキル」は、一つ以上のハロ基(上に定義されるもの)で置換されている上に定義されるアルキル基を指し、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、2,2,2−トリフルオロエチル、1,2−ジフルオロエチル、3−ブロモ−2−フルオロプロピル、1,2−ジブロモエチルなどを指す。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、ハロアルキル基は場合により置換されていてよい。
「ヘテロシクリル」または「複素環式の環」は2〜12個の炭素原子と、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択される1〜6個のヘテロ原子とからなる安定な3〜18員の非芳香環基を指す。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、ヘテロシクリル基は単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得、それらは、縮合環系または架橋型環系を含み得、そして、ヘテロシクリル基中の窒素、炭素またはイオウ原子は場合により酸化されていてよく、該窒素原子は場合により四級化されていてよく、ヘテロシクリル基は部分飽和であっても完全飽和であってもよい。このようなヘテロシクリル基の例としては、限定されないが、ジオキソラニル、チエニル[1,3]ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、2−オキソピペラジニル、2−オキソピペリジニル、2−オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、4−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、1−オキソ−チオモルホリニル、および1,1−ジオキソ−チオモルホリニルが挙げられる。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、ヘテロシクリル基は場合により置換されていてよい。
「N−ヘテロシクリル」は、少なくとも1個の窒素を含み、分子の残部へのヘテロシクリル基の結合点が該ヘテロシクリル基中の窒素原子を介する結合点である、上に定義されるヘテロシクリル基を指す。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、N−ヘテロシクリル基は場合により置換されていてよい。
「ヘテロシクリルアルキル」は式−RbReの基を指し、式中、Rbは上に定義されるアルキレン鎖であり、Reは上に定義されるヘテロシクリル基であり、ヘテロシクリルが含窒素ヘテロシクリルである場合、該ヘテロシクリルは該アルキル基に窒素原子において結合し得る。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、ヘテロシクリルアルキル基は場合により置換されていてよい。
「ヘテロアリール」は、水素原子、1〜13個の炭素原子、窒素、酸素およびイオウからなる群より選択される1〜6個のヘテロ原子、ならびに少なくとも一つの芳香環を含む5〜14員の環系基を指す。本発明の目的に対して、ヘテロアリール基は単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得、それらは、縮合環系または架橋型環系を含み得、ヘテロアリール基中の窒素、炭素またはイオウ原子は場合により酸化されていてよく、該窒素原子は場合により四級化されていてよい。例としては、限定されないが、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾインドリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ[b][1,4]ジオキセピニル、1,4−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル(ベンゾチオフェニル)、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ[4,6]イミダゾ[1,2−a]ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、2−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、1−オキシドピリジニル、1−オキシドピリミジニル、1−オキシドピラジニル、1−オキシドピリダジニル、1−フェニル−1H−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、およびチオフェニル(すなわち、チエニル)が挙げられる。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、ヘテロアリール基は場合により置換されていてよい。
「N−ヘテロアリール」は、少なくとも1個の窒素を含み、分子の残部へのヘテロアリール基の結合点が該ヘテロアリール基の窒素原子を介する結合点である、上に定義されるヘテロアリール基を指す。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、N−ヘテロアリール基は場合により置換されていてよい。
「ヘテロアリールアルキル」は式−RbRfの基を指し、式中、Rbは上に定義されるアルキレン鎖であり、Rfは上に定義されるヘテロアリール基である。本明細書において明確にそうでないと記載していない限り、ヘテロアリールアルキル基は場合により置換されていてよい。
本明細書において使用される場合、用語「置換(された)」は、上記基(すなわち、アルキル、アルキレン、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、N−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、N−ヘテロアリール、および/またはヘテロアリールアルキル)のいずれかにおいて、少なくとも1個の水素原子が、非水素原子、例えば限定されないが、F、Cl、BrおよびIなどのハロゲン原子;ヒドロキシル基、アルコキシ基およびエステル基などの基中の酸素原子;チオール基、チオアルキル基、スルホン基、スルホニル基およびスルホキシド基などの基中のイオウ原子;アミン、アミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、N−オキシド、イミドおよびエナミンなどの基中の窒素原子;トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基およびトリアリールシリル基などの基中のケイ素原子;ならびに種々の他の基中の他のヘテロ原子に対する結合で置き換えられていることを意味する。また、「置換(された)」は、上記基のいずれかにおいて、1個以上の水素原子が、ヘテロ原子、例えば、オキソ、カルボニル、カルボキシルおよびエステル基中の酸素;ならびにイミン、オキシム、ヒドラゾンおよびニトリルなどの基中の窒素に対する高次結合(例えば、二重結合または三重結合)で置き換えられていることを意味する。例えば、「置換(された)」は、上記基のいずれかにおいて、1個以上の水素原子が−NRgRh、−NRgC(=O)Rh、−NRgC(=O)NRgRh、−NRgC(=O)ORh、−NRgSO2Rh、−OC(=O)NRgRh、−ORg、−SRg、−SORg、−SO2Rg、−OSO2Rg、−SO2ORg、=NSO2Rg、および−SO2NRgRhで置き換えられていることを包含する。また、「置換(された)は、上記基のいずれかにおいて、1個以上の水素原子が−C(=O)Rg、−C(=O)ORg、−C(=O)NRgRh、−CH2SO2Rg、−CH2SO2NRgRhで置き換えられていることを意味する。前述の事項において、RgとRhは同じであるかまたは異なっており、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、N−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、N−ヘテロアリールおよび/またはヘテロアリールアルキルである。「置換(された)」は、さらに、上記基のいずれかにおいて、1個以上の水素原子が、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、イミノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、N−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、N−ヘテロアリールおよび/またはヘテロアリールアルキル基に対する結合で置き換えられていることを意味する。また、前述の置換基の各々もまた、上記置換基のうちの一つ以上で、場合により置換されていてよい。
「安定な化合物」および「安定な構造」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離に耐えるのに充分に頑強である化合物を示すことを意図する。
「任意選択の」または「任意選択的に」は、続いて記載する事象または状況が起こっても、起こらなくてもよいこと、およびその記載が、該事象または状況が起こる場合と、起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「任意選択的に置換されているアリール」は、アリール基が置換されても、置換されなくてもよいこと、およびその記載が、置換されたアリール基と、置換を有しないアリール基の両方を含むことを意味する。
多くの場合、晶出および沈殿によって本発明の化合物の溶媒和物が生成される。本明細書において使用される場合、用語「溶媒和物」は、本発明の化合物の一つ以上の分子を、溶媒の一つ以上の分子と共に含む凝集体を指す。溶媒は水であってもよく、その場合、溶媒和物は水和物であり得る。あるいはまた、溶媒は有機溶媒であってもよい。したがって、本発明の化合物は、水和物(例えば、一水和物、二水和物、半水和物、セスキ水和物、三水和物、四水和物など)、ならびに対応する溶媒和形態として存在し得る。本発明の化合物は真の溶媒和物であり得るが、場合によっては、本発明の化合物は、単に付随的な水分を保持したものであっても、水といくらかの付随的な溶媒との混合物であってもよい。
本発明の化合物またはその塩もしくは互変異性体は、一つ以上の不斉中心を含むものであってもよく、したがって、エナンチオマー、ジアステレオマーおよび他の立体異性体形態(絶対立体化学に関して(R)−もしくは(S)−、またはアミノ酸では(D)−もしくは(L)−で規定され得るもの)が生じるものであってもよい。本発明は、このような可能な異性体のすべて、ならびにそのラセミ化合物および光学的に純粋な形態を包含することを意図する。光学活性な(+)および(−)、(R)−および(S)−、または(D)−および(L)−異性体は、キラルシントンまたはキラル試薬を用いて調製したものであっても、慣用的手法、例えばクロマトグラフィーおよび分別結晶を用いて分割したものであってもよい。個々のエナンチオマーの調製/単離のための慣用的手法としては、適当な光学的に純粋な前駆物質からのキラル合成、または、例えば、キラル高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用するラセミ化合物(あるいは塩もしくは誘導体のラセミ化合物)の分割が挙げられる。本明細書に記載の化合物がオレフィン性二重結合または他の幾何学的不斉中心を含むものである場合、特に記載のない限り、該化合物は、EとZの両方の幾何異性体を包含することを意図する。同様に、あらゆる互変異性体形態も包含されることを意図する。
「立体異性体」は、同じ結合によって結合された同じ原子から構成されているが、異なる3次元構造を有し、互換的でない化合物を指す。本発明では、種々の立体異性体およびその混合物が想定され、二つの立体異性体分子が互いに重なり合うことができない鏡像である二つの立体異性体を指す「エナンチオマー」を包含する。
「互変異性体」は、分子のある一つの原子から同じ分子の別の原子へのプロトンシフトを指す。本発明は、任意の上記化合物の互変異性体を包含する。
「ポリマー」は、一つまたは複数の繰り返しサブユニットを有する分子を指す。サブユニット(「モノマー」)は、同じでも異なっていてもよく、ポリマー中に任意の位置または順番で生じ得る。ポリマーは、天然または合成起源であってよい。本発明は、秩序化された繰り返しサブユニットを有するポリマー、ランダムコポリマーおよびブロックコポリマーを含めた、様々なタイプのポリマーを含む。
「ランダムコポリマー」は、ポリマー鎖に沿って無作為な順序で連結されている一より多くのタイプのサブユニットを含むポリマーを指す。ランダムコポリマーは、任意の数の異なるサブユニットを含むことができる。すなわち、ランダムコポリマーは、ポリマー鎖の任意の所与の部位において所与のモノマー単位を見出す確率が、隣接する単位の性質から独立しているポリマーである。「統計コポリマー」は、モノマーサブユニットの配列が統計的法則に従うコポリマーである。ポリマー鎖の特定の点において所与のタイプのモノマー残基を見出す確率が、鎖中のモノマー残基のモル分率と等しい場合、そのポリマーは、完全なランダムコポリマーと呼ぶことができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のポリマーは、「ランダムコターポリマー」であり、これは、ポリマーが、無作為な順番で連結された三つの異なるサブユニットを含むことを意味する。個々のサブユニットは、ランダムポリマー中に任意のモル比で存在することができ、例えば各サブユニットは、ポリマー中の他のサブユニットのモルに対して約0.1モル%〜約99.8モルパーセントで存在することができる。いくつかの実施形態では、ランダムコターポリマーのサブユニットは、以下の一般構造によって表すことができる。
式中、X、Y、およびZは、独立に、独特のサブユニットであり、a、b、およびcは、ポリマー中の各サブユニットの数を表す整数である。上記の構造は、説明しやすくするためにX、Y、およびZの直鎖状の連結を図示している。しかし、本発明のランダムコポリマー(例えば、ランダムコターポリマー)は、図示したサブユニットの連結を有するポリマーに限定されず、ランダムポリマー中のサブユニットは、任意の無作為な配列で連結することができ、コポリマーおよびコターポリマーは分岐状であってよいことを強調しておく。
「ブロックコポリマー」は、二つ以上のサブユニットの繰り返しブロックを含むポリマーを指す。
「官能基」は、特定のタイプの反応性(例えば、酸性、塩基性、求核性、求電子性等)を有する分子の一部である。「反応基」は、官能基の一つのタイプである。官能基の非限定的な例として、アジド、アルキン、アミン、アルコール等が挙げられる。「標的官能基」は、別の官能基が反応することが企図される任意の官能基である。「親水性官能基」は、親水性の特性を有する官能基である。親水性官能基は、一般に、水などの極性溶媒への全体的な分子の可溶性を増大させる傾向がある。
「共有結合性コンジュゲーション」は、二つ以上の官能基が反応することによって共有結合が形成されることを指す。
「直交性」または「直交反応性」は、官能基および/または反応基の反応特性を指す。二つの反応基が直交反応性を有する場合、第2の反応基が標的官能基と実質的な程度まで反応しない条件下で、反応基の一方がその標的官能基と反応すること、およびその逆のことを意味する。
「開始剤」は、重合反応を開始するために使用される分子である。開示のポリマーの調製に使用される開始剤は、当技術分野で周知である。代表的な開始剤として、原子移動ラジカル重合、リビング重合に有用な開始剤、AIBNファミリーの開始剤、およびベンゾフェノン開始剤が挙げられるが、それらに限定されない。「開始剤残基」は、ラジカルまたは他の機構を介してポリマーに付着する、開始剤の部分である。いくつかの実施形態では、開始剤残基は、開示のポリマーの末端に付着する。
「クリックケミストリー」は、少なくとも以下の特徴、(1)官能基の直交性を呈すること(すなわち、官能性部分は、他の反応性部位と反応することなく、その官能性部分に相補的な反応性部位だけと反応する)、および(2)得られた結合が不可逆的であること(すなわち、反応物が反応して生成物を形成すると、反応物への生成物の分解が困難になる)、またはある場合には、得られた結合が可逆的であり得ること(すなわち、適切な条件下では、反応物に戻る)を有する反応を指す。任意選択的に、「クリック」ケミストリーは、以下の特徴、(1)立体特異性、(2)厳密な精製、雰囲気制御等を伴わない反応条件、(3)容易に利用可能な出発材料および試薬、(4)無害な溶媒を利用できることまたは溶媒を全く利用せずに済むこと、(5)晶出または蒸留によって生成物が単離されること、(6)生理的安定性、(7)熱力学的駆動力が大きいこと(例えば、10〜20kcal/mol)、(8)単一の反応生成物、(9)高い化学的収率(例えば、50%超)、ならびに(10)副生成物が実質的に生成されないことまたは副生成物が環境に無害であること、の一つまたは複数をさらに有することができる。
「クリック」官能性を使用する反応の例として、限定されるものではないが、付加反応、環化付加反応、求核置換等を挙げることができる。環化付加反応の例として、ヒュスゲン1,3−双極性環化付加、Cu(I)触媒アジド−アルキン環化付加、およびディールスーアルダー反応を挙げることができる。付加反応の例として、エポキシ化およびジヒドロキシル化などの炭素−炭素二重結合への付加反応が挙げられる。求核置換の例として、エポキシおよびアジリジン化合物などのひずみを有する環への求核置換を挙げることができる。他の例として、尿素およびアミドの形成を挙げることができる。クリックケミストリーのいくつかのさらなる説明は、Huisgen, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 2, No. 11, 1963, pp. 633−696; Lewis et al., Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 41, No. 6, 2002, pp. 1053−1057; Rodionov et al., Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 44, 2005, pp. 2210−2215; Punna et al., Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 44, 2005, pp. 2215−2220; Li et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 127, 2005, pp. 14518−14524; Himo et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 127, 2005, pp. 210−216; Noodleman et al., Chem. Rev., Vol. 104, 2004, pp. 459−508; Sun et al., Bioconjugate Chem., Vol. 17, 2006, pp. 52−57; and Fleming et al., Chem. Mater., Vol. 18, 2006, pp. 2327−2334に見出すことができ、これらの内容全体が、参考として本明細書に援用される。
「クリック反応性」は、クリックケミストリー条件下で反応できる官能基を指す。
「クリック官能基」は、クリック反応性を有する二つの官能基の反応から得られる官能基、例えばトリアゾール部分等である。
「固体基材」は、外表面を有する任意の固体物質を指す。一般に外表面は、ポリマーを固定することができる(例えば、共有結合性の付着によって)官能基を有するか、または外表面は、表面がポリマーを固定できるように修飾され得る官能基を有する。適切な固体基材として、ガラスおよびポリマー支持体などの当技術分野で公知の固体基材のいずれかが挙げられる。固体基材は、光学的に透明であっても、不透明であっても、一部光学的に透明であってもよい。固体基材として、平面基材(すなわち、少なくとも一つの平らな表面を有する形状)、ならびにビーズ、粒子、多孔質マトリックス、多孔質モノリス等が挙げられる。非限定的な具体的な固体基材の例を、本明細書で以下に提供する。
「固体支持体」は、本明細書で使用される場合、ポリマーおよび/または捕捉プローブを含む固体基材であって、それに該ポリマーおよび/または捕捉プローブが固定されている、固体基材を指す。典型的に、ポリマーは、それぞれアジドとアルキンの反応、または反応性エステルとアミンから得られるアジド官能基またはアミド結合などにより、共有結合を介して固体基材に固定される。
固体支持体に関する「固定している」または「固定されている」には、共有結合性コンジュゲーション、非特異的会合、イオン性相互作用、および物質(例えば、ポリマー)を固体基材に接着させる他の手段が含まれる。
標的官能基「に対して特異的な反応性」を有する反応基とは、反応基が反応条件下で標的官能基と優先的に反応し、他の官能基との副反応が最小限にされているか、または存在しないことを意味する。同様に、捕捉プローブとのコンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する反応基とは、反応基が、反応条件下で捕捉プローブと優先的にコンジュゲートし、他の官能基との副反応が最小限にされているか、または存在しないことを意味する。
「分析物」または「分析物分子」は、分析の対象となる化合物または分子を指し、例えば分析物分子は、未知の構造の分子であってもよく、分析は、構造の識別を含む。分析物分子として、DNA、タンパク質、ペプチドおよび炭水化物、有機および無機分子、金属(放射性同位元素を含む)等を含めた、いくつもの一般的な分子が挙げられる。分析物として、ウイルス、細菌、変形体(plasmodium)、真菌および金属、ならびに細菌戦、生物災害および化学戦争材料が挙げられる。分析物には、本明細書で定義される分析物プローブも含まれる。
「捕捉プローブ」は、例えば水素結合(例えば、DNAハイブリダイゼーション)、封鎖、共有結合、イオン性相互作用等によって分析物分子と相互作用することができる分子である。例示的な捕捉プローブとして、オリゴヌクレオチドプローブまたはフラップ、オリゴ糖(例えばレクチン(lechtins))およびタンパク質と配列特異的に結合(ハイブリダイゼーション)することができるオリゴヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、フルオロフォア標識を含む。例えば、捕捉プローブは、フルオロフォア標識を含むことができ、分析物分子(例えば、分析物プローブ)は、クエンチャーを含むことができ、分析物分子の存在は、捕捉プローブからの蛍光信号が存在しないことによって検出される(蛍光は、クエンチャーと相互作用すると消光するため)。関連する実施形態では、捕捉プローブは、クエンチャーを含む。これらの実施形態では、蛍光標識された分析物分子の蛍光は、捕捉プローブによって捕捉されると消光する。
「プローブ」または「分析物プローブ」は、分析物分子を間接的に識別するために使用される分子を指す。例えば、プローブは、分析物分子を独特に識別する配列情報を担持することができる。例示的なプローブとして、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
「フラップ」は、プローブの任意選択の一部を指す。特定の実施形態では、フラップは、プローブ(したがって分析物分子)を独特に識別するための配列情報を含有する。フラップは、プローブの残りから切断され(例えばPCR条件下で)、固体支持体上の捕捉プローブとハイブリダイズし得る。固体支持体上の結合したフラップの存在は、特定の分析物の存在を示している。
A.ポリマー
前述の通り、本開示の一態様は、直交性反応基を有するポリマー(すなわち「直交性ポリマー」)を対象とする。ポリマーは、様々な適用で使用することができる。特定の実施形態では、ポリマーは、第1の反応基と固体基材上の標的官能基との反応によって、固体基材に共有結合により付着して、固体支持体をもたらすことができる。関連する実施形態では、基材に結合しているポリマーは、第2の反応基と捕捉プローブ上の標的官能基のコンジュゲーションによって、固体支持体に捕捉プローブを共有結合により付着させるために使用される。固定されたポリマーに共有結合により付着している捕捉プローブは、水性試料に溶解した分析物分子などの、試料に由来する分析物分子を捕捉/封鎖することができる。特定の実施形態では、捕捉機序として、錯体化、水素結合(例えば、DNAハイブリダイゼーション)、および/または共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用(例えば、抗体−ストレプトアビジン相互作用)を挙げることができる。
前述の通り、本開示の一態様は、直交性反応基を有するポリマー(すなわち「直交性ポリマー」)を対象とする。ポリマーは、様々な適用で使用することができる。特定の実施形態では、ポリマーは、第1の反応基と固体基材上の標的官能基との反応によって、固体基材に共有結合により付着して、固体支持体をもたらすことができる。関連する実施形態では、基材に結合しているポリマーは、第2の反応基と捕捉プローブ上の標的官能基のコンジュゲーションによって、固体支持体に捕捉プローブを共有結合により付着させるために使用される。固定されたポリマーに共有結合により付着している捕捉プローブは、水性試料に溶解した分析物分子などの、試料に由来する分析物分子を捕捉/封鎖することができる。特定の実施形態では、捕捉機序として、錯体化、水素結合(例えば、DNAハイブリダイゼーション)、および/または共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用(例えば、抗体−ストレプトアビジン相互作用)を挙げることができる。
他の実施形態では、固体基材にポリマーを固定するための反応基を有する固体基材を調製するのに有用な化合物も提供される。ポリマーを含む固体支持体は、アレイフォーマットのポリヌクレオチドのハイスループット分析を含む多種多様な方法において有用である。これに関する分析方法は、当技術分野で公知であり、本明細書において以下に詳説される。
開示のポリマーの特定の実施形態によって、捕捉プローブを固体支持体に固定するための他の手段を上回る利点が提供される。例えば、ポリマーの実施形態は、直交性反応基を含むので、固体支持体と捕捉プローブの間の連結を正確な制御が達成され得る。図1に示されている通り、ポリマーは、固体基材に固定するための一つまたは複数のサブユニット、捕捉プローブ(例えば、生体分子、ポリヌクレオチド、DNA等)とのコンジュゲーションのための一つまたは複数のサブユニット、およびポリマーの親水性を制御するための一つまたは複数のサブユニット(図1では「ヒドロゲル骨格」と示される)を含む。固定化サブユニットおよびコンジュゲーションサブユニットの数および位置を改変して、所望の形態および濃度の捕捉プローブを有する反応性表面(すなわち、捕捉プローブとのコンジュゲーションのための一つまたは複数の反応基を含む固体支持体の表面)を得ることができる。
本明細書に記載の方法およびポリマーとは対照的に、直交性反応基を有していないポリマーを使用する従来の方法は、反応性表面の形態に対してこのような制御を発揮することができず、多くの場合、バッチごとに変化し得る無作為な形態が得られる。さらに、ポリマーにおける親水性サブユニット(例えば、サブユニットB)の数を制御することによって、ポリマーの所望の親水性を得ることができる。捕捉プローブを、固体基材上に固定されたポリマーにコンジュゲートするには、活性な表面と、溶媒に溶解した捕捉プローブとの反応(すなわち「界面反応」)がしばしば必要であるので、水接触角を反応溶媒の親水性または疎水性の性質に従って変え得ることから、活性な表面の水接触角を制御する能力によって、より容易に界面反応がもたらされる。
したがって一実施形態では、本発明は、固体基材に固定するための一つまたは複数のサブユニット、および捕捉プローブとのコンジュゲーションのための一つまたは複数のサブユニットを含むポリマーを提供する。ポリマーは、場合によって、ポリマーの親水性を制御するためのサブユニットをさらに含むことができる。一実施形態では、本発明は、A、BおよびCサブユニットを含むポリマーを提供し、
Aサブユニットは、出現するごとに独立に、標的官能基との反応に対して特異的な反応性を有する第1の反応基を含み、
Bサブユニットは、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
Cサブユニットは、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する第2の反応基を含み、
第1の反応基および第2の反応基の反応性は、互いに直交性である。
Aサブユニットは、出現するごとに独立に、標的官能基との反応に対して特異的な反応性を有する第1の反応基を含み、
Bサブユニットは、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
Cサブユニットは、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する第2の反応基を含み、
第1の反応基および第2の反応基の反応性は、互いに直交性である。
いくつかの実施形態では、標的官能基は、固体基材上にあり、例えば固体基材の外表面上または多孔質ネットワーク(porous network)内にある。
特定の実施形態では、ポリマーは、ランダムコターポリマーなどのランダムコポリマーである。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマーは、以下の構造(I)
を有する[式中、
T1およびT2は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
x、yおよびzは、独立に、1〜350,000の整数である]。
T1およびT2は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
x、yおよびzは、独立に、1〜350,000の整数である]。
前述の実施形態のいくつかの実施形態では、x、yおよびzは、独立に、1〜50,000の整数である。
図示した構造(I)のA、BおよびCサブユニットの接続は、限定するものではなく、構造(I)のポリマーの実際の構造は、構造(I)のポリマーがランダムコポリマーであり、A、BおよびCサブユニットのそれぞれがポリマー内の任意の位置に生じる実施形態を含む。
他の実施形態では、ポリマーは、以下の構造(Ia)
を有する[式中、
A、BおよびCは、構造(Ia)のポリマー中に少なくとも1回存在し、
T1およびT2は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
x1、y1およびz1は、出現するごとに独立に、0または1であり、
nは、1〜700,000の整数である]。
A、BおよびCは、構造(Ia)のポリマー中に少なくとも1回存在し、
T1およびT2は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
x1、y1およびz1は、出現するごとに独立に、0または1であり、
nは、1〜700,000の整数である]。
前述の実施形態の他の実施形態では、nは、1〜150,000の整数である。
開始剤残基は、存在する場合、開始剤とポリマーの反応から生じる。開始剤残基の正確な構造は、変わる場合があり、重合反応中に使用される開始剤のタイプに依存する。特定の実施形態では、開始剤残基は、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、Rは、1〜10個の炭素原子、ならびに任意選択の窒素および酸素原子を含むアルキル基である]。
前述の実施形態のいずれかでは、ポリマーは、該ポリマーの末端位置にAサブユニットを含む。
前述の実施形態の他の実施形態では、Aサブユニットは、出現するごとに独立に、以下の構造(II)
を有する[式中、
R1は、第1の反応基であり、
L1は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーである]。
R1は、第1の反応基であり、
L1は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーである]。
前述の実施形態のさらに他の実施形態では、Aサブユニットは、出現するごとに独立に、以下の構造(III)
を有する[式中、
R1は、第1の反応基であり、
R2は、水素またはアルキルであり、
L1は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
αは、0〜10の範囲の整数である]。
R1は、第1の反応基であり、
R2は、水素またはアルキルであり、
L1は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
αは、0〜10の範囲の整数である]。
前述の実施形態のさらなる実施形態では、L1は、アルキレン、エステル、アルキレンオキシド、アミド、イミド、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む。他の実施形態では、L1は、存在しない。
前述の実施形態のいくつかの実施形態では、αは1である。前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、R2はHである。
第1の反応基の実際の構造または反応性は、第1の反応基が第2の反応基に対して直交反応性を有する限り、制限されない。いくつかの実施形態では、R1は、アルキン、アルキルシリルで保護されたアルキン、アジド、ニトリル、チオール、アルケン、マレイミド、エポキシド、アジリジンまたはチイラン官能基である。特定の実施形態では、R1は、アルキンまたはアジド官能基である。
他の実施形態では、βは、1または3であり、他の態様では、χは1である。
他の実施形態では、少なくとも一つのAサブユニットは、T1に共有結合している末端位置にある。例えば、いくつかの実施形態では、T1はHである。
他の態様では、Aサブユニットの少なくとも一つは、以下の構造
を有する[式中、R3は、アリールである]。例えば、このような構造は、アルキン部分を含むポリマーの調製に有用であり得る。例えば、Aサブユニットの少なくとも一つは、特定の実施形態では、以下の構造
を有することができる。
前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、第1の反応基は、出現するごとに独立に、クリック反応性を有する。例えば特定の実施形態では、第1の反応基は、出現するごとに独立に、アジドとの反応に対して特異的である。例えば第1の反応基は、いくつかの実施形態では、出現するごとに独立に、アルキンである。他の実施形態では、第1の反応基は、出現するごとに独立に、アルキンとの反応に対して特異的である。例えば、いくつかの実施形態では、第1の反応基は、出現するごとに独立に、アジドである。
特定の他の実施形態では、第1の反応基の反応性は、出現するごとに独立に、固体基材上のアミン基に対して特異的である。他の実施形態では、第1の反応基は、出現するごとに独立に、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)エステル、スクシンイミジルアセチルチオアセテート(SATA)、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、アリールエステル、イミドエステル、イソシアネート、ソラレン、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アズラクトンまたはベンゾフェノンである。いくつかのより具体的な実施形態では、第1の反応基は、出現するごとに独立に、NHSエステル、アズラクトンまたはアリールエステルである。
前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、第1の反応基は、出現するごとに独立に、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
R6、R7、R8およびR9は、それぞれ独立に、Hまたはアルキルであり、
R10、R11、R12、R13およびR14は、それぞれ独立に、H、電子求引基、−NCS、−NCO、−CO2H、−SO3H、−L’−ポリまたはそれらの塩であり、L’は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、ポリは、水溶性ポリマーである]。
R6、R7、R8およびR9は、それぞれ独立に、Hまたはアルキルであり、
R10、R11、R12、R13およびR14は、それぞれ独立に、H、電子求引基、−NCS、−NCO、−CO2H、−SO3H、−L’−ポリまたはそれらの塩であり、L’は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、ポリは、水溶性ポリマーである]。
いくつかの実施形態では、R6、R7、R8およびR9のそれぞれは、Hである。他の実施形態では、R10、R11、R12、R13またはR14の少なくとも一つは、電子求引基である。他の実施形態では、R10、R11、R12、R13またはR14のそれぞれは、電子求引基である。例えば、いくつかの実施形態では、電子求引基は、ハロゲン、ニトロまたはニトリルであり、他のより具体的な実施形態では、電子求引基は、フルオロである。
いくつかの他の実施形態では、第1の反応基のそれぞれは、上記の構造を有する。
前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、Cサブユニットは、出現するごとに独立に、以下の構造(IV)
を有する[式中、
R4は、第2の反応基であり、
R5は、水素またはアルキルであり、
L2は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
δは、0〜10の範囲の整数である]。
R4は、第2の反応基であり、
R5は、水素またはアルキルであり、
L2は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
δは、0〜10の範囲の整数である]。
前述の実施形態のいくつかでは、L2は、アルキレン、エステル、アルキレンオキシド、アミド、イミド、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む。他の実施形態では、L2は、存在しない。
前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、δは1であり、他の実施形態では、R5はHである。
特定の実施形態では、第2の反応基の反応性は、出現するごとに独立に、捕捉プローブにおけるアミン基に対して特異的である。他の実施形態では、第2の反応基は、出現するごとに独立に、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)エステル、スクシンイミジルアセチルチオアセテート(SATA)、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、アリールエステル、イミドエステル、イソシアネート、ソラレン、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アズラクトンまたはベンゾフェノンである。いくつかのより具体的な実施形態では、第2の反応基は、出現するごとに独立に、NHSエステル、アズラクトンまたはアリールエステルである。
前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、第2の反応基は、出現するごとに独立に、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
R6、R7、R8およびR9は、それぞれ独立に、Hまたはアルキルであり、
R10、R11、R12、R13およびR14は、それぞれ独立に、H、電子求引基、−NCS、−NCO、−CO2H、−SO3H、−L’−ポリまたはそれらの塩であり、L’は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、ポリは、水溶性ポリマーである]。
R6、R7、R8およびR9は、それぞれ独立に、Hまたはアルキルであり、
R10、R11、R12、R13およびR14は、それぞれ独立に、H、電子求引基、−NCS、−NCO、−CO2H、−SO3H、−L’−ポリまたはそれらの塩であり、L’は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、ポリは、水溶性ポリマーである]。
いくつかの実施形態では、R6、R7、R8およびR9のそれぞれは、Hである。他の実施形態では、R10、R11、R12、R13またはR14の少なくとも一つは、電子求引基である。他の実施形態では、R10、R11、R12、R13またはR14のそれぞれは、電子求引基である。例えば、いくつかの実施形態では、電子求引基は、ハロゲン、ニトロまたはニトリルであり、他のより具体的な実施形態では、電子求引基は、フルオロである。
他の実施形態では、第2の反応基のそれぞれは、上記の構造を有する。
いくつかの他の実施形態では、Cサブユニットは、出現するごとに独立に、クリック反応性を有する。例えば、捕捉プローブは、クリック官能基を含むことができ、捕捉プローブは、クリックケミストリーを使用してポリマーにコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、R4は、アルキン、アルキルシリルで保護されたアルキン、アジド、ニトリル、チオール、アルケン、マレイミド、エポキシド、アジリジンまたはチイラン官能基である。特定の実施形態では、R4は、アルキンまたはアジド官能基である。
他の実施形態では、βは、1または3であり、他の態様では、χは1である。
他の実施形態では、少なくとも一つのCサブユニットは、T2に共有結合している末端位置にある。例えば、いくつかの実施形態では、T2はHである。
他の態様では、Cサブユニットの少なくとも一つは、以下の構造
を有する[式中、R3は、アリールである]。例えば、このような構造は、アルキン部分を含むポリマーの調製に有用であり得る。例えば、Cサブユニットの少なくとも一つは、特定の実施形態では、以下の構造
を有することができる。
いくつかの実施形態では、ポリは、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(メチルビニルエーテル)、ポリ(エチルビニルエーテル)、ポリ(N−ビニルホルムアミド)、ポリ(N−ビニルアセトアミド)またはポリ(N−メチル−N−ビニルアセトアミド)である。
前述のポリマーの他の具体的な実施形態では、Cサブユニットの少なくとも一つは、T2に共有結合している末端位置にある。例えば、特定の実施形態では、T2はHである。
前述の実施形態のいくつかでは、Bサブユニットは、出現するごとに独立に、以下の構造(V)
を有する[式中、
R15は、親水性官能基であり、
R16は、水素またはアルキルであり、
L3は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
εは、0〜10の範囲の整数である]。
R15は、親水性官能基であり、
R16は、水素またはアルキルであり、
L3は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
εは、0〜10の範囲の整数である]。
特定の実施形態では、L3は、アルキレン、エステル、アルキレンオキシド、アミド、イミド、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む。他の実施形態では、L3は、存在しない。
いくつかの実施形態では、εは1であり、他の実施形態では、R16はHである。
前述の実施形態の他の実施形態では、R15は、出現するごとに独立に、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
R17、R18、R19、R20、R21、R22およびR23は、それぞれ独立に、H、アルキルまたはヒドロキシルアルキルであり、
φは、1〜200の範囲の整数である]。
R17、R18、R19、R20、R21、R22およびR23は、それぞれ独立に、H、アルキルまたはヒドロキシルアルキルであり、
φは、1〜200の範囲の整数である]。
前述の実施形態のいくつかの実施形態では、R17、R18、R19、R20、R21、R22およびR23は、それぞれ独立に、Hまたはメチルである。他の実施形態では、R15は、出現するごとに独立に、以下の構造
を有する。
前述の実施形態のいずれかでは、ポリマーは、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
A、BおよびCサブユニットは、ポリマー中に少なくとも1回存在し、
OPFPは、ペンタフルオロフェノキシを表し、
T1およびT2は、それぞれ独立に、存在しないか、またはHおよびアルキルから選択されるポリマー末端基であり、
x、yおよびzは、それぞれ独立に、1〜350,000の整数である]。
A、BおよびCサブユニットは、ポリマー中に少なくとも1回存在し、
OPFPは、ペンタフルオロフェノキシを表し、
T1およびT2は、それぞれ独立に、存在しないか、またはHおよびアルキルから選択されるポリマー末端基であり、
x、yおよびzは、それぞれ独立に、1〜350,000の整数である]。
前述の実施形態のいくつかでは、x、yおよびzは、それぞれ独立に、1〜50,000の整数である。
他の例示的な実施形態では、ポリマーは、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
A、BおよびCサブユニットは、ポリマー中に少なくとも1回存在し、
OPFPは、ペンタフルオロフェノキシを表し、
T1およびT2は、それぞれ独立に、存在しないか、またはHおよびアルキルから選択されるポリマー末端基であり、
x1、y1およびz1は、出現するごとに独立に、0または1であり、
nは、1〜700,000の整数である]。
A、BおよびCサブユニットは、ポリマー中に少なくとも1回存在し、
OPFPは、ペンタフルオロフェノキシを表し、
T1およびT2は、それぞれ独立に、存在しないか、またはHおよびアルキルから選択されるポリマー末端基であり、
x1、y1およびz1は、出現するごとに独立に、0または1であり、
nは、1〜700,000の整数である]。
前述の実施形態の他の実施形態では、nは、1〜150,000の整数である。
前述の通り、ポリマーの親水性、したがって得られた固体支持体表面の水接触角は、Bサブユニット、およびポリマーに組み込まれるサブユニットの数を適切に選択することによって少なくとも部分的に制御され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ポリマー中のサブユニットの少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%は、Bサブユニットである。
他の実施形態では、A、BおよびCサブユニットのモル分率は、変わり得る。例えばA、BおよびCサブユニットのそれぞれのモル分率は、約0.1モル%から約99.8モル%まで変わり得る。いくつかの例示的な実施形態では、A、BおよびCサブユニットの合計の総モルパーセントは、100%である。
特定の実施形態では、Aサブユニットのモルパーセントは、約1%〜約30%、例えば約15%〜約25%の範囲である。他の実施形態では、Bサブユニットのモルパーセントは、約20%〜約60%、例えば約35%〜約45%の範囲である。他の実施形態では、Cサブユニットのモルパーセントは、約20%〜約60%、例えば約35%〜約45%の範囲である。他のさらなる実施形態では、Aサブユニットのモルパーセントは、約15%〜約25%の範囲であり、Bサブユニットのモルパーセントは、約35%〜約45%の範囲であり、Cサブユニットのモルパーセントは、約35%〜約45%の範囲である。さらに他の実施形態では、Aサブユニットのモルパーセントは、約20%であり、Bサブユニットのモルパーセントは、約40%であり、Cサブユニットのモルパーセントは、約40%である。
特定の実施形態では、ポリマーは、ただ一つのAサブユニットを含む。例えば、いくつかの実施形態では、Aサブユニットは、ポリマーの末端にある。
前述の実施形態のいずれかの様々な実施形態では、捕捉プローブは、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチドまたは炭水化物である。例えば、いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ポリヌクレオチドである。他の実施形態では、捕捉プローブは、DNAである。
特定の実施形態では、本発明はまた、固体基材の表面を活性化するのに有用な化合物を提供する。活性化された基材は、前述のポリマーを固定して(例えば、共有結合性の付着を介して)固体支持体を調製することを含めたいくつもの用途で使用することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、光分解性(photolizable)アジド部分、およびアルキルアジドまたはアルキン部分のいずれかを含み、ここでアルキンまたはアルキルアジドは、リンカー部分(例えば、ポリマー)を介して光分解性(photolysable)アジドに連結されている。光分解性アジドは、適切な光源を用いて照射すると、固体基材の表面上のC−H結合にニトレンを挿入することができる任意のアジド部分であり得る。このような方法は、当技術分野で周知である。特定の実施形態では、光分解性アジドは、アリールアジドである。
いくつかの実施形態では、固体基材の表面を活性化するための化合物は、以下の構造(IX)
を有する[式中、
Xは、アジドまたはアルキン部分であり、
L5およびL6は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステルもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
R26、R27、R28およびR29は、それぞれ独立に、H、アルキル、ハロ、ニトリル、ニトロまたはアンモニウムであり、
Pは、−(OCH2CH2)−または−(CH2)−であり、
Aは、直接結合または−S(O)2−であり、
ιは、0〜10の範囲の整数であり、
γは、1〜2000の範囲の整数である]。
Xは、アジドまたはアルキン部分であり、
L5およびL6は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステルもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
R26、R27、R28およびR29は、それぞれ独立に、H、アルキル、ハロ、ニトリル、ニトロまたはアンモニウムであり、
Pは、−(OCH2CH2)−または−(CH2)−であり、
Aは、直接結合または−S(O)2−であり、
ιは、0〜10の範囲の整数であり、
γは、1〜2000の範囲の整数である]。
いくつかの実施形態では、R26、R27、R28およびR29のそれぞれは、Hである。他の実施形態では、Aは直接結合である。
いくつかの実施形態では、Pは、−(OCH2CH2)−である。他の実施形態では、Pは、−(CH2)−である。P部分、およびその部分における繰り返しサブユニットの数(すなわちγ)を注意深く選択することによって、本発明の出願人らは、得られた表面の水接触角が、上記のポリマーを固定するのに必要な界面反応に最適であり得ることを発見した。
前述の化合物のいくつかの特定の実施形態では、γは、1〜100、例えば55〜90の範囲である。
本明細書に記載の化合物および/またはポリマーの任意の実施形態、ならびに本明細書に記載の化合物および/またはポリマーにおける本明細書に記載の任意の特定の置換基は、独立に、本明細書に記載の化合物および/またはポリマーの他の実施形態および/または置換基と組み合わせて、具体的に記載されていない本発明の実施形態を形成できると理解される。さらに、特定の一実施形態および/または特許請求の範囲において、任意の特定のR基について置換基の一覧が列挙されている場合、個々の各置換基は、特定の実施形態および/または特許請求の範囲から排除することができ、置換基の残りの一覧は、本発明の範囲内であるとみなされると理解される。
本説明では、図示した式の置換基および/または変数の組合せは、このような寄与が安定な化合物をもたらす場合にのみ容認されると理解される。
開示の化合物およびポリマーを調製する方法は、当業者に容易に理解されよう。例えば、特定の実施形態では、本発明のポリマーは、所望の比のサブユニットおよび任意選択の活性化因子(例えば、熱重合ではAIBN、またはATRPでは触媒)を混合することによって調製され得る。アジドまたはアルキンなどのクリック官能基を含むサブユニットおよびポリマーは、当技術分野で公知の方法に従って調製されてもよく、商業的供給源から購入されてもよい(例えば、プロパルギルアクリレートまたは3−アジドプロピルアクリレート)。例えば、S.R. Gondi, el at., Macromolecules 2007, 40, 474−481; P.J. Roth, el at., J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2009, 47, 3118−3130;およびC. Li, et al., Macromolecules, 2009, 42, 2916-2924を参照されたい。これらの開示は、その全体が参考として本明細書に援用される。例示的な方法は、実施例に提供される。
また、当業者には、本明細書に記載のプロセスにおいて、中間体化合物の官能基を適当な保護基で保護する必要があり得ることも認識される。このような官能基としてはヒドロキシ、アミノ、メルカプトおよびカルボン酸が挙げられる。ヒドロキシに対する好適な保護基としては、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル(例えば、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル)、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどが挙げられる。アミノ、アミジノおよびグアニジノに対する好適な保護基としては、t−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが挙げられる。メルカプトに対する好適な保護基としては、−C(O)−R”(式中、R”はアルキル、アリールまたはアリールアルキルである)、p−メトキシベンジル、トリチルなどが挙げられる。カルボン酸に対する好適な保護基としては、アルキル、アリールまたはアリールアルキルエステルが挙げられる。保護基は、当業者に公知の標準的な手法に従って、本明細書に記載のようにして付加または除去され得る。保護基の使用は、Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wileyに詳細に記載されている。当業者が認識するであろうとおり、保護基はまた、Wang樹脂、Rink樹脂または2−クロロトリチルクロリド樹脂などの高分子樹脂であってもよい。
さらに、遊離の塩基または酸の形態で存在する本発明のすべての化合物および/またはポリマーは、当業者に公知の方法による適切な無機塩基、無機酸、有機塩基または有機酸での処理によって、塩に変換され得る。本発明の化合物の塩は、標準的な手法によって、その遊離塩基または酸の形態に変換され得る。
B.固体支持体
前述の通り、本発明の特定の態様は、固体支持体も含む。固体支持体は、それに固定されたポリマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、固体支持体上にさらなるポリマーを固定するための官能基を含む。他の実施形態では、固定されたポリマーは、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションのための官能基を含むか、または固定されたポリマーは、それにコンジュゲートした捕捉プローブを含む。固体支持体は、いくつかの分析アッセイで使用することができ、特定の実施形態では、このようなアッセイとして、DNAマイクロアレイアッセイなどのアレイフォーマットのアッセイが挙げられる。
前述の通り、本発明の特定の態様は、固体支持体も含む。固体支持体は、それに固定されたポリマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、固体支持体上にさらなるポリマーを固定するための官能基を含む。他の実施形態では、固定されたポリマーは、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションのための官能基を含むか、または固定されたポリマーは、それにコンジュゲートした捕捉プローブを含む。固体支持体は、いくつかの分析アッセイで使用することができ、特定の実施形態では、このようなアッセイとして、DNAマイクロアレイアッセイなどのアレイフォーマットのアッセイが挙げられる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、固体基材の外表面に固定されたポリマーを含む固体支持体を提供し、該ポリマーは、B、DおよびEサブユニットを含み、
Bサブユニットは、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
Dサブユニットは、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する反応基を含むか、またはDサブユニットは、捕捉プローブとの共有結合を含み、
Eサブユニットは、出現するごとに独立に、二つの相補的なクリック官能基の反応生成物を含み、反応生成物は、固体基材の外表面との共有結合、またはEサブユニットと固体基材の外表面の間に配置された任意選択のリンカー(L4)との共有結合を含む。
Bサブユニットは、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
Dサブユニットは、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する反応基を含むか、またはDサブユニットは、捕捉プローブとの共有結合を含み、
Eサブユニットは、出現するごとに独立に、二つの相補的なクリック官能基の反応生成物を含み、反応生成物は、固体基材の外表面との共有結合、またはEサブユニットと固体基材の外表面の間に配置された任意選択のリンカー(L4)との共有結合を含む。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、ランダムコポリマー、例えばランダムターポリマーである。
前述の固体支持体のいくつかの実施形態では、ポリマーは、ランダムターポリマーなどのランダムコポリマーである。前述の固体支持体のいくつかの実施形態では、ポリマーは、以下の構造(VI)
を有する[式中、
T3およびT4は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
q、rおよびsは、それぞれ独立に、1〜350,000の整数である]。
T3およびT4は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
q、rおよびsは、それぞれ独立に、1〜350,000の整数である]。
いくつかの他の実施形態では、q、rおよびsは、それぞれ独立に、1〜50,000の整数である。
図示した構造(VI)のB、DおよびEサブユニットの接続は、限定するものではなく、特定の実施形態では、構造(VI)のポリマーの実際の構造は、ランダムコポリマーであり、B、DおよびEサブユニットのそれぞれは、ポリマーの任意の位置に生じる。
前述の固体支持体のいくつかの他の実施形態では、ポリマーは、以下の構造(VIa)
を有する[式中、
B、DおよびEは、構造(VIa)のポリマー中に少なくとも1回存在し、
T3およびT4は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
q1、r1およびs1は、出現するごとに独立に、0または1であり、
mは、1〜700,000の整数である]。
B、DおよびEは、構造(VIa)のポリマー中に少なくとも1回存在し、
T3およびT4は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
q1、r1およびs1は、出現するごとに独立に、0または1であり、
mは、1〜700,000の整数である]。
他の実施形態では、mは、1〜150,000の整数である。
他の例では、クリック官能基は、アルキン、アミン、アルキルシリルで保護されたアルキン、アジド、ニトリル、チオール、アルケン、マレイミド、エポキシド、アジリジンまたはチイラン官能基と、相補的なクリック反応基との反応によって形成され得る。
前述の固体支持体の他の実施形態では、Eサブユニットは、ポリマーの末端位置にある。
他の実施形態では、Eサブユニットは、出現するごとに独立に、以下の構造(VI)
を有する[式中、
L1は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
RPは、反応生成物であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
Qは、固体基材の外表面を表す]。
L1は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
RPは、反応生成物であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
Qは、固体基材の外表面を表す]。
いくつかの実施形態では、L4は、最大100個の原子の長さである。
他の実施形態では、Eサブユニットのそれぞれは、上記の構造(VI)を有する。
前述の固体支持体の他の実施形態では、Eサブユニットは、出現するごとに独立に、以下の構造(VII)
を有する[式中、
L1は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
RPは、反応生成物であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
R2は、Hまたはアルキル(alky)であり、
Qは、固体基材の外表面を表す]。
L1は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
RPは、反応生成物であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
R2は、Hまたはアルキル(alky)であり、
Qは、固体基材の外表面を表す]。
他の実施形態では、Eサブユニットのそれぞれは、上記の構造(VII)を有する。
前述の固体支持体のさらに他の実施形態では、L1は、アルキレン、エステル、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む。他の実施形態では、L1は、存在しない。
いくつかの実施形態では、αは1である。他の実施形態では、R2はHである。
前述の固体支持体のさらに他の実施形態では、L4は、ケイ素−酸素結合、アルキレン鎖、ポリマーまたはそれらの組合せを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。いくつかの態様では、ポリエチレングリコールは、1〜50,000(例えば、10〜50,000)個のモノマーサブユニットを含む。他の実施形態では、ポリエチレングリコールは、1〜90個のモノマーサブユニットを含む。例えば、他の実施形態では、ポリエチレングリコールは、55〜90個のモノマーサブユニットを含む。
前述の固体支持体のいくつかの実施形態では、L4は、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
L5およびL6は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステルもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
R24およびR25は、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシまたは−OQであり、Qは、固体基材の外表面であり、
R26、R27、R28およびR29は、それぞれ独立に、H、アルキル、ハロ、ニトリル、ニトロまたはアンモニウムであり、
Pは、ポリマーサブユニットを表し、
Aは、直接結合または−S(O)2−であり、
γは、1〜2000の整数であり、
L4は、末端窒素または酸素原子を介して固体基材に結合している]。
L5およびL6は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステルもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
R24およびR25は、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシまたは−OQであり、Qは、固体基材の外表面であり、
R26、R27、R28およびR29は、それぞれ独立に、H、アルキル、ハロ、ニトリル、ニトロまたはアンモニウムであり、
Pは、ポリマーサブユニットを表し、
Aは、直接結合または−S(O)2−であり、
γは、1〜2000の整数であり、
L4は、末端窒素または酸素原子を介して固体基材に結合している]。
前述の実施形態の特定の実施形態では、Pは、−CH2−または−OCH2CH2−である。
特定の実施形態では、γは、1〜90、例えば55〜90の範囲である。他の実施形態では、L4は、存在しない。
前述の固体支持体のいくつかの実施形態では、クリック官能基は、トリアゾールである。例えば、いくつかの実施形態では、Eサブユニットは、出現するごとに独立に、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
βおよびχは、それぞれ独立に、1〜5の範囲の整数であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
Qは、固体基材を表す]。
βおよびχは、それぞれ独立に、1〜5の範囲の整数であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
Qは、固体基材を表す]。
他の実施形態では、Eサブユニットのそれぞれは、上記の構造のうちの一つを有する。
他の実施形態では、少なくとも一つのEサブユニットは、T4に共有結合している末端位置にある。例えば、いくつかの実施形態では、T4はHである。
特定の実施形態では、L4は、一つまたは複数のポリエチレングリコール繰り返し単位を含む。
前述の固体支持体の他の実施形態では、Bサブユニットは、前述のポリマーの実施形態のいずれかにおいてBサブユニットについて定義された通りである。前述の固体支持体のいくつかの他の実施形態では、Dサブユニットは、前述のポリマーの実施形態のいずれかにおいてCサブユニットについて定義された通りである。
特定の実施形態では、少なくとも一つのDサブユニットは、捕捉プローブとの共有結合を含む。例えば、いくつかの例では、少なくとも一つのDサブユニットは、以下の構造(VIII)
を有する[式中、
Mは、捕捉プローブであり、
R5は、水素またはアルキルであり、
L2は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
δは、0〜10の範囲の整数である]。
Mは、捕捉プローブであり、
R5は、水素またはアルキルであり、
L2は、最大100個の原子の長さの任意選択のリンカーであり、
δは、0〜10の範囲の整数である]。
他の実施形態では、Dサブユニットのそれぞれは、上記の構造(VIII)を有する。
いくつかの実施形態では、L2は、アルキレン、エステル、カルボニル、アルキレンオキシド、アミド、イミドエーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む。他の実施形態では、δは1である。さらに他の実施形態では、R5はHである。
他の実施形態では、Dサブユニットのそれぞれは、上記の構造のうちの一つを有する。
前述の固体支持体のさらに他の実施形態では、固体支持体の表面は、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
B、DおよびEサブユニットは、ポリマー中に少なくとも1回存在し、
T3およびT4は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
q、rおよびsは、それぞれ独立に、1〜350,000の整数であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
Mは、出現するごとに独立に、捕捉プローブを表し、
Qは、固体基材の外表面を表す]。
B、DおよびEサブユニットは、ポリマー中に少なくとも1回存在し、
T3およびT4は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
q、rおよびsは、それぞれ独立に、1〜350,000の整数であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
Mは、出現するごとに独立に、捕捉プローブを表し、
Qは、固体基材の外表面を表す]。
前述の固体支持体のいくつかの他の実施形態では、固体支持体の表面は、以下の構造
のうちの一つを有する[式中、
B、DおよびEサブユニットは、ポリマー中に少なくとも1回存在し、
T3およびT4は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
q1、r1およびs1は、出現するごとに独立に、0または1であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
Mは、出現するごとに独立に、捕捉プローブを表し、
Qは、固体基材の外表面を表し、
mは、1〜150,000の整数である]。
B、DおよびEサブユニットは、ポリマー中に少なくとも1回存在し、
T3およびT4は、それぞれ独立に、存在しないか、またはH、アルキルおよび開始剤残基から選択されるポリマー末端基であり、
q1、r1およびs1は、出現するごとに独立に、0または1であり、
L4は、任意選択のリンカーであり、
Mは、出現するごとに独立に、捕捉プローブを表し、
Qは、固体基材の外表面を表し、
mは、1〜150,000の整数である]。
前述の実施形態の特定の実施形態では、L4は、上記の実施形態のいずれかに定義されている通りである。
前述の固体支持体の他の実施形態では、捕捉プローブは、窒素原子を介してDサブユニットに共有結合している。いくつかの態様では、捕捉プローブは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドである。例えば、いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、DNAなどのポリヌクレオチドである。
固体支持体の水接触角は、溶媒、例えば水性溶媒に溶解した分析物分子との界面反応を可能にするように制御される(例えば、Bサブユニットの数およびタイプを制御することによって)。これに関して、水接触角は、一般に、溶解した分析物と、固体支持体の反応性表面(すなわち、ポリマーが固定されている表面)の接触を増強するように調整される。いくつかの実施形態では、固体支持体の水接触角は、約50°〜90°、例えば約50°〜70°の範囲である。いくつかの実施形態では、水接触角は、約55°〜65°の範囲であり、他の実施形態では、水接触角は、約60°〜65°の範囲であり、さらに他の実施形態では、水接触角は、約80°〜90°の範囲である。水接触角を決定する方法は、当技術分野で周知である。
したがって、いくつかの実施形態では、ポリマー中のサブユニットの少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%は、Bサブユニットである。
他の実施形態では、B、DおよびEサブユニットのモル分率は、変わり得る。例えばB、DおよびEサブユニットのそれぞれのモル分率は、約0.1モル%から約99.8モル%まで変わり得る。いくつかの例示的な実施形態では、B、DおよびEサブユニットの合計の総モルパーセントは、100%である。
特定の実施形態では、Eサブユニットのモルパーセントは、約1%〜約30%、例えば約15%〜約25%の範囲である。他の実施形態では、Bサブユニットのモルパーセントは、約20%〜約60%、例えば約35%〜約45%の範囲である。他の実施形態では、Dサブユニットのモルパーセントは、約20%〜約60%、例えば約35%〜約45%の範囲である。他のさらなる実施形態では、Eサブユニットのモルパーセントは、約15%〜約25%の範囲であり、Bサブユニットのモルパーセントは、約35%〜約45%の範囲であり、Dサブユニットのモルパーセントは、約35%〜約45%の範囲である。さらに他の実施形態では、Eサブユニットのモルパーセントは、約20%であり、Bサブユニットのモルパーセントは、約40%であり、Dサブユニットのモルパーセントは、約40%である。
特定の実施形態では、ポリマーは、ただ一つのEサブユニットを含む。例えば、いくつかの実施形態では、Eサブユニットは、ポリマーの末端にある。
本発明の実施において用いられる固体基材のタイプは、制限されない。一般に固体基材は、開示のポリマーの固定化を受ける可能性のあるタイプおよび/またはポリマーが固体基材に固定され得るように活性化を受ける可能性のあるタイプの固体基材である。本発明の範囲に含まれる固体基材として、限定されるものではないが、光学的に透明および不透明なポリマーが挙げられる。平面基材、ビーズ、粒子、多孔質マトリックスおよび多孔質モノリスの形態の固体基材も、特定の実施形態に含まれる。
いくつかの実施形態では、固体基材は、有機ポリマーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、固体支持体は、ポリ(スチレン)、ポリ(カーボネート)、ポリ(エーテルスルホン)、ポリ(ケトン)、ポリ(脂肪族エーテル)、ポリ(アリールエーテル)、ポリ(アミド) ポリ(イミド)、ポリ(エステル) ポリ(アクリレート)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(オレフィン)、ポリ(環式オレフィン)、ポリ(ビニルアルコール)またはそれらのコポリマー、ハロゲン化誘導体もしくは架橋誘導体を含む。特定の実施形態では、ハロゲン化誘導体は、ハロゲン化ポリ(アリールエーテル)、ハロゲン化ポリ(オレフィン)またはハロゲン化ポリ(環式オレフィン)である。いくつかの特定の実施形態では、固体基材は、ポリ(環式オレフィン)を含む。
さらに他の実施形態では、固体基材は、酸化物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、固体基材は、ケイ素、溶融シリカ、ガラス、石英、酸化インジウムスズ、二酸化チタン、酸化アルミニウムまたはそれらの組合せを含む。
酸化物層を含む外表面を有する有機ポリマーを含む固体基材もまた、本願発明の範囲に含まれる。
本発明の特定の実施形態は、分析アッセイで固体支持体を使用することを含む。このようなアッセイは、しばしば、蛍光アッセイなどの光学的分析ステップを含む。したがって、いくつかの実施形態では、固体基材は、実質的に光学的に透明である。他の実施形態では、固体基材は、約400nm〜約800nmで実質的に光学的に透明である。さらに他の実施形態では、固体基材は、少なくとも約90%、光学的に透明である。
他の本発明の特定の実施形態は、アレイタイプの分析アッセイで固体支持体を使用することを対象とする。したがって、いくつかの実施形態は、別個の位置の系統的なアレイを含む固体支持体を提供し、該別個の位置の各々は独立に、上記ポリマーの少なくとも一つを含み、該ポリマーは別個の位置の各々にコンジュゲートしている。例えば、いくつかの実施形態では、別個の位置の各々は、独立に、それにコンジュゲートしている複数のポリマーを含む。より具体的な実施形態では、別個の位置の各々にある少なくとも一つのポリマーは、それにDサブユニットを介して共有結合している捕捉プローブを含み、他の実施形態では、別個の位置の各々は、それに結合している少なくとも一つの捕捉プローブを含み、ここで捕捉プローブは、その他の別個の位置の各々において結合している少なくとも一つの捕捉プローブとは構造的に別個である。さらなる実施形態では、別個の位置の各々は、それに結合している複数の構造的に別個の分析物分子を含む。
先の固体支持体の様々な実施形態では、捕捉プローブは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドである。特定の実施形態では、捕捉プローブは、DNAなどのポリヌクレオチドである。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドまたはDNAは、分析物であるポリヌクレオチドまたはDNA分子の配列に相補的な配列を含む。
C.活性化された固体基材
別の態様では、本発明は、活性化された外表面を有する固体基材を対象とする。固体基材は、いくつもの固体支持用途で使用することができる。いくつかの実施形態では、固体基材は、固体基材の外表面に共有結合しているアジドまたはアルキン部分を含む。このような固体基材は、例えば、ポリマーおよび/または捕捉プローブを含む固体支持体であって、それに該ポリマーおよび/または捕捉プローブが固定されている、固体支持体を調製する方法で使用することができる。特定の実施形態では、固体基材は、クリック反応を介して開示のポリマーを固体支持体に共有結合によって付着させるために使用することができる。
別の態様では、本発明は、活性化された外表面を有する固体基材を対象とする。固体基材は、いくつもの固体支持用途で使用することができる。いくつかの実施形態では、固体基材は、固体基材の外表面に共有結合しているアジドまたはアルキン部分を含む。このような固体基材は、例えば、ポリマーおよび/または捕捉プローブを含む固体支持体であって、それに該ポリマーおよび/または捕捉プローブが固定されている、固体支持体を調製する方法で使用することができる。特定の実施形態では、固体基材は、クリック反応を介して開示のポリマーを固体支持体に共有結合によって付着させるために使用することができる。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、外表面を含む固体基材を対象とし、ここで固体基材は、外表面に共有結合しているアジドまたはアルキン部分を含む。
本発明者らは、固体基材の水接触角が、様々な極性を有する溶媒におけるポリマーとの界面反応に合わせて最適化されるように、L4リンカー部分を選択できることを発見した。したがって、特定の具体的な実施形態では、L4は、存在する。固体基材の水接触角は、約50°〜90°、例えば約50°〜70°の範囲である。いくつかの実施形態では、水接触角は、55°〜65°の範囲である。特定の実施形態では、水接触角は、60°〜65°の範囲である。特定の他の実施形態では、水接触角は、80°〜90°の範囲である。
いくつかの特定の実施形態では、L4は、ポリエチレングリコールポリマーを含み、これらの実施形態のいくつかでは、ポリエチレングリコールポリマーは、1〜90個のエチレングリコールサブユニット、例えば55〜90個のエチレングリコールサブユニットを含む。
いくつかの他の実施形態では、L4は、固体基材に固定されているポリマーを含む前述の固体基材の実施形態のいずれかにおいて先に定義されている通りである。さらに、使用される固体基材(例えば、ポリマー、酸化物等)のタイプは、特に制限されない。特定の実施形態では、固体支持体の組成は、固体基材上に固定されたポリマーを含む前述の固体支持体の実施形態のいずれかに記載されている通りである。いくつかの他の実施形態では、ιは、1、2または3である。
いくつかの他の実施形態では、本発明は、外表面を含む固体基材を対象とし、ここで固体基材は、外表面に共有結合しているアミノ部分を含む。特定の実施形態では、固体支持体の組成は、アミノ化固体基材上に固定された、エステルまたはアズラクトンを含有する直交性ポリマーを含む前述の固体支持体の実施形態のいずれかに記載されている通りである。直交性ポリマーは、後のバイオコンジュゲーションのためのアジドまたはアルキン部分を含む。
D.方法
本発明の特定の実施形態は、方法を対象とする。このような方法として、限定されるものではないが、本明細書に記載のポリマー、活性化された固体基材および固体支持体を調製する方法が挙げられる。分析アッセイにおいて固体支持体を使用する方法も提供される。例えば、固体支持体は、いくつもの分析物、例えばウイルス、細菌、変形体、真菌および金属、ならびに未知の細菌戦、生物災害および化学戦争材料を検出するためのアッセイで使用することができる。
本発明の特定の実施形態は、方法を対象とする。このような方法として、限定されるものではないが、本明細書に記載のポリマー、活性化された固体基材および固体支持体を調製する方法が挙げられる。分析アッセイにおいて固体支持体を使用する方法も提供される。例えば、固体支持体は、いくつもの分析物、例えばウイルス、細菌、変形体、真菌および金属、ならびに未知の細菌戦、生物災害および化学戦争材料を検出するためのアッセイで使用することができる。
様々な分析物を分析するために固体支持体を使用する方法は、当業者に明らかである。このような方法は、例えば米国特許仮出願第61/463,580号、同第61/561,198号、同第1/684,104号、同第61/600,569号、米国特許出願第13/399,872号および米国特許出願公開第2012/0214686号に記載されており、これらの完全な開示内容は、あらゆる目的でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。開示の固体支持体を使用する例示的な方法は、図2に模式的に図示されている。
図2Aに図示されている通り、方法の一実施形態では、分析物プローブは、セクションAおよびBを含む。Aセクションは、任意選択的にクエンチャー部分を含み、クエンチャーは、Aセクションの3’末端またはAセクション内の任意の他の点に存在することができる。Aセクションは、標的分析物配列(例えば、病原体DNA等)の少なくとも一部と相補的である。また分析物プローブは、セクションB(「フラップ」)を含む。フラップは、フルオロフォア、および固体支持体に結合している捕捉プローブの配列の少なくとも一部に相補的な配列を含む。任意選択的に、分析物プローブの配列は、Aセクションおよびフラップが少なくともいくらかの相補性を有するように選択され、その結果、クエンチャーおよびフルオロフォアが非常に接近させられ、したがって非結合分析物プローブに関連する蛍光信号を低下させ、アッセイの全体的な感受性を増大させる。
アッセイ条件は、一般に、異なる標的分析物に対して特異的な独特の配列を有する複数の分析物プローブを含む。PCR条件下および相補的な(または少なくとも部分的に相補的な)標的分析物が存在する状態で、フラップは、分析物プローブから切断される。次に、切断されたフラップは、フラップに相補的な(または少なくとも部分的に相補的な)、固体支持体に結合している捕捉プローブにハイブリダイズされる。捕捉プローブが結合する位置における蛍光信号の存在(または増大)は、標的分析物配列の存在を示している。
代替の一実施形態は、図2Bに図示されている。この例示的な実施形態では、フラップは、クエンチャーを含み、支持体に結合している捕捉プローブは、フルオロフォアを含む。フラップまたは捕捉プローブ上のクエンチャーまたはフルオロフォアの正確な位置は、やはりそれぞれに変わり得る。PCR条件下で、標的分析物配列が存在する状態で、フラップはプローブから切断される。次に、フラップは捕捉プローブにハイブリダイズされ、それによって、捕捉プローブ上のフルオロフォアは消光させられる。したがって、捕捉プローブが結合する位置における蛍光の非存在(または低下)は、標的分析物配列の存在を示している。
さらに別の例示的な方法は、図2Cに図示されている。ここでプローブは、標的分析物配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、切断可能なフラップを含まない。この実施形態では、プローブは、クエンチャーを含み、支持体に結合している捕捉プローブは、フルオロフォアを含む。プローブが捕捉プローブとハイブリダイズされると、捕捉プローブが結合する位置における信号が消滅する。次に、固体支持体をPCR条件に曝す。標的分析物配列が存在する状態で、プローブクエンチャーは切断され、捕捉プローブからの蛍光信号は増大する。
したがって一実施形態では、本発明は一般的に、標的分析物分子の存在または非存在を決定する方法を対象とし、該方法は、
a)本明細書に記載の固体支持体を準備するステップであって、ここで、Dサブユニットが、出現するごとに独立に、それに共有結合している捕捉プローブを含む、ステップと、
b)分析物プローブまたはその断片を、固体支持体と接触させるステップと、
c)捕捉プローブと分析物プローブの相互作用から生じた信号の存在または非存在を検出するステップと
を含む。
a)本明細書に記載の固体支持体を準備するステップであって、ここで、Dサブユニットが、出現するごとに独立に、それに共有結合している捕捉プローブを含む、ステップと、
b)分析物プローブまたはその断片を、固体支持体と接触させるステップと、
c)捕捉プローブと分析物プローブの相互作用から生じた信号の存在または非存在を検出するステップと
を含む。
他の関連する実施形態では、本発明は、標的核酸を検出する方法を提供し、該方法は、
A)捕捉プローブのアレイを含む本明細書に記載の少なくとも一つの固体支持体を含む、検出チャンバを準備するステップと、
B)検出される標的核酸の一つまたは複数のコピーを含む試料を、検出チャンバに入れるステップと、
C)増幅プライマーおよびプローブを、一つまたは複数のコピーにハイブリダイズするステップと、
D)増幅プライマー依存性増幅反応において標的核酸コピーの一つまたは複数の少なくとも一部を増幅し、その増幅反応によってプローブを切断し、第1のプローブ断片を放出するステップと、
E)第1のプローブ断片を高効率アレイにハイブリダイズするステップと、
F)第1のプローブ断片をアレイに結合させることによって生じた信号を検出し、それによって標的核酸を検出するステップと
を含む。
A)捕捉プローブのアレイを含む本明細書に記載の少なくとも一つの固体支持体を含む、検出チャンバを準備するステップと、
B)検出される標的核酸の一つまたは複数のコピーを含む試料を、検出チャンバに入れるステップと、
C)増幅プライマーおよびプローブを、一つまたは複数のコピーにハイブリダイズするステップと、
D)増幅プライマー依存性増幅反応において標的核酸コピーの一つまたは複数の少なくとも一部を増幅し、その増幅反応によってプローブを切断し、第1のプローブ断片を放出するステップと、
E)第1のプローブ断片を高効率アレイにハイブリダイズするステップと、
F)第1のプローブ断片をアレイに結合させることによって生じた信号を検出し、それによって標的核酸を検出するステップと
を含む。
特定の実施形態では、検出ステップ(複数可)は、アレイに近位のバックグラウンド信号を低下させる条件下で実施される。
他の実施形態では、複数の標的核酸配列について試料を分析することを含む方法が提供され、該方法は、
A)試料を、第1の複数の標識されたプローブと接触させるステップであって、第1の複数の標識されたプローブのそれぞれが、標的核酸配列の第1のパネルにおいて対象となる、異なる標的配列に相補的な第1の部分、および本明細書に記載の固体支持体を含む高効率プローブアレイ上の異なる捕捉プローブに相補的な第2の部分を含み、第2の部分が、それに付着している標識を有し、対象となる標的配列に相補的でないステップと、
B)増幅プライマー依存性増幅反応において、試料に存在する標的核酸配列の第1のパネルからの任意の標的配列を増幅し、その増幅反応によって標的配列にハイブリダイズされた標識されたプローブを切断し、標識を担持している標識されたプローブの第2の部分を放出するステップと、
C)標識されたプローブの放出された第2の部分を、高効率アレイにハイブリダイズするステップと、
D)標識されたプローブの第2の部分の、高効率アレイの捕捉プローブへの結合を検出するステップと、
E)高効率アレイにハイブリダイズする標識されたプローブの第2の部分から、試料中に存在する標的配列を識別するステップと
を含む。
A)試料を、第1の複数の標識されたプローブと接触させるステップであって、第1の複数の標識されたプローブのそれぞれが、標的核酸配列の第1のパネルにおいて対象となる、異なる標的配列に相補的な第1の部分、および本明細書に記載の固体支持体を含む高効率プローブアレイ上の異なる捕捉プローブに相補的な第2の部分を含み、第2の部分が、それに付着している標識を有し、対象となる標的配列に相補的でないステップと、
B)増幅プライマー依存性増幅反応において、試料に存在する標的核酸配列の第1のパネルからの任意の標的配列を増幅し、その増幅反応によって標的配列にハイブリダイズされた標識されたプローブを切断し、標識を担持している標識されたプローブの第2の部分を放出するステップと、
C)標識されたプローブの放出された第2の部分を、高効率アレイにハイブリダイズするステップと、
D)標識されたプローブの第2の部分の、高効率アレイの捕捉プローブへの結合を検出するステップと、
E)高効率アレイにハイブリダイズする標識されたプローブの第2の部分から、試料中に存在する標的配列を識別するステップと
を含む。
さらに他の実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法を提供し、該方法は、
A)第1の標的核酸配列に相補的な第1の部分および第1の標的核酸配列に相補的でない第2の標識された部分を含む第1の標識されたプローブが存在する状態で、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いて試料上で増幅反応を実施し、それによって、標的核酸配列が増幅される場合には第1の部分から第2の部分を切断するステップと、
B)第2の標識された部分を、第2の部分に相補的な、本明細書に記載の固体支持体に共有結合している捕捉プローブにハイブリダイズするステップと、
C)基材上の捕捉プローブにハイブリダイズされた第2の標識された部分の存在を検出するステップと
を含む。
A)第1の標的核酸配列に相補的な第1の部分および第1の標的核酸配列に相補的でない第2の標識された部分を含む第1の標識されたプローブが存在する状態で、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いて試料上で増幅反応を実施し、それによって、標的核酸配列が増幅される場合には第1の部分から第2の部分を切断するステップと、
B)第2の標識された部分を、第2の部分に相補的な、本明細書に記載の固体支持体に共有結合している捕捉プローブにハイブリダイズするステップと、
C)基材上の捕捉プローブにハイブリダイズされた第2の標識された部分の存在を検出するステップと
を含む。
方法のさらに他の実施形態は、試料中の標的核酸配列を検出する方法を含み、該方法は、
A)標的核酸配列に相補的な第1の部分、および第1の標的核酸配列に相補的でない第2の部分を含む第1のプローブを含む試薬であって、該第2の部分が、第1の位置で該第2の部分にカップリングされた第1のクエンチャー部分を含む、試薬が存在する状態で、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いて試料上で増幅反応を実施し、それによって、標的核酸配列が増幅される場合には、第1の部分から第2の部分を第1のプローブ断片として切断するステップと、
B)第1のプローブ断片を、本明細書に記載の固体支持体上に固定されている捕捉プローブにハイブリダイズするステップであって、捕捉プローブが、第1のクエンチャー部分によって少なくとも部分的に消光させられるフルオロフォアを含み、該フルオロフォアは捕捉プローブ上の第2の位置にカップリングしており、それによって、プローブ断片を捕捉プローブにハイブリダイズすると、フルオロフォアがクエンチャーによって少なくとも部分的に消光させられるステップと、
C)捕捉プローブ上のフルオロフォアの消光に基づいて、標的配列の存在を検出するステップと
を含む。
A)標的核酸配列に相補的な第1の部分、および第1の標的核酸配列に相補的でない第2の部分を含む第1のプローブを含む試薬であって、該第2の部分が、第1の位置で該第2の部分にカップリングされた第1のクエンチャー部分を含む、試薬が存在する状態で、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いて試料上で増幅反応を実施し、それによって、標的核酸配列が増幅される場合には、第1の部分から第2の部分を第1のプローブ断片として切断するステップと、
B)第1のプローブ断片を、本明細書に記載の固体支持体上に固定されている捕捉プローブにハイブリダイズするステップであって、捕捉プローブが、第1のクエンチャー部分によって少なくとも部分的に消光させられるフルオロフォアを含み、該フルオロフォアは捕捉プローブ上の第2の位置にカップリングしており、それによって、プローブ断片を捕捉プローブにハイブリダイズすると、フルオロフォアがクエンチャーによって少なくとも部分的に消光させられるステップと、
C)捕捉プローブ上のフルオロフォアの消光に基づいて、標的配列の存在を検出するステップと
を含む。
別の実施形態では、本発明は、試料中の少なくとも一つの第1の標的核酸配列の存在を検出する方法を対象とし、該方法は、
A)本明細書に記載の固体支持体が存在する状態で、標的核酸配列を増幅できる増幅反応に試料を曝すステップであって、固体支持体が、少なくとも一つの第1の組の核酸プローブを含み、該第1の組の核酸プローブが、捕捉プローブおよび標的特異的な核酸プローブを含み、該捕捉プローブはそれに付着しているフルオロフォアを含み、該標的特異的な核酸プローブは、該捕捉プローブおよび該標的核酸配列の少なくとも一部に相補的であり、かつそれに付着しているクエンチャーを含み、それによって、該標的特異的なプローブが該捕捉プローブにハイブリダイズされる場合には、該クエンチャーが該フルオロフォアからの蛍光を消光するステップと、
B)ポリメラーゼ連鎖反応の一つまたは複数のサイクル後に、試料からの蛍光を検出するステップであって、蛍光の増大が、標的核酸配列の存在を示すステップと
を含む。
A)本明細書に記載の固体支持体が存在する状態で、標的核酸配列を増幅できる増幅反応に試料を曝すステップであって、固体支持体が、少なくとも一つの第1の組の核酸プローブを含み、該第1の組の核酸プローブが、捕捉プローブおよび標的特異的な核酸プローブを含み、該捕捉プローブはそれに付着しているフルオロフォアを含み、該標的特異的な核酸プローブは、該捕捉プローブおよび該標的核酸配列の少なくとも一部に相補的であり、かつそれに付着しているクエンチャーを含み、それによって、該標的特異的なプローブが該捕捉プローブにハイブリダイズされる場合には、該クエンチャーが該フルオロフォアからの蛍光を消光するステップと、
B)ポリメラーゼ連鎖反応の一つまたは複数のサイクル後に、試料からの蛍光を検出するステップであって、蛍光の増大が、標的核酸配列の存在を示すステップと
を含む。
本発明はまた、本明細書に記載の固体支持体および固体基材を含むデバイスおよび消耗品を提供する。一実施形態では、本発明は、核酸検出デバイスを提供し、核酸検出デバイスは、
A)チャンバの少なくとも一つの表面上に、本明細書に記載の固体支持体を含む少なくとも一つの高効率核酸検出アレイを含む検出チャンバであって、アレイから検出された信号の信号バックグラウンドを低下させるように構成されている検出チャンバと、
B)検出チャンバに動作可能に連結されている温度調節モジュールであって、デバイスの動作中にチャンバ内の温度を調節する温度調節モジュールと、
C)デバイスの動作中にアレイにおいて生じる信号を検出する光の列(optical train)と
を含む。
A)チャンバの少なくとも一つの表面上に、本明細書に記載の固体支持体を含む少なくとも一つの高効率核酸検出アレイを含む検出チャンバであって、アレイから検出された信号の信号バックグラウンドを低下させるように構成されている検出チャンバと、
B)検出チャンバに動作可能に連結されている温度調節モジュールであって、デバイスの動作中にチャンバ内の温度を調節する温度調節モジュールと、
C)デバイスの動作中にアレイにおいて生じる信号を検出する光の列(optical train)と
を含む。
他の実施形態では、本発明は、核酸検出消耗品を提供し、核酸検出消耗品は、深さが約500μm未満の薄いチャンバを含み、チャンバは、窓の内表面に配置された高効率捕捉核酸アレイを含む光学的に透明な窓を含み、チャンバはさらに、チャンバに流体連結されている少なくとも一つの試薬送達ポートを含み、消耗品は、チャンバ内の流体の熱循環を可能にするように構成されており、高効率捕捉核酸アレイは、本明細書に記載の固体支持体を含む。
特定の実施形態では、標的分析物分子は、病原体、例えばウイルス、細菌、変形体または真菌の存在を示す配列を有するDNA配列である。
いくつかの実施形態では、分析物プローブは、フラップである。いくつかの他の実施形態では、分析物プローブは、クエンチャーを含む。いくつかの他の実施形態では、分析物プローブは、フルオロフォアを含む。さらに他の実施形態では、捕捉プローブは、フルオロフォアを含む。さらに他の実施形態では、プローブは、オリゴヌクレオチドを含む。
固体支持体は、本明細書に記載の固体支持体のいずれであってもよい。さらに、特定の実施形態では、捕捉プローブはポリヌクレオチドであり、他の実施形態では、標的分析物分子はポリヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、標的分析物分子は、ポリメラーゼ連鎖反応を介して調製される。
いくつかの他の実施形態では、信号は、蛍光信号である。例えば、いくつかの実施形態では、蛍光信号は、標的分析物分子と捕捉プローブの特異的なハイブリダイゼーションの結果として生じる。
他の関連する実施形態では、本発明は、試料中の分析物を検出する方法を提供する。該方法は、分析物を本発明の固体支持体と接触させて、本発明の固体支持体の捕捉プローブによって分析物を捕捉させ、分析物の捕捉を検出するステップを含む。特定の実施形態では、分析物は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、またはそれらのハイブリッドなどの生体分子である。他の実施形態では、分析物は、薬物、薬物候補、補因子または代謝産物などの有機分子である。別の実施形態では、分析物は、金属錯体または補因子などの無機分子である。例示的な一実施形態では、分析物は、標識されたプローブである核酸である。別の例示的な実施形態では、本発明は、後のステップで分析物を捕捉し検出するために使用できる、タンパク質、酵素、抗体、抗原、ホルモン、炭水化物、複合糖質、または合成によって生成された分析物標的、例えば合成によって生成されたエピトープを共有結合によって固定する反応性表面を提供する。
様々な他の実施形態では、本発明は、本発明の固体支持体を使用して標的核酸を検出する方法を提供する。該方法は、検出可能な程度に標識された核酸プローブ断片を、本発明の固体支持体のポリマー上に固定された相補的な配列の核酸に結合させるステップを含む。例示的な方法は、
A)増幅プライマーおよび検出可能な程度に標識されたプローブを、標的核酸にハイブリダイズするステップと、
B)プライマー依存性増幅反応において標的核酸の少なくとも一部を増幅し、その増幅反応によって標識されたプローブを切断し、標識されたプローブ断片を放出するステップと、
C)標識されたプローブ断片を、前記標識されたプローブ断片に少なくとも部分的に相補的な核酸である固定されたアッセイ成分にハイブリダイズし、それによって前記核酸を検出するステップと
を含む。
A)増幅プライマーおよび検出可能な程度に標識されたプローブを、標的核酸にハイブリダイズするステップと、
B)プライマー依存性増幅反応において標的核酸の少なくとも一部を増幅し、その増幅反応によって標識されたプローブを切断し、標識されたプローブ断片を放出するステップと、
C)標識されたプローブ断片を、前記標識されたプローブ断片に少なくとも部分的に相補的な核酸である固定されたアッセイ成分にハイブリダイズし、それによって前記核酸を検出するステップと
を含む。
分析物の検出は、当該技術分野において認識されている任意の方法またはデバイスによって達成することができる。特定の実施形態では、分析物は、固体支持体上に固定された分析物またはプローブから生じる蛍光信号によって検出される。例示的な一実施形態では、本発明の固体支持体は、核酸アレイであり、信号は、固体支持体のポリマー上に固定されたアッセイ成分にハイブリダイズされた、蛍光標識された核酸から生じる。様々な実施形態では、固定されたアッセイ成分は、蛍光標識された核酸の配列に少なくとも部分的に相補的な配列を有する核酸である。分析物が蛍光標識される選択された実施形態では、分析物は、CCDアレイなどの蛍光検出器によって検出される。特定の実施形態では、該方法は、試料を、固体支持体の一つまたは複数のアドレス可能な位置に適用し、アドレス可能な一つまたは複数の位置において捕捉された分析物を検出することによって、試料中の特定のクラスの分析物(例えば生体分子、例えば核酸)をプロファイリングすることを含む。本発明を実施するのに有用な方法の例として、米国仮特許出願第61/561,198号、およびUSSN13/399,872に記載されているものが挙げられ、これらの完全な開示内容は、これによって、あらゆる目的でそれら全体が参考として本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、本発明の固体支持体は、アッセイ混合物中の分析物を単離し、検出するのに有用である。特に、本発明の固体支持体は、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、クロマトグラフィーによる捕捉、免疫アッセイ、競合アッセイ、DNAまたはRNA結合アッセイ、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、タンパク質および核酸プロファイリングアッセイ、サンドイッチアッセイ等を含めた実質的に任意のフォーマットのアッセイを実施するのに有用である。以下の議論では、例示的なアッセイを実施するために本発明の固体支持体を使用することに焦点を当てる。この焦点は、単に明確な例示のためだけのものに過ぎず、本発明の範囲を規定または制限することは企図されない。当業者は、本発明の方法が、分析物の存在および/または量を検出するための任意のアッセイ技術に広範に適用できることを理解されよう。
様々な他の実施形態では、本発明は、本発明の固体支持体を使用して標的核酸を検出する方法を提供する。該方法は、検出可能な程度に標識された核酸プローブ断片を、本発明の固体支持体の反応性ポリマー上に固定した相補的な配列の核酸に結合させることを含む。例示的な方法は、
A)増幅プライマーおよび検出可能な程度に標識されたプローブを、標的核酸にハイブリダイズするステップと、
B)プライマー依存性増幅反応において標的核酸の少なくとも一部を増幅するステップであって、その増幅反応が標識されたプローブの切断および標識されたプローブ断片の放出をもたらす、ステップと、
C)標識されたプローブ断片を、前記標識されたプローブ断片に少なくとも部分的に相補的な核酸である固定されたアッセイ成分にハイブリダイズし、それによって前記核酸を検出するステップと
を含む。
A)増幅プライマーおよび検出可能な程度に標識されたプローブを、標的核酸にハイブリダイズするステップと、
B)プライマー依存性増幅反応において標的核酸の少なくとも一部を増幅するステップであって、その増幅反応が標識されたプローブの切断および標識されたプローブ断片の放出をもたらす、ステップと、
C)標識されたプローブ断片を、前記標識されたプローブ断片に少なくとも部分的に相補的な核酸である固定されたアッセイ成分にハイブリダイズし、それによって前記核酸を検出するステップと
を含む。
試料は、任意の供給源に由来するものであってよく、生物学的試料、例えば同じまたは異なる種に由来する生物または生物群に由来する試料であってよい。生物学的試料は、体液試料、例えば血液試料、血清試料、リンパ試料、骨髄試料、腹水、胸水、骨盤洗浄流体、眼液、尿、精液、喀痰、または唾液であってよい。生物学的試料は、皮膚、鼻、喉、生殖器の拭き取り検体由来の抽出物であってもよく、糞便材料の抽出物であってもよい。生物学的試料は、腫瘍を含む、臓器の試料であっても組織の試料であってもよい。生物学的試料は、原核細胞および真核細胞の両方の細胞株および初代培養物の両方を含む、細胞培養物の試料であってもよい。
試料は、水域もしくは土壌などの環境、または食品、飲料もしくは水供給源、工業供給源、職場領域、公共領域、または生活領域に由来するものであり得る。試料は、抽出物、例えば土壌または食品試料の液体抽出液であってよい。試料は、用具、衣類品、人為産物または他の材料などの物品を洗浄もしくは浸漬するか、またはそれらに由来する拭き取り検体を懸濁させることによって作製された溶液であり得る。また試料として、細菌戦薬剤を識別するための試料、例えば公知または未知の起源の粉末または液体の試料が挙げられる。
試料は、未処理のまたは処理済みの試料であり得る。処理は、試料成分の純度、濃度または到達性を増大させて、試料の分析を容易にするステップを含むことができる。非限定的な例として、処理は、試料の体積を低減し、試料成分を除去もしくは分離し、試料もしくは一つもしくは複数の試料成分を可溶化するか、または試料成分を撹乱、修飾、曝露、放出もしくは単離するステップを含むことができる。このような手順の非限定的な例は、遠心分離、沈殿、濾過、均質化、細胞溶解、抗体結合、細胞分離等である。例えば、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、試料は、例えば赤血球の除去、濃縮、一つもしくは複数の細胞もしくはウイルスタイプの選択(例えば、白血球または病原性細胞)、または細胞溶解等によって少なくとも部分的に処理されている血液試料である。
例示的な試料は、少なくとも部分的に精製された核酸分子の溶液を含む。核酸分子は、単一供給源または複数供給源から得ることができ、DNA、RNAまたはその両方を含むことができる。例えば、核酸分子の溶液は、細胞溶解、濃縮、抽出、沈殿、核酸選択(例えば、ポリA RNAの選択またはAlu要素を含むDNA配列の選択など)、または一つもしくは複数の酵素による処理のステップのいずれかに供した試料であってよい。試料は、合成核酸分子を含む溶液であってもよい。
例示的な一実施形態では、本発明の固体支持体は、核酸を検出し、かつ/またはその特徴を決定するために使用される場合、表面結合したポリマーに、固体支持体上の公知の位置で共有結合している、異なる配列の複数の核酸を有する核酸アレイである。様々な実施形態では、固体支持体は、反応容器の部品であり、この反応容器内で、アッセイ混合物に含有されている標的核酸試料に対してPCRが実施される。例示的な方法では、一つまたは複数の核酸プライマー、および検出可能な程度に標識された核酸プローブは、標的核酸にハイブリダイズされる。PCR鋳型伸長の最中、プローブが切断されると、プローブ断片が生成される。プローブ断片は、標的核酸から放出され、表面結合したポリマー上に固定された、核酸である分析物成分によって捕捉される。プローブ配列は、アレイ上のその結合位置によって決定される。
様々な実施形態では、本発明の固体支持体は、アッセイ混合物中の一つまたは複数の種を検出するために、多重アッセイの成分として利用される。本発明の固体支持体は、多重型分析およびアッセイを実施するのに特に有用である。例示的な多重分析では、二つ以上の別個の種(または一つもしくは複数の種の領域)が、二つ以上のプローブを使用して検出され、ここでプローブのそれぞれは、異なるフルオロフォアで標識されている。本発明の固体支持体は、アッセイにおいて、検出可能な程度に標識された一つより多いプローブ構造を使用する多重アッセイの設計を考慮に入れる。本発明の固体支持体を使用するいくつかの異なる多重アッセイは、当業者に明らかになろう。ある例示的なアッセイでは、少なくとも二つの別個のフルオロフォアのそれぞれを使用して、表面に固定された核酸への核酸プローブ断片のハイブリダイゼーションを信号化する。
本発明の方法を実施するのに役立つ、例示的な標識されたプローブは、核酸プローブである。有用な核酸プローブとして、例えば5’−ヌクレアーゼアッセイ、鎖置換増幅(SDA)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、ローリングサークル増幅(RCA)を含めた様々なDNA増幅/定量化戦略における検出剤の成分として使用することができる核酸プローブ、ならびに液相または固相(例えばアレイ)アッセイにおいて標的を直接的に検出するために使用できる核酸プローブが挙げられる。さらに、固体支持体およびオリゴマーは、例えば分子ビーコン、Scorpionプローブ(商標)、Sunriseプローブ(商標)、立体配座支援プローブ、点灯プローブ、インベーダー検出プローブ、およびTaqMan(商標)プローブから選択されるフォーマットを含めた実質的に任意のフォーマットのプローブに使用することができる。例えば、Cardullo, R.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85巻:8790〜8794頁(1988年);Dexter, D.L.、J. Chem. Physics、21巻:836〜850頁(1953年);Hochstrasser, R.A.ら、Biophysical Chemistry、45巻:133〜141頁(1992年);Selvin, P.、Methods in Enzymology、246巻:300〜334頁(1995年);Steinberg, I.、Ann. Rev. Biochem.、40巻:83〜114頁(1971年);Stryer, L.、Ann. Rev. Biochem.、47巻:819〜846頁(1978年);Wang, G.ら、Tetrahedron Letters、31巻:6493〜6496頁(1990年);Wang, Y.ら、Anal. Chem.、67巻:1197〜1203頁(1995年);Debouck, C.ら、nature genetics、21巻:48〜50頁(1999年)の補遺において;Rehman, F.N.ら、Nucleic Acids Research、27巻:649〜655頁(1999年);Cooper, J.P.ら、Biochemistry、29巻:9261〜9268頁(1990年);Gibson, E.M.ら、Genome Methods、6巻:995〜1001頁(1996年);Hochstrasser, R.A.ら、Biophysical Chemistry、45巻:133〜141頁(1992年);Holland, P.M.ら、Proc Natl. Acad. Sci USA、88巻:7276〜7289頁(1991年);Lee, L.G.ら、Nucleic Acids Rsch.、21巻:3761〜3766頁(1993年);Livak, K.J.ら、PCR Methods and Applications、Cold Spring Harbor Press(1995年);Vamosi, G.ら、Biophysical Journal、71巻:972〜994頁(1996年);Wittwer, C.T.ら、Biotechniques、22巻:176〜181頁(1997年);Wittwer, C.T.ら、Biotechniques、22巻:130〜38頁(1997年);Giesendorf, B.A.J.ら、Clinical Chemistry、44巻:482〜486頁(1998年);Kostrikis, L.G.ら、Science、279巻:1228〜1229頁(1998年);Matsuo, T.、Biochemica et Biophysica Acta、1379巻:178〜184頁(1998年);Piatek, A.S.ら、Nature Biotechnology、16巻:359〜363頁(1998年);Schofield, P.ら、Appl. Environ. Microbiology、63巻:1143〜1147頁(1997年);Tyagi S.ら、Nature Biotechnology、16巻:49〜53頁(1998年);Tyagi, S.ら、Nature Biotechnology、14巻:303〜308頁(1996年);Nazarenko, I.A.ら、Nucleic Acids Research、25巻:2516〜2521頁(1997年);Uehara, H.ら、Biotechniques、26巻:552〜558頁(1999年);D. Whitcombeら、Nature Biotechnology、17巻:804〜807頁(1999年);Lyamichev, V.ら、Nature Biotechnology、17巻:292頁(1999年);Daubendiekら、Nature Biotechnology、15巻:273〜277頁(1997年);Lizardi, P.M.ら、Nature Genetics、19巻:225〜232頁(1998年);Walker, G.ら、Nucleic Acids Res.、20巻:1691〜1696頁(1992年);Walker, G.T.ら、Clinical Chemistry、42巻:9〜13頁(1996年);およびCompton, J.、Nature、350巻:91〜92頁(1991年)参照のこと。これらの開示内容は各々、それらの全体があらゆる目的で参考として本明細書に援用される。
様々な実施形態では、本発明は、標的核酸配列における多型を検出する方法を提供する。多型は、集団において、二つ以上の遺伝的に決定された代替の配列または対立遺伝子が発生することを指す。多型マーカーまたは部位は、相違が生じている座位である。例示的なマーカーは、選択された集団の1%超、より好ましくは10%超または20%超の頻度でそれぞれ生じる、少なくとも二つの対立遺伝子を有する。多型座位は、1個ほどの少ない塩基対であり得る。多型マーカーとして、制限酵素断片長多型、高変異反復配列(VNTR)、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純反復配列、およびAluなどの挿入要素が挙げられる。識別された第1の対立遺伝子型は、任意に基準型と指定され、他の対立遺伝子型は、代替対立遺伝子または変異対立遺伝子と指定される。選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子型は、野生型と呼ばれることがある。二倍体生物は、対立遺伝子型に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。2対立遺伝子(diallelic)多型は、二つの型を有する。3対立遺伝子(triallelic)多型は、三つの型を有する。
例示的な一実施形態では、本発明の固体支持体を利用して、単一ヌクレオチド多型を検出する。単一ヌクレオチド多型は、対立遺伝子配列間の変異部位である、単一ヌクレオチドが占める多型部位において生じる。その部位には、通常、対立遺伝子の高度に保存された配列(例えば、集団の1/100未満または1/1000未満のメンバーが異なる配列)が先行し、その配列が続く。単一ヌクレオチド多型は、通常、多型部位における別のヌクレオチドが、あるヌクレオチドで置換されることに起因して生じる。転移とは、あるプリンが別のプリンに、またはあるピリミジンが別のピリミジンに置き換わられることである。転換とは、プリンがピリミジンに置き換わられること、またはその逆が生じることである。単一ヌクレオチド多型は、基準対立遺伝子と比較してヌクレオチドが欠失すること、またはヌクレオチドが挿入されることによっても生じ得る。
多型が検出される実施形態では、多型核酸は、アドレス可能な位置で固体支持体に結合する。特定の位置における検出可能な信号の発生は、標的核酸配列に多型が存在することを示している。
例示的な一実施形態では、プローブは、フルオロフォア部分で検出可能な程度に標識される。以下の参考文献によって例示される通り、特定のプローブに適したフルオロフォアを選択するための多くの実用的な指針が、文献から利用可能である。Pesceら編集、FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker、New York、1971年);Whiteら、FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker、New York、1970年)等。文献には、フルオロフォアを選択するための蛍光性および色素原性分子、ならびにそれらの関連する光学特性の網羅的一覧を提供する参考文献も含まれる(例えば、Berlman、HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES、第2版(Academic Press、New York、1971年);Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press、New York、1976年);Bishop編集、INDICATORS (Pergamon Press、Oxford、1972年); Haugland、HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes、Eugene、1992年) Pringsheim、FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers、New York、1949年)等参照。さらに、以下の参考文献に例示されている通り、核酸に付加できる一般的な反応基を介して共有結合によって付着させるために、フルオロフォア分子を誘導体化するための広範囲に亘る指針が、文献に記載されている。Haugland(上記);Ullmanら、米国特許第3,996,345号;Khannaら、米国特許出願第4,351,760号。したがって、特定の用途に合わせてエネルギー交換対を選択し、例えば核酸、ペプチドまたは他のポリマーなどのプローブ分子に、この対のメンバーをコンジュゲートすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。
核酸への小分子のコンジュゲーションに関する論文の十分に述べられている本文を考慮すると、核酸にドナー/アクセプター対を付着させる他の多くの方法が、当業者に明らかになろう。例えば、ローダミンおよびフルオレセイン染料は、好都合なことには、ホスホルアミダイト部分で誘導体化された染料として、固相合成の最後に核酸の5’−ヒドロキシルに付着する(例えば、Wooら、米国特許第5,231,191号、およびHobbs, Jr.、米国特許第4,997,928号参照)。
より具体的には、以下の参考文献に例示されている通り、核酸の5’または3’末端に基を付着させるための多くのリンカー部分および方法論が存在する。Eckstein編集、Nucleic acids and Analogues:A Practical Approach(IRL Press、Oxford、1991年);Zuckermanら、Nucleic Acids Research、15巻:5305〜5321頁(1987年)(核酸上の3’−チオール基);Sharmaら、Nucleic Acids Research、19巻:3019頁(1991年)(3’−スルフヒドリル);Giustiら、PCR Methods and Applications、2巻:223〜227頁(1993年)、およびFungら、米国特許第4,757,141号(P.E.Biosystems、CA.から利用可能なAminolink TM IIを介する5’−ホスホアミノ基)、Stabinsky、米国特許第4,739,044号(3−アミノアルキルホスホリル基);Agrawalら、Tetrahedron Letters、31巻:1543〜1546頁(1990年)(ホスホルアミダイト連結を介する付着);Sproatら、Nucleic Acids Research、15巻:4837頁(1987年)(5−メルカプト基);Nelsonら、Nucleic Acids Research、17巻:7187〜7194頁(1989年)(3’−アミノ基)等。
蛍光標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって例えば、蛍光標識は、適切な波長の光でフルオロフォアを励起し、得られた蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムを用いることによって、電子検出器、例えば電荷結合固体支持体(CCD)または光電子増倍管等を使用することによって、視覚的に検出することができる。同様に、酵素標識は、酵素に適した基材を提供し、得られた反応生成物を検出することによって検出され得る。
蛍光標識された核酸の検出を参照することによって例示してきたが、本発明の固体支持体は、分析物分子の検出にも有用である。ポリマーが結合基で官能化される場合、固体支持体は、その表面上に、特定の基に結合する分析物を捕捉する。非結合材料は、洗い流され得、分析物は、例えば気相イオン分光法、光学的方法、電気化学的方法、原子間力顕微鏡および無線周波数法を含めたいくつもの方法で検出することができる。例示的な光学的方法として、例えば蛍光、発光、化学発光、吸光率、反射率、透過率、複屈折率または屈折率の検出(例えば、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、水晶振動子マイクロバランス、共振ミラー法、回折格子カプラー導波管方法(例えば、波長監視(wavelength−interrogated)光学センサー(「WIOS」)または干渉法)が挙げられる。光学的方法として、顕微鏡法(共焦点および非共焦点の両方)、画像法および非画像法が挙げられる。様々なフォーマットの免疫アッセイ(例えばELISA)は、固相上に捕捉された分析物の検出によく用いられる方法である。電気化学的方法として、ボルタンメトリーおよび電流測定法が挙げられる。無線周波数法として、多極性共鳴分光法または干渉法が挙げられる。光学的方法として、顕微鏡法(共焦点および非共焦点の両方)、画像法および非画像法が挙げられる。様々なフォーマットの免疫アッセイ(例えばELISA)は、固相上に捕捉された分析物の検出によく用いられる方法である。電気化学的方法として、ボルタンメトリーおよび電流測定法が挙げられる。無線周波数法として、多極性共鳴分光法が挙げられる。
本発明のオリゴマーと標的核酸分子の間のハイブリダイゼーションにとって好ましい条件は、当業者によって経験的に決定され得るが、それには、最適なインキュベーション温度、塩濃度、オリゴヌクレオチド類似体プローブの長さおよび基本組成、ならびに試料のオリゴマーおよび核酸分子の濃度が含まれ得る。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、少なくとも1ミリモル濃度のマグネシウムイオンの存在下で、6.0を超えるpHで実施される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションを行う前に試料を処理して、試料中の核酸分子を一本鎖にすることが必要である場合、または望ましい場合がある。このような処理の例として、塩基による処理(好ましくはその後中和する)、高温でのインキュベーション、またはヌクレアーゼによる処理が挙げられるが、それらに限定されない。
さらに、核酸へのハイブリダイゼーションの塩依存性は、主に、ハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチド類似体の骨格の電荷密度によって決まるので、本発明のHypNA−pPNAオリゴマーまたはSerNA−pPNAオリゴマーにおけるpPNAモノマーの比率を増大させると、ハイブリダイゼーションの塩依存性を増大させることができる。本発明の方法では、このことを使用して利益を得ることができ、いくつかの態様では、塩条件を変更することによってハイブリダイゼーションの厳密性を増大させることができること、例えば、または塩濃度を低減することによって、ハイブリダイズした核酸を放出することができることが望ましい場合がある。本発明のさらに他の態様では、本発明のオリゴヌクレオチド類似体が、非常に低い塩で核酸に対して高い親和性結合を有することが望ましい場合がある。この場合、本発明のオリゴヌクレオチド類似体におけるHypNAモノマーとpPNAモノマーの比を1:1近くに維持することが有利である。
標的核酸分子との結合において、本発明のオリゴマーの特異性の度合いが高いことにより、実務者は、一つまたは複数のオリゴマーの少なくとも一部に完全に相補的なひと続きの配列を含む核酸配列と、実質的に相補的な配列の中に少数の相補的でない塩基を含むひと続きの配列を含む標的核酸分子との区別に有利に働き得るハイブリダイゼーション条件を選択することが可能となる。例えば、本発明のオリゴマーと、ひと続きの配列に沿って完全に相補的な標的核酸分子との間の安定なハイブリッドを可能にするが、本発明のオリゴマーと、ひと続きの相補的な配列に沿って一つまたは二つの塩基ミスマッチを含むものを含めて完全には相補的でない標的核酸分子との間のハイブリッドの解離を促進する、ハイブリダイゼーションまたは洗浄の温度を選択することができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度の選択は、他の条件、例えば塩濃度、オリゴマーおよび標的核酸分子の濃度、標的核酸分子に対するオリゴマーの相対的割合、ハイブリダイズされるオリゴマーの長さ、オリゴマーおよび標的核酸分子の基本組成、オリゴヌクレオチド類似体分子のモノマー組成等に少なくとも部分的に依存し得る。さらに、完全に相補的な分子の安定なハイブリッドに有利に働き、オリゴマーと、一つまたは複数の塩基によってミスマッチである標的核酸分子との間の安定なハイブリッドに不利に働く条件を選択する場合、限定されるものではないが、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド類似体の長さ、オリゴマーと標的核酸分子との間の相補性を示すひと続きの配列の長さ、相補性を示すひと続きの配列内の相補的でない塩基の数、ミスマッチ塩基の同一性、ミスマッチ塩基の近傍の塩基の同一性、およびひと続きの相補性に沿った任意のミスマッチ塩基の相対的な位置を含めた追加の条件を考慮に入れることができ、望ましい場合には、それらを変えることができる。核酸ハイブリダイゼーション分野の技術者であれば、本発明のオリゴマーを使用して標的核酸分子にハイブリダイズするのに好ましいハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、特定の用途に応じて決定できるはずである。「好ましい条件」とは、オリゴマーと、一つまたは複数のミスマッチを含む核酸分子を含めて、少なくとも部分的に実質的に相補的な標的核酸分子との間の安定なハイブリッドに有利に働く条件であり得る。
「好ましい条件」とは、オリゴマーと、少なくとも部分的に完全に相補的な標的核酸分子との間の安定なハイブリッドに有利に働くが、完全には相補的でない分子間のハイブリッドに不利に働くか、またはそのハイブリッドを不安定にする条件であり得る。
本明細書に開示の方法などの方法を使用すると、異なる配列の標的核酸分子にハイブリダイズした本発明のオリゴマーの融解温度を決定することができ、その温度を、所与の用途に好ましい条件を決定するのに使用することができる。例えば、標的核酸分子を、固体支持体に付着しているオリゴマーにハイブリダイズし、ハイブリダイズした複合物を検出することによって、好ましいハイブリダイゼーション条件を経験的に決定することも可能である。
本発明の固体支持体またはオリゴマー性プローブに結合している標的核酸分子は、オリゴマープローブを固体支持体に直接的または間接的に付着させることによって、調査集団の非結合核酸分子から好都合に、効率的に分離することができる。固体支持体は、オリゴマープローブに結合していない核酸分子を除去するのに、高い厳密性で洗浄することができる。しかし、オリゴマープローブが固体支持体に付着することは、本発明の必須要件ではない。例えばいくつかの用途では、結合核酸分子および非結合核酸分子は、マトリックスを介して遠心分離することによって、または相分離によって、またはオリゴマープローブに組み込まれた化学基により場合によって促進することができる(例えば、Nieらの2000年5月9日発行の米国特許第6,060,242号)いくつかの他の形態の分離(例えば、差異的沈殿)によって分離することができる。
例示的な一実施形態では、本発明の固体支持体は、一般に自己所有の同時係属の米国特許出願第13/399,872号に記載のリアルタイムPCRアッセイなどの、リアルタイムPCRアッセイで利用される。
本発明の他の方法では、本発明は、固体支持体であって、それに結合しているプローブ分子を有する固体支持体を調製する方法を対象とし、該方法は、固体支持体の外表面に共有結合しているアジドまたはアルキン部分を含む固体支持体(本明細書で先に記載した通り)を、本明細書で先に記載したA、BおよびCサブユニットを含むポリマーと接触させるステップを含む。
他の実施形態では、該方法は、Cu(I)触媒を、固体支持体およびポリマーと接触させるステップをさらに含む。さらなる実施形態は、固体支持体であって、それに結合しているポリマーを含む固体支持体と、アミン官能基を有するプローブ分子を接触させて、固体支持体であって、それに結合しているプローブ分子を含む固体支持体を調製するステップを含む。このような方法は、DNAマイクロアレイ等の調製などのいくつもの用途において実用性がある。
本明細書中で言及されている米国特許文書、米国特許出願公開文書、米国特許出願文書、外国特許文書、外国特許出願文書および非特許刊行物のすべては、本発明と矛盾しない範囲でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。
本発明の具体的な実施形態を例示目的で本明細書に記載してきたが、前述のことから、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な改変がなされ得ることが理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によって限定される場合を除いて限定されない。
以下の実施例は、限定ではなく例示目的で提供される。
実施例
(実施例1)
Boc−NH−PEG57−アセト−(4−アジド)アニリドの合成
(実施例1)
Boc−NH−PEG57−アセト−(4−アジド)アニリドの合成
4−アジドアニリン塩酸塩(51mg、300μmol、Sigma−Aldrich)を、水(10mL)および1NのNaOH(10mL)に溶解させ、次にEtOAc(3×20mL)中に抽出した。有機相を水で洗浄し、次に飽和NaClで洗浄し、次にNa2SO4で乾燥させた。蒸発させることによって、アジドアニリンの遊離塩基を琥珀色の油として得た。ガラス製品全体をホイルで包んで、室内光への曝露を最小限に抑えた。別個のフラスコ(オーブン乾燥させた)に、Boc−アミノ−PEG57−酢酸NHSエステル、平均MW2800(280mg、100μmol、Laysan Bio、Arab、AL)を、乾燥DMF(250μL)およびTEA(27μL、200μmol)と共に入れた。これに、少量のDMFに入れたアジドアニリンを添加した。フラスコをArでパージし、次に封止し、ホイルで被覆し、終夜振とうした。TLC(DCM/MeOH/TEA、80:20:1)によって、UV活性のある単一生成物(Rf=0.25)が、未反応アジドアニリン(Rf=0.88)と共に観測された。反応混合物をEtOAc(5mL)で希釈し、ボルテックス中のヘキサンに滴下添加することによって生成物を沈殿させ、冷凍庫に入れて−20℃で終夜静置した。沈殿物をガラスフリット上に収集し、ヘキサンで洗浄し、次にEtOAcに再び溶解させ、前述の通り再び沈殿させた。生成物を、収集した後にMeOHから再び乾燥させて、一定重量(189mg、65%)を得た。ベージュ色の吸湿性固体を封止し、使用するまで暗室で保存した。1H−NMR (400MHz, DMSO−d6) δ: 9.36 (s, 1H), 7.69 (d, 2H), 7.08 (d, 2H), 6.62 (dd, 1H), 4.07 (s, 2H), 3.4−3.6 (m, 230H), 2.91 (dd, 2H), 1.37 (s, 9H); 13C−NMR δ: 172.24, 172.17, 168.80, 156.11, 136.19, 134.73, 121.71, 119.91, 73.18, 51.87, 40.08, 28.78.
(実施例2)
Boc−NH−PEG44−アセト−(4−アジド)アニリドの合成
Boc−NH−PEG44−アセト−(4−アジド)アニリドの合成
4−アジドアニリン塩酸塩(100mg、600μmol、Sigma−Aldrich)を、水(20mL)および1NのNaOH(20mL)に溶解させ、次にEtOAc(3×40mL)中に抽出した。抽出液を前述の通り処理して、遊離塩基を得た。別個のフラスコ(オーブン乾燥させた)に、Boc−アミノ−PEG44−酢酸NHSエステル、平均MW2000(400mg、200μmol、Laysan Bio、Arab、AL)を、乾燥DMF(1000μL)およびTEA(55μL、400μmol)と共に入れた。これに、少量のDMFに入れたアジドアニリンを添加した。フラスコをArでパージし、封止し、被覆し、終夜振とうした。TLC(DCM/MeOH/TEA、80:20:1)によって、UV活性のある単一生成物(Rf=0.38)が、未反応アジドアニリン(Rf=0.88)と共に観測された。反応混合物をEtOAc(10mL)で希釈し、ボルテックス中のペンタンに滴下添加することによって生成物を沈殿させ、冷凍庫に入れて−20℃で終夜静置した。沈殿物をガラスフリット上に収集し、ヘキサンで洗浄し、次にEtOAcに再び溶解させ、前述の通り再び沈殿させた。生成物を、収集した後にMeOHから再び乾燥させて、一定重量(272mg、65%)を得た。ベージュ色の吸湿性固体を封止し、使用するまで暗室で保存した。1H−NMR (DMSO−d6) δ: 9.69 (s, 1H), 7.69 (d, 2H), 7.08 (d, 2H), 6.74 (dd, 1H), 4.07 (s, 2H), 3.53 (s, 2H), 3.46−3.52 (m, 178H), 3.05 (dd, 2H), 1.37 (s, 9H).
(実施例3)
N−(4−アジドベンゾイル)ポリアリルアミンの合成
N−(4−アジドベンゾイル)ポリアリルアミンの合成
手順は、Sugawaraら、Macromolecules 27巻、7809〜14頁(1994年)から作り変えた。KHCO3(0.28g、2.8mmol)の水(42mL)溶液を調製した。これに、ポリアリルアミン塩酸塩、MW120−200K(Alfa Aesar、0.69g、約9.4mmolアミン)、4−アジド安息香酸(TCI、0.38g、2.8mmol)およびDMF(14mL)を添加した。混合物を撹拌し、氷浴中で冷却した。次に、EDC(0.59g、3.1mmol)の、DMF(1mL)および水(0.5mL)混合物溶液を、ゆっくり滴下添加した。反応混合物を室温にして終夜撹拌し、周囲光から遮蔽した。終夜、溶液のpHは6.7であった。溶液を大型透析管(Snakeskin MWCO7000、Pierce)に移し、水(14L)中で24時間透析した。72時間の全透析時間にわたって、水を2回取り替えた。透析液を微量遠心管に入れて凍結させ、凍結乾燥させて(Speedvac)、アジドベンゾイルポリマー0.70gを得た。1H−NMR (D2O) δ: 7.87 (s, 2H), 7.03 (d, 2H), 3.01 (br s, 8.8H), 1.96 (br s, 4.4H), 1.48 (br s, 4.4H). 芳香族と脂肪族(ポリマー骨格)のプロトンの比に基づくと、アジドベンゾイル置換は、アミン4.4個当たり約1個、すなわち23%であった。
(実施例4)
ガラススライドの表面前処理
ガラススライドの表面前処理
顕微鏡ガラススライド(1’’×3’’×1mm)を、0.5wt%溶液のSDSを含有するガラス染色瓶に入れて20分間かけて超音波処理し、DI水で十分にすすいだ。次にそれを、1:1:5v/v比の29%NH4OH、30%H2O2およびDI水の混合物中で20分間かけて超音波処理し、DI水で十分にすすいだ。次に、スライドを、1:1:6v/v比の38%HCl、30%H2O2およびDI水の混合物中で20分間かけて超音波処理し、DI水で十分にすすいだ。前処理したスライドを、キャップ付きの瓶に入れたDI水中で保存した。スライドを、使用する前に、DI水による保存から取り出し、アルゴンで風乾させ、110℃で5分間焼成した。前処理したガラススライドは、<10°の水接触角を示した。
(実施例5)
3−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシランによるガラススライドのシリル化
3−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシランによるガラススライドのシリル化
前処理した五つのガラススライドを、スクリューキャップ付きのポリプロピレン染色管に入れた無水EtOH(30mL)、3−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン(500μL)およびトリエチルアミン(TEA、20μL)の混合物に浸漬した。管を、オービタルシェーカー上で2〜3時間穏やかに旋回させた。スライドを反応混合物から取り出し、十分な95%EtOHですすぎ、アルゴンで風乾させ、110℃のオーブン中で5分間焼き鈍した。シリル化ガラススライドは、55.8°±1.8°の水接触角を示し、調製した直後にこれらを使用した。
(実施例6)
一つまたは複数のアジドまたはアルキンサブユニットおよびN,N−ジメチルアクリルアミドおよびペンタフルオロフェニルアクリレートサブユニットを含むポリマーを調製するための一般手順
一つまたは複数のアジドまたはアルキンサブユニットおよびN,N−ジメチルアクリルアミドおよびペンタフルオロフェニルアクリレートサブユニットを含むポリマーを調製するための一般手順
サブユニットを、使用前に、それぞれ58〜60℃/3.5mmHgおよび42〜43℃/5トルで真空蒸留することによって精製される。ガラスアンプルに入れたアジドまたはアルキンを含有するサブユニット(所望のポリマーに従うモル比)、DMA(991.3mg、10.0mmol)、PFPA(238.11mg、1.0mmol)、2,2’−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニトリル)(1.0mg)、およびACN(3.0mL)を含有する混合物に、超純粋アルゴンを1分間通気して発泡させる。次に、アンプルを封止し、55℃の油浴に入れて22時間置く。封止を破り、溶媒を減圧下で除去し、残渣を最小量のTHFに溶解させる。THF溶液を、絶え間なく撹拌しながら10倍体積のn−ペンタンに滴下添加する。沈殿したポリマーを遠心分離処理し、上清を破棄する。ポリマーを、ペンタン(40mL)中で摩砕し、濾過し、40℃で真空乾燥する。
この一般手順は、アルキンまたはアジドサブユニット、DMAおよびPFPAを有する様々なコポリマーの調製に適用できる。サブユニットの比を変えると、異なる比のポリマーが得られる。
(実施例7)
クリックケミストリーを介して固体基材上にポリマーを表面固定化するための一般手順
クリックケミストリーを介して固体基材上にポリマーを表面固定化するための一般手順
実施例6に従って調製したポリマーを、Cu(I)を含む溶液中で、外表面上にアルキンまたはアジド部分(ポリマーが、アルキンを含有するか、またはアジドを含有するかに依存する)を含む固体基材と接触させる。溶媒および残りの反応物を、例えば洗浄することによって除去して、トリアゾール部分を介して共有結合により連結されているポリマーを含む固体支持体を得る。水接触角は、約50°〜70°の範囲である。
ポリマーは、アルキンまたはアジド官能基を介して固体基材に付着しているので、活性化エステルは、直交性方式での捕捉プローブへのコンジュゲーションに利用可能である。
(実施例8)
活性化エステルを介して固体基材上にポリマーを表面固定化するための一般手順
活性化エステルを介して固体基材上にポリマーを表面固定化するための一般手順
ACN(30mL)を含有するポリプロピレンスライド染色管に、TEA(150μL)および実施例6に記載の通り調製したポリマーを加える。この溶液に、四つのアミノシリル化顕微鏡ガラススライドを浸漬し、4〜16時間かけて穏やかに回転させる。スライドを取り出し、十分なアセトニトリルですすぎ、アルゴンで風乾させる。水接触角は、約50°〜70°の範囲である。
ポリマーは、活性化エステルを介して固体基材に付着しているので、アルキンまたはアジド官能基は、クリックケミストリーを介する捕捉プローブへのコンジュゲーションに利用可能である。
(実施例9)
アルキンまたはアジド、N,N−ジメチルアクリルアミド、および2−ビニル−4,4’−ジメチルアズラクトンサブユニットを含むポリマーの調製
アルキンまたはアジド、N,N−ジメチルアクリルアミド、および2−ビニル−4,4’−ジメチルアズラクトンサブユニットを含むポリマーの調製
2−ビニル−4,4’−ジメチルアズラクトン(VAL、Polysciences,Inc.)を、26〜27℃/600ミリトルで真空蒸留することによって精製する。ACN(30mL)中の再蒸留したDMA(4.80g、48.5mmol)、VAL(0.74g、5.39mmol)、アルキンまたはアジドサブユニット(所望のポリマーに従うモル比)、およびAIBN(15.9mg、0.097mmol)の混合物を、水冷型冷却器、超純粋Arに接続した20cmの19ゲージSS採血針(bleeding needle)、および鉱物油バブラー(mineral oil bubbler)に接続した排出用19ゲージSS針を備えた150mLの14/20三つ口フラスコに入れる。アルゴンを溶液中に20分間通気して発泡させ、次にフラスコを71℃の油浴に浸漬し、3〜4時間にわたって絶え間なく撹拌する。溶媒を減圧下で60℃において除去する。残渣を、真空下で50℃において2〜3時間乾燥させて、フラスコの壁上にコーティングされたガラス状ポリマーを得る。次に、ポリマーをメチルエチルケトン(15mL)に再び溶解させる。溶液が曇るまで、絶え間なく撹拌しながら石油エーテルを滴下添加する。次に、この曇った懸濁液を、激しく撹拌しながら過剰の石油エーテル(200mL)に滴下添加する。得られた上清を廃棄し、残りのポリマーを新しい石油エーテル(200mL)中で10分間かけて摩砕する。沈殿したポリマーを濾過し、石油エーテルですすぎ、真空乾燥する。異なる比のサブユニットを含有するポリマーを、モノマーサブユニットの比を調節することによって同様の仕方で調製する。
(実施例10)
溶液からCOCスライド上へのアジドベンゾイル−(10mol%)−ポリ(アリルアミン)のUVグラフト、およびその後の、それへのポリマーの表面固定化
溶液からCOCスライド上へのアジドベンゾイル−(10mol%)−ポリ(アリルアミン)のUVグラフト、およびその後の、それへのポリマーの表面固定化
約10mol%の4−アジドベンゾイル基を含有するN−アジドベンゾイル−ポリ(アリルアミン)(4.0mg)を、DI水(180μL)に溶解させることによって、グラフト用溶液を調製した。COCスライド(1’’×3’’×1mm)を、95%EtOHで十分にすすぎ、Arで風乾させた。乾燥COCスライドは、UVグラフトの前に85°を超える水接触角を示した。一定分量のポリマー溶液(90μL)を、COCスライドの中心上に移し、その上部に石英スライド(1’’×3’’×1mm)を置くことによって、COCスライド全体を被覆するように広げた。UVグラフトのために、合計二つの試料を調製した。このサンドイッチ状の組立て品を、365nmのUV光供給源(BondWang、Electro−Lite Corp.、10mW/cm2)の5cm下に置き、UV照射に15分間曝露した。サンドイッチ状の組立て品を、DI水に浸漬し、COCスライドを分離し、DI水で十分にすすいだ。次に、スライドを0.5NのHCl(30mL)中で60分間回転させた。0.5NのHClを1度入れ替えて、さらに60分間回転させ、次にそれらをDI水ですすぎ、Arで風乾させた。接触角は31.7°±3.7°であった。
ポリプロピレン染色管に入れた無水アセトニトリル(30mL)に、TEA(150μL)、および実施例6に従って調製されるポリマーを添加する。洗浄し乾燥させた二つのUVグラフト化COCスライドを、この溶液に浸漬し、4〜16時間かけて穏やかに回転させ、次に取り出し、アセトニトリルで十分にすすぎ、アルゴンで風乾させる。
得られた表面に固定されたポリマーは、クリックケミストリーを介する捕捉プローブへのコンジュゲーションに利用可能なアルキンまたはアジド部分を含む。ポリマーは、表面が、アミンではなくアジドまたはアルキンを含む類似の手順を使用して、固体基材に固定される。
この手順を、COCまたはCOP表面上へのその後のUVグラフトのために、広範な4−アジドベンゾイル置換レベルを有する様々なアジドベンゾイル−ポリ(アリルアミン)組成物に適用することができる。
(実施例11)
COPスライド上へのBoc−アミノ−PEG57−アセト−(4−アジド)アニリドの乾燥フィルムのUVグラフト、アミノ基の脱保護、およびその後の、代表的ポリマーの表面固定化
COPスライド上へのBoc−アミノ−PEG57−アセト−(4−アジド)アニリドの乾燥フィルムのUVグラフト、アミノ基の脱保護、およびその後の、代表的ポリマーの表面固定化
Boc−アミノ−PEG57−アセト−(4−アジド)アニリド(20.1mg)を、DI水(200μL)に溶解させることによって、グラフト用溶液を調製した。COPスライド(1’’×3’’×1mm)を、95%EtOHで十分にすすぎ、Arで風乾させた。乾燥スライドは、90°を超える水接触角を示した。スライドの片面を、外気中でコロナ放電によって処理し、スライドを、コロナ処理機(Electro−Technic Products,Inc.、モデルBD−20)の0.5cm下の距離を7回通過させた。コロナ処理した表面は、40.0°±1.9°の水接触角を示した。コロナ処理した表面の中心に、一定分量のグラフト用溶液(100μL)を置き、表面全体を被覆するようにステンレス鋼ヘラを用いて広げた。グラフト用溶液で表面を均一にコーティングし、乾燥させ、暗箱に入れて周囲温度で一晩かけて蒸発させた後、薄膜が形成された。乾燥フィルムを上向きにし、次にスライドを365nmのUV光供給源(BondWang、Electro−Lite Corp.、10mW/cm2)の5cm下に置き、UV照射に15分間曝露した。UV照射した表面を、アセトニトリルで十分にすすぎ、アルゴンで風乾させて、水接触角が57.1°±1.6°のグラフト化表面を得た。グラフト化アミノ基を脱保護するために、スライドを、MeOH中5%トリフルオロ酢酸に浸漬し、60分間回転させた。次に、スライドを十分なMeOHですすぎ、Arで風乾させて、水接触角が61.9°±3.7°のアミン表面を得た。
その後スライドを、実施例6に従って調製されるポリマー、およびTEA(150μL)を含むACN(30mL)溶液に浸漬する。スライドを60分間回転させ、十分なアセトニトリルですすぎ、アルゴンで風乾させて、水接触角が53°から70°までの表面を得る。
得られた表面に固定されたポリマーは、クリックケミストリーを介する捕捉プローブへのコンジュゲーションに利用可能なアルキンまたはアジド部分を含む。ポリマーは、表面が、アミンではなくアジドまたはアルキンを含む類似の手順を使用して、固体基材に固定される。
(実施例12)
100ÅのSiO2をスパッタリングした表面のアミノリシル化、およびその後の、代表的ポリマーの表面固定化
100ÅのSiO2をスパッタリングした表面のアミノリシル化、およびその後の、代表的ポリマーの表面固定化
COCまたはCOPスライドの片面を、プラズマエッチングし、その後、プレート(palate)(Hionix,Inc.、San Jose、CA)を用いて80℃でSiO2スパッタリングすることによって処理した。蒸着したSiO2の平均的な厚さは、100Åであり、水接触角は10°未満であった。シリカをスパッタリングしたCOCおよびCOPスライドを、3−アミノプロピルジイソプロピルエトキシシラン(250μL)およびTEA(20μL)の無水EtOH(30mL)溶液に浸漬した。スライドを穏やかに2時間回転させ、EtOHで十分にすすぎ、アルゴンで風乾させて、COCおよびCOPスライドについてそれぞれ58.2°±1.4°および55.9°±2.4°の水接触角を得た。
アミノシリル化COCまたはCOPスライドを、トリエチルアミン(150μL)を含有するアセトニトリル(30mL)に個々に浸漬する。浸漬させたCOCまたはCOPスライドに、実施例6に従って調製されるポリマーを添加する(COCについては28.6mgまたはCOPについては23.7mg)。COCまたはCOPスライドを、終夜回転させ、次に十分なアセトニトリルですすぎ、アルゴンで風乾させる。水接触角を決定する。
(実施例13)
COC表面上の代表的ポリマーの、架橋剤を用いずにUVで開始した界面重合
COC表面上の代表的ポリマーの、架橋剤を用いずにUVで開始した界面重合
N,N−ジメチルアクリルアミド(DMA)、ペンタフルオロフェニルアクリレート(PFPA)、およびアルキンまたはアジドを含有するサブユニットを、前述の通り真空蒸留によって精製する。DMA(800mg、8.07mmol)、PFPA(68.0mg、0.286mmol)、アジドまたはアルキンサブユニット(所望のポリマー組成に依存して変更されるモル比)、およびベンゾフェノン(31.8mg、0.175mmol)をアセトニトリル(1.0mL)に溶解させて、モノマー溶液を調製する。一定分量のモノマー溶液(150μL)を、COCスライドの中心に置き、次にその上部にPTFEスライド(1’’×3’’×1mm)を置くことによって、COCスライド全体を被覆するように広げる。次に、サンドイッチ状の組立て品を反転させ、COCスライドを上向きにし、365nmのUV光供給源(BondWang、Electro−Lite Corp.、10mW/cm2)の5cm下に置き、UV照射に15分間曝露する。次に、PTFEスライドを剥離し、COCスライドをアセトニトリルで十分にすすぎ、次にアルゴンで風乾させて、50°から70°までの水接触角を有するグラフト化表面を得る。この手順は、一般に、様々なモノマーモル比を有するDMAおよびPFPAのグラフト化コポリマーの調製に適用できる。
(実施例14)
COC表面上の代表的ポリマーの、架橋剤を用いてUV照射で開始した界面重合
COC表面上の代表的ポリマーの、架橋剤を用いてUV照射で開始した界面重合
実施例13の一般手順を適用する。DMA(794.4mg、8.01mmol)、PFPA(668mg、0.281mmol)、メチレン−ビス−アクリルアミド(MBA、40.0mg、0.259mmol)、アルキンまたはアジドモノマー(所望のポリマーに依存するモル比)、およびベンゾフェノン(32.0mg、0.176mmol)をACN(10.0mL)に溶解させることによって、モノマー溶液を調製する。一定分量のモノマー溶液(50μL)を、COCスライドの中心に適用し、次に前述の通りPTFEスライドを置くことによって、COCスライド全体を被覆するように広げる。サンドイッチ状の組立て品を反転させ、UVを照射した(前述の通り)。この手順は一般的に、他のポリマーに適用可能である。
(実施例15)
オリゴヌクレオチドアレイおよびデバイスの調製
オリゴヌクレオチドアレイおよびデバイスの調製
スポッティング用の、20μMのアミン修飾オリゴヌクレオチドの50mMリン酸ナトリウム(pH8.5)溶液を、384ウェルプレート内に調製する。次に、オリゴを、所望のパターンの、上記の調製される固体支持体(バイオコンジュゲーションに利用可能な活性化エステルを含む)上に、所望のスポットのサイズに合わせて選択した適切なスポットピンを備えたアレイスポッター(Array−it SpotBot3)によってスポットする。スライドの長さの1/4および3/4、かつスライドの幅に対して中心の点に、スライド一つ当たり二つのアレイをスポットする。スポットした後、スライドを75%相対湿度で4〜18時間インキュベートし、次にDI水流ですすぎ、アルゴンで風乾させる。
アジドまたはアルキン官能基を含むオリゴヌクレオチドのスポッティングは、コンジュゲーションに利用可能なアジドまたはアルキンを含む固体支持体が使用され、スポッティングが適切なクリック条件下で(例えばCu(I)の存在下で)実施されることを除いて類似の方式で実施される。
乾燥後にスライドを半分に切断し、その結果、スポットされたアレイがそれぞれ中心にある二つの1’’×1.5’’チップを得る。小型単一チャンバデバイスを組み立て、その底部に、スポットされたスライドを形成する。予め切断しておいた適切な寸法の両面PSAガスケットを、スライド上に置き、アレイスポット部分を、その周囲のほぼ円形の固定寸法領域と共に露出させておく。このガスケットの最上部に、予めドリルで穴を開けた二つの充填ポートを備えたポリカーボネートの蓋を置く。得られた組立て品を、熱サイクル中の適切な接着を保証する目的で、室温で積層状にする。
プライマーおよびプローブミックスを含む多重PCR溶液、緩衝液、酵素、ならびに標的DNAを、管中で予めミックスし、次に前述のチャンバに添加する。典型的な反応チャンバ容積は、25〜40μLである。PCR反応溶液を添加した後、チップのポリカーボネートの蓋のポートを、光学的に透明なフィルムで封止する。
PCR反応溶液で充填したデバイスを、熱サイクル過程中、落射蛍光顕微鏡を介してデジタルカメラによって表面を画像化することができる特別注文の熱サイクル装置で試験する。切断された蛍光性DNAフラップ(および完全なプローブ)に典型的なハイブリダイゼーション時間は、それらのハイブリダイゼーション温度(Tm)より低く冷却すると、2分未満である。捕捉プローブアレイにハイブリダイズした、切断されたフラップ(または完全なプローブ)の蛍光強度を測定することによって、表面の特徴を決定する。この方式では、表面安定性を、緩衝液中、典型的な熱サイクル条件下で測定する。デバイスのPCRも実施し、ここでの一つの実施は、典型的に、所望の時間に対して95℃で活性化し、95℃〜60℃の熱サイクルを40サイクル行うことを含み、滞留時間は95℃では15秒、60℃では60秒である。特定の選択されたサイクルにおいて、チャンバをプローブのTmより低く冷却して、60℃における伸長ステップ後にハイブリダイゼーションを行う。
自動化画像分析ソフトウェアを利用して、アレイスポットを位置付け、画素強度を測定することによって信号を定量化する。実際のスポット領域の外側の平均画素強度を、スポット内側の平均画素強度から差し引いて、スポット領域についてバックグラウンド−差分画素強度を得る。これらの強度を、捕捉プローブに特異的な切断DNAフラップを検出するために、熱サイクル過程にわたってモニタする。
本明細書および/または添付の出願データシートにおいて言及されている、2012年10月12日出願の米国特許出願第61/713,329号を含めた米国特許文書、米国特許出願公開文書、米国特許出願文書、外国特許文書、外国特許出願文書および非特許刊行物のすべては、本発明と矛盾しない範囲でそれらの全体が参考として本明細書に援用される。
前述のことから、本発明の具体的な実施形態を本明細書において例示目的で記載したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な改変がなされ得ることが理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によって限定される場合を除いて限定されない。
Claims (168)
- 固体基材の外表面に固定されたポリマーを含む固体支持体であって、前記ポリマーが、B、DおよびEサブユニットを含み、
前記Bサブユニットが、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
前記Dサブユニットが、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する反応基を含むか、または前記Dサブユニットが、捕捉プローブとの共有結合を含み、
前記Eサブユニットが、出現するごとに独立に、二つの相補的なクリック官能基の反応生成物を含むサブユニットであり、前記反応生成物が、前記固体基材の前記外表面との共有結合、または前記Eサブユニットと前記固体基材の前記外表面の間に任意選択のリンカー(L4)との共有結合を含む、
固体支持体。 - 前記反応生成物が、アルキン、アミン、アルキルシリルで保護されたアルキン、アジド、ニトリル、チオール、アルケン、マレイミド、エポキシド、アジリジンまたはチイラン官能基と、相補的なクリック反応基との反応によって形成され得る、請求項1または2のいずれかに記載の固体支持体。
- 少なくとも一つのEサブユニットが、前記ポリマーの末端位置にある、請求項1から3のいずれかに記載の固体支持体。
- L1が、アルキレン、エステル、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む、請求項5または6のいずれかに記載の固体支持体。
- L1が、存在しない、請求項5または6のいずれかに記載の固体支持体。
- αが、1である、請求項5から8のいずれかに記載の固体支持体。
- R2が、Hである、請求項5から9のいずれかに記載の固体支持体。
- L4が、ケイ素−酸素結合、アルキレン鎖、ポリマーまたはそれらの組合せを含む、請求項1から10のいずれかに記載の固体支持体。
- 前記ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項11に記載の固体支持体。
- 前記ポリエチレングリコールが、1〜50,000個のモノマーサブユニットを含む、請求項12に記載の固体支持体。
- 前記ポリエチレングリコールが、55〜90個のモノマーサブユニットを含む、請求項13に記載の固体支持体。
- L4が、以下の構造
L5およびL6は、それぞれ独立に、アルキレン、アルキレンオキシド、イミド、エーテル、エステルもしくはアミド部分、またはそれらの組合せを含む任意選択のリンカーであり、
R24およびR25は、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシまたは−OQであり、Qは、前記固体基材の前記外表面であり、
R26、R27、R28およびR29は、それぞれ独立に、H、アルキル、ハロ、ニトリル、ニトロまたはアンモニウムであり、
Pは、ポリマーサブユニットを表し、
Aは、直接結合または−S(O)2−であり、
γは、1〜2000の範囲の整数であり、
L4は、末端窒素または酸素原子を介して前記固体基材に結合している、
請求項1から14のいずれかに記載の固体支持体。 - Pが、−CH2−または−OCH2CH2−である、請求項15に記載の固体支持体。
- γが、1〜90の範囲である、請求項17に記載の固体支持体。
- L4が、存在しない、請求項1から10のいずれかに記載の固体支持体。
- 前記反応生成物が、トリアゾールである、請求項1から19のいずれかに記載の固体支持体。
- 少なくとも一つのEサブユニットが、T4に共有結合している末端位置にある、請求項1から21のいずれかに記載の固体支持体。
- T4が、Hである、請求項22に記載の固体支持体。
- L4が、一つまたは複数のポリエチレングリコール繰り返し単位を含む、請求項21に記載の固体支持体。
- L3が、アルキレン、エステル、アルキレンオキシド、アミド、イミド、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む、請求項25に記載の固体支持体。
- L3が、存在しない、請求項25に記載の固体支持体。
- εが、1である、請求項25から27のいずれかに記載の固体支持体。
- R16が、Hである、請求項25から28のいずれかに記載の固体支持体。
- R17、R18、R19、R20、R21、R22およびR23が、それぞれ独立に、Hまたはメチルである、請求項30に記載の固体支持体。
- L2が、アルキレン、エステル、アルキレンオキシド、アミド、イミド、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む、請求項34に記載の固体支持体。
- L2が、存在しない、請求項34に記載の固体支持体。
- δが、1である、請求項34から36のいずれか一項に記載の固体支持体。
- R5が、Hである、請求項34から37のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記反応基が、出現するごとに独立に、前記捕捉プローブにおけるアミン基との共有結合形成に対して特異的な反応性を有する、請求項1から38のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記反応基が、出現するごとに独立に、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)エステル、スクシンイミジルアセチルチオアセテート(SATA)、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、アリールエステル、イミドエステル、イソシアネート、ソラレン、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アズラクトンまたはベンゾフェノンである、請求項1から39のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記反応基が、出現するごとに独立に、NHSエステル、アズラクトンまたはアリールエステルである、請求項40に記載の固体支持体。
- R6、R7、R8およびR9のそれぞれが、Hである、請求項42に記載の固体支持体。
- R10、R11、R12、R13またはR14の少なくとも一つが、電子求引基である、請求項43に記載の固体支持体。
- R10、R11、R12、R13またはR14のそれぞれが、電子求引基である、請求項44に記載の固体支持体。
- 前記電子求引基が、ハロゲン、ニトロまたはニトリルである、請求項44から45のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記電子求引基が、フルオロである、請求項46に記載の固体支持体。
- ポリが、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(メチルビニルエーテル)、ポリ(エチルビニルエーテル)、ポリ(N−ビニルホルムアミド)、(ポリ(N−ビニルアセトアミド)または(ポリ(N−メチル−N−ビニルアセトアミド)である、請求項42に記載の固体支持体。
- 前記Dサブユニットが、T2に共有結合している末端位置にある、請求項1から51のいずれか一項に記載の固体支持体。
- T2が、Hである、請求項52に記載の固体支持体。
- 前記Dサブユニットが、捕捉プローブとの共有結合を含む、請求項1から33のいずれか一項に記載の固体支持体。
- L2が、アルキレン、エステル、カルボニル、アルキレンオキシド、アミド、イミドエーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む、請求項55に記載の固体支持体。
- δが、1である、請求項55または56に記載の固体支持体。
- R5が、Hである、請求項55から57のいずれかに記載の固体支持体。
- L4が、請求項11から18のいずれかに定義した通りである、請求項60に記載の固体支持体。
- 前記捕捉プローブが、窒素原子を介して前記Dサブユニットに共有結合している、請求項54から61のいずれかに記載の固体支持体。
- 前記捕捉プローブが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドである、請求項54から62のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記捕捉プローブが、ポリヌクレオチドである、請求項63に記載の固体支持体。
- 前記捕捉プローブが、DNAである、請求項64に記載の固体支持体。
- 50°〜90°の範囲の水接触角を有する、請求項1から65のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 有機ポリマーを含む、請求項1から66のいずれかに記載の固体支持体。
- 前記固体基材が、ポリ(スチレン)、ポリ(カーボネート)、ポリ(エーテルスルホン)、ポリ(ケトン)、ポリ(脂肪族エーテル)、ポリ(アリールエーテル)、ポリ(アミド) ポリ(イミド)、ポリ(エステル) ポリ(アクリレート)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(オレフィン)、ポリ(環式オレフィン)、ポリ(ビニルアルコール)、またはそれらのコポリマー、ハロゲン化誘導体もしくは架橋誘導体を含む、請求項67に記載の固体支持体。
- 前記ハロゲン化誘導体が、ハロゲン化ポリ(アリールエーテル)、ハロゲン化ポリ(オレフィン)またはハロゲン化ポリ(環式オレフィン)である、請求項68に記載の固体支持体。
- 前記固体基材が、環式ポリ(オレフィン)を含む、請求項68に記載の固体支持体。
- 前記固体基材が、酸化物を含む、請求項1から66のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記固体基材が、ケイ素、溶融シリカ、ガラス、石英、酸化インジウムスズ、二酸化チタン、酸化アルミニウムまたはそれらの組合せを含む、請求項71に記載の固体支持体。
- 前記固体基材が、有機ポリマーを含み、前記固体支持体は外表面を含み、前記外表面は、それに付着している酸化物層を有する、請求項1から66のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記固体基材が、実質的に光学的に透明である、請求項1から73のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記固体基材が、約400nm〜約800nmの間で実質的に光学的に透明である、請求項1から74のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記固体基材が、少なくとも約90%光学的に透明である、請求項1から75のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 前記固体支持体が別個の位置の系統的なアレイを含み、別個の位置の各々が、それにコンジュゲートしている前記ポリマーのうちの少なくとも一つを独立に含む、請求項1から76のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 別個の位置の各々が、それにコンジュゲートしている前記ポリマーのうちの複数を独立に含む、請求項77に記載の固体支持体。
- 別個の位置の各々にある少なくとも一つのポリマーが、それにDサブユニットを介して共有結合している捕捉プローブを含む、請求項77〜78のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 別個の位置の各々が、それに結合している少なくとも一つの捕捉プローブを含み、前記捕捉プローブが、その他の別個の位置の各々において結合している少なくとも一つの捕捉プローブとは構造的に別個である、請求項77から79のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 別個の位置の各々が、それに結合している複数の構造的に別個の分析物分子を含む、請求項77に記載の固体支持体。
- 前記捕捉プローブが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドである、請求項77から80のいずれかに記載の固体支持体。
- 前記捕捉プローブが、ポリヌクレオチドである、請求項82に記載の固体支持体。
- 前記捕捉プローブが、DNAである、請求項83に記載の固体支持体。
- 前記ポリヌクレオチドまたはDNAが、標的ポリヌクレオチドまたはDNAの配列に相補的な配列を含む、請求項83または84のいずれか一項に記載の固体支持体。
- A、BおよびCサブユニットを含むポリマーであって、
前記Aサブユニットが、出現するごとに独立に、固体基材上の標的官能基との共有結合形成に対して特異的な反応性を有する第1の反応基を含み、
前記Bサブユニットが、出現するごとに独立に、親水性官能基を含み、
前記Cサブユニットが、出現するごとに独立に、捕捉プローブとの共有結合性コンジュゲーションに対して特異的な反応性を有する第2の反応基を含み、
前記第1の反応基および前記第2の反応基の反応性が、互いに直交性である、
ポリマー。 - 前記ポリマーの末端位置にAサブユニットを含む、請求項86または87に記載のポリマー。
- 前記第1の反応基が、出現するごとに独立に、クリック反応性を有する、請求項86から88のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記第1の反応基が、出現するごとに独立に、アジドとの反応に対して特異的である、請求項89に記載のポリマー。
- 前記第1の反応基が、出現するごとに独立に、アルキンである、請求項90に記載のポリマー。
- 前記第1の反応基が、出現するごとに独立に、アルキンとの反応に対して特異的である、請求項89に記載のポリマー。
- 前記第1の反応基が、出現するごとに独立に、アジドである、請求項92に記載のポリマー。
- L1が、アルキレン、エステル、アルキレンオキシド、アミド、イミド、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む、請求項94または95のいずれか一項に記載のポリマー。
- L1が、存在しない、請求項94または95のいずれか一項に記載のポリマー。
- αが、1である、請求項95から97のいずれか一項に記載のポリマー。
- R2が、Hである、請求項95から98のいずれかに記載のポリマー。
- R1が、アルキン、アルキルシリルで保護されたアルキン、アジド、ニトリル、チオール、アルケン、マレイミド、エポキシド、アジリジンまたはチイラン官能基である、請求項94から99のいずれか一項に記載のポリマー。
- R1が、アルキンまたはアジド官能基である、請求項94から99のいずれか一項に記載のポリマー。
- βが、1または3である、請求項102に記載のポリマー。
- χが、1である、請求項102に記載のポリマー。
- 少なくとも一つのAサブユニットが、T1に共有結合している末端位置にある、請求項86から105のいずれかに記載のポリマー。
- T1が、Hである、請求項106に記載のポリマー。
- L2が、アルキレン、エステル、アルキレンオキシド、アミド、イミド、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む、請求項110に記載のポリマー。
- L2が、存在しない、請求項110に記載のポリマー。
- δが、1である、請求項110から112のいずれか一項に記載のポリマー。
- R5が、Hである、請求項110から113のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記第2の反応基の反応性が、出現するごとに独立に、前記捕捉プローブにおけるアミン基に対して特異的である、請求項86から114のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記第2の反応基が、出現するごとに独立に、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)エステル、スクシンイミジルアセチルチオアセテート(SATA)、カルボジイミド、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、アリールエステル、イミドエステル、イソシアネート、ソラレン、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アズラクトンまたはベンゾフェノンである、請求項86から115のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記第2の反応基が、出現するごとに独立に、NHSエステル、アズラクトンまたはアリールエステルである、請求項116に記載のポリマー。
- R6、R7、R8およびR9のそれぞれが、Hである、請求項118に記載のポリマー。
- R10、R11、R12、R13またはR14の少なくとも一つが、電子求引基である、請求項118から119のいずれか一項に記載のポリマー。
- R10、R11、R12、R13またはR14のそれぞれが、電子求引基である、請求項120に記載のポリマー。
- 前記電子求引基が、ハロゲン、ニトロまたはニトリルである、請求項118から121のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記電子求引基が、フルオロである、請求項122に記載のポリマー。
- ポリが、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(メチルビニルエーテル)、ポリ(エチルビニルエーテル)、ポリ(N−ビニルホルムアミド)、(ポリ(N−ビニルアセトアミド)または(ポリ(N−メチル−N−ビニルアセトアミド)である、請求項118に記載のポリマー。
- 少なくとも一つのCサブユニットが、T2に共有結合している末端位置にある、請求項86から127のいずれか一項に記載のポリマー。
- T2が、Hである、請求項128に記載のポリマー。
- L3が、アルキレン、エステル、アルキレンオキシド、アミド、イミド、エーテルもしくはジチオ部分、またはそれらの組合せを含む、請求項130に記載のポリマー。
- L3が、存在しない、請求項130に記載のポリマー。
- εが、1である、請求項130から132のいずれか一項に記載のポリマー。
- R16が、Hである、請求項130から133のいずれか一項に記載のポリマー。
- R17、R18、R19、R20、R21、R22およびR23が、それぞれ独立に、Hまたはメチルである、請求項135に記載のポリマー。
- 前記ポリマー中の前記サブユニットの少なくとも30%が、Bサブユニットである、請求項86から139のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記ポリマー中の前記サブユニットの少なくとも75%が、Bサブユニットである、請求項86から140のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記ポリマー中の前記サブユニットの少なくとも90%が、Bサブユニットである、請求項86から141のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記ポリマー中の前記サブユニットの少なくとも95%が、Bサブユニットである、請求項86から142のいずれか一項に記載のポリマー。
- ただ一つのAサブユニットを含む、請求項86から143のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記Aサブユニットが、前記ポリマーの末端にある、請求項144に記載のポリマー。
- 前記捕捉プローブが、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチドまたは炭水化物である、請求項86から145のいずれか一項に記載のポリマー。
- 前記捕捉プローブが、ポリヌクレオチドである、請求項146に記載のポリマー。
- 前記捕捉プローブが、DNAである、請求項147に記載のポリマー。
- 外表面を含む固体基材であって、前記外表面に共有結合しているアジドまたはアルキン部分を含む、固体基材。
- L4が、存在する、請求項150に記載の固体基材。
- L4が、請求項11から18のいずれかに定義した通りである、請求項150に記載の固体基材。
- ιが、1、2または3である、請求項149から152のいずれかに記載の固体基材。
- 固体支持体であって、それに結合している捕捉プローブを有する固体支持体を調製する方法であって、前記方法は、請求項149から153のいずれかに記載の固体支持体を、請求項86から148のいずれかに記載のポリマーと接触させて、固体支持体であって、それに結合しているポリマーを含む固体支持体を得るステップを含む、方法。
- Cu(I)触媒を、請求項149から153のいずれかに記載の固体支持体および請求項86から148のいずれかに記載のポリマーと接触させるステップをさらに含む、請求項154に記載の方法。
- 前記固体支持体であって、それに結合しているポリマーを含む固体支持体と、アミン官能基を有する捕捉プローブを接触させるステップをさらに含む、請求項154または155のいずれかに記載の方法。
- a)請求項1から85のいずれかに記載の固体支持体を準備するステップであって、前記Dサブユニットが、それに共有結合している捕捉プローブを含む、ステップと、
b)分析物プローブを、前記固体支持体と接触させるステップと、
c)前記捕捉プローブと前記分析物プローブの相互作用から生じた信号の存在または非存在を検出するステップとを含む、
標的分析物分子の存在または非存在を決定する方法。 - 前記固体支持体が、請求項54から65のいずれかに記載の固体支持体である、請求項157に記載の方法。
- 前記捕捉プローブが、ポリヌクレオチドである、請求項157または158のいずれかに記載の方法。
- 前記標的分析物分子が、ポリヌクレオチドである、請求項157から159のいずれかに記載の方法。
- 前記信号が、蛍光信号である、請求項157から160のいずれかに記載の方法。
- 前記蛍光信号が、捕捉プローブを用いる前記分析物プローブの特異的なハイブリダイゼーションの結果として生じる、請求項161に記載の方法。
- 前記分析物プローブが、フルオロフォアまたはフルオロフォアクエンチャーを含む、請求項157から162のいずれか一項に記載の方法。
- R26、R27、R28およびR29のそれぞれが、Hである、請求項164に記載の化合物。
- Aが、直接結合である、請求項164または165のいずれかに記載の化合物。
- γが、1〜90の範囲である、請求項167に記載の化合物。
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