KR20150083859A - 직교 반응성 기를 갖는 중합체 및 그의 용도 - Google Patents

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알드리치 엔. 케이. 라우
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Abstract

직교 반응성 기를 갖는 중합체, 및 여기에 고정화된 중합체를 포함하는 고체 지지체가 제공된다. 본 중합체는 높은 처리량 검정을 위해 고체 지지체에 분석물 분자를 고정화시킴을 포함하는 임의 수의 용도에서 유용성을 발견한다.

Description

직교 반응성 기를 갖는 중합체 및 그의 용도 {POLYMERS HAVING ORTHOGONAL REACTIVE GROUPS AND USES THEREOF}
[정부 이익에 대한 진술]
본 명세서에서 기술된 작업에 대한 부분적 자금은 미국 국토안전보장성에 의해 HSHQDC-10-C-00053에 따라 제공되었다. 미국 정부는 이 발명에 일정한 권리를 갖는다.
[발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 신규의 중합체, 이 고분자를 포함하는 고체 지지체, 및 이의 사용방법에 관한 것이다.
생물학적 검정(bioassay)은 생물학적 시료에서 분석물의 존재 및/또는 양을 탐침하기 위해 사용한다. DNA 마이크로어레이와 같은 표면 기본 검정에서, 분석물 종은 일반적으로 고체 지지체 또는 기판 상에서 포획되고 검출된다. DNA 마이크로어레이의 사용은 다수개의 유전자들을 동시에 검출하는 능력으로 인하여 유전자 발현 및 유전자 진단의 연구에서 널리 채용되어 왔다.(Schena et al., Science 270:467-470 (1995); Pollack et al., Nat. Genet. 23:41-46 (1999)). 표면 어레이는 또한 배열 형태의 광범위한 생물학적 검정을 촉진하기 위하여 탄수화물, 항체, 단백질, 합텐 또는 앱타머와 같은 다른 결합 모이어티를 사용하여 제조할 수 있다.
생물학적 검정 적용을 위해 효과적인 작용화 물질은, 검출에 적용하였을 때 (예를 들면, 중합효소 연쇄 반응), 적절한 신호를 제공하기 위하여 관련 시료로부터 충분한 량의 분석물을 고정화하는 적절한 능력을 가져야 한다. 또한 적절한 작용화 물질은, 특히 시료와 대조군이 이들이 관련하는 이종의 표면 지지체 상에, 예를 들면 동일 지지체 상의 상이한 지지체 또는 상이한 위치에서 분석해야 하는 검정 형태로, 프로파일 실험에 이익되게 적용하기 위하여 고도로 재생 가능한 표면을 제공하여야 한다. 예를 들면, 고도로 재생 가능한 표면 화학을 기본으로 하지 않는 지지체들은 지지체 대 지지체의 변동 또는 동일 지지체 상의 상이한 위치로 인하여 어세이 (예를 들면, 프로파일링 비교)를 수행할 때 현저한 오류를 초래할 수 있다.
표면 어레이(예를 들어, "DNA 칩")은 중합체들을 사용하여 고체 지지체에 분석물을 부착함으로써 제조되었다. 일반적으로, 중합체를 포함하는 어레이는 고체 기판(예를 들면, 비이드, 입자, 플레이트 등)의 전구체 모노머 또는 프리폴리머의 인사이투(in situ) 중합 반응에 의해 형성된다. 유기 중합체를 포함하는 어레이들의 선택성 및 재현성은 흔히, 단량체의 농도, 단량체 비율, 개시제의 종류와 농도, 용매 증발 속도, 주변 습도 (용매가 물인 경우), 가교제의 종류와 농도, 단량체/가교제/용매의 순도, 실험실 온도, 피펫 시간, 스파징 조건, 반응 온도 (열중합의 경우), 반응 습도, 자외선 조사의 균일성 (UV 광중합체의 경우) 및 주위산소 조건을 포함하는 다수의 실험 변수에 매우 의존적이다. 이들 파라미터의 대부분은 제조 세팅에서 조절할 수 있지만, 이들 파라미터의 모두를 조절하는 것이 불가능하지 않다면 어렵다. 그 결과, 인사이투 반응은 스폿 대 스폿(spot-to-spot), 칩 대 칩(chip-to-chip) 및 로트 대 로트(lot-to-lot) 비교적 열악한 재생가능성을 초래한다. 더욱이, 잔류 단량체/가교제/개시제 및 부산물은 용이하게 실행할 수 없는 추가적인 정제 단계를 필요로 한다.
그 외에, 실리카계 기판, 예를 들면, 유리, 석영, 융합 실리카 및 실리콘을 사용하여 어레이 표면의 개발에 상당량의 작업이 소용되었지만 [참조, 예를 들면, D. Cuschin et al, Anal. Biochem. 1997, 250, 203-211; G.M. Harbers et al, Chem. Mater. 2007, 19, 4405-4414; and 미국특허 제6,790,613호 (Shi et al), 제 5,932,711호 (Boles et al), 제6,994,972호 (Bardhan, et al등), 제7,781,203호 (Frutos et al) 및 제7,217,512호 및 제7,541,146호 (Lewis et al)], 더 적은 비용으로 더욱 용이하게 제조된 기판, 예를 들어 중합체 기판으로부터 특정의 이점들이 파생한다. 그러나 추가적인 도전들은 생물학적 검정 목적을 위한 이러한 기판의 선택 및 제작에서 직면하였다. 예를 들면, 중합체 기판은 흔히 주요 중합체 기판에 인사이투 중합된 코팅을 부착하거나 결합시키는 도전은 물론 증가된 자가형광, 증가된 소수성 등의 추가적 표면 작용화의 결과 나쁜 문제점을 안고 있다.
따라서 이 분야에서 발전이 이루어졌지만, 당해 분야에는 개선된 작용화 고체 기판, 중합체 및 이들 고체 기판에 분석물을 부착시키기 위한 방법, 및 DNA 마이크로 어레이와 같은 다양한 어세이에서 사용되는 이러한 중합체를 포함하는 고체 지지체에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족하고 관련된 추가적인 이점을 제공한다.
요컨대, 본 발명은 일반적으로 직교 반응성 기를 갖는 중합체에 관한 것이다. 이들 중합체는 분석적 검정에 사용하기 위한 고체 기판 상에 포획 프로브를 고정화하는 것을 포함하는 임의의 다수의 용도에서 유용성을 발견한다. 중합체와의 반응 또는 상호작용에 적합한 반응기를 포함하는 고체 기판, 및 상기 중합체 및 임의의 포획 프로브를 포함하는 고체 지지체가 또한 제공된다. 본 출원에서 기술되는 중합체, 고체 기판 및 고형 지지체는 다양한 분석적 용도, 예를 들면 분석 치료 상황의 개별적인 포인트에서 사용하기 위한 DNA 및 단백질 마이크로 어레이 (지지체 (실제로, 병원, 응급실, 가정), 높은 처리량 테스트 및 다른 용도에 유용하다.
본 출원에서 기술되는 중합체, 고체 기판, 고체 지지체 및 관련 방법은 다양한 실시형태에서 다수의 이점을 제공한다. 예를 들면, 특정의 실시형태에서, 고체 기판에 중합체를 고정화하기 위해 여기서 기술되는 반응기는 고정화 반응 중에 제공되는 특정 조건을 제외하고는 실질적으로 불확성이며, 이것은 표면 코팅 공정 중에 예측 가능한 및 최적의 반응성을 보장한다. 또한 일부 실시형태는 고체 기판에 중합체를 고정화하기 위한 클릭 화학(click chemistry)을 이용하며, 이러한 화학은 실질적으로 pH-민감성이 없으며 또한 제한된 부산물을 생산하거나 부산물을 전혀 생산하지 않는다. 관련된 이점들은 클릭 반응성을 갖는 작용기들이 클릭 화학을 통해 포획 프로브 (예를 들면, DNA 또는 올리고뉴클레오티드 등의 생체분자)에 중합체를 접합하기 위해 사용된다.
상기 중합체는 직교 반응성 기를 포함하기 때문에 추가의 이점이 실현된다. 예를 들어, 중합체의 실시형태는 고체 기판에 중합체의 고정화 ("고정화기")에 특이적인 하나 이상의 반응성 기 및 폴리뉴클레오티드 또는 항체 등의 포획 프로브 ("접합기")에 접합을 위해 특이적인 하나 이상의 작용기를 갖는 고분자를 포함한다. 따라서, 단지 한 종류의 반응성 기는 어레이 스포팅 중에 포획 프로브 (아민 개질 생체분자)와 반응할 수 있다. 중합체 기반 표면에 존재하는 임의의 미반응 고정화 기 (예를 들면, 제1 반응기)는 접합에 사용되는 조건하에 불활성이며 또한 생물학적 검정 성능에 영향을 미치지 않을 것이다. 또한 본 발명의 특정한 실시형태는 거의 정량적이며 거의 즉각적인(분) 커플링 반응을 이용하는 반면, 선행기술 방법은 몇 시간 걸릴 수 있고 경쟁적 가수분해 때문에 반응성 기의 일부에 단지 커플링할 수 있다.
일 실시형태에서, A, B 및 C 서브 유닛을 포함하는 중합체가 제공되며, 여기서,
상기 A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 표적 작용기와의 반응에 특이적인 반응성을 갖는 제1 반응성 기를 포함하고;
상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 친수성 작용기를 포함하고;
상기 C 서브 유닛은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브에 대한 공유 접합을 위해 특이적인 반응성을 갖는 제2 반응기를 포함하고;
여기서 상기 제1반응기 및 제2반응기의 반응성은 서로 직교한다.
상기 표적 작용기는 고체 기판의 외부 및/또는 내부 표면상에, 예를 들면 다공성 단일체의 표면상에 위치하는 작용기일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 고체 기판에 고정화된 중합체를 포함하며, 상기 중합체는 B, D 및 E 서브유닛을 포함하는 것인 고체 지지체를 제공하며, 여기서
상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 친수성 작용기를 포함하고;
상기 D 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브에 대한 공유접합을 위해 특이적인 반응성을 갖는 반응기를 포함하거나 또는 상기 D 서브유닛은 포획 프로브에 대한 공유 결합을 포함하며; 또한
상기 E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 클릭 작용기 및 상기 고체 기판에 또는 상기 D 서브유닛과 상기 고체 기판 사이에 배치된 임의 선택적 링커(L4) 중의 하나에 공유 결합을 포함한다.
여기에 중합체를 고정화기 위한 반응성 기를 포함하는 고체 기체, 화합물 (예를 들면, 중합체), 및 이러한 고형 지지체를 제조하는 방법 및 관련 분석 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 이들 및 다른 양상들은 다음의 상세한 설명을 참조하면 명백해질 것이다. 이를 위해, 특정의 배경 정보, 절차, 화합물 및/또는 조성물을 상세하게 설명하는 다양한 참조가 본 명세서에서 서술되며, 이들은 각각 그의 전문이 참고로 포함된다.
도면에서, 동일한 참조 번호는 유사한 구성요소를 식별한다. 도면에서 크기 및 상대적인 위치는 반드시 축척대로 도시되지 않으며, 이들 요소 중 일부는 가독성을 향상시키기 위해 임의로 확대되거나 또는 위치된다. 또한, 도시된 바와 같은 구성요소들의 특정 형상은 특정한 구성요소들의 실제 형상에 관한 임의의 정보를 전달하도록 의도되지 않으며, 오로지 도면에서 인식의 용이성을 위해 선택되었다.
도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 고형 지지체의 표면에 생체분자의 고정화를 보여주는 개략도이다.
도 2a, 2b 및 2c는 예시적인 방법을 도시한다.
다음의 설명에서, 특정의 구체적 사항들은 본 발명의 다양한 실시형태들의 완전한 이해를 제공하기 위해 설명된다. 그러나 당업자는 본 발명이 이러한 세부 사항 없이도 실시할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "~들을 포함하다"(comprise) 및 그의 변형어, 예를 들면 "~을 포함하는" 및 "~을 포함하는"은 개방적이고, 포괄적인 의미로, 즉 "~을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다"로 해석되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "일 실시형태" 또는 "실시형태"에 대한 언급은 상기 실시형태와 관련하여 기술된 특정의 특성, 구조 또는 특징들이 본 발명의 적어도도 일 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 "일 실시형태에서" 또는 "실시형태에서"는 반드시 모두 동일한 실시형태를 언급하는 것이 아니다. 더욱이, 특정의 특성, 구조 또는 특징들은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적절한 방식으로 결합할 수 있다.
"아미노"는 -NH2 라디칼을 의미한다.
"시아노"는 -CN 라디칼을 의미한다.
"히드록시" 또는 "히드록실"은 -OH 라디칼을 의미한다.
"이미노"는 =NH 치환기를 의미한다.
"니트로"는 -N02 라디칼을 의미한다.
"옥소"는 =0 치환기를 의미한다.
"티옥소"는 = S 치환기를 의미한다.
"알킬"은 오직 탄소 및 수소원자로 이루어진 직선형 또는 분지형 탄화수소 사슬 라디칼로서, 포화 또는 불포화되고 (즉, 하나 이상의 이중 및/또는 삼중결합을 함유하고), 1 내지 12개의 탄소원자 (C1-C12 알킬), 바람직하게는 1 내지 8개의 탄소원자 (C1-C8 알킬)을 가지며, 또한 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착되며, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸 (iso-프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸 (t-부틸), 3-메틸헥실, 2-메틸헥실, 에테닐, 프로프-1-에닐, 부트--1-에닐, 펜트-1-에닐, 펜타-1,4-디에닐, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시 닐 등을 언급한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬기는 임의로 치환될 수 있다.
"알킬렌" 또는 "알킬렌 사슬"은 오직 탄소 및 수소원자로 이루어진, 분자의 나머지에 라디칼기를 연결하는 직선형 또는 분지형 이가 탄화수소 사슬로서, 포화 또는 불포화되고(즉, 하나 또는 그 이상의 이중 및/ 삼중 결합을 포함하고), 1 내지 12개의 탄소원자를 가지며, 예를 들면, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, N-부틸렌, 에테닐렌, 프로페닐렌, n-부테닐렌, 프로피닐렌, n-부티닐렌, 등을 언급한다. 상기 알킬렌 사슬은 단일 또는 이중결합을 통해 분자의 나머지에 부착되거나 또는 단일 또는 이중결합을 통해 라디칼기에 부착된다. 라디칼기의 나머지에 및 라디칼기에 알킬렌 사슬의 부착 지점은 상기 사슬 내에서 하나의 탄소 또는 임의의 두 개의 탄소를 통해서일 수 있다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬렌 사슬은 임의로 치환될 수 있다.
"알콕시"는 식 -ORa의 라디칼을 의미하며, 여기서 Ra는 1 내지 12개의 탄소원자를 함유하는 상술한 바와 같은 알킬 라디칼이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알콕시기는 임의로 치환 될 수 있다.
"알킬아미노"는 식 -NHRa 또는 -NRaRa의 라디칼을 의미하며, 여기서 각각의 Ra는 독립적으로 1 내지 12개의 탄소원자를 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬 라디칼이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬기는 임의로 치환 될 수 있다.
"티오알킬"은 식 -SRa의 라디칼을 의미하며, 여기서 Ra는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬 라디칼이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 티오알킬기는 임의로 치환될 수 있다.
"아릴"은 수소, 6 내지 18개의 탄소원자 및 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 탄화수소 고리 시스템 라디칼을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 아릴 라디칼은 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템일 수 있으며, 이는 융합 또는 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있다. 아릴 라디칼은, 이들로 제한되지 않지만, 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세펜안트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 플루오란텐, 플루오렌, as-인다센, s-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 페날린, 페난트렌, 플레이아덴, 피렌, 및 트리페닐렌으로부터 유도된 아릴 라디칼을 포함한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "아릴" 또는 접두어 "아르-" (예를 들어 "아르알킬")은 임의로 치환된 아릴 라디칼을 포함한다는 것을 의미한다.
"아르알킬"은 식 -Rb-Rc의 라디칼을 의미하며, 여기서 Rb는 상기 정의된 바와 같은 알킬렌 사슬이며 Rc는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 아릴 라디칼, 예를 들면, 벤진, 디페닐메틸 등이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 아르알킬기는 임의로 치환 될 수 있다.
"사이클로 알킬" 또는 "카르보사이클릭 고리"는 단지 탄소 및 수소 원자로만 루어진 안정한 비-방향족 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소 라디칼로서, 융합 또는 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있고, 3 내지 15개의 탄소 원자를 가지며, 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소원자를 가지며, 또한 포화 또는 불포화되고 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착되는 것을 의미한다. 모노사이클릭 라디칼은 예를 들면 사이클로 프로필, 사이클로 부틸, 사이클로 펜틸, 사이클로 헥실, 사이클로 헵틸, 및 사이클로 옥틸을 포함한다. 폴리사이클릭 라디칼은 예를 들면 아 다만틸, 노르보르닐, 데칼리닐, 7,7-디메틸-비사이클로 [2.2.1]헵타닐 등을 포함한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 사이클로알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"사이클로 알킬알킬"은 식 -Rb-Rd의 라디칼을 의미하며, 여기서 Rb는 상기 정의된 바와 같은 알킬렌 사슬이고 Rd는 상기 정의된 바와 같은 사이클로알킬기이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 사이클로알킬 기는 임의로 치환될 수 있다.
"융합된"은 본 발명의 화합물에 존재하는 고리 구조에 융합되는 본원에 기재된 임의의 고리 구조를 의미한다. 상기 융합 고리가 헤테로사이클릴 고리 또는 헤테로아릴 고리인 경우, 융합된 헤테로사이클릴 고리 또는 융합된 헤테로아릴 고리의 일부분이 되는 기존의 고리 구조상의 임의의 탄소 원자는 질소원자로 대체될 수 있다.
"할로" 또는 "할로겐"은 브로모, 클로로, 플루오로 또는 요오드를 의미한다.
"할로알킬"은 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 할로 라디칼에 의해 치환되는 상기 정의된 바와 같은 알킬 라디칼, 예를 들면 트리플루오로 메틸, 디플루오로 메틸, 트리클로로 메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 1,2- 디플루오로에틸, 3-브로 모-2-플루오로 프로필, 1,2-디브로모에틸 등을 언급한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 할로 알킬기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로사이클릴" 또는 "헤테로시클릭 고리"는 2 내지 12개의 탄소원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로 원자로 이루어진 안정한 3- 내지 18-원 비방향족 고리 라디칼을 의미한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로 사이클릴 라디칼은 융합된 또는 가교된 고리 시스템을 포함할 수있는 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템 일 수 있으며; 헤테로사이클릴 라디칼 중의 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며; 상기 질소 원자는 임의로 사급화 될 수 있으며; 또한 헤테로사이클릴 라디칼은 부분 또는 완전 포화될 수 있다. 이러한 헤테로사이클릴 라디칼의 예는, 이들로 제한되지 않지만, 디옥소라닐, 티에닐[1,3]디티아닐, 데카하이드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로이소인돌릴, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리돈일, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴뉴클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로푸릴, 트리티안일, 테트라하이드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 1-옥소-티오모르폴리닐, 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐을 포함한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로사이클릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"N-헤테로사이클릴"은 적어도 하나의 질소를 함유하는 상기 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴 라디칼로서, 여기서 분자의 나머지에 헤테로사이클릴 라디칼의 부착점은 헤테로사이클릴 라디칼에서 질소 원자를 통해서인 것을 의미한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, N-헤테로사이클릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로사이클릴 알킬"은 식 -Rb-Re의 라디칼을 의미하며, 여기서 Rb는 상기 정의된 바와 같은 알킬렌 사슬이고, Re는 상기 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴 라디칼이고, 또한 상기 헤테로시클릴이 질소-함유 헤테로사이클릴인 경우, 상기 헤테로사이클릴은 질소 원자에서 상기 알킬 라디칼에 부착될 수 있다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로사이클릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로아릴"은 수소 원자, 1 내지 13개의 탄소 원자, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자, 및 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 5-원 내지 14-원 고리 시스템 라디칼을 언급한다. 본 발명의 목적을 위하여, 헤테로아릴 라디칼은 융합된 또는 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있는 모노사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템일 수 있으며, 또한 상기 헤테로아릴 라디칼 내의 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며; 상기 질소 원자는 임의로 사급화 될 수 있다. 그의 예로는, 이들로 제한되지 않지만, 아제피닐, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤진돌릴, 벤조디옥솔, 벤조푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조[b][1,4]디옥세핀일, 1,4-벤조디옥산일, 벤조나프토푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥시닐, 벤조피라닐, 벤조피라노일, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐(벤조티오페닐), 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리 디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티오페닐, 푸라닐, 푸라노닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 나프티리디닐, 옥사디아졸릴, 2-옥소아제핀일, 옥사졸릴, 옥시판일, 1-옥시도피라지닐, 1-옥시도피리미디닐, 1-옥시도피리다지닐, 1-옥시도피리다지닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 펜아지닐, 페노티아지닐, 펜옥사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살린일, 퀴놀리닐, 퀴뉴클리디닐, 이소퀴놀린일, 테트라하이드로퀴놀린일, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐 및 티오페닐 (즉, 티에닐)을 포함한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로 아릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"N-헤테로아릴"은 적어도 하나의 질소를 함유하는 상기 정의된 바와 같은 헤테로아킬 라디칼로서, 여기서 분자의 나머지에 헤테로아릴 라디칼의 부착점이 헤테로 아릴 라디칼 내의 질소원자를 통해서인 것을 의미한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, N-헤테로아릴 기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로 아릴알킬"은 식 -RbRf의 라디칼을 의미하며, 여기서 Rb는 상기 정의 된 바와 같은 알킬렌 사슬이고 Rf는 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 라디칼이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로 아릴기는 임의로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치환된"은 상기 기 (즉, 알킬, 알킬렌, 알콕시, 알킬아미노, 티오알킬, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로사이클릴, N-헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴, N- 헤테로아릴 및/또는 헤테로아릴알킬) 중 어느 하나를 의미하며, 여기서 적어도 하나의 수소 원자는 비-수소 원자들, 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, F, Cl, Br 및 I 등의 할로겐 원자; 하이드록실기, 알콕시기, 및 에스테르기와 같은 기 내의 산소원자; 티올기, 티오알킬기, 설폰기, 설포닐기 및 설폭시드 기와 같은 기내의 황 원자; 아민, 아미드, 알킬아민, 디알킬아민, 아릴아민, 알킬아릴아민, 디아릴 아민, N-옥사이드, 이미드, 및 엔아민과 같은 기내의 질소 원자; 트리알킬실릴기, 디알킬아릴실릴기, 알킬디아릴실릴기, 및 트리아릴실릴기와 같은 기내의 실리콘 원자; 여러 다른 그룹내의 다른 헤테로 원자들에 결합에 의해 대체될 수 있다. 또한 "치환된"은 고차 결합 (예를 들어, 이중 또는 삼중 결합)에 의해 옥소, 카르보닐, 카르복실 및 에스테르 기 중의 산소와 같은 헤테로 원자; 이민, 옥심, 히드라존 및 니트릴과 같은 그룹 내의 질소로 대체되는 상기 기 중의 어느 하나를 의미한다. 예를 들면, "치환된"은 하나 이상의 수소 원자가 -NRgRh, -NRgC(=0)Rh, -NRgC(=0)NRgRh, -NRgC(=0)ORh, -NRgS02Rh, -OC(=0)NRgRh, -ORg, -SRg, -SORg, -S02Rg, -OS02Rg, -S02ORg, =NS02Rg, 및 -S02NRgRh로 대체되는 상기 기 중의 어느 하나를 의미한다. "치환된"은 또한 하나 이상의 수소원자가 -C(=0)Rg, -C(=0)ORg, -C(=0)NRgRh, -CH2S02Rg, -CH2S02NRgRh로 대체되는 상기 기중의 어느 하나를 의미한다. 전술에서, Rg 및 Rh는 동일하거나 상이하며 또한 독립적으로 수소, 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 티오알킬, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로사이클릴, N-헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴, N-헤테로아릴 및/또는 헤테로아릴알킬이다. "치환된"은 추가로 하나 이상의 수소원자가 아미노, 시아노, 하이드록실, 이미노, 니트로, 옥소, 티옥소, 할로, 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 티오알킬, 아릴, 아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로사이클릴, N- 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴, N-헤테로아릴 및/또는 헤테로 아릴알킬에 결합에 의해 치환되는 상기 기 중의 어느 하나를 의미한다. 그 외에, 전술한 치환기의 각각은 또한 상기 치환기 중의 하나 이상과 임의로 치환될 수 있다.
"안정 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 순도로 분리를 견디기에 충분히 견고한 화합물을 나타내는 것을 의미한다.
"임의적" 또는 "임의로"는 이후에 기술되는 상황 또는 사건이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있고, 상기 기재는 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그것이 없는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들면, "임의로 치환된 아릴"은 아릴 라디칼이 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수도 있고 상기 기재가 치환된 아릴 라디칼 및 전혀 치환되지 않은 아릴 라디칼을 모두 포함하는 것을 의미한다.
흔히 결정화 또는 침전은 본 발명의 화합물의 용매화물을 생성한다. 본원에서 사용되는 용어 "용매화물"은 용매의 하나 이상의 분자와 본 발명의 화합물의 하나 이상의 분자를 포함하는 집합물을 말한다. 용매화물은 물일 수 있으며, 이 경우용매는 수화물일 수 있다. 대안적으로, 용매는 유기 용매일 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 일수화물, 이수화물, 반수화물, 세스퀴 수화물, 삼수화물, 사수화물 등 뿐만 아니라 대응하는 용매화 된 형태를 포함하는 수화물로서 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물은 순수한 용매화물일 수 있지만, 다른 경우에 본 발명의 화합물은 외래의 물을 보유할 수 있거나 또는 물과 일부 외래 용매의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 화합물, 또는 그의 염 또는 호변이성질체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 또한 거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체, 및 아미노산에 대해 (R)- 또는 (S)-로서 또는, (D)- 또는 (L)-로서 절대 입체 화학 관점에서 정의될 수 있는 다른 입체 이성질체 형태를 야기할 수 있다. 본 발명은 이러한 가능한 이성질체는 물론 이들의 라세미체 및 임의로 순수한 형태를 모두 포함하는 것을 의미한다. 광학 활성 (+) 및 (-), (R)- 및 (S)-, 또는 (D)- 및 (L)- 이성질체는 키랄 합성 단위체 또는 키랄 시약을 사용하여 제조하거나 또는 종래기술 예를 들어 크로마토그래피 또는 분별결정을 사용하여 분해할 수 있다. 개개 거울상 이성체들의 제조/분리를 위한 통상적인 기술들은 예를 들면 키랄 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 적절한 광학적으로 순수한 전구체로부터 키랍 합성 또는 라세미체(또는 염 또는 유도체의 라세미체)의 분해를 포함한다. 본 출원에 기술된 화합물이 기하 비대칭의 올레핀 이중결합 또는 다른 중심을 함유하는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 상기 화합물들은 E 및 Z 기하 이성질체를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 모든 호변 이성질체 형태도 포함되는 것으로 의도된다.
"입체 이성질체"는 동일한 결합에 의해 결합되지만 상호 교체가 아닌 다른 삼차원 구조를 갖는 동일한 원자로 이루어진 화합물을 의미한다. 본 발명은 다양한 입체 이성질체 및 이들의 혼합물을 고려하며 또한 그 분자가 서로 겹쳐 놓을 수 없는 두 개의 입체 이성질체를 의미하는 "거울상 이성질체"를 포함한다.
"호변 이성질체"는 분자의 한 원소에서 동일 분자의 다른 원자로의 양성자 이동을 의미한다. 본 발명은 상기 화합물의 호변 이성체를 포함한다.
"중합체"는 하나 이상의 반복 서브유닛을 갖는 분자를 의미한다. 상기 서브유닛("단량체")는 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 중합체 내의 임의의 위치 또는 순서로 발생할 수 있다. 중합체는 천연 또는 합성 기원일 수 있다. 본 발명은 정렬 된 반복 서브유닛을 갖는 중합체, 랜덤 공중 합체 및 블록 공중합체를 포함하는 다양한 형태의 중합체를 포함한다.
"랜덤 공중합체"는 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 중합체로서, 여기서 상기 서브유닛은 중합체 사슬을 따라 불규칙하게 연결되어 있는 것을 의미한다. 랜덤 공중합체는 임의 수의 상이한 서브유닛을 포함할 수 있다. 즉, 랜덤 공중합체는 중합체 사슬 내의 임의의 소정 위치에서 소정의 단량체 단위를 발견할 수 있는 가능성이 인접한 단위의 성질과 독립적인 중합체이다. "통계적 공중합체"는 단량체 서브유닛의 순서가 통계적 규칙을 따르는 공중합체이다. 중합체 사슬내의 특정 지점에서 소정 유형의 단량체 잔기를 발견할 가능성이 상기 사슬 내의 단량체 잔기의 몰 분획과 동일한 경우, 중합체는 진정한 랜덤 공중합체로 지칭될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기술된 중합체는 "램덤 코터폴리머"이며, 이것은 중합체가 랜덤한 순서로 연결된 세 개의 상이한 서브유닛을 포함하는 것을 의미한다. 개개 서브유닛은 랜덤 중합체 중에 임의의 몰비로 존재할 수 있으며, 예를 들어 각각의 서브 유닛은 중합체 내의 다른 서브유닛의 몰에 대하여 약 0.1 몰% 내지 약 99.8 몰%로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 랜덤 코-터폴리머의 서브유닛은 다음과 같은 일반구조식으로 표현할 수 있다:
Figure pct00001
여기서.
X, Y 및 Z는 독립적으로 고유한 서브유닛이고, a, b 및 c는 중합체 내의 각 서브유닛의 수를 나타내는 정수이다. 설명의 편의를 위해, 상기 구조식은 X, Y 및 Z의 선형연결형태를 도시한다; 그러나 본 발명의 랜덤 공중합체 (예를 들면, 랜덤 코-터폴리머)가 서브유닛의 도시된 연결형태를 갖는 중합체로 한정되지 않고 또한 랜덤중합체 내의 서브유닛은 임의의 랜덤 배열로 연결될 수 있고 공중합체 및 코-터폴리머는 분지형일 수 있다는 것이 강조되어야 한다.
"블록 공중합체"는 둘 이상의 서브유닛의 반복블록을 포함하는 중합체를 의미한다.
"작용기"는 특정 유형의 반응성 (예를 들면, 산성, 염기성, 친핵성, 친전자성 등)을 갖는 분자의 일부분이다. "반응성 기"는 일종의 작용기이다. 작용기의 비 제한적인 예는 아지드, 알킨, 아민, 알코올 등을 포함한다. "표적 작용기"는 임의의 작용기이며 여기서 또 하나의 작용기가 반응하는 것이다. "친수성 작용기"는 친수성을 갖는 작용기이다. 친수성 작용기는 일반적으로 물과 같은 극성 용매중에서 전체적인 분자의 용해도를 증가시키는 경향이 있다.
"공유 콘쥬게이션"은 둘 또는 그 이상의 작용기의 반응에 의한 공유결합의 형성을 일컫는다.
"직교" 또는 "직교 반응성"은 작용기 및/또는 반응기의 반응 특성을 의미한다. 두 개의 반응기가 직교 반응성을 갖는 경우, 반응성 기 중의 하나는 제2 반응성 기가 표적 작용기와 실질적인 정도로 반응하지 않거나 또는 그 반대인 상태에서 표적 작용기와 반응할 것이라는 것을 의미한다.
"개시제"는 중합반응을 개시하는데 사용되는 분자이다. 기술된 중합체의 제조에 사용하기 위한 개시제는 당업계에 잘 알려져 있다. 대표적인 개시제는, 이들로 제한되지 않지만, 원자 이동 라디칼 중합, 리빙(living) 중합에 유용한 개시제, AIBN 패미리의 개시제, 및 벤조페논 개시제를 포함한다. "개시제 잔기"는 라디칼 또는 다른 메커니즘을 통해 중합체에 부착되는 개시제의 부분이다. 일부 실시형태에서, 개시제 잔기는 기술된 중합체의 말단 단부(들)에 부착된다.
"클릭 화학"은 적어도 다음과 같은 특징들을 가지는 반응을 의미한다: (1) 작용기 직교성을 나타내고 (즉, 작용부분은 다른 반응성 부위와 반응하지 않고, 단지 상기 작용부분에 상보적인 반응성 부위와만 반응함); (2) 얻어진 결합은 비가역적이거나 (즉, 일단 반응물이 반응하여 생성물이 생성되면, 생성물이 반응물로 분해되기 어려움) 또는 일부 경우에 생성된 결합은 가역적이다 (즉, 적절한 조건하에서 반응물로 되돌아감). 경우에 따라, "클릭" 화학은 다음과 같은 특징들 중 하나 이상을 가질 수 있다: (1) 입체특이성; (2) 엄격한 정제, 대기 제어 등을 수반하지 않는 반응 조건; (3) 용이하게 입수 가능한 출발물질 및 시약; (4) 무용매 또는 양성 (benign)을 활용하는 능력; (5) 결정화 또는 증류에 의해 제품 분리; (6) 생리학적 안정성; (7) 큰 열역학적 구동력 (예를 들어, 10 내지 20 kcal/mol); (8) 단일의 반응 생성물; (9) 높은 (예를 들면, 50% 이상) 화학적 수율; 및 (10) 실질적으로 부산물이 없거나 또는 환경 친화적 부산물인 부산물.
"클릭" 작용성을 이용한 반응의 예는, 이들로 제한되지 않지만, 부가 반응, 환상부가반응, 친핵성 치환 등을 포함할 수 있다. 환상 부가반응의 예는 Huisgen 1,3-쌍극성 환화 부가반응, Cu(I)촉매화 아지드-알킨 환화부가반응, 및 디일즈-알더 반응을 포함할 수 있다. 부가 반응의 예는 에폭시화 및 탈가수분해와 같은 탄소-탄소 이중결합에 부가반응을 포함한다. 친핵성 치환 예는 에폭시 및 아지리딘 화합물과 같은 변형된 고리에 친핵성 치환을 포함할 수 있다. 클릭 화학의 일부 추가적인 설명은 문헌 [Huisgen, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 2, No. 11, 1963, pp. 633-696; Lewis et al, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 41, No. 6, 2002, pp. 1053-1057; Rodionov et al, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 44, 2005, pp. 2210-2215; Punna et al, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 44, 2005, pp. 2215-2220; Li et al, J. Am. Chem. Soc, Vol. 127, 2005, pp. 14518-14524; Himo et al, J. Am. Chem. Soc, Vol. 127, 2005, pp. 210-216; Noodleman et al, Chem. Rev., Vol. 104, 2004, pp. 459-508; Sun et al, Bioconjugate Chem., Vol. 17, 2006, pp. 52-57; and Fleming et al, Chem. Mater., Vol. 18, 2006, pp. 2327-2334]에서 발견할 수 있으며, 이의 전문은 여기서 참고로 포함된다.
"클릭 화학"은 클릭화학 조건에서 반응할 수 있는 작용기를 의미한다.
"버튼 작용기"는 클릭 반응성, 예를 들어, 트리아졸 모이어티 등을 갖는 2개의 작용기의 반응으로 인한 작용기이다.
"고체 기판"은 외부 표면을 갖는 임의의 고체 물질을 지칭한다. 일반적으로 외부 표면은 중합체 (예를 들면, 공유결합에 의해) 고정화할 수 있는 작용기를 가지거나 또는 외부 표면은 상기 표면이 중합체를 고정화할 수 있도록 변형될 수 있는 관능기를 가질 것이다. 적합한 고체 기판은 유리 및 중합체 지지체와 같은 당 업계에 공지된 임의의 고체기판을 포함한다. 고형 기질은 광학적으로 투명하거나, 불투하거나 또는 부분적으로 광학적으로 투명할 수 있다. 고체 기판은 평면 기질 (즉, 적어도 하나의 편평한 표면을 갖는 형상)뿐만 아니라 비이드, 입자, 다공성 매트릭스, 다공성 단일체 등을 포함한다. 고형 기질의 구체적이지만 비제한적인 예는 이하에서 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "고체 지지체"는 이에 고정화된 중합체 및/또는 포획 프로브를 포함하는 고체기판을 의미한다. 전형적으로, 상기 중합체는 각각 공유 결합을 통해, 예를 들어 아지드 및 알킨 또는 반응성 에스테르 및 아민의 반응으로부터 생성되는 아지드 작용기 또는 아미드 결합을 통해, 고체 기판에 고정화할 것이다.
고형 지지체에 대하여 "고정화하는" 또는 "고정화된"은 공유 접합, 비특이적 결합, 이온성 상호작용 및 고체기판에 물질(예를 들면, 중합체)을 부착하는 다른 수단을 포함한다.
표적 작용기에 "특이적 반응성"을 갖는 반응성 기는 상기 반응성 기가 반응조건하에 표적 작용기와 우선적으로 반응하며 또한 다른 작용기와의 부반응이 최소화되거난 없다는 것을 의미한다. 유사하게, 포획 프로브와 접합을 위해 특이적인 반응성을 갖는 반응성 기는 상기 반응성 기가 반응 조건하에 포획 프로브와 우선적으로 접합하며 다른 작용기와의 부반응은 최소화되거나 없다는 것을 의미한다.
"분석물" 또는 "분석물 분자"는 분석대상인 화합물 또는 분자를 언급하며, 예를 들면 분석물 분자는 미지의 구조일 수 있으며 또한 분석은 구조의 식별을 포함한다. 분석물 분자는 DNA, 단백질, 펩티드 및 탄수화물, 유기 및 무기 분자, 금속 (방사성 동위 원소를 포함함) 등을 포함하는 임의 수의 공통 분자를 포함한다. 분석물은 바이러스, 박테리아, 변형체, 진균뿐만 아니라 금속 및 바이오 전쟁, 바이오 해저드 및 화학전 재료 포함한다. 분석물은 또한 본 출원에서 정의된 바와 같은 분석 프로브를 포함한다.
"포획 프로브"(capture prove)는 예를 들면 수소 결합 (예를 들어, DNA 혼성화), 시퀘스터링 (sequestering), 공유결합, 이온성 상호작용 등에 의해, 분석물 분자와 상호작용할 수 있는 분자이다. 전형적인 포획 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브 또는 플랩, 올리고당 (예를 들면, 레시틴) 및 단백질과 서열 특이적 결합 (하이브리드화)할 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서 포획 프로브는 형광 표지를 포함한다. 예를 들어, 포획 프로브는 형광 라벨을 포함할 수 있으며, 분석물 분자(예를 들면, 분석물 프로브)는 소광물질을 포함할 수 있으며, 또한 분석물 분자의 존재는 포획 프로브로부터 형광 신호의 부존재에 의해 검출된다 (형광제는 소광물질과 상호작용시 퀀칭되기 때문). 관련된 실시형태에서, 포획 프로브는 소광물질을 포함한다. 이들 실시형태에서, 형광 표지 분석물 분자의 형광은 포획 프로브에 의한 포획시 퀀칭된다.
"프로브" 또는 "분석물 프로브"는 분석물 분자의 간접적인 식별을 위해 사용되는 분자를 의미한다. 예를 들어, 프로브는 분석물 분자를 독특하게 식별하는 서열정보를 전달할 수 있다. 전형적인 프로브는 올리고 뉴클레오티드 등을 포함한다.
"플랩"은 프로브의 선택적 부분을 의미한다. 특정 실시형태에서 플랩은 프로브 (및 따라서 분석물 분자)를 독특하게 식별하기 위한 서열정보를 포함한다. 플랩은 프로브의 나머지로부터 (예를 들면, PCR 조건하에) 절단하고 고형 지지체 상에 포획 프로브와 혼성화될 수 있다. 고형 지지체상에 결합된 플랩의 존재는 특정한 분석물의 존재를 나타낸다.
A. 중합체
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 일 측면은 직교 반응성 기를 갖는 중합체 (즉, "직교 중합체")에 관한 것이다. 상기 중합체는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 중합체는 고체 기판상에 표적 작용기와 제1 반응성 기의 반응에 의해 고체 지지체에 공유결합하여, 고체 지지체를 생기게 할 수 있다. 관련된 실시형태에서, 기판 결합된 중합체는 포획 프로브 상에 표적 작용기와 제2 반응기의 접합에 의해 고형 지지체에 포획 프로브를 공유적으로 부착시키는데 사용된다. 고정화된 중합체에 공유적으로 부착된 포획 프로브는 시료로부터 분석물 분자, 예를 들면 수성 시료 중에 용해된 분석물 분자를 포획/퀀칭할 수 있다. 특정의 실시형태에서, 포착 메카니즘은 착화, 수소결합 (예를 들면, DNA 하이브리드화) 및/또는 공유 또는 비공유 (예를 들면, 항체-스트렙타비딘 상호작용)을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 중합체를 고정화시키기 위한 반응성 기를 갖는 고체 기판의 제조에 유용한 화합물이 또한 제공된다. 중합체를 포함하는 고체 지지체는 어레이 형태로 높은 처리량 분석을 포함하는 다양한 방법에 유용하다. 이와 관련하여 분석 방법은 당업계에 알려져 있으며 이하에 상세하게 설명된다.
기술된 중합체의 특정한 실시형태들은 고체 지지체 상에 포획 프로브를 고정시키기 위한 다른 수단에 비해 장점들을 제공한다. 예를 들면, 중합체의 실시형태는 직교 반응성 기를 포함하기 때문에, 예를 들어, 고체 지지체와 포획 프로브 사이의 결합을 통해 정확한 제어를 얻을 수 있다. 도 1에 예시된 바와 같이, 본 중합체는 고체 기판에 고정화를 위한 하나 이상의 서브유닛, 포획 프로브 (예를 들면, 생체 분자, 폴리뉴클레오티드, DNA 등)에 접합을 위한 하나 이상의 서브유닛 및 중합체의 친수성을 조절하기 위한 하나 이상의 서브유닛 (도 1에서 "하이드로겔 골격"으로 언급)을 포함한다. 고정화 서브유닛 및 접합 서브유닛의 수 및 위치를 변형시켜 포획 프로브의 원하는 형태학 및 농도를 갖는 반응성 표면 (즉, 포획 프로브에 접합을 위한 하나 이상의 반응성 기를 포함하는 고체 지지체의 표면)을 얻을 수 있다.
본 출원에 기술된 방법 및 중합체와 대조적으로, 직교 반응성 기를 갖지 않는 중합체를 사용하는 선행기술 방법은 이러한 조절을 반응성 표면의 형태보다 발휘할 수 없으며 또한 배치 대 배치 간에 변화할 수 있는 랜덤 형태가 흔히 얻어진다. 추가로, 중합체 내에 친수성 서브유닛 (예를 들면, 서브유닛 B)의 수를 조절함으로써, 중합체의 원하는 친수성이 얻어질 수 있다. 고체 기판상에 고정화된 중합체에 포획 프로브를 접합하는 것은 흔히 용매 중에 용해된 활성 표면과 포획 프로브 사이의 반응 (즉, "계면 반응")을 필요로 하기 때문에, 활성 표면의 물 접촉각을 조절하는 능력은 물 접촉각이 반응 용매의 친수성 또는 소수성 성질에 따라 변할 수 있기 때문에 더욱 손쉬운 계면 반응을 초래한다.
따라서 일 실시형태에서, 본 발명은 고체 기판에 고정하기 위한 하나 이상의 서브유닛 및 포획 프로브에 접합하기 위한 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 중합체를 제공한다. 이 중합체는 임의로 중합체의 친수성을 제어하는 서브유닛을 포함 할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 A, B 및 C 서브 유닛을 포함하는 중합체가 제공되며, 여기서,
상기 A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 표적 작용기와의 반응에 특이적인 반응성을 갖는 제1 반응성 기를 포함하고;
상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 친수성 작용기를 포함하고;
상기 C 서브 유닛은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브에 대한 공유 접합에 특이적인 반응성을 갖는 제2 반응기를 포함하고;
여기서 상기 제1반응기 및 제2반응기의 반응성은 서로 직교한다.
특정의 실시형태에서, 중합체는 랜덤 공중합체, 예를 들면 랜덤 코-터폴리머이다. 예를 들면 일부 실시형태에서 중합체는 다음과 같은 화학식(I)을 갖는다.
Figure pct00002
여기서,
T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단기이며,
x, y 및 z는 독립적으로 1 내지 350,000의 정수이다.
전술한 것의 일부 실시형태에서, x, y 및 z는 독립적으로 1 내지 50,000의 정수이다.
화학식(I)의 A, B 및 C 서브유닛의 도시된 연결성은 제한적인 방식이 아니고, 화학식(I)의 중합체의 실제 구조는 A, B 및 C 서브유닛의 각각이 중합체내의 임의 위치에서 발생하는 랜덤 공중합체이다.
다른 실시형태에서, 중합체는 다음과 같은 화학식(Ia)를 갖는다.
Figure pct00003
상기 식에서,
A, B 및 C는 구조식(Ia)의 중합체 중에 적어도 한번 존재하고;
T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단기이며,
x1, y1 및 z1는 각각의 경우에 독립적으로 0 또는 1이고;
n은 1 내지 700,000의 정수이다.
전술한 것의 다른 실시형태에서, n은 1 내지 150,000의 정수이다.
존재하는 경우, 개시제 잔기는 개시제 및 중합체의 반응로부터 생긴다. 개시제 잔기의 정확한 구조는 다양할 수 있고, 중합 반응 중에 사용되는 개시제의 종류에 따라 달라질 것이다. 특정의 실시형태에서, 개시제 잔기는 다음과 같은 화학식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
또는
Figure pct00008
상기 식에서,
R은 1 내지 10개의 탄소원자 및 임의의 질소 및 산소원자를 포함하는 알킬기이다.
전술한 실시형태의 임의의 것에서, 중합체는 중합체의 말단 위치에서 A 서브유닛을 포함한다.
전술한 실시형태의 다른 것에서, A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 화학식(II)를 갖는다:
Figure pct00009
상기 식에서,
R1은 제1 반응성 기이고;
L1은 길이가 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이다.
전술한 실시형태의 또 다른 것에서, A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 화학식(III)을 갖는다:
Figure pct00010
상기 식에서,
R1은 제1 반응성 기이고;
R2는 수소 또는 알킬이고;
L1은 길이가 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이고;α는 0 내지 10 범위의 정수이다.
전술한 실시형태의 추가의 것에서, L1은 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 모이어티, 또는 그의 조합을 포함한다. 다른 실시형태에서, L1은 존재하지 않는다.
전술한 실시형태의 일부에서, α는 1이다. 전술한 실시형태의 일부에서, R2는 H이다.
제1 반응성 기의 실제 구조 또는 반응성은 제한되지 않으며, 단 이것은 제2 반응성 기에 직교 반응성을 갖는다. 일부 실시형태에서, R1은 알킬렌, 알킬실릴-보호된 알킨, 아지드, 니트릴, 티올, 알켄, 말레이미드, 에폭시드, 아지리딘 또는 티이란 작용기이다. 특정의 실시형태에서, R1은 알킬렌 또는 아지드 작용기이다.
전술한 실시형태의 추가의 것에서, A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식중 하나를 갖는다:
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
또는
Figure pct00015
상기 식에서,
β 및 χ는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
다른 실시형태에서, β는 1 또는 3이고, 다른 양상에서 χ는 1이다.
전술한 것 중 다른 더욱 구체적인 실시형태에서, A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
또는
Figure pct00020
다른 실형태에서, 적어도 하나의 A 서브유닛은 말단 위치에서 T1에 공유결합되어 있다. 예를 들면 일부 실시형태에서 T1은 H이다.
다른 양상에서 A 서브유닛의 적어도 하나는 다음과 같은 화학식을 갖는다:
Figure pct00021
상기식에서,
R3은 아릴이다. 예를 들면, 이러한 구조식은 알킬 잔기를 포함하는 중합체의 제조에 유용할 수 있다. 예를 들면, A 서브유닛의 적어도 하나는 특정의 실시형태에서 다음과 같은 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00022
전술한 실시형태의 일부의 다른 것에서, 제1 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 클릭 반응성을 갖는다. 예를 들어, 특정의 실시형태에서 제1 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 아지드와의 반응에 특이적이다. 예를 들어, 제1 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 일부 실시형태에서 알킨이다. 다른 실시형태에서, 제1 반응성 기는 알킨과의 반응에 특이적이다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 제1 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 아지드이다.
특정의 다른 실시형태에서, 제1 반응성 기의 반응성은 각각의 경우에 독립적으로 고체 기판상에 아민기에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 제1 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 N-하이드록시 숙신이미드(NHS)에스테르, N-하이드록시설 포숙신이미드(설포-NHS)에스테르, 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트(SATA), 카르 보디이미드, 하이드록시메틸 포스핀, 말레이미드, 아릴에스테르, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 프소랄렌, 비닐설폰, 피리딜 디설파이드, 아즈락톤 또는 벤조페논이다. 일부 더 구체적인 실시형태에서, 제1 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 NHS 에스테르, 아즈락톤 또는 아릴에스테르이다.
전술한 실시형태의 일부 다른 것에서, 제1 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 화학식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
상기 식에서,
R6, R7, R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 알킬이고;
R10, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 H, 전자 끄는 기, -NCS, -NCO, -C02H, -SO3H, -L'-폴리 또는 그의 염이고, 여기서 L'은 길이 100개 이하 원자의 선택적 링커이고 폴리는 수용성 중합체이다.
일부 실시형태에서, R6, R7, R8 및 R9의 각각은 H이다. 다른 실시형태에서, R10, R11, R12, R13 또는 R14의 적어도 하나는 전자 끄는 기이다. 다른 실시형태에서, R10, R11, R12, R13 또는 R14의 각각은 전자 끄는 기이다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 전자 끄는 기는 할로겐, 니트로, 또는 니트릴이고, 다른 더욱 구체적인 실시형태에서 전자 끄는 기는 플루오로이다.
전술한 실시형태의 일부에서, 제1 반응성 기의 적어도 하나는 다음과 같은 화학식을 갖는다:
Figure pct00025
일부 다른 실시형태에서, 제1 반응성 기의 각각은 상기 구조를 갖는다.
전술한 실시형태의 다른 것에서, A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음 구조식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00026
Figure pct00027
또는
Figure pct00028
일부 더욱 구체적인 양상에서, A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00029
또는
Figure pct00030
전술한 실시형태의 일부 다른 것에서, C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식(IV)를 갖는다:
Figure pct00031
상기 식에서,
R4은 제2 반응성 기이고;
R5는 수소 또는 알킬이고;
L2는 길이 100개 이하 원자의 선택적 링커이고;
δ는 0 내지 10 범위의 정수이다.
전술한 실시형태의 일부에서, L2는 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 잔기 또는 이의 조합이다. 다른 실시형태에서, L2는 존재하지 않는다.
전술한 것의 일부 다른 실시형태에서,δ는 1이고, 다른 실시형태에서 R5는 H이다.
특정의 실시형태에서, 제2 반응성 기의 반응성은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브 내의 아민기에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 제2 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 N-하이드록시숙신이미드(NHS)에스테르, N-하이드록시설포숙신이미드(설포-NHS)에스테르, 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트(SATA), 카르보디이미드, 하이드록시메틸 포스핀, 말레이미드, 아릴에스테르, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 프소랄렌, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아즈락톤 또는 벤조페논이다. 일부 더욱 구체적인 실시형태에서, 제2 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 NHS 에스테르, 아즈락톤 또는 아릴에스테르이다.
전술한 실시형태의 일부 다른 것에서, 제2 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
상기 식에서,
R6, R7, R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 알킬이고;
R10, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 H, 전자 끄는 기, -NCS, -NCO, -C02H, -SO3H, -L'-폴리 또는 그의 염이고, 여기서 L'는 길이가 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이고 폴리는 수용성 중합체이다.
일부 실시형태에서, R6, R7, R8 및 R9의 각각은 H이다. 다른 실시형태에서, R10, R11, R12, R13 또는 R14 중 적어도 하나는 전자 끄는 기이다. 다른 실시형태에서, R10, R11, R12, R13 또는 R14의 각각은 전자 끄는 기이다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 전자 끄는 기는 할로겐, 니트로, 또는 니트릴이고, 다른 더욱 구체적인 실시형태에서, 전자 끄는 기는 플루오로이다.
전술한 실시형태의 일부에서, 제2 반응성 기의 적어도 하나는 다음과 같은 구조식을 갖는다:
Figure pct00034
다른 실시형태에서, 제2 반응성 기의 각각은 상기 구조식을 갖는다.
전술한 실시형태의 다른 것에서, C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식을 갖는다:
Figure pct00035
Figure pct00036
또는
Figure pct00037

일부 더욱 구체적인 양상에서, C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식의 적어도 하나를 갖는다.
Figure pct00038
또는
Figure pct00039
일부 다른 실시형태에서, C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 클릭 반응성을 갖는다. 예를 들면, 포획 프로브는 클릭 작용기를 포함할 수 있고, 포획 프로브는 클릭 화학을 이용하여 중합체에 접합된다. 일부 실시형태에서, R4는 알킨, 알킬실릴-보호된 알킨, 아지드, 니트릴, 티올, 알켄, 말레이미드, 에폭시드, 아지리딘, 또는 티이란 작용기이다. 특정의 실시형태에서, R4는 알킨 또는 아지드 작용기이다.
전술한 실시형태의 추가의 것에서, C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
또는
Figure pct00044
상기 식에서,
β 및 χ는 각각 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수이다.
다른 실시형태에서, β는 1 또는 3이고 다른 양상에서 χ는 1이다.
전술한 것의 다른 더욱 구체적인 실시형태에서, C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식 중의 하나를 갖는다.
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
또는
Figure pct00049
다른 실시형태에서, 적어도 하나의 C 서브유닛은 말단 위치에서 T2에 공유결합되어 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, T2는 H이다.
다른 양상에서, C 서브유닛의 적어도 하나는 다음과 같은 구조식을 갖는다:
Figure pct00050
상기 식에서,
R3는 아릴이다. 예를 들면, 이러한 구조는 알킨 모이어티를 포함하는 중합체의 제조에 유용할 수 있다. 예를 들면 C 서브유닛의 적어도 하나는 특정한 실시형태에서 다음과 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00051
일부 실시형태에서, 폴리는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아미드, 폴리(디메틸아크릴아미드), 폴리(아크릴산), 폴리비닐알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리(메틸비닐에테르), 폴리(에틸비닐에테르), 폴리(N-비닐포름아미드), 폴리(N-비닐아세트아미드) 또는 폴리(N-메틸-N-비닐아세트아미드)이다.
전술한 중합체의 다른 구체적 실시형태에서, C 서브유닛의 적어도 하나는 말단 위치에서 T2에 공유결합되어 있다. 예를 들면, 특정의 실시형태에서, T2는 H이다.
전술한 실시형태의 일부에서, B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식(V)를 갖는다:
Figure pct00052
상기 식에서,
R15는 친수성 작용기이고;
R16은 수소 또는 알킬이고;
L3는 길이 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
ε은 0 내지 10 범위의 정수이다.
특정의 실시형태에서, L3은 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 모이어티, 또는 그의 조합이다. 다른 실시형태에서, L3는 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, ε은 1이고, 다른 실시형태에서 R16은 H이다.
전술한 실시형태의 다른 것에서, R15는 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식을 갖는다:
Figure pct00053
Figure pct00054
또는
Figure pct00055
상기 식에서,
R17, R18, R19, R20, R21, R22 및 R23은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 하이드록실 알킬이고;
φ는 1 내지 200 범위의 정수이다.
전술한 것의 일부 실시형태에서, R17, R18, R19, R20, R21, R22 및 R23은 각각 독립적으로 H 또는 메틸이다. 다른 실시형태에서, R15는 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식을 갖는다:
Figure pct00056
예를 들면, 일부 실시형태에서 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식을 갖는다:
Figure pct00057
또는
Figure pct00058
전술한 실시형태의 임의의 것에서, 중합체는 다음과 같은 구조식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062

Figure pct00063
Figure pct00064
또는
Figure pct00065
상기 식에서,
A, B 및 C 서브유닛은 중합체 내에 적어도 한번 존재하고;
OPFP는 펜타플루오로펜옥시를 나타내고;
T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H 및 알킬로부터 선택된 중합체 말단기이고;
x, y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 350,000의 정수이다.
전술한 실시형태의 일부에서, x, y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 50,000의 정수이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 중합체는 다음과 같은 구조식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
또는
Figure pct00072
상기 식에서,
A, B 및 C 서브유닛은 중합체 내에 적어도 한 번 존재하고;
OPFP는 펜타플루오로펜옥시를 나타내고;
T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H 및 알킬로부터 선택된 중합체 말단기이고;
xl, yl 및 zl은 각각의 경우에 독립적으로 0 또는 1이고;
n은 1 내지 700,000의 정수이다.
전술한 것의 다른 실시형태에서, n은 1 내지 150,000의 정수이다.
상기 지적한 바와 같이, 중합체의 친수성 및 그리하여 수득된 고체 지지체 표면의 물 접촉각은 중합체 내에 서브유닛의 수 및 B 서브유닛의 적절한 선택에 의해 적어도 부분적으로 조절할 수 있다. 따라서 일부 실시형태에서, 중합체 내의 서브유닛의 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%는 B 서브유닛이다.
다른 실시형태에서, A, B 및 C 서브유닛의 몰 분획은 변할 수 있다. 예를 들면, A, B 및 C 서브유닛 각각의 몰 분획은 약 0.1 몰% 내지 약 99.8 몰%로 변할 수 있다. 일부 예시적 실시형태에서, A, B 및 C 서브유닛의 총 몰%는 100%이다.
특정의 실시형태에서, A 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 1% 내지 약 30%, 예를 들면 약 15% 내지 약 25% 범위이다. 다른 실시형태에서, B 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 20% 내지 약 60%, 예를 들면 약 35% 내지 약 45% 범위이다. 다른 실시형태에서, C 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 20% 내지 약 60%, 예를 들면 약 35% 내지 약45% 범위이다. 다른 추가 실시형태에서, A 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 15% 내지 약 25% 범위이고, B 서브유닛의 몰%는 약 35% 내지 약 45% 범위이고 또한 C 서브유닛의 몰%는 약 35% 내지 약 45% 범위이다. 또 다른 실시형태에서, A 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 20%이고, B 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 40%이고, 또한 C 서브유닛의 몰 퍼센트는 40%이다.
특정의 실시형태에서, 중합체는 단지 하나의 A 서브유닛을 포함한다. 예를 들면 일부 실시형태에서 A 서브유닛은 중합체의 말단에 있다.
전술한 내용의 임의의 것의 다양한 실시형태에서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 탄수화물이다. 예를 들면 일부 실시형태에서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에서, 포획 프로브는 DNA이다.
특정의 실시형태에서, 본 발명은 또한 고체 기판의 표면을 활성화하는데 유용한 화합물을 제공한다. 다음에 활성화된 기판은 고체 지지체를 제조하기 위해 전술한 중합체를 (예를 들면, 공유결합을 통해) 고정화함을 포함하는 임의의 수의 용도에 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 화합물은 광분해성 아지드 모이어티 및 알킬 아지드 또는 알킨 모이어티를 포함하고, 여기서 상기 알킨 또는 알킬 아지드는 렁커 모이어티 (예를 들면, 중합체)를 통해 광분해성 아지드에 결합된다. 광분해성 아지드는 적절한 광원의 조사시 고체 기판의 표면상에 C-H 결합 내에 니트렌 삽입 가능한 임의의 아지드 모이어티일 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정의 실시형태에서, 광분해성 아지드는 아릴 아지드이다.
일부 실시형태에서, 고체 기판의 표면을 활성화하는 화합물은 다음과 같은 구조식 (IX)를 갖는다:
Figure pct00073
상기 식에서,
X는 아지드 또는 알킨 모이어티이고;
L5 및 L6는 각각 독립적으로 알킬렌, 알킬렌 옥사이드, 이미드, 에테르, 에스테르 또는 아미드 모이어티, 또는 그의 조합을 포함하는 선택적 링커이고;
R26, R27, R28 및 R29는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로, 니트릴, 니트로 또는 암모늄이고;
P는 -(OCH2CH2)- 또는 -(CH2)-이고;
A는 직접결합 또는 -S(0)2-이고;
ι은 0 내지 10 범위의 정수이고;
γ는 1 내지 2000 범위의 정수이다.
일부 실시형태에서, R26, R27, R28 및 R29의 각각은 H이다. 다른 실시형태에서, A는 직접결합이다.
일부 실시형태에서, P는 -(OCH2CH2)-이다. 다른 실시형태에서, P는 -(CH2)-이다. P 모이어티 및 그 내부의 반복단위(즉, γ)의 수를 조심스럽게 선택함으로써, 본 출원인들은 수득된 표면의 물 접촉각이 상기 중합체의 고정화에 필요한 계면 반응에 최적합할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서 일부 실시형태에서, 본 화합물은 다음과 같은 구조식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
또는
Figure pct00077
전술한 화합물의 일부 구체적 실시형태에서, γ는 1 내지 100, 예를 들면 55 내지 90 범위이다.
본 출원에서 기술된 바와 같은 화합물, 및/또는 중합체 및 본 출원에서 기술된 바와 같은 화합물 및/또는 중합체에서 본 출원에서 기술된 임의의 구체적 치환기에 관한 임의의 실시형태는 독립적으로 본 출원에서 기술된 바와 같은 화합물 및/또는 중합체의 다른 실시형태 및/또는 치환기와 결합하여 상기에서 구체적으로 기술되지 않는 본 발명의 실시형태를 형성할 수 있는 것으로 이해된다. 그 외에, 치환기의 목록이 특별한 실시형태 및/또는 특허청구범위에서 임의의 특수한 R 기에 대해 나열되는 경우에, 각각의 개개 치환기는 특정의 실시형태로부터 삭제될 수 있는 것으로 이해되며 또한 치환기의 나머지 목록은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 발명에 있어서, 도시된 식들의 치환기들 및/또는 변수들의 조합은 이러한 기여가 안정한 화합물을 생기게 하는 경우에만 허용 가능한 것으로 이해된다.
기술된 화합물 및 중합체의 제조방법은 당해 분야에서 통상의 기술자에게 용이하게 명확할 것이다. 예를 들면, 특정의 실시형태에서, 본 발명의 중합체는 원하는 비율의 서브유닛 및 선택적 활성화제 (예를 들면, 열중합용 AIBN 또는 ATRP용 촉매)를 혼합하여 제조할 수 있다. 아지드 또는 알킨과 같은 클릭 작용기를 포함하는 서브유닛 및 중합체는 당해 분야에 알려진 방법에 따라 제조할 수 있거나 또는 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다 (예를 들면, 프로파킬 아크릴레이트 또는 3-아지도프로필아크릴레이트). 예를 들면 문헌[S.R. Gondi, el at., Macromolecules 2007, 40, 474-481; P.J. Roth, el at., J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2009, 47, 3118-3130; and C. Li, et al, Macromolecules, 2009, 42, 2916-2924]을 참조하며, 이의 전문은 본 출원에서 참고로 포함된다. 예시적인 방법들은 실시예에서 제공된다.
또한 본 출원에 기술된 방법에서 중간체 화합물의 작용기는 적절한 보호기에의해 보호될 필요가 있는 것으로 당업자들에게 인식될 것이다. 이러한 작용기는 하이드록시, 아미노, 머르캅토 및 카르복실산을 포함한다. 하이드록시의 적절한 보호기는 트리알킬실릴 또는 디아릴알킬실릴 (예를 들면, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 또는 트리메틸실릴), 테트라하이드로피라닐, 벤질 등을 포함한다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노의 적절한 보호기는 t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 등을 포함한다. 머르캅토의 적절한 보호기는 식 -C(0)-R" (여기서 R"는 알킬, 아릴 또는 아르알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등을 포함한다. 카르복실산의 적절한 보호기는 알킬, 아릴 또는 아르알킬 에스테르를 포함한다. 보호기는 당업자에게 알려져 있거나 또는 본 출원에서 기술된 바와 같은 표준 기술에 따라 첨가 또는 제거될 수 있다. 보호기의 사용은 문헌 [Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wiley]에 상세하게 기술되어 있다. 당업자가 인하는 바와 같이, 보호기는 또한 Wang 수지, Rink 수지 또는 2-클로로트리틸-클로라이드 수지와 같은 중합체일 수 있다.
더욱이, 유리 염기 또는 산 형태로 존재하는 본 발명의 모든 화합물 및/또는 중합체는 당해 분야의 기술자에게 알려진 방법에 의해 적절한 무기 또는 유기 염기 또는 산으로 처리하여 염으로 전환할 수 있다. 본 발명의 화합물의 염들은 표준 기술에 의해 이들의 유리 염기 또는 산으로 전환할 수 있다.
B. 고체 지지체
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 특정한 양상은 또한 고체 지지체를 포함한다. 고체 지지체는 여기에 고정화된 중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체는 고체 지지체 상에 추가 중합체의 고정화를 위한 작용기를 포함한다. 다른 실시형태에서, 고정화된 중합체는 포획 프로브와 공유 접합을 위한 작용기를 포함하거나 또는 상기 고정화된 중합체는 여기에 접합된 포획 프로브를 포함한다. 고체 지지체는 다수의 분석 검정에서 사용될 수 있으며, 특히 검정과 같은 실시형태는 DNA 마이크로 어레이 검정과 같은 어레이 형태의 검정을 포함한다.
따라서 일부 실시형태에서, 본 발명은 고체 기판의 외부 표면에 고정화된 중합체를 포함하는 고체 지지체를 제공하며, 여기서 상기 중합체는 B, D 및 E 서브유닛을 포함하고,
상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 친수성 작용기를 포함하고;
상기 D 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브에 대한 공유접합에 특이적인 반응성을 갖는 반응성 기를 포함하거나 또는 상기 D 서브유닛은 포획 프로브에 대한 공유결합을 포함하며;
상기 E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 두 개의 상보적 클릭 작용기의 반응 생성물을 포함하며, 여기서 상기 반응 생성물은 기판의 외부 표면에 또는 E 서브유닛과 고체 기판의 외부 표면 상에 배치된 선택적 링커 (L4)에 공유결합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체는 랜던 공중합체, 예를 들면 랜던 삼원중합체이다.
전술한 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 중합체는 랜덤 삼원 중합체와 같은 랜덤 공중합체이다. 전술한 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 중합체는 다음과 같은 구조식(VI)를 갖는다:
Figure pct00078
상기 식에서,
T3 및 T4는 각각 독립적으로 부재하거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단기이고;
q, r 및 s는 각각 독립적으로 1 내지 350,000의 정수이다.
일부 실시형태에서, q, r 및 s는 각각 독립적으로 1 내지 50,000의 정수이다.
구조식(VI)의 B, D 및 E 서브유닛의 도시된 연결성은 제한적인 방식이 아니며, 특정의 실시형태에서, 구조식 (VI)의 중합체의 실제구조는 랜덤 공중합체이며, 여기서 B, D, 및 E 서브유닛의 각각은 중합체 내의 임의 위치에서 발생한다.
전술한 고체 지지체의 일부 다른 실시형태에서, 중합체는 다음과 같은 구조식(VIa)를 갖는다:
Figure pct00079
상기식에서,
B, D 및 E는 구조식(VIa)의 중합체 내에 적어도 한 번 존재하고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단기이고;
ql, rl 및 sl은 각각의 경우에 독립적으로 0 또는 1이며, 또한
m은 1 내지 700,000의 정수이다.
다른 실시형태에서, m은 1 내지 150,000의 정수이다.
다른 예에서, 클릭 작용기는 상보적 클릭 반응성 기와 알킨, 아민, 알킬실릴-보호된 알킨, 아지드, 니트릴, 티올, 알켄, 말레이미드, 에폭시드, 아지리딘 또는 티이란 작용기의 반응에 의해 형성될 수 있다.
전술한 고체 지지체의 다른 실시형태에서, E 서브유닛은 중합체 내에 말단 위치에 있다.
다른 실시형태에서, E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식(VI)을 갖는다:
Figure pct00080
상기식에서,
L1은 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
RP는 반응생성물이고;
L4는 임의 선택적 링커이고; 또한
Q는 고체 지지체의 외부 표면을 나타낸다.
일부 실시형태에서, L4는 길이가 100개 원자 이하이다.
다른 실시형태에서, E 서브유닛의 각각은 상기 구조식(VI)를 갖는다.
전술한 고체 지지체의 다른 실시형태에서, E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식 (VII)를 갖는다:
Figure pct00081
상기 식에서,
L1은 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
RP는 반응 생성물이고;
L4은 임의 선택적 링커이고;
R2는 H 또는 알키이고;
Q는 고체 기판의 외부 표면을 나타낸다.
다른 실시형태에서, E 서브유닛의 각각은 상기 구조식(VII)을 갖는다.
전술한 고체 지지체의 또 다른 실시형태에서, L1은 알킬렌, 에스테르, 에테르, 또는 디티오 모이어티, 또는 그의 조합을 포함한다. 다른 실시형태에서, L1은 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, α은 1이다. 다른 실시형태에서, R2는 H이다.
전술한 고체 지지체의 또 다른 실시형태에서, L4은 실리콘-산소 결합, 알킬렌 사슬, 중합체 또는 이의 조합을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 중합체는 폴리에틸렌글리콜이다. 일부 양상에서, 폴리에틸렌 글리콜은 1 내지 50,000 (예를 들면, 10 내지 50,000)개의 단량체 서브유닛을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 1 내지 90개의 단량체 서브유닛을 포함한다. 예를 들면, 다른 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 55 내지 90개의 단량체 서브유닛을 포함한다.
전술한 고체 지지체의 일부 실시형태에서, L4는 다음과 같은 구조식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00082
또는
Figure pct00083
상기식에서,
L5 및 L6는 각각 독립적으로 알킬렌, 알킬렌 옥사이드, 이미드, 에테르, 에스테르 또는 아미드 모이어티, 또는 이의 조합을 포함하는 임의 선택적 링커이고;
R24 및 R25는 각각 독립적으로 H, 하이드록실, 알킬, 알콕시 또는 -OQ이고, 여기서 Q는 고체 지지체의 외부 표면이고;
R26, R27, R28 및 R29는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로, 니트릴, 니트로 또는 암모늄이고;
P는 중합체 서브유닛을 나타내고;
A는 직접 결합 또는 -S(0)2-이고;
γ는 1 내지 2000 범위의 정수이고,
여기서 L4는 말단 질소 또는 산소 원자를 통해 고체 기판에 결합된다.
전술한 것의 특정 실시형태에서, P는 -CH2- 또는 -OCH2CH2-이다. 다른 실시형태에서, L4는 다음 구조식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00084
또는
Figure pct00085
특정의 실시형태에서, γ는 1 내지 90, 예를 들면, 55 내지 90 범위이다. 다른 실시형태에서, L4는 존재하지 않는다.
전술한 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 클릭 작용기는 트리아졸이다. 예를 들면 일부 실시형태에서 E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 다음과 같은 구조식중 하나를 갖는다:
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
또는
Figure pct00089
상기식에서,
β 및 χ는 각각 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수이고;
L4는 임의 선택적 링커이고;
Q는 고체 기판을 나타낸다.
다른 실시형태에서, E 서브유닛의 각각은 상기 구조식 중의 하나를 갖는다.
다른 실시형태에서, 적어도 하나의 E 서브유닛은 말단 위치에서 T4에 공유결합되어 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서 T4는 H이다.
특정의 실시형태에서, L4는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 반복단위를 포함한다.
전술한 고체 지지체의 다른 실시형태에서, B 서브유닛은 상술한 중합체의 실시형태의 임의의 것에서 B 서브유닛에 대해 정의된 바와 같다. 전술한 고체 지지체의 일부 실시형태에서, D 서브유닛은 상술한 중합체의 실시형태의 임의의 것에서 C 서브유닛에 대해 정의된 바와 같다.
특정의 실시형태에서, 적어도 하나의 D 서브유닛은 포획 프로브에 대한 공유결합을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서 적어도 하나의 D 서브유닛은 다음과 같은 구조식 (VIII)를 갖는다:
Figure pct00090
상기 식에서,
M은 포획 프로브이고;
R5는 수소 또는 알킬이고;
L2는 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
δ는 0 내지 10 범위의 정수이다.
다른 실시형태에서, D 서브유닛의 각각은 상기 구조식(VIII)를 갖는다.
일부 실시형태에서, L2는 알킬렌, 에스테르, 카르보닐, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드 에테르 또는 디티오 모이어티, 또는 이의 조합을 포함한다. 다른 실시형태에서, δ는 1이다. 또 다른 실시형태에서, R5는 H이다.
전술한 고체 지지체의 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 D 서브유닛은 다음과 같은 구조식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00091
또는
Figure pct00092
다른 실시형태에서, D 서브유닛의 각각은 상기 구조식 중의 하나를 갖는다.
전술한 고체 지지체의 또 다른 실시형태에서, 고체 지지체의 표면은 다음과 같은 구조식들 중 하나를 갖는다:
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
상기 식에서,
B, D 및 E 서브유닛은 중합체 내에 적어도 한번 존재하고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단 기이고;
q, r 및 s는 각각 독립적으로 1 내지 350,000의 정수이고;
L4는 임의 선택적 링커이고;
M은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브를 나타내고;
Q는 고체 지지체의 외부 표면을 나타낸다.
전술한 고체 지지체의 일부 다른 실시형태에서, 고체 지지체의 표면은 다음과 같은 구조식들 중 하나를 갖는다:
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
또는
Figure pct00108
상기식에서,
B, D 및 E 서브유닛은 중합체 중에 적어도 한번 존재하고;
T3 및 T4는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 또는 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단기이고;
ql, rl 및 sl은 각각의 경우에 독립적으로 0 또는 1이고;
L4는 임의 선택적 링커이고
M은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브를 나타내고;
Q는 고체 지지체의 외부 표면을 나타내고;
m은 1 내지 150,000의 정수이다.
전술한 내용의 특정한 실시형태에서, L4는 상기 실시형태의 어느 하나에 정의된 바와 같다.
전술한 고체 지지체의 다른 실시형태에서, 포획 프로브는 질소 원자를 통해 D 서브유닛에 공유결합 된다. 일부 양상에서, 포획 프로브는 펩티드, 단백질, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 일부 실시형태에서 포획 프로브는 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드이다.
고체 지지체의 물 접촉각은 (예를 들면, B 서브유닛의 수 및 형태를 조절하여) 조절하여 용매, 예를 들면 수성 용매 용매 중에 용해된 분석물 분자와의 계면 반응을 가능하게 한다. 이와 관련하여, 물 접촉각은 일반적으로 용해된 분석물의 접촉 및 고체 지지체의 반응표면 (즉, 여기에 고정화된 중합체를 갖는 표면)을 증강시키도록 짜맞춘다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체의 물 접촉각은 약 50°내지 90°, 예를 들면 약 50°내지 70°범위이다. 일부 실시형태에서, 물 접촉각은 55°내지 65°범위이다. 다른 실시형태에서, 물 접촉각은 60°내지 65°범위이고, 더욱 다른 실시형태에서 물 접촉각은 약 80°내지 90°범위이다. 물 접촉각의 결정 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다.
따라서 일부 실시형태에서, 중합체 중의 서브유닛의 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%는 B 서브유닛이다.
다른 실시형태에서, B, D 및 E 서브유닛의 몰 분획은 변할 수 있다. 예를 들면, B, D 및 E 서브유닛의 몰 분율은 약 0.1 몰% 내지 약 99.8 몰%로 변할 수 있다. 일부 예시적 실시형태에서, B, D 및 E 서브유닛의 총 몰%는 100%이다.
특정의 실시형태에서, E 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 1% 내지 약 30%, 예를 들면 약 15% 내지 약 25% 범위이다. 다른 실시형태에서, B 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 20% 내지 약 60%, 예를 들면 약 35% 내지 약 45% 범위이다. 다른 실시형태에서, D 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 20% 내지 약 60%, 예를 들면 약 35% 내지 약 45% 범위이다. 다른 추가 실시형태에서, B 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 15% 내지 약 25% 범위이고, B 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 35% 내지 약 45% 범위이고 또한 D 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 35% 내지 약 45% 범위이다. 또 다른 실시형태에서, E 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 20%이고, B 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 40%이고 또한 D 서브유닛의 몰 퍼센트는 약 40%이다.
특정의 실시형태에서, 중합체는 단지 하나의 E 서브유닛을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, E 서브유닛은 중합체의 말단부에 있다.
본 발명의 실시에 사용되는 고체 지지체의 유형은 제한되지 않는다. 일반적으로 고체 지지체는 기술된 중합체의 고정화에 수정가능한 유형 및/또는 중합체가 여기에 고정화할 수 있도록 활성화에 수정하가능한 유형일 것이다. 본 발명의 범위 내에서 고체 지지체는, 이들로 제한되지 않지만, 광학적으로 투명한 및 불투명한 중합체들을 포함한다. 평면 기판, 비이드, 입자, 다공성 매트릭스 및 다공성 모노리스 형태의 고체 기판은 또한 특정의 실시형태에 포함된다.
일부 실시형태에서, 고체 기판은 유기 중합체를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 폴리(스티렌), 폴리(카르보네이트), 폴리(에테르설폰), 폴리(케톤), 폴리(지방족 에테르), 폴리(아릴 에테르), 폴리(아미드) 폴리(이미드), 폴리(에스테르) 폴리(아크릴레이트), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(올레핀), 폴리(사이클릭 올레핀), 폴리(비닐 알코올) 또는 공중합체, 그의 할로겐화 유도체 또는 가교결합 유도체를 포함한다. 특정의 실시형태에서, 할로겐화 유도체는 할로겐화 폴리(아릴 에테르), 할로겐화 폴리(올레핀) 또는 할로겐화 폴리(사이클릭 올레핀)이다. 일부 구체적 실시형태에서, 고체 지지체는 폴리(사이클릭 올레핀)을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 고체 지지체는 옥사이드를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 실리콘, 융합 실리카, 유리, 석영, 인듐-산화 주석, 이산화 티타늄, 산화 알루미늄 또는 이의 조합을 포함한다.
옥사이드 층을 포함하는 외부 표면을 갖는 유기 중합체를 포함하는 고체 지지체는 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 특정한 실시형태는 분석검정에서 고체 지지체의 사용을 포함한다. 이러한 검정은 흔히 형광 검정과 같은 광학 분석 단계를 포함한다. 따라서 일부 실시형태에서 고체 기판은 실질적으로 광학적으로 투명하다. 다른 실시형태에서, 고체 기판은 약 400 nm 내지 약 800 nm로 실질적으로 광학적으로 투명하다. 또 다른 실시형태에서, 고체 기판은 적어도 약 90% 광학적으로 투명하다.
본 발명의 다른 특정한 실시형태는 분석 어레이 유형 검정에서 고체 지지체의 용도에 관한 것이다. 따라서 일부 실시형태는 고체 지지체를 제공하며, 여기서 상기 고체 지지체는 별개 위치의 체계적 어레이를 포함하고, 각각의 별개 위치는 독립적으로 여기에 접합된 중합체의 적어도 하나를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 각각의 별개 위치는 독립적으로 여기에 접합된 다수개의 중합체를 포함한다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 각각의 별개 위치에서 적어도 하나의 중합체는 D 서브유닛을 통해 여기에 공유결합된 포획 프로브를 포함하며, 다른 실시형태에서 각각의 별개 위치는 여기에 결합된 적어도 하나의 포획 프로브를 포함하고, 여기서 상기 포획 프로브는 다른 별개 위치의 각각에 결합된 적어도 하나의 포획 프로브와 구조적으로 구별된다. 추가의 실시형태에서, 각각의 별개 위치는 여기에 결합된 다수개의 구조적으로 별개의 분석물 분자들을 포함한다.
상기 고체 지지체의 다양한 실시형태에서, 포획 프로브는 펩티드, 단백질, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드이다. 구체적 실시형태에서, 포획 프로브는 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드이다. 다양한 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 DNA는 분석물 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 분자의 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
C. 활성화된 고체 기판
또 하나의 실시형태에서, 본 발명은 활성화된 외부 표면을 갖는 고체 지지체에 관한 것이다. 고체 기판은 임의 수의 고체 지지성 용도에서 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 기판은 고체 기판의 외부 표면에 공유결합된 아지드 또는 알킨 모이어티를 포함한다. 이러한 고체 기판은 예를 들면 여기에 고정화된 중합체 및/또는 포획 프로브를 포함하는 고체 지지체를 제조하는 방법에서 사용할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 고체 기판은 클릭 반응을 통해 고체 지지체에 기술된 중합체를 공유결합시키는데 사용할 수 있다.
따라서 특정의 실시형태에서 본 발명은 외부 표면을 포함하는 고체 기판으로서, 외부 표면에 공유결합된 아지드 또는 알킨 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서 고체 기판은 다음과 같은 구조식 중의 하나를 갖는다:
Figure pct00109
또는
Figure pct00110
상기 식에서,
Q는 고체 기판의 외부 표면을 나타내고;
L4은 임의 선택적 링커이고;
ι은 0 내지 10 범위의 정수이다.
본 발명자들은 고체 기판의 물 접촉각이 다양한 극성을 갖는 용매 중에서 중합체와 계면반응에 적합하도록 L4 링커 모이어티를 선택할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서 특정의 구체적 실시형태에서 L4는 존재하지 않는다. 고체 기판의 물 접촉각은 약 50°내지 90°, 예를 들면 약 50°내지 70°범위이다. 일부 실시형태에서, 물 접촉각은 55°내지 65°범위이다. 특정의 실시형태에서, 물 접촉각은 60°내지 65°범위이다. 특정의 실시형태에서 물 접촉각은 80°내지 90°범위이다.
일부 구체적 실시형태에서, L4는 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하며, 이들 실시형태중 특정의 것에서 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 1 내지 90개의 에틸렌 글리콜 서브유닛, 예를 들면 55 내지 90개의 에틸렌 글리콜 서브유닛을 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, L4는 여기에 고정화된 중합체를 포함하는 전술한 고체 기판의 실시형태의 임의의 것에서 상기 정의된 바와 같다. 추가로, 사용된 고체 기판의 유형 (예를 들면, 중합체, 옥사이드 등)은 특별히 제한되지 않는다. 특정의 실시형태에서, 고체 지지체의 조성물은 고체 기판상에 고정화된 중합체를 포함하는 전술한 고체 지지체의 실시형태 중 어느 것에 기술된 바와 같다. 일부 다른 실시형태에서, ι은 1, 2 또는 3이다.
일부 다른 실시형태에서, 본 발명은 외부 표면을 포함하는 고체 기판으로서, 외부 표면에 공유결합된 아미노 모이어티를 포함하는 고체 기판에 관한 것이다. 특정의 실시형태에서, 고체 지지체의 조성물은 아미드화 고체 기판상에 고정화된 에스테르- 또는 아즈락톤-함유 직교 중합체를 포함하는 전술한 고체 지지체의 실시형태의 임의의 것에 기술된 바와 같다. 직교 중합체는 후속 생물접착을 위한 아지드 또는 알킨 모이어티를 포함한다.
D. 방법
본 발명의 특정한 실시형태는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 이에 제한되지 않지만, 본 출원에 기술된 중합체, 활성화 고체 기판 및 고체 지지체의 제조방법을 포함한다. 분석 검정에서 고체 지지체의 사용방법이 또한 제공된다. 예를 들면, 고체 지지체는 임의 수의 분석물, 예를 들면 바이러스, 세균, 열원충, 진균은 물론 금속 및 미지의 바이오 전쟁, 바이오 해저드 및 화학전 재료의 검출을 위한 평가분석에서 사용할 수 있다.
다양한 분석물의 분석을 위한 고체 지지체의 사용방법은 당업계의 통상의 기술자에 명백할 것이다. 이러한 방법은 예를 들면 미국 가특허출원 제61/463,580호, 제61/561,198호, 제1/684,104호, 제61/600,569호, 미국특허출원 제13/399,872호 및 미국공개공보 제2012/0214686호에 기술되어 있으며, 이의 전문은 본 출원에서 다목적으로 참고로 포함된다. 기술된 고체 지지체를 사용하는 예시적인 방법은 도 2에 개략적으로 도시되어 있다.
도 2A에 도시된 바와 같이, 방법의 일 실시형태에서, 분석물 프로브는 섹션 A 및 B를 포함한다. A 섹션은 임의로 소광물질 모이어티를 포함하며, 상기 소광물질은 A 섹션의 3'말단에서 또는 A 섹션 내에 임의의 다른 지점에서 있을 수 있다. A 섹션은 표적 분석물 서열의 적어도 일부에 상보적이다 (예를 들면, 병원체 DNA 등). 분석물 프로브는 또한 섹션 B ("플랩")을 포함한다. 플랩은 형광체 및 상기 고체 지지체에 결합된 포획 프로브의 서열의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 경우에 따라, 분석물 프로브의 서열은 A 섹션 및 플랩이 적어도 일부 상보성을 가지도록 선택할 수 있으며, 그리하여 소광제 및 형광체는 밀접하게 근접하게 되어, 미결합된 분석물 프로브와 관련된 형광 신호를 감소시키고, 평가분석의 전체 민감성을 증가시킨다.
평가분석 조건은 일반적으로 상이한 표적 분석물에 특이적인 독특한 서열을 갖는 다수개의 분석물 프로브를 포함한다. PCR 조건하에 및 상보적 (또는 적어도 부분적으로 상보적) 표적 분석물의 존재하에, 플랩은 분석물 프로브로부터 절단된다. 다음에 절단된 플랩은 플랩에 상보적인 (또는 적어도 부분적으로 상보적인) 고체 지지체 결합 포획 프로브로 하이브리드화 된다. 포획 프로브가 결합되는 위치에서 형광 신호의 존재 (또는 증가)는 표적 분석물 서열의 존재를 나타낸다.
대안적인 실시형태에는 도 2B에 도시된다. 이러한 예시적 실시형태에서, 플랩은 소광물질을 포함하고 지지체 결합된 포획 프로브는 형광체를 포함한다. 다시, 플랩 또는 포획 프로브 상에 소광물질 또는 형광체의 정확한 위치는 각각 변화할 수 있다. 표적 분석물 서열의 존재하에 PCR 조건에서, 플랩은 프로브로부터 절단된다. 다음에 플랩은 포획 프로브로 하이브리드화되며, 따라서 포획 프로브상의 형광체는 퀀칭된다. 따라서 포획 프로브가 결합되는 위치에서 형광성의 부존재 (또는 감소)는 표적 분석물 서열의 존재를 나타낸다.
또 다른 예시적 방법은 도 2C에 제공된다. 여기서, 프로브는 표적 분석물 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하며 또한 절단 가능한 플랩을 포함하지 않는다. 이 실시형태에서 프로브는 소광물질을 포함하고 상기 지지체 결합된 포획 프로브는 형광체를 포함한다. 프로브는 포획 프로브로 하이드리드화되어, 포획 신호가 결합되는 위치에서 퀀칭 신호를 초래한다. 다음에 고체 지지체는 PCT 상태로 적용시킨다. 표적 분석물 서열의 존재하에, 프로브 소광물질은 절단되고 포획 프로브로부터 형광신호는 증가한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 일반적으로 표적 분석물 분자의 존재 또는 부존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 본 출원에 기술된 바와 같는 고체 지지체를 제공하고, 여기서 상기 D 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 여기에 공유결합된 포획 프로브를 포함하고;
b) 상기 고체 지지체에 분석물 프로브 또는 그의 단편을 접촉시키고;
c) 상기 포획 프로브와 상기 분석물 프로브의 상호작용으로부터 생성된 신호의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를
포함하는 방법에 관한 것이다.
다른 관련 실시형태에서, 본 발명은 표적 핵산의 검출방법으로서, 상기 방법은
A) 본 출원에 기술된 적어도 하나의 고체 지지체를 포함하는 검출 챔버를 제공하고, 상기 고체 지지체는 포획 프로브의 어레이를 포함하고;
B) 시료를 검출 챔버 내에 로딩하고, 상기 시료는 검출될 표적 핵산의 하나 이상의 카피를 포함하고;
C) 증폭 프라이머 및 프로브를 상기 하나 이상의 카피에 하이브리드화 하고;
D) 증폭 프라이머 의존적 증폭 반응에서 상기 표적 핵산 카비의 하나 이상의 적어도 일부를 증폭하고, 여기서 상기 증폭반응은 상기 프로브의 절단 및 제1 프로브 단편의 방출을 초래하고;
E) 제1 프로브 단편을 고효율 어레이로 하이브리드화하고;
F) 상기 어레이에 제1 프로브 단편을 결합시켜 생성된 신호를 검출하고, 따라서 표적 핵산을 검출하는 단계를
포함하는 방법에 관한 것이다.
특정의 실시형태에서, 상기 검출 단계(들)은 상기 어레이에 근접한 배경 신호를 감소시키는 조건하에 수행한다.
다른 실시형태에서, 다수개의 표적 핵산 서열의 시료를 분석하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 방법은
A) 상기 시료를 제1 다수개의 표지 프로브로 접촉시키고, 상기 제1 다수개의 표지 프로브의 각각은 표적 핵산 서열의 제1 패널에서 목적한 상이한 표적 서열에 상보적인 제1 부분 및 고효율 프로브 어레이 상에 상이한 포획 프로브에 상보적인 제2 부분을 포함하며, 상기 고효율 프로브 어레이는 본 명세서에 기술된 바와 같은 고체 지지체를 포함하고, 여기서 상기 제2 부분은 여기에 부착된 표지를 가지며 또한 목적한 표적 서열에 상보적이지 않고;
B) 증폭 프라이머 의존적 증폭 반응에서 시료 중에 존재하는 표적 핵산 서열의 제1 패널로부터 임의의 표적 서열을 증폭시키고, 여기서 상기 증폭 반응은 표적 서열에 하이브리드화된 표지 프로브의 절단 및 표지를 갖는 표지 프로브의 제2 부분의 방출을 생기게 하며;
C) 상기 표지된 프로브의 방출된 제2 부분을 상기 고효율 어레이로 하이브리드화하고;
D) 고효율 어레이로 포획 프로브에 상기 표지 프로브의 제2 부분의 결합을 검출하고;
E) 고효율 어레이로 하이브리드화 하는 표지 프로브의 제2 부분으로부터 시료 중에 존재하는 표적 서열을 동정하는 단계를
포함하는 방법을 제공한다.
추가의 다른 실시형태에서, 본 발명은 하기 A) 내지 C) 단계를 포함하는 시료에서 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공한다:
A) 제1 표적 핵산 서열에 상보적인 제1 부분 및 상기 제1 표적 핵산 서열에 비상보적인 제2 표지 부분을 포함하는 제1 표지 프로브의 존재하에 뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소로 시료에 대한 증폭반응을 수행하고, 그리하여 상기 표적 핵산 서열이 증폭될 때 상기 제2 부분을 상기 제1 부분으로부터 절단한는 단계;
B) 상기 제2 표지 부분을 상기 제2 부분에 상보적인 포획 프로브로 하이브리드화하는 단계, 이때 상기 포획 프로브는 본 명세서에 기술된 고체 지지체에 공유결합됨;
C) 상기 기판상에 포획 프로브에 하이브리드화된 제2 표지 부분의 존재를 검출하는 단계.
본 방법의 또 다른 실시형태는 하기 단계 A) 내지 C)를 포함하는 시료중의 표적 핵산 서열을 검출하는 방법을 포함한다:
A) 상기 표적 핵산 서열에 상보적인 제1 부분 및 상기 제1 표적 핵산 서열에 비상보적인 제2 부분을 포함하는 제1 프로브를 포함하는 시약의 존재하에, 뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소로 시료에 대한 증폭을 수행하는 단계, 이때 제2 부분은 제1 위치에서 제2 부분에 결합되된 제1 소광물질 모이어티를 포함하거, 핵산 서열이 증폭할 때 제2 부분을 제1 프로브 단편으로서 제1 부분으로부터 절단함;
B) 본 명세서에 기술된 고체 지지체상에 고정화된 포획 프로브에 제1 프로부를 하이브리드화하는 단계, 여기서 상기 포획 프로브는 제1 소광물질 모이어티에 의해 적어도 부분적으로 퀀칭되는 형광체를 포함하고, 상기 형광체는 포획 프로브상의 제2 부분에 결합되어 상기 포획 프로브에 상기 프로브 단편의 하이브리드화 시 형광체가 소광물질에 의해 적어도 부분적으로 퀀칭됨;
C) 상기 포획 프로브상에 형광체의 퀀칭을 기본으로 하는 표적 서열의 존재를 검출하는 단계.
또 하나의 실시형태에서, 본 발명은 하기 단계 A) 및 B)를 포함하는 시료중에 적어도 제1 표적 핵산 서열을 검출하는 방법에 관한 것이다:
A) 본 명세서에 기술된 고체 지지체의 존재하에 표적 핵산 서열을 증폭할 수 있는 증폭 반응에 상기 시료를 적용시키는 단계, 여기서 상기 고체 지지체는 적어도 제1 세트의 핵산 프로브를 포함하고, 상기 제1 세트의 핵산 프로브는 여기에 부착된 형광체를 포함하는 포획 프로브, 및 상기 포획 프로브 및 상기 표적 핵산 서열의 적어도 일부에 상보적이고 여기에 부착된 소광물질을 포함하는 표적 특이적 핵산 프로브를 포함하고, 표적 특이적 프로브가 포획 프로브에 하이브리드화 될 때 형광체로부터 형광성을 퀀칭함; 및
B) 중합효소 연쇄 반응의 하나 이상의 사이클 후에 시료로부터 형광성을 검출하는 단계, 이때 형광성의 증가는 표적 핵산 서열의 존재를 나타냄.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 고체 지지체 및 고체 기판을 포함하는 장치 및 소모부품을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 하기 단계 A) 내지 C)를 포함하는 핵산 검출 장치를 제공한다:
A) 챔버의 적어도 하나의 표면상에 적어도 하나의 고효율 핵산 검출 어레이를 포함하는 검출 챔버, 이때 상기 핵산 검출 어레이는 본 명세서에 기술된 고체 지지체를 포함하고, 상기 챔버는 상기 어레이로부터 검출된 신호를 위한 신호 배경을 감소시키도록 구성됨;
B) 상기 검출장치에 작동 가능하게 결합된 온도 조절 모듈, 이때 상기 모듈은 상기 장치의 조작 중에 챔버 내에서 온도를 조절함; 및
C) 상기 장치의 조작 중에 상기 어레이에서 생성된 신호를 검출하는 광학 트레인.
다른 실시형태에서, 본 발명은 핵산 검출 소모부품을 제공하며, 이때 상기 핵산 검출 소모부품은 깊이 약 500㎛ 미만의 얇은 챔버를 포함하고, 상기 챔버는 윈도우의 내부 표면상에 배치된 고효율 포획 핵산 어레이를 포함하는 광학적으로 투명한 윈도우를 포함하고, 상기 챔버는 챔버에 유동적으로 결합된 적어도 하나의 시약 공급 포트를 추가로 포함하고, 여기서 상기 소모부품은 상기 챔버 내에 유체의 열 사이클링을 허용하도록 구성되고, 여기서 상기 고효율 포획 핵산 어레이는 본 명세서에 기술된 고체 지지체를 포함한다.
특정의 실시형태에서, 표적 분석물 분자는 DNA 서열이고, 상기 DNA 서열은 병원체, 예를 들면, 바이러스, 세균, 변형체 또는 진균의 존재를 나타내는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 분석물 프로브는 플랩이다. 일부 다른 실시형태에서, 상기 분석물 프로브는 소광물질을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 분석물 프로브는 형광체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 포획 프로브는 형광체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
고체 지지체는 본 명세서에 기술된 고체 지지체의 임의의 것일 수 있다. 추가로, 특정한 실시형태에서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드이고, 다른 실시형태에서 표적 분석물 분자는 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에서, 표적 분석물 분자는 중합효소 연쇄 반응을 거쳐 제조된다.
일부 다른 실시형태에서, 상기 신호는 형광신호이다. 예를 들면 일부 실시형태에서 상기 형광 신호는 포획 프로브와 표적 분석물 분자의 특이적 하이브리드화의 결과로서 생성된다.
다른 관련 실시형태에서, 본 발명은 시료중의 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 분석물을 본 발명의 고체 지지체와 접촉시켜 본 발명의 고체 지지체에 의해 분석물의 포획을 가능하게 한 다음, 상기 분석물의 포획을 검출하는 단계를 포함한다. 특정의 실시형태에서, 상기 분석물은 바이오 분자, 예를 들면 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 또는 그의 하이브리드이다. 다른 실시형태에서, 분석물은 의약, 의약 후보물질, 보조인자 또는 대사물질과 같은 유기분자이다. 또 하나의 실시형태에서, 분석물은 금속 착물 또는 보조인자와 같은 무기분자이다. 예시적 실시형태에서, 분석물은 표지 프로브인 핵산이다. 또 하나의 예시적 실시형태에서, 본 발명은 단백질, 효소, 항체, 항원, 호르몬, 탄수화물, 당접합체 또는 합성적으로 생산된 분석물 표적, 예를 들어 후속 단계에서 분석물을 포획하고 검출하는데 사용될 수 있는 합성적으로 생산된 에피토프를 공유적으로 고정화하는 반응성 표면을 제공한다.
다양한 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 고체 지지체를 사용하여 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 고체 지지체 상에 고정화된 상보적 서열의 핵산에 검출 가능하게 표지된 핵산 프로브 단편을 결합하는 단계를 포함한다. 예시적 방법은 다음 단계 A) 내지 C)를 포함한다:
A) 증폭 프라이머 및 검출 가능하게 표지된 프로브를 표적 핵산에 하이브리드화 하는 단계;
B) 프라이머 의존적 증폭 반응에서 표적 핵산의 적어도 일부를 증폭시키는 eksreP, 여기서 상기 증폭 반응은 표지된 프로브의 절단 및 표지된 프로브 단편의 방출을 생기게 함; 및
C) 고정화 검정 성분에 표지 프로브 단편을 하이브리드화 하며, 여기서 상기 성분은 상기 표지된 프로브 단편에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산이고, 따라서상기 핵산을 검출하는 단계.
분서물의 검출은 임의의 기술 인식된 방법 또는 장치에 의해 수행할 수 있다. 특정의 실시형태에서, 분석물은 고체 지지체 상에 고정화된 분석물 또는 프로브로부터 생기는 형광 신호에 의해 검출한다. 예시적 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 핵산 어레이이며, 또한 상기 신호는 고체 지지체 상에 고정화된 검정 성분에 하이브리드화 된 형광 표지 핵산으로부터 발생한다. 다양한 실시형태에서, 고정화된 검정 성분은 형광 표지된 핵산의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 핵산이다. 분석물이 형광 표지되는 선택된 실시형태에서는, CCD 어레이와 같은 형광 검출기에 의해 검출된다. 특정의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 고체 지지체의 하나 이상의 어드레스 가능한 위치에 시료를 적용시킨 다음 상기 어드레스 가능한 위치 또는 위칟들에서 포획된 분석물을 검출함으로써 시료 중에 특정 부류의 분석물을 프로파일링 하는 것을 포함한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 방법의 예들은 미국 가특허출원 제61/561,198호, 및 미국특허출원 제13/399,872호에 기술된 것을 포함하며, 이들의 전체 기재사항은 다목적을 위해 본 출원에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 검정 혼합물중에 분석물의 분리 및 검출을 위해 유용하다. 특히 본 발명의 고체 지지체는 실질적으로 임의 형태의 검정, 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 중합효소 연쇄반응(PCR), 크로마토그래피 포획, 면역학적 검정, 경쟁적 검정, DNA 또는 RNA 결합 검정, 형광 인사이투 하이브리드화(FISH), 단백질 및 핵산 프로하일링 검정, 샌드위치 검정 등을 수행하는데 유용하다. 다음의 논의들은 본 발명의 고체 지지체를 사용하여 예시적인 검정을 실시하는데 촛점이 있다. 이러한 촛점은 단지 예시의 명확화를 위한 것이며 본 발명의 범위를 정의하거나 한정하는 것이 아니다. 당업자들은 본 발명의 방법이 분석물의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 임의의 검정 기술에 광범위하게 적용가능하다는 것을 인식할 것이다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 고체 지지체를 사용하여 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 고체 지지체의 반응성 중합체상에 고정화된 상보적 서열의 핵산에 검출 가능하게 표지된 핵산 프로브 단편을 결시키는 단계를 포함한다. 예시적인 방법은 다음 단계 A) 내지 C)를 포함한다:
A) 증폭 프라이머 및 검출 가능하게 표지된 프로브를 상기 표적 핵산에 하이브리드화 하는 단계;
B) 프라이머 의존적 증폭 반응에서 표적 핵산의 적어도 일부를 증폭하는 단계, 여기서 상기 증폭 반응은 표지된 프로브의 절단 및 표지된 프로브 단편의 방출을 생기게 함; 및
C) 상기 표지된 프로브 단편을 상기 고정화 검정 성분에 하이브리드화 하며, 여기서 상기 성분은 상기 표지된 프로브 단편에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산이며, 따라서 상기 핵산을 검출하는 단계.
시료는 임의의 근원으로부터 유래할 수 있고, 생물학적 시료, 예를 들면 동일 또는 상이한 종으로부터 유기물 또는 유기물 그룹으로부터의 시료일 수 있다. 생물학적 시료는 체액 시료, 예를 들면, 혈액 시료, 혈청 시료, 림프 시료, 골수시료, 복수액, 흉막액, 골반 세척액, 안구액, 소변, 정액, 가래 또는 침일 수 있다. 생물학적 시료는 또한 피부, 코, 목, 또는 생식선으로부터 추출물, 또는 대변물질의 추출물일 수 있다. 생물학적 시료는 또한 종양을 포함하는 기관 또는 조직의 시료일 수 있다. 생물학적 시료는 또한 진핵 및 원핵 세포의 세포주 및 일차 배양물을 포함하는 세포 배양물의 시료일 수 있다.
시료는 환경으로부터, 예를 들면 수체로부터, 토양으로부터, 또는 음식, 음료수, 또는 물 공급원, 공업 오염원, 작업장, 공공지역, 또는 생활 영역으로부터 유래할 수 있다. 시료는 추출물, 예를 들면 토양 또는 식품 시료의 액체 추출물일 수 있다. 시료는 기구, 의류품, 인공물, 또는 기타 재료와 같은 물품으로부터 면봉을 세척하거나 소킹하거나 서스펜딩 하여 만든 용액일 수 있다. 시료는 또한 세균전 약제 동정을 위한 시료, 예를 들면 기지 또는 미지 기원의 분말 또는 액체의 시료를 포함한다.
시료는 가공처리 또는 미가공처리 시료일 수 있으며; 가공처리는 시료의 분석물을 촉진하기 위하여 시료의 성분들의 순도, 농도 또는 액세스 성을 증가시키는 단계를 포함한다. 비제한적 예로서, 가공처리는 시료의 용적을 감소시키고, 시료의 성분들을 제거하거나 분리하고, 시료 또는 하나 이상의 성분들을 가용화하거나, 또는 시료의 성분들을 붕괴시키고, 변형하고, 노출하고, 방출하거나 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 절차의 비제한적 예들은 원심분리, 침전, 여과, 균질화, 세포분해, 항체 결합, 세포 분리 등이다. 예를 들면, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 시료는 예를 들면 적혈 세포의 제거에 의해, 농축에 의해, 하나 이상의 세포 또는 바이러스 유형 (예를 들면, 백혈 세포 또는 병원세포)의 선택에 의해, 또는 세포의 용해에 의해 적어도 부분적으로 가공처리되는 혈액 시료이다.
예시적인 시료는 적어도 부분적으로 정제된 핵산 분자의 용액을 포함한다. 핵산 분자들은 단일 근원 또는 다중 근원으로부터 유래할 수 있으며 또한 DNA, R A, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들면, 핵산분자의 용액은 세포 용해, 농축, 추출, 침전, 핵산 선택 (예를 들면, 폴리 A RNA 선택 또는 Alu 성분들을 포함하는 DNA 서열의 선택), 또는 하나 이상의 효소에 의한 처리의 단계들의 임의의 것에 적용되는 시료일 수 있다. 시료는 또한 합성 핵산 분자들을 포함하는 용액일 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체가 핵산을 검출하고 및/또는 특성화하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 고체 지지체는 고체 지지체 상의 기지 위치에서 표면결합 중합체에 공유 결합되는 상이한 서열의 핵산을 다수개 갖는 핵산 어레이이다. 다양한 실시형태에서, 고체 지지체는 PCR이 검정 혼합물에 함유된 표적 핵산 시료상에서 수행되는 반응용기의 성분이다. 예시적인 방법에서, 하나 이상의 핵산 프라이머 및 검출 가능하게 표지된 핵산 프로브는 표적 핵산으로 하이드리드화 한다. PCR 주형 확장 중에, 프로브를 절단하여, 프로브 단편을 생성시킨다. 프로브 단편은 표적 핵산으로부터 박리하고 표면 결합 중합체 상에서, 핵산인 고정화 분석물 성분에 의해 포획된다. 프로브 서열은 어레이 상의 결합 위치에 의해 결정된다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 검정 혼합물 중의 하나 이상의 종을 검출하기 위한 다중 검정의 성분으로서 사용된다. 본 발명의 고체 지지체는 다중 유형 분석 및 검정을 수행하는데 특히 유용하다. 예시적인 다중 분석에서, 두 개 이상의 상이한 종(또는 하나 이상의 종의 영역)은 두 개 이상의 프로브를 사용하여 검출하며, 여기서 상기 프로브의 각각은 상이한 형광체로 표지된다. 본 발명의 고체 지지체는 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 프로브 구조가 검정에 사용되는 다중 검정의 설계가 가능하다. 본 발명의 고체 지지체를 사용하는 다수개의 상이한 다중 검정은 당업자에게 명백할 것이다. 하나의 예시적인 검정에서, 적어도 두 개의 별개 형광체의 각각은 핵산 프로브 단편을 표면 고정화 핵산에 신호 하이브리드화에 사용된다.
본 발명의 방법을 실시하는데 사용되는 예시적인 표지 프로브는 핵산 프로브이다. 유용한 핵산 프로브는 다양한 DNA 증폭/정량화 전략, 예를 들면 5'-뉴클레아제 검정, 스트랜드 치환 증폭(SDA), 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 롤링 써클 증폭 (RCA)에서 검출약제의 성분으로서 뿐만 아니라 용액상 또는 고체상 (예를 들면, 어레이)검정에서 표적의 직접 검출을 위해 사용할 수 있다. 더욱이, 고체 지지체 및 올리고머는 실질적으로 임의 형태의 프로브, 예를 들면, 분자 비콘, Scorpion 프로브TM, Sunrise 프로브TM, 입체구조적 지원성 프로브, 라이트 업 프로브(light up probe), Invader 검출 프로브, 및 TaqManTM프로브로부터 선택된 형태의 프로브에 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Cardullo, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8790-8794 (1988); Dexter, D.L., J. Chem. Physics, 21 :836-850 (1953); Hochstrasser, R.A., et al, Biophysical Chemistry, 45:133-141 (1992) ; Selvin, P., Methods in Enzymology, 246:300-334 (1995); Steinberg, I., Ann. Rev. Biochem., 40:83-114 (1971); Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47:819-846 (1978); Wang, G., et al, Tetrahedron Letters, 31 :6493-6496 (1990); Wang, Y., et al, Anal. Chem., 67: 1197-1203 (1995); Debouck, C, et al, in supplement to nature genetics, 21 :48-50 (1999); Rehman, F.N., et al, Nucleic Acids Research, 27:649-655 (1999); Cooper, J.P., et al, Biochemistry, 29:9261-9268 (1990); Gibson, E.M., et al, Genome Methods, 6:995-1001 (1996); Hochstrasser, R.A., et al, Biophysical Chemistry, 45:133-141 (1992); Holland, P.M., et al, Proc Natl. Acad. Sci USA, 88:7276-7289 (1991); Lee, L.G., et al, Nucleic Acids Rsch., 21 :3761-3766 (1993); Livak, K.J., et al, PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Press (1995); Vamosi, G., et al, Biophysical Journal, 71 :972-994 (1996); Wittwer, C.T., et al, Biotechniques, 22:176-181 (1997); Wittwer, C.T., et al, Biotechniques, 22:130-38 (1997); Giesendorf, B.A.J., et al, Clinical Chemistry, 44:482-486 (1998); Kostrikis, L.G., et al, Science, 279:1228-1229 (1998); Matsuo, T., Biochemica et Biophysica Acta, 1379:178-184 (1998); Piatek, A.S., et al, Nature Biotechnology, 16:359-363 (1998); Schofield, P., et al, Appl. Environ. Microbiology, 63:1143-1147 (1997); Tyagi S., et al, Nature Biotechnology, 16:49-53 (1998); Tyagi, S., et al, Nature Biotechnology, 14:303-308 (1996); Nazarenko, I.A., et al, Nucleic Acids Research, 25:2516-2521 (1997); Uehara, H., et al, Biotechniques, 26:552-558 (1999); D. Whitcombe, et al, Nature Biotechnology, 17:804-807 (1999); Lyamichev, V., et al, Nature Biotechnology, 17:292 (1999); Daubendiek, et al, Nature Biotechnology, 15:273-277 (1997); Lizardi, P.M., et al, Nature Genetics, 19:225-232 (1998); Walker, G., et al, Nucleic Acids Res., 20:1691-1696 (1992); Walker, G.T., et al, Clinical Chemistry, 42:9-13 (1996); and Compton, J., Nature, 350:91-92 (1991)]을 참조하며, 이들의 기재내용은 다목적을 위해 그 전문이 본 명세서에서 참고로 도입된다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 표적 핵산 서열에서 다형성을 검출하는 방법을 제공한다. 다형성은 집단에서 두 개 이상의 유전적으로 결정된 대체 서열 또는 대립유전자의 발생을 언급한다. 다형성 마커 또는 부위는 분기(divergence)가 발생하는 유전자 자리이다. 예시적인 마커는 적어도 두 개의 대립유전자를 가지며, 각각은 선택된 집단의 1% 이상 및 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 빈도로 발생한다. 다형체 유전자 자리는 하나의 염기쌍 정도로 작을 수 있다. 다형체 마커는 제한 단편 길이 다형체, 다양한 수의 탠덤 반복(VNTR's), 고도가변 영역, 미니스텔라이드(minisatellite), 디뉴클레오티드 반복, 트리뉴클레오티드 반복, 테트라뉴클레오티드 반복, 단순서열 반복, 및 Alu 등의 삽입 요소를 포함한다. 제1 동정된 대립유전자 형태는 참조 형태로 임의로 지정되며 또한 다른 대립유전자 형태는 대체 또는 변이 대립유전자로 지정된다. 선택된 집단에서 가장 흔하게 발생하는 ㄷ대립유전자 형태는 때때로 야생형 형태로 언급된다. 이배체 생물은 대립유전자 형태에 동형접합 또는 이형 접합일 수 있다. 두 개의 대립유전자 다형성은 두 개의 형태를 갖는다. 세개의 대립유전자 다형성은 3개의 형태를 갖는다.
예시적 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는데 사용된다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 단일 뉴클레오티드에 의해 차지하는 다형성 부위에서 발생하며, 이 부위는 대립 유전자 서열들 사이의 변동 부위이다. 이 부위는 통상적으로 대립유전자의 고도로 보존된 서열 (예를 들면, 집단의 1/100 또는 1/1000 멤버 미만에서 변화하는 서열)에 의해 선행하거나 뒤따른다. 단일의 뉴클레오티드 다형성은 일반적으로 다형성 부위에서 하나의 뉴클레오티드를 다른 것으로 치환으로 인하여 발생한다. 전환은 하나의 퓨린에서 다른 퓨린으로 또는 하나의 피리미딘에서 다른 피리미딘으로의 치환이다. 전환은 퓨린을 피리미딘으로의 치환 또는 이와 반대 치환이다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 또한 뉴클레오티드의 결실 또는 참조 대립유전자에 대하여 뉴클레오티드의 삽입으로부터 발생한다.
다형성이 검출되는 실시형태에서, 다형성 핵산은 어드레스 가능한 위치에서 고체 지지체에 결합된다. 특별한 위치에서 어드레스 가능한 신호의 발생은 표적 핵산 서열에서 다형성의 존재를 나타낸다.
예시적인 실시형태에서, 프로브는 형광체 모이어티로 검출 가능하게 표지된다. 다음 문헌[Pesce et al, Eds., FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al, FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970)]등에 예시된 바와 같이 특정의 프로브에 적절한 형광물질을 선택하기 위해 문헌에서 입수 가능한 상당량의 실제적 가이던스가 있다. 문헌은 또한 형광 및 발색 분자 및 형광물질을 선택하기 위한 이들의 관련 광학 성질들의 철저한 리스트를 제공하는 문헌들을 포함한다. 예를 들면, Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, Ed., INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992) Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949) 등을 참조한다. 추가로, 다음 문헌 [Haugland (supra); Ullman et al, U.S. Pat. No. 3,996,345; Khanna et al, U.S. Pat. No. 4,351,760]에 예시된 바와 같이 핵산에 첨가될 수 있는 통상의 반응성 기를 통해 고유 부착을 위한 형광물질 분자를 유도체화하기 위한 문헌에 광범위한 가이던스가 있다. 따라서 특별한 적용을 위해 에너지 교환 쌍을 선택하고 또한 예를 들면 핵산, 펩티드 또는 다른 중합체와 같은 프로브 분자에 이러한 쌍의 멤버들을 선택하는 것은 당해 분야의 기술자들의 능력 범위내에 있다.
핵산에 소분자들의 접합에 관한 잘 개발된 문헌 본문을 비추어 보아, 핵산에 주게/받게 쌍을 부착하는 많은 다른 방법들은 당업자들에게 명확할 것이다. 예를 들면, 로다민 및 형광 염료는 포스포라미다이트 모이어티로 유도체화된 염료를 통하여 고체상 합성의 종결에서 핵산의 5'-하이드록시에 편리하게 부착된다 (참조, 예를 들면, Woo et al, 미국특허 제5,231,191호; and Hobbs, Jr., 미국특허 제4,997,928호)
더욱 구체적으로, 다음 문헌들 [Eckstein, editor, Nucleic acids and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al, Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321 (1987) (3'-thiol group on nucleic acid); Sharma et al, Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3*-sulfhydryl); Giusti et al, PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) and Fung et al, U.S. Pat. No. 4,757,141 (5'-phosphoamino group via Aminolink TM II available from P.E. Biosystems, CA.) Stabinsky, U.S. Pat. No. 4,739,044 (3-aminoalkylphosphoryl group); Agrawal et al, Tetrahedron Letters, 31 : 1543-1546 (1990) (attachment via phosphoramidites linkages); Sproat et al., Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (5-mercapto group); Nelson et al, Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (3'-amino group)] 등에 예시된 바와 같이 핵산의 5'- 또는 3'-말단에 기들을 부착하는 많은 링커 모이어티 및 방법들이 있다.
형광 표지를 검출하는 수단들은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 따라서 예를 들면 형광 표지는 적절한 광파장으로 형광물질을 자극한 다음 얻어진 형광물질을 검출함으로서 검출할 수 있다. 형광물질은 사진 필름을 사용하여, 전자 검출기 예를 들어 전하결합 고체 지지체 (CCD) 또는 광전자 배전관 등을 사용하여 육안으로 검출할 수 있다. 유사하게, 효소 표지는 효소에 적절한 기판을 제공한 다음 얻어진 반응 생성물을 검출함으로써 검출할 수 있다.
형광 표지된 핵산의 검출과 관련하여 예시하였지만, 본 발명의 고체 지지체는 분석물 분자의 검출에 유용하다. 중합체가 결합기로 작용화되는 경우, 고체 지지체는 특정의 기에 결합하는 표면 분석물 상에 포획할 것이다. 미결합 물질은 세척 제거할 수 있고, 분석물은 다수의 방법들, 예를 들면 가스상 이온 분광측정법, 광학적 방법, 전기화학 방법, 원자간력 현미경법 및 무선주파수 방법에 의해 검출할 수 있다. 예시적인 광학적 방법은 예를 들면 형광, 발광, 화학발광, 흡광도, 반사율, 투과율, 복굴절 또는 굴절율 (예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 편광해석법, 수정 마이크로밸런스, 공명 미러 방법, 격자 커플러 도파관 방법(예를 들면, 파장 심문형 광학 센서("WIOS") 또는 간섭법)의 검출을 포함한다. 광학적 방법은 현미경 (공초점 및 비공초점 모두), 영상 방법 및 비영상 방법을 포함한다. 다양한 형태의 면역학적 검점(예를 들면, ELISA)은 고체 상에 포획된 분석물의 검출을 위한 대중적 방법이다. 전기 화학적 방법은 볼트메트리 및 전류측정법을 포함한다. 무선 주파수 방법은 다극 공명 분광계 또는 간섭법을 포함한다. 광학적 방법은 현미경 (공초점 및 비공초점 모두), 영상 방법 및 비영상 방법을 포함한다. 다양한 형태의 면역학적 검정(예를 들면, ELISA)은 고체상에 포획된 분석물의 검출을 위한 대중적 방법이다. 전기화학적 방법은 볼트메트리 및 전류측정법을 포함한다. 무선 주파수 방법은 다극 공명 분광계를 포함한다.
본 발명의 올리고머와 표적 핵산 분자 사이의 하이브리드화를 좋게 하는 조건은 당업자들에 의해 경험적으로 결정할 수 있고, 올리고뉴클레오티드 유사물 프로브의 최적 인큐베이션 온도, 염농도, 길이 및 기본 조성, 및 시료의 올리고머 및 핵산 분자의 농도를 포함할 수 있다. 바람직하게, 하이브리드화는 적어도 1 밀리몰 마그네슘 이온의 존재하에 및 6.0 이상의 pH에서 수행한다. 일부 실시형태에서는, 하이브리드화 전에 단일 가닥의 시료중에 핵산 분자를 만들도록 시료를 처리할 필요가 있거나 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 처리의 예들은, 이들로 제한되지 않지만, 염에 의한 처리 (바림직하게는 이어서 중화), 고온에서 인큐베이션 및 뉴클레아제에 의한 처리를 포함한다.
그 외에, 핵산으로 하이브리드화의 염 의존성은 하이브리드화 올리고뉴클레오티드 유사체의 골격의 전하 밀도에 의해 주로 결정되기 때문에, 본 발명의 HypNA-pPNA 올리고머 또는 SerNA-pPNA 올리고머 중에 pPNA m 단량체의 비를 증가시키면 하이브리드화의 염 의존성을 증가시킬 수 있다. 이것은 일부 양상에서 염 조건을 변화시켜 하이브리드화의 엄중함을 증가시키거나 또는 염 농도를 감소시켜 하이브리드화 핵산을 방출할 수 있는 것이 바람직할 수 있는 본 발명의 방법에서 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양상에서는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체를 매우 낮은 염중 핵산에 고친화성 결합을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우에, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체에서 HypNA 대 pPNA 단량체 1:1 근사한 비를 유지하는 것이 유리하다.
표적 핵산 분자에 결합하는데 본 발명의 올리고머의 고도의 특이성은 하나 이상의 올리고머의 적어도 일부에 완전히 상보적인 서열의 스트레치를 포함하는 핵산서열과 실질적으로 상보적인 서열 내에 소수의 비상보적인 염기를 포함하는 서열의 스트레치를 포함하는 표적 핵산 분자 사이의 구별을 보조하는 하이브리드화 조건을 의사게 선택할 수 있게 한다. 예를 들면, 서열의 스트레치를 따라 완전히 상보적인 표적 핵산 분자와 본 발명의 올리고머 사이에 안정한 하이브리드를 허용하지만, 상보적인 핵산의 스트레치를 따라 하나 또는 두 개의 염기 미스매치를 포함하는 것들을 포함하여, 완전히 상보적이지 않은 표적 핵산 분자와 본 발명의 올리고머 사이의 하이브리드의 해리를 촉진하는 하이브리드화 또는 세척 온도가 선택될 수 있다. 하이브리드화 및 세척의 온도의 선택은 적어도 부분적으로는 다른 조건들, 예를 들면 염 농도, 올리고머 및 표적 핵산 분자의 농도, 올리고머 대 표적 핵산 분자의 상대 비율, 하이브리드화 대상의 올리고머의 길이, 올리고머 및 표적 핵산 분자의 염기 조성, 올리고머 유사체 분자의 단량체 조성 등에 따라 달라질 수 있다. 그 외에, 완전히 상보적인 분자들의 안정한 하이브리드를 유리하게 하고 Ehg한 하나 이상의 염기에 의해 미스매치 되는 표적 핵산 분자들과 올리고머 사이에 안정한 하이브리드를 불리하게 하는 조건들을 선택하는 경우, 추가적인 조건들이 고려될 수 있고, 바람직하게는, 변화될 수 있으며, 예를 들면, 이들로 제한되지 않지만, 하이브리드화 대상의 올리고뉴클레오티드 유사체의 길이, 올리고머와 표적 핵산 분자 사이의 상보성의 스트레치 길이, 상보성 서열의 스트레치 내에 비상보적인 염기의 수, 미스매치 염기의 동일성, 미스매치 염기 부근의 염기의 동일성, 및 상보성의 스트레치를 따라 미스매치 염기의 상대위치가 변할 수 있다. 핵산 하이브리드화의 분야의 기술자들은 특별한 적용용도에 따라 표적 핵산 분자들에 하이브리드화를 위한 본 발명의 올리고머를 사용하는 유리한 하이브리드화 및 세척 조건을 결정할 수 있을 것이다. "유리한 조건들"은 하나 이상의 미스매치를 포함하는 것들을 포함하여, 적어도 부분적으로 실질적으로 상보적인 표적 핵산 분자들과 올리고머 사이에 안정한 하이브리드를 유리하게 하는 것들일 수 있다.
"유리한 조건들"은 적어도 부분적으로 완전히 상보적인 안정한 하이브리드를 유리하게 하거나 또는 완전히 상보적이지 않은 분자들 사이의 하이브리드를 불리하게 하거나 불안정하게 하는 것들일 수 있다.
본 명세서에 기술된 것들과 같은 방법들을 사용하여, 상이한 서열들의 표적 핵산 분자들로 하이브리드화 되는 본 발명의 올리고머의 용융 온도는 결정할 수 있으며 또한 소정의 적용 용도에 유리한 조건들을 결정하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체에 부착되는 올리고머로 표적 핵산 분자들을 하이브리드화 한 다음 하이브리드화 된 복합물을 검출함으로써 유리한 하이브리드화 조건들을 경험적으로 결정할 수 있다.
본 발명의 고체 지지체 또는 올리고머 프로브에 결합되는 표적 핵산 분자들은 고체 지지체의 직접 또는 간접 부착에 의해 조사 집단의 미결합 핵산 분자들로부터 편리하게 효과적으로 분리할 수 있다. 고체 지지체는 매우 엄중합으로 세척하여 올리고머 프로브에 결합되지 않은 핵산 분자들을 제거할 수 있다. 그러나 고체 지지체에 올리고머 프로브의 부착은 본 발명의 필수요건이 아니다. 예를 들면, 일부 적용용도에서 결합 및 미결합 핵산 분자들은 매트릭스를 통한 원심분리에 의해 또는 상분리에 의해 또는 일부는 올리고머 프로브 내에 도입되는 화학적기들에 의해 임의로 보조되는 다른 형태의 분리 (예를 들면, 시차 침전)에 의해 분리할 수 있다 (참조, 예를 들면 2000년 5월 9일 허여된 미국특허 제6,060,242호, Nie et al).
예시적 실시형태에서, 본 발명의 고체 지지체는 공동 소유의 계류중인 미국특허출원 제13/399,872호에 기술된 것들과 같은 실시간 PCR 검정에서 사용된다.
본 발명의 다른 방법에서, 본 발명은 지지체에 결합된 프로브를 갖는 고체 지지체를 제조하는 방법으로서, (본 명세서에서 상술한 바와 같은) 고체 지지체의 외부 표면에 공유결합된 아지드 또는 알킨 모이어티를 포함하는 고체 지지체를 본 명세서에 기술된 바와 같은 A, B 및 C 서브유닛을 포함하는 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 상기 고체 지지체 및 상기 중합체와 Cu(I) 촉매를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시형태는 아민 작용기를 갖는 프로브 분자를 여기에 결합된 중합체를 함유하는 고체 지지체와 접촉시켜 여기에 결합된 프로브 분자를 포함하는 고체 지지체를 제조하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 DNA 마이크로 검정 등의 제조와 같은 임의 수의 적용에서 유용성을 갖는다.
본 명세서에서 인용되는 미국특허, 미국특허출원 공개, 미국특허출원, 외국 특허, 외국특허 출원 및 비특허 문헌은 모두 본 명세서와 불일치하지 않을 정도로 그의 전문이 본 출원에서 참고로 포함된다.
전술한 설명으로부터, 본 발명의 구체적 실시형태들이 예시 목적으로 본 명세서에 기술되었지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서 본 발명은 첨부된 특허청구범위 외에 제한되지 않는다.
다음의 실시예들는 예시목적으로 제공되며, 제한되는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
BOC-NH-PEG57-아세트-(4-아지드)아닐리드의 합성
4-아지도아닐린 하이드로클로라이드 (51 mg, 300μmol, Sigma-Aldrich)을 물(10 mL) 및 1N NaOH (10 mL)중에 용해한 다음, EtOAc (3 x 20 mL)로 추출하였다. 유기상을 물로 세척한 다음, 포화 NaCl로 세척한 다음, Na2S04로 건조시켰다. 증발은 호박유로서 아지도아닐린의 유리 염기를 생성하였다. 글라스 제품은 완전히 호일에 싸서 실내 조명에 노출을 최소하였다. 별개의 플라스크 (오븐 건조)속에 건조 DMF (250μL) 및 TEA (27 μL, 200μmol)과 함께 Boc-아미노-PEG57-아세트산 NHS 에스테르, 평균 MW 2800 (280 mg, 100μmol, Laysan Bio, Arab, AL)을 넣었다. 여기에 소량의 DMF중 아지도아닐린을 첨가하였다. 플라스크를 Ar로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 호일로 커버링하고, 하룻밤 흔들었다. TLC (DCM/MeOH/TEA, 80:20:1)에 의해, 단일 UV-활성 생성물은 미반응 아지도아닐린 (Rf=0.88)과 함께 관찰되었다 (Rf=0.25). 반응 혼합물은 EtOAc (5 mL)로 희석하고 생성물은 와동하는 헥산에 적가하면서 침전시키고 냉동기에 -20C에서 하룻밤 방치하였다. 침전물은 글래스 프릿으로 수집하고, 핵산으로 세척한 다음, EtOAc중에 재용해하고 이전과 같이 재침전시켰다. 수집 후에, 생성물은 MeOH로부터 일정 중량 (189 mg, 65%)으로 재건조하였다. 베이지색 흡습 고체를 밀봉하고 사용시까지 어두운 곳에 저장하였다. 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 9.36 (s, 1H), 7.69 (d, 2H), 7.08 (d, 2H), 6.62 (dd, 1H), 4.07 (s, 2H), 3.4-3.6 (m, 230H), 2.91 (dd, 2H), 1.37 (s, 9H); 13C-NMR δ: 172.24, 172.17, 168.80, 156.11, 136.19, 134.73, 121.71, 119.91, 73.18, 51.87, 40.08, 28.78.
실시예 2
BOC-NH-PEG44-아세트-(4-아지도)아닐리드의 합성
4-아지도아닐린 하이드로클로라이드 (100 mg, 600 μmol, Sigma- Aldrich)을 물 (20 mL) 및 1N NaOH (20 mL)중에 용해한 다음, EtOAc (3 x 40 mL)로 추출하였다. 추출물을 상기와 같이 핸들링하여 유리 염기를 생성시켰다. 별개의 플라스크 (오븐 건조)속에 건조 DMF (1000μL) 및 TEA (55 μL, 400μmol)과 함께 Boc-아미노-PEG44-아세트산 NHS 에스테르, 평균 MW 2000 (400 mg, 200μmol, Laysan Bio, Arab, AL)을 넣었다. 여기에 소량의 DMF중 아지도아닐린을 첨가하였다. 플라스크를 Ar로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 호일로 커버링하고, 하룻밤 흔들었다. TLC (DCM/MeOH/TEA, 80:20:1)에 의해, 단일 UV-활성 생성물은 미반응 아지도아닐린 (Rf=0.88)과 함께 관찰되었다 (Rf=0.38). 반응 혼합물은 EtOAc (10 mL)로 희석하고 생성물은 와동하는 펜탄에 적가하여 침전시키고 냉동기에 -20C에서 하룻밤 방치하였다. 침전물은 글래스 프릿으로 수집하고, 핵산으로 세척한 다음, EtOAc중에 재용해하고 이전과 같이 재침전시켰다. 수집 후에, 생성물은 MeOH로부터 일정 중량 (272 mg, 65%)으로 재건조하였다. 베이지색 흡습 고체를 밀봉하고 사용시까지 어두운 곳에 저장하였다. 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 9.69 (s, 1H), 7.69 (d, 2H), 7.08 (d, 2H), 6.74 (dd, 1H), 4.07 (s, 2H), 3.53 (s, 2H), 3.46-3.52 (m, 178H), 3.05 (dd, 2H), 1.37 (s, 9H).
실시예 3
N-(4-아지도벤조일)폴리알릴아민의 합성
Sugawara et al., Macromolecules 27, 7809-14, (1994)로부터 절차를 조정하였다. 물 (42 mL)중 KHC03 (0.28 g, 2.8 mmol)의 용액을 제조하였다. 여기에 폴리알릴아민 하이드로클로라이드, MW 120-200K (Alfa Aesar, 0.69 g, ~9.4 mmol 아민), 4-아지도벤조산 (TCI, 0.38 g, 2.8 mmol), 및 DMF (14 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 얼음욕에 냉각하였다. 이어서 DMF (1 mL)과 물 (0.5 mL)의 혼합물 중에 EDC (0.59 g, 3.1 mmol)의 용액을 서서히 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하고, 주위 광으로부터 차폐하였다. 하룻밤, 용액의 pH는 6.7이었다. 용액은 큰 투석관(Snakeskin MWCO 7000, Pierce)에 옮기고 물(14L)속에서 24 시간 동안 투석하였다. 물은 총투석시간 72시간 동안 2번 변하였다. 투석물은 미량원심기 튜브속에 냉동하고 동결건조(Speedvac)하여 0.70 g의 아지도벤조일 중합체를 생성하였다. 1H-NMR (D20) δ: 7.87 (s, 2H), 7.03 (d, 2H), 3.01 (br s, 8.8H), 1.96 (br s, 4.4H), 1.48 (br s, 4.4H). 방향족 대 지방족 (중합체 골격) 양성자의 비율을 기준으로, 아지도벤조일 치환은 4.4 아민당 ~1, 또는 23%이였다.
실시예 4
글래스 슬라이드의 표면 전처리
유리 현미경 슬라이드 (1" x 3" x 1 mm)을 SDS의 0.5 중량% 용액을 함유하는 유리 염색 병(jar)에서 20분 동안 초음파 처리하고, DI수로 완전하게 헹구었다. 다음에 이들을 1 :1 :5 v/v 비의 29% NH4OH, 30% H202, 및 DI 수의 혼합물 중에 20분 동안 초음파 처리한 다음, DI 수로 철저하게 헹구었다. 이어서 슬라이드를 1:1:6 v/v 비의 38% HCl. 30% H2O2, 및 DI 수의 혼합물 중에 20분 동안 초음파 처리한 다음, DI 수로 철저하게 헹구었다. 전처리된 슬라이드를 뚜껑 달린 병속에 DI 수 중에 저장하였다. 사용 전에, 슬라이드를 그의 물 저장으로부터 제거하고, 아르곤으로 블로잉 건조하고 110℃에서 5분 동안 열처리하였다. 전처리된 유리 슬라이드는 물 접촉각 < 10o을 나타냈다.
실시예 5
3-아미노프로필 디이소프로필에톡시실란에 의한 유리 슬라이드의 실릴화
5개의 전처리된 유리 슬라이드는 나사 뚜껑 달린 폴리프로필렌 염색 튜브 속에 무수 EtOH (30 mL), 3-아미노프로필 디이소프로필에톡시실란(500 μL) 및 트리에틸아민(TEA, 20 L)의 혼합물 중에 침지하였다. 튜브를 오비탈 진탕기상에서 2-3 시간 동안 가볍게 와류시켰다. 슬라이드를 반응 혼합물로부터 제거하고, 풍부한 95% EtOH로 헹구고 아르곤으로 브로잉 건조하고 110℃ 오븐에서 5분 동안 어닐링하였다. 실릴화된 유리 슬라이드는 55.8o ± 1.8o의 물 접촉각을 나타냈으며, 이들은 제조 직후에 사용하였다.
실시예 6
하나 이상의 아지드 또는 알킨 서브유닛 및 N,N-디메틸아크릴아미드 및 펜타플루오로페닐아크릴레이트 서브유닛을 포함하는 중합체의 제조를 위한 일반적 절차
서브유닛들은 사용 전에 각각 58-60 ℃/3.5 mm Hg 및 42-43℃/5 torr에서 진공 증류에 의해 정제하였다. 글라스 앰플 중에 아지드 또는 알킨 함유 서브유닛들(원하는 중합체에 따른 몰비), DMA (991.3 mg, 10.0 mmol), PFPA (238.11 mg, 1.0 mmol), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴) (1.0 mg), 및 ACN (3.0 mL)을 함유하는 혼합물에, 초순수 아르곤을 1분 동안 버블링하였다. 이어서 앰플을 밀봉하고 55℃ 오일 욕에 22 시간 동안 넣었다. 밀봉을 파손하고 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 미량의 THF중에 용해시켰다. THF 용액을 일정하게 교반하면서 10배 용적의 n-펜탄에 적가하였다. 침전된 중합체를 원심분리하고, 상청액을 따라 버렸다. 중합체를 펜탄(40 mL)중에 분쇄하고 여과하고 40℃에서 진공 건조하였다.
이러한 일반적 절차는 알킨 또는 아지드 서브유닛, DMA 및 PFPA를 갖는 다양한 공중합체의 제조에 적용 가능하다. 서브유닛들의 비를 변화시켜 상이한 비의 중합체를 얻었다.
실시예 7
클릭 화학에 의해 고체 기판상에 중합체들의 표면 고정화를 위한 일반적 절차
실시예 6에 따라 제조된 중합체를 Cu(I) 함유 용액 중에 외부 표면상에 알킨 또는 아지드 모이어티 (중합체가 알킨 또는 아지드 잔기를 함유하는지 여부에 따라) 를 함유하는 고체 기판과 접촉시켰다. 용매 및 잔류 반응물을 예를 들면 세척에 의해 제거하여 트리아졸 모이어티를 통해 공유결합된 중합체를 포함하는 고체 지지체를 얻었다. 물 접촉각은 약 50o 내지 70o 범위이다.
중합체는 알킨 또는 아지드 작용기를 통해 고체 기판에 부착되기 때문에, 활성화된 에스테르는 직교 방식으로 포획 프로브에 접합에 이용가능하다.
실시예 8
활성화된 에스테르를 통해 고체 기판상에 중합체의 표면 고정화를 위한 일반적 절차
ACN (30 mL)를 함유하는 폴리프로필렌 슬라이드 오염 튜브 중에, 실시예 6에 기술된 바와 제조된 중합체 및 TEA (150 μL)을 첨가하였다. 이 용액에 4개의 아미노실릴화 현미경 유리 슬라이드를 침지하고 4-16 시간 동안 가볍게 텀블링하였다. 이들을 제거하고 풍부한 아세토니트릴로 헹구고 아르곤으로 블로잉 건조하였다. 물 접촉각은 약 50o 내지 70o 범위이다.
중합체는 할성화된 에스테르를 통해 고체 기판에 부착되기 때문에, 알킨 또는 아지드 작용기는 클릭 화학을 통해 포획 프로브에 접합에 이용 가능하다.
실시예 9
알킨 또는 아지드, N,N-디메틸아크릴아미드, 및 2-비닐-4,4'-디메틸아즈락톤 서브유닛을 포함하는 중합체의 제조
2-비닐-4,4'-디메틸아즈락톤 (VAL, Polysciences, Inc.)을 26-27℃/600 밀리토르에서 진공 증류에 의해 정제하였다. ACN (30 mL)중 재증류된 DMA (4.80 g, 48.5 mmol), VAL (0.74 g, 5.39 mmol), 알킨 또는 아지드 서브유닛(원하는 중합체에 따른 몰비) 및 AIBN (15.9 mg, 0.097 mmol)의 혼합물에, 수 냉각 콘덴서, 초순수 Ar에 연결된 20 cm 19-게이지 SS 채혈 침, 및 광물유 분류기에 연결된 벤팅 19 게이지 SS 니들이 장착된 150-mL 14/20 삼목 플라스크 속에 넣었다. 아르곤을 용액을 통해 20 분 동안 버블링시킨 다음 플라스크를 3-4 시간 동안 일정하게 교반하면서 71℃에서 오일욕에 침지하였다. 용매를 60℃에서 감압하에 제거하였다. 잔류물을 2-3 시간 동안 50℃에서 진공하에 건조시켜 플라스크 벽에 코팅된 글라스상 중합체를 얻었다. 다음에 중합체를 메틸에틸케톤(15 mL)중에 재용해하였다. 일정하게 교반하면서, 석유 에테르를 용액이 흐리게 변할 때까지 적가하였다. 다음에 이 흐린 현탁액을 격렬하게 교반하면서 과량의 석유 에테르(200 mL)에 적가하였다. 수득된 상등액을 버리고 잔류 중합체를 새로운 석유 에테르 (200 mL)중에 10분 동안 분쇄하였다. 침전된 중합체를 여과하고, 석유 에테르로 헹구고 진공 건조하였다. 상이한 비의 서브유닛을 함유하는 중합체를 단량체 서브유닛의 비를 조절하여 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 10
UV에 의한 용액으로부터 COC 슬라이드 상에 아지도벤조일-(10 MOL%)-폴리(알릴아민)의 그라프팅, 및 이후에 여기에 중합체의 표면 고정화
그라프팅 용액은 DI 수 (180 μL) 중 약 10몰% 4-아지도벤조일기를 함유하는 N-아지도벤조일-폴리(알릴아민) (4.0 mg)을 용해하여 제조하였다. COC 슬라이드 (1" x 3" x 1 mm)를 95% EtOH로 철저하게 헹구고 Ar로 블로잉 건조하였다. 건조 COC 슬라이드는 UV-그라프팅 전에 85o이상의 물 접촉각을 나타냈다. 일정 분량의 중합체 용액 (90 μL)을 COC 슬라이드의 중앙에 옮기고 펼쳐서 그의 상부에 Quartz 슬라이드(1" x 3" x 1 mm) 아래에 놓아서 전체 COC 슬라이드를 커버링 하였다. 총 2개의 시료를 UV 그라프팅을 위해 제조하였다. 샌드위치 어셈블리를 a 365 nm UV 광원 (BondWang, Electro-Lite Corp., 10 mW/cm2) 아래 5 cm에 놓고 15 분 동안 UV 조사에 노출시켰다. 샌드위치 어셈블리를 DI 수중에 침지하고 COC 슬라이드를 분리하고 DI 수로 잘 헹구었다. 다음에 슬라이드를 0.5 N HC1 (30 mL)중에 60 분 동안 텀블링하였다. 0.5 N HCl을 추가의 60분 텀플링 하면서 한번 교체하였다. 이어서 이들을 DI수로 헹구고 Ar로 블로잉 건조하였다. 접촉각은 31.7o ± 3.7o이었다.
폴리프로필렌 함유 튜브 중에 무수 아세토니트릴(30 mL)에 실시예 6에 따라 제조된 중합체 및 TEA (150 μL)를 첨가하였다. 2개의 세척 건조 UV-그라프팅 COC 슬라이드를 이 용액 중에 침지하고 4-16 시간 동안 가볍게 텀블링한 다음 아세토니트릴로 잘 헹구고 아르곤으로 블로잉 건조시켰다.
얻어진 표면 고정화 중합체는 클릭 화학을 통해 포획 프로브에 접합을 위해 이용가능한 알킨 또는 아지드 모이어티를 포함한다. 중합체는 유사한 절차를 이용하여 고체 기판에 고정화시키며, 여기서 표면은 아민보다는 아지드 또는 알킨을 포함한다.
이 절차는 COC 또는 COP 표면상에 후속 UV-그라프팅을 위해 광범위한 4-아지도벤조일 치환도를 갖는 다양한 아지도벤조일-폴리(알릴아민)조성물에 적용할 수 있다.
실시예 11
UV에 의한 BOC-아미노-PEG57-아세트-(4-아지도)아닐라이드의 건조필름의 그라프팅, 아미노기의 탈보호 및 대표적인 중합체의 후속 표면 고정화
그라프팅 용액은 DI 수 (200 μL) 중 Boc-아미노-PEG57-아세트-(4-아지도)아닐리드(20.1 mg)를 용해시켜 제조하였다. COC 슬라이드 (1" x 3" x 1 mm)를 95% EtOH로 철저하게 헹구고 Ar로 블로잉 건조하였다. 건조 COP 슬라이드는 UV-그라프팅 전에 90o이상의 물 접촉각을 나타냈다. 슬라이드의 한쪽을 열린 공기 중에 코로나 방전에 의해 처리하고, Corona Treater (Electro-Technic Products, Inc., Model BD-20)하에 0.5 cm 거리로 7번 슬라이드를 통과시켰다. 코로나 처리된 표면은 40.0o ± 1.9o의 물 접촉각을 나타냈다. 코로나 처리된 표면의 중앙에 일정 분량의 그라프팅 용액 (100 μL)을 넣고 펼쳐서 스테인레스 스틸 스파툴라로 전체 표면을 덮었다. 표면을 그라프팅 용액으로 균일하게 코팅하고 건조시켜 암실에서 하룻밤 주위 온도에서 증발 후에 엷은 필름을 형성시켰다. 건조 필름을 페이싱업하면서, 슬라이드를 365nm UV광원 (BondWang, Electro-Lite Corp., 10 mW/cm2) 5 cm 아래에 놓고 15 분 동안 UV 조사에 노출시켰다. UV-조사된 표면을 아세토니트릴로 잘 헹구고 아르곤으로 블로잉 건조시켜 57.1o ± 1.6o의 물 접촉각을 갖는 그라프팅된 표면을 생성시켰다. 그라프팅된 아미노기를 탈보호하기 위하여, 슬라이드를 MeOH 중 5% 트리플루오로아세트산 중에 침지하였다. 다음에 슬라이드를 풍부한 MeOH로 헹구고 Ar로 블로일 건조시켜 61.9o ± 3.7o의 물 접촉각을 갖는 아민 표면을 생성시켰다.
다음에 슬라이드를 ACN (30 mL)중에 TEA (150 μL) 및 실시예 6에 따라 제조된 중합체를 포함하는 용액 중에 침지하였다. 슬라이드를 60 분 동안 텀블링하고, 풍부한 아세토니트릴로 헹구고 아르곤으로 블로일 건조시켜 53o ± 70o의 물 접촉각을 갖는 표면를 제공하였다.
수득된 표면 고정화 중합체는 클릭 화학을 통해 포획 프로브에 접착을 위해 이용가능한 알킨 또는 아지드 모이어티를 포함한다. 중합체들을 고정화시켜 유사한 ㅈ절차를 사용하여 고체 기판에 고정화시키고 여기서 상기 표면은 아민보다는 아지드 또는 알킨을 포함한다.
실시예 12
10OÅ Si02 SPU 스퍼터링 표면의 아미노실릴화 및 대표적 중합체의 후속 고정화
COC 또는 COP 슬라이드의 한면을 플라즈마 에팅으로 처리하고 이어서 80℃에 구개로 Si02 스퍼터링(Hionix, Inc., San Jose, CA)으로 처리하였다. 침착된 Si02의평균 두께는 lOOÅ이었고 물 접촉각은 10o미만이었다. 실리카 스퍼터링 COC 및 COP 슬라이드를 무수 EtOH (30 mL)중 3-아미노프로필 디이소프로필에톡시실란 (250 μL) 및 TEA (20 μL)의 용액 중에 침지하였다. 슬라이드를 2 시간 동안 가볍게 텀플링 하고 EtOH로 잘 헹구고 아르곤으로 블로잉 건조시켜 COC 및 COP 슬라이드를 위해 각각 58.2o ± 1.4o 및 55.9o ± 2.4o의 물 접촉각을 제공하였다.
아미노실릴화된 COC 또는 COP 슬라이드를 트리에틸아민(150 μL) 함유 아세토니트릴 (30 mL) 중에 개별적으로 침지하였다. 침지된 COC 또는 COP 슬라이드에, 실시예 6에 따라 제조된 중합체를 첨가하였다 (COC의 경우 28.6 mg 또는 COP의 경우 23.7 mg). COC 또는 COP 슬라이드를 하룻밤 텀플링한 다음, 풍부한 아세토니트릴로 헹구고 아르곤으로 블로잉 건조시켰다. 물 접촉각을 측정하였다.
실시예 13
가교결합제 없이 COC 표면 상의 대표적인 중합체의 UV 개시된 계면 중합
N,N-디메틸아크릴아미드 (DMA), 펜타플루오로페닐 아크릴레이트 (PFPA) 및 알킨 또는 아지드 함유 서브유닛을 전술한 바와 같이 진공 증류에 의해 정제하였다. 단량체의 용액을 아세토니트릴 (1.0 mL) 중 DMA (800 mg, 8.07 mmol), PFPA (68.0 mg, 0.286 mmol), 아지드 또는 알킨 서브유닛(원하는 중합체 조성에 따라 변화된 몰비) 및 벤조페논(31.8 mg, 0.175 mmol)을 용해시켜 제조하였다. 일정 분량의 단량체 용액 (150 μL)을 COC슬라이드의 중앙에 놓은 다음 펼쳐서 그의 상부에 PTFE 슬라이드 (1" x 3" x 1 mm)를 내려 놓아 전체 COC 슬라이드를 커버링 하였다. 다음에 샌드위치 어셈블리를 365 nm UV 광원 (BondWang, Electro-Lite Corp., 10 mW/cm2) 5 cm 아래에 놓고 15 분 동안 UV 조사에 노출시켰다. 다음에 PTFE 슬라이드를 벗기고 COC슬라이드를 아세토니트릴로 철저하게 헹군 다음 아르곤으로 블로잉 건조시켜 50o 또는 70o의 물접촉각을 갖는 그라프팅 표면을 제공하였다. 이 절차는 다양한 단량체 몰비를 갖는 DMA 및 PFPA의 그라프팅 공중합체의 제조에 일반적으로 적용가능하다.
실시예 14
가교결합제에 의한 COC 표면상에 대표적인 중합체의 UV 개시된 계면 중합
실시예 13의 일반적 절차가 적용된다. 단량체 용액은 ACN (10.0 mL)중에 DMA (794.4 mg, 8.01 mmol), PFPA (668 mg, 0.281 mmol), 메틸렌-비스-아크릴아미드 (MBA, 40.0 mg, 0.259 mmol), 알킨 또는 아지드 단량체 (원하는 중합체에 따른 몰비) 및 벤조페논(32.0 mg, 0.176 mmol)을 용해시켜 제조한다. 일정 분량의 단량체 용액 (50 μL)을 COC슬라이드의 중앙에 적용시킨 다음 펼쳐서 상술한 바와 같이 PTFE를 내려놓아 전체 COC 슬라이드를 커버링한다. 샌드위치 어셈블리를 도치시켜 UV(상기와 같음)로 조사하였다. 절차는 일반적으로 다른 중합체에 대해 적용가능하다.
실시예 15
올리고뉴클레오티드 어레이 및 장치의 제조
50 mM 인산 나트륨(pH 8.5)중 20 μM 아민-변형 올리고뉴클레오티드의 스포팅 용액을 384-웰 플레이트에서 제조한다. 이어서 올리고를 원하는 스폿 크기을 위해 선택된 적절한 스포팅 핀으로, 어레이 스포터 (Array-it SpotBot3)에 의해 원하는 형상으로 상기와 같이 제조된 고체 지지체 (이중 접합을 위해 이용가능한 활성화된 에스테르를 포함함)상이 스폿팅하였다. 두 개의 어레이를 슬라이드 길이의 포인트 1/4 및 3/4에서 슬라이드마다 스포팅하고, 슬라이드 폭에 대하여 중심에 있게 하였다. 스폿팅 이후에, 슬라이드를 75% 습도에서 4-18시간 동안 인큐베이팅 한 다음 DI 수의 스트림으로 헹구고 아르곤으로 블로잉 건조시켰다.
아지드 또는 알킨 작용기를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 스폿팅은 접합에 이용 가능한 아지드 또는 알킨을 포함하는 고체 지지체를 사용하는 것을 제외하고는 유사한 방식으로 수행하고, 스폿팅은 적절한 클릭 조건하에 (예를 들면 Cu(I)중에) 수행하였다.
건조 후에, 슬라이드를 반으로 절단하여 각각 중심에 있는 스포팅 된 어레이로 두개의 1" x 1.5" 칩을 생성시켰다. 작은 단일 챔버 장치는 조립하고 여기서 스폿팅 된 슬라이드를 하부를 형성하였다. 적절한 치수의 프리-컷-더블-사이드 PSA 가스켓은 슬라이드 상에 놓고, 그 주위에 고정 치수의 대략 둥근 영역과 함께 노출된 어레이 스폿팅된 부분을 남겼다. 이 가스켓의 상부에, 두개의 프리-드릴링 충진 포트를 갖는 폴리카르보네이트 뚜껑을 놓았다. 얻어진 어셈블리를 열 사이클링 중에 적절한 접착을 보장하기 위하여 실온에서 적층하였다.
프라이머와 프로브 믹스, 효소 및 표적 DNA를 포함하는 다중 PCR 용액을 튜브 속에 예비 혼합한 다음 상술한 챔버에 첨가하였다. 대표적인 반응 챔버 용적은 25-40 μL이다. PCR 반응 용액의 첨가 후에, 칩의 폴리카르보네이트 뚜껑 속의 포트 중의 포트를 광학적으로 깨끗한 필름으로 밀봉하였다.
PCR반응용액으로 충진된 장치는 커스톰 열 사이클링 장치로 시험하고, 이것은 열 사이클링 과정 중에 낙사 형광 현미경을 통해 디지탈 카메로로 표면을 영상화시킨다. 절단된 형광 DNA 플랩 (및 전체 프로브)의 대표적인 하이브리드화 시간은 그들의 하이브리드화 온도(Tm) 이하로 냉각하였을 때 2 분 미만이다. 표면은 포획 프로브 어레이에 하이브리드화 하는 절단된 플뱁 (또는 전체 프로브)의 형광강도를 측정하는 것을 특징으로 한다. 이러한 방식으로, 표면 안정성은 대표적인 열 사이클링 중에 완충액으로 측정한다. 이 장치에서 PCR는 또한 원하는 시간 동안 95℃에서 활성화, 95℃ 내지 60℃에서 열 사이클링의 40 사이클, 95℃에서 15초 체류 시간, 60℃에서 60 초 체류시간을 포함하는 시험으로 수행하였다. 특정의 선택된 사이클에서 챔버는 프로브의 Tm 이하로 칠링하고, 60℃ 연장 단계 이후에 하이브리드화를 하였다.
자동화 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 배열된 스폿을 찾아내고 픽셀 강도를 측정하여 신호를 정량화하였다. 실제 스폿 영역 외측의 평균 픽셀 강도는 스폿 내측의 평균픽셀 강도로 감산하여, 스폿 영역의 배경 감산된 픽셀을 생성시켰다. 이들 강도는 포착 프로브에 특이적인 절단된 DNA 플랩의 검출을 위해 열 사이클링 과정에서 모니터링하였다.
본 명세서 및/또는 첨부된 출원 데이터 시트에서 인용되는 미국특허, 미국특허출원 공개, 미국특허출원, 외국 특허, 외국특허 출원 및 비특허 문헌은 모두 본 명세서와 불일치하지 않을 정도로 2012년 10월 12일자 출원된 미국특허출원 제61/713,329호를 포함하여, 그의 전문이 본 출원에서 참고로 포함된다.
전술한 설명으로부터, 본 발명의 구체적 실시형태들이 예시 목적으로 본 명세서에 기술되었지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서 본 발명은 첨부된 특허청구범위 외에 제한되지 않는다.

Claims (168)

  1. 고체 기판의 외부 표면에 고정화된 중합체를 포함하며, 상기 중합체는 B, D 및 E 서브유닛을 포함하며, 여기서
    상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 친수성 작용기를 포함하고;
    상기 D 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브에 대한 공유접합에 특이적인 반응성을 갖는 반응기를 포함하거나 또는 상기 D 서브유닛은 포획 프로브에 대한 공유 결합을 포함하며; 또한
    상기 E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 2 개의 상보적인 클릭 작용기의 반응 생성물을 포함하며, 상기 반응 생성물은 상기 고체 기판의 외부표면에 대한 공유결합 또는 상기 E 서브유닛과 상기 고체 기판의 외부 표면 사이에 배치된 임의 선택적 링커(L4)에 대한 공유 결합을 포함하는 것인
    고체 지지체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중합체가 하기 구조식(VI)를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00111

    상기 식에서,
    T3 및 T4는 각각 독립적으로 부재하거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단기이고;
    q, r 및 s는 각각 독립적으로 1 내지 350,000의 정수이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 생성물이 상보적 클릭 반응성 기와 알킨, 아민, 알킬실릴-보호된 알킨, 아지드, 니트릴, 티올, 알켄, 말레이미드, 에폭시드, 아지리딘 또는 티이란 작용기의 반응에 의해 형성될 수 있는 것인 고체 지지체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 E 서브유닛은 중합체내의 말단 위치에 있는 것인 고체 지지체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식(VI)을 갖는 것인 고체 지지체:
    Figure pct00112

    상기식에서,
    L1은 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    RP는 반응생성물이고;
    L4는 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고; 또한
    Q는 고체 지지체의 외부 표면을 나타낸다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 (VII)를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00113

    상기 식에서,
    L1은 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    RP는 반응 생성물이고;
    L4은 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    R2는 H 또는 알킬이고;
    Q는 고체 지지체의 외부 표면을 나타낸다.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, L1은 알킬렌, 에스테르, 에테르, 또는 디티오 잔기, 또는 그의 조합을 포함하는 고체 지지체.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, L1은 존재하지 않는 것인 고체 지지체.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, α가 1인 고체 지지체.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 H인 고체 지지체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L4는 실리콘-산소 결합, 알킬렌 사슬, 중합체 또는 이의 조합을 포함하는 고체 지지체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌글리콜인 고체 지지체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 1 내지 50,000개의 단량체 서브유닛을 포함하는 고체 지지체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 55 내지 90개의 단량체 서브유닛을 포함하는 고체 지지체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, L4는 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00114
    또는
    Figure pct00115

    상기식에서,
    L5 및 L6는 각각 독립적으로 알킬렌, 알킬렌 옥사이드, 이미드, 에테르, 에스테르 또는 아미드 잔기, 또는 이의 조합을 포함하는 임의 선택적 링커이고;
    R24 및 R25는 각각 독립적으로 H, 하이드록실, 알킬, 알콕시 또는 -OQ이고, 여기서 Q는 고체 지지체의 외부 표면이고;
    R26, R27, R28 및 R29는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로, 니트릴, 니트로 또는 암모늄이고;
    P는 중합체 서브유닛을 나타내고;
    A는 직접 결합 또는 -S(0)2-이고;
    γ는 1 내지 2000 범위의 정수이고,
    여기서 L4는 말단 질소 또는 산소 원자를 통해 고체 기판에 결합된다.
  16. 제15항에 있어서, P는 -CH2- 또는 -OCH2CH2-인 고체 지지체.
  17. 제15항에 있어서, L4는 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00116
    또는
    Figure pct00117
  18. 제17항에 있어서, γ는 1 내지 90 범위인 고체 지지체.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L4는 존재하지 않는 것인 고체 지지체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 생성물이 트리아졸인 고체 지지체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00118

    Figure pct00119

    Figure pct00120
    또는
    Figure pct00121

    상기식에서,
    β 및 χ는 각각 독립적으로 1 내지 5 범위의 정수이고;
    L4는 임의 선택적 링커이고;
    Q는 고체 기판을 나타낸다.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 E 서브유닛이 말단 위치에서 T4에 공유결합되어 있는 것인 고체 지지체.
  23. 제22항에 있어서, T4는 H인 고체 지지체.
  24. 제21항에 있어서, L4는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 반복단위를 포함하는 고체 지지체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식(V)를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00122

    상기 식에서,
    R15는 친수성 작용기이고;
    R16은 수소 또는 알킬이고;
    L3는 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    ε은 0 내지 10 범위의 정수이다.
  26. 제25항에 있어서, L3은 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 잔기, 또는 그의 조합인 고체 지지체.
  27. 제25항에 있어서, L3는 존재하지 않는 것인 고체 지지체.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, ε이 1인 고체 지지체.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, R16은 H인 고체 지지체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, R15는 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00123

    Figure pct00124
    또는
    Figure pct00125

    상기 식에서,
    R17, R18, R19, R20, R21, R22 및 R23은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 하이드록실 알킬이고;
    φ는 1 내지 200 범위의 정수이다.
  31. 제30항에 있어서, R17, R18, R19, R20, R21, R22 및 R23은 각각 독립적으로 H 또는 메틸인 고체 지지체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 R15는 하기 구조식을 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00126
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00127
    또는
    Figure pct00128
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D 서브유닛이 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식(IV)를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00129

    상기 식에서,
    R4은 제2 반응성 기이고;
    R5는 수소 또는 알킬이고;
    L2는 길이가 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    δ는 0 내지 10 범위의 정수이다.
  35. 제34항에 있어서, L2는 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 잔기 또는 이의 조합인 고체 지지체.
  36. 제34항에 있어서, L2는 존재하지 않는 것인 고체 지지체.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, δ는 1인 고체 지지체.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, R5는 H인 고체 지지체.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브 내의 아민기와의 공유 결합 형성에 특이적인 반응성을 갖는 것인 고체 지지체.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 N-하이드록시숙신이미드(NHS)에스테르, N-하이드록시설포숙신이미드(설포-NHS)에스테르, 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트(SATA), 카르보디이미드, 하이드록시메틸 포스핀, 말레이미드, 아릴에스테르, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 프소랄렌, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아즈락톤 또는 벤조페논인 고체 지지체.
  41. 제40항에 있어서, 상기 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 NHS 에스테르, 아즈락톤 또는 아릴에스테르인 고체 지지체.
  42. 제41항에 있어서, 상기 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00130
    또는
    Figure pct00131

    상기 식에서,
    R6, R7, R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 알킬이고;
    R10, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 H, 전자 끄는 기, -NCS, -NCO, -C02H, -SO3H, -L'-폴리 또는 그의 염이고, 여기서 L'는 길이가 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이고 폴리는 수용성 중합체이다.
  43. 제42항에 있어서, R6, R7, R8 및 R9의 각각은 H인 고체 지지체.
  44. 제43항에 있어서, R10, R11, R12, R13 또는 R14 중 적어도 하나는 전자 끄는 기인 고체 지지체.
  45. 제44항에 있어서, R10, R11, R12, R13 또는 R14의 각각은 전자 끄는 기인 고체 지지체.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 전자 끄는 기는 할로겐, 니트로, 또는 니트릴인 고체 지지체.
  47. 제46항에 있어서, 상기 전자 끄는 기는 플루오로인 고체 지지체.
  48. 제47항에 있어서, 상기 제2 반응성 기는 하기 구조식을 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00132
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00133

    Figure pct00134
    또는
    Figure pct00135
  50. 제49항에 있어서, 상기 D 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00136
    또는
    Figure pct00137
  51. 제42항에 있어서, 폴리는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아미드, 폴리(디메틸아크릴아미드), 폴리(아크릴산), 폴리비닐알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리(메틸비닐에테르), 폴리(에틸비닐에테르), 폴리(N-비닐포름아미드), 폴리(N-비닐아세트아미드) 또는 폴리(N-메틸-N-비닐아세트아미드)인 고체 지지체.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D 서브유닛이 말단 위치에서 T2에 공유결합되어 있는 것인 고체 지지체.
  53. 제52항에 있어서, T2는 H인 고체 지지체.
  54. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D 서브유닛이 포획 프로브에 대한 공유결합을 포함하는 고체 지지체.
  55. 제54항에 있어서, 상기 D 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 (VIII)를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00138

    상기 식에서,
    M은 포획 프로브이고;
    R5는 수소 또는 알킬이고;
    L2는 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    δ는 0 내지 10 범위의 정수이다.
  56. 제55항에 있어서, L2는 알킬렌, 에스테르, 카르보닐, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드 에테르 또는 디티오 잔기, 또는 이의 조합을 포함하는 고체 지지체.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서,δ는 1인 고체 지지체.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, R5는 H인 고체 지지체.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 D 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식을 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00139
    또는
    Figure pct00140
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체의 표면은 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 지지체:
    Figure pct00141

    Figure pct00142

    Figure pct00143

    Figure pct00144

    Figure pct00145

    Figure pct00146

    Figure pct00147
    또는
    Figure pct00148

    상기 식에서,
    B, D 및 E 서브유닛은 중합체 내에 적어도 한번 존재하고;
    T3 및 T4는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단 기이고;
    q, r 및 s는 각각 독립적으로 1 내지 350,000의 정수이고;
    L4는 임의 선택적 링커이고;
    M은 포획 프로브를 나타내고;
    Q는 고체 지지체의 외부 표면을 나타낸다.
  61. 제60항에 있어서, L4는 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 고체 지지체.
  62. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브는 질소 원자를 통해 D 서브유닛에 공유결합되는 것인 고체 지지체.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브는 펩티드, 단백질, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드인 고체 지지체.
  64. 제63항에 있어서, 상기 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드인 고체 지지체.
  65. 제64항에 있어서, 상기 포획 프로브는 DNA인 고체 지지체.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 약 50°내지 90°범위의 물 접촉각을 갖는 고체 지지체.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 유기 중합체를 포함하는 고체 지지체.
  68. 제67항에 있어서, 상기 고체 기판이 폴리(스티렌), 폴리(카르보네이트), 폴리(에테르설폰), 폴리(케톤), 폴리(지방족 에테르), 폴리(아릴 에테르), 폴리(아미드) 폴리(이미드), 폴리(에스테르) 폴리(아크릴레이트), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(올레핀), 폴리(사이클릭 올레핀), 폴리(비닐 알코올) 또는 공중합체, 그의 할로겐화 유도체 또는 가교결합 유도체를 포함하는 고체 지지체.
  69. 제68항에 있어서, 상기 할로겐화 유도체는 할로겐화 폴리(아릴 에테르), 할로겐화 폴리(올레핀) 또는 할로겐화 폴리(사이클릭 올레핀)인 고체 지지체.
  70. 제68항에 있어서, 상기 고체 기판이 폴리(사이클릭 올레핀)을 포함하는 고체 지지체.
  71. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판이 옥사이드를 포함하는 것인 고체 지지체.
  72. 제71항에 있어서, 상기 고체 기판이 실리콘, 융합 실리카, 유리, 석영, 인듐-산화 주석, 이산화 티타늄, 산화 알루미늄 또는 이의 조합을 포함하는 고체 지지체.
  73. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판이 유기 중합체를 포함하고, 여기서 상기 고체 지지체가 여기에 결합된 옥사이드 층을 갖는 외부 표면을 포함하는 고체 지지체.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판이 실질적으로 광학적으로 투명한 것인 고체 지지체.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판이 약 400 nm 내지 약 800 nm로 실질적으로 광학적으로 투명한 것인 고체 지지체.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기판이 적어도 약 90% 광학적으로 투명한 것인 고체 지지체.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체가 별개 위치의 체계적 어레이를 포함하고, 각각의 별개 위치는 독립적으로 여기에 접합된 중합체의 적어도 하나를 포함하는 것인 고체 지지체.
  78. 제77항에 있어서, 각각의 별개 위치는 독립적으로 여기에 접합된 다수개의 중합체를 포함하는 것인 고체 지지체.
  79. 제77항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 별개 위치에서 적어도 하나의 중합체는 D 서브유닛을 통해 여기에 공유결합된 포획 프로브를 포함하는 것인 고체 지지체.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 별개 위치는 여기에 결합된 적어도 하나의 포획 프로브를 포함하고, 여기서 상기 포획 프로브는 다른 별개 위치의 각각에 결합된 적어도 하나의 포획 프로브와 구조적으로 구별되는 것인 고체 지지체.
  81. 제77항에 있어서, 각각의 별개 위치는 여기에 결합된 다수개의 구조적으로 별개의 분석물 분자들을 포함하는 것인 고체 지지체.
  82. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브는 펩티드, 단백질, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드인 고체 지지체.
  83. 제82항에 있어서, 상기 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드인 고체 지지체.
  84. 제83항에 있어서, 상기 포획 프로브는 DNA인 고체 지지체.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 DNA는 표적 폴리뉴클레오티드 또는 DNA의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인 고체 지지체.
  86. A, B 및 C 서브 유닛을 포함하며, 여기서
    상기 A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 고체 기판 상의 표적 작용기와의 공유 결합 반응에 특이적인 반응성을 갖는 제1 반응성 기를 포함하고;
    상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 친수성 작용기를 포함하고;
    상기 C 서브 유닛은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브에 대한 공유 접에 특이적인 반응성을 갖는 제2 반응기를 포함하고;
    여기서 상기 제1반응기 및 상기 제2반응기의 반응성은 서로 직교하는 것인
    중합체.
  87. 제86항에 있어서, 상기 중합체는 하기 구조식(I)를 갖는 것인 중합체.
    Figure pct00149

    상기 식에서,
    T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H, 알킬 및 개시제 잔기로부터 선택된 중합체 말단기이며,
    x, y 및 z는 독립적으로 1 내지 350,000의 정수이다.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 중합체가 중합체의 말단 위치에서 A 서브유닛을 포함하는 중합체.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 반응성 기가 각각의 경우에 독립적으로 클릭 반응성을 갖는 중합체.
  90. 제89항에 있어서, 상기 제1 반응성 기가 각각의 경우에 독립적으로 아지드와 반응을 위해 특이적인 중합체.
  91. 제90항에 있어서, 상기 제1 반응성 기가 각각의 경우에 독립적으로 알킨인 중합체.
  92. 제89항에 있어서, 상기 제1 반응성 기가 각각의 경우에 독립적으로 알킨과 반응을 위해 특이적인 중합체.
  93. 제92항에 있어서, 상기 제1 반응성 기가 각각의 경우에 독립적으로 아지드인 중합체.
  94. 제86항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A 서브유닛이 각각의 경우에 독립적으로 하기 화학식(II)를 갖는 중합체:
    Figure pct00150

    상기 식에서,
    R1은 제1 반응성 기이고;
    L1은 길이가 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이다.
  95. 제86항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 화학식(III)을 갖는 중합체:
    Figure pct00151

    상기 식에서,
    R1은 제1 반응성 기이고;
    R2는 수소 또는 알킬이고;
    L1은 길이가 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    α는 0 내지 10 범위의 정수이다.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, L1은 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 잔기, 또는 그의 조합을 포함하는 중합체.
  97. 제94항 또는 제95항에 있어서, L1은 존재하지 않는 것인 중합체.
  98. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, α는 1인 중합체.
  99. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 H인 중합체.
  100. 제94항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 알킬렌, 알킬실릴-보호된 알킨, 아지드, 니트릴, 티올, 알켄, 말레이미드, 에폭시드, 아지리딘 또는 티이란 작용기인 중합체.
  101. 제94항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 알킬렌 또는 아지드 작용기인 중합체.
  102. 제86항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 중합체:
    Figure pct00152

    Figure pct00153

    Figure pct00154

    Figure pct00155
    또는
    Figure pct00156

    상기 식에서,
    β 및 χ는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
  103. 제102항에 있어서, β는 1 또는 3인 중합체.
  104. 제102항에 있어서, χ는 1인 중합체.
  105. 제102항에 있어서, 상기 A 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중 하나를 갖는 중합체:
    Figure pct00157

    Figure pct00158

    Figure pct00159

    Figure pct00160
    또는
    Figure pct00161
  106. 제86항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 A 서브유닛은 말단 위치에서 T1에 공유결합되어 있는 것인 중합체.
  107. 제106항에 있어서, T1은 H인 중합체.
  108. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A 서브유닛이 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식을 갖는 중합체:
    Figure pct00162

    상기식에서,
    R3은 아릴이다.
  109. 제108항에 있어서, 상기 A 서브유닛이 하기 구조식을 갖는 중합체:
    Figure pct00163
  110. 제86항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식(IV)를 갖는 중합체:
    Figure pct00164

    상기 식에서,
    R4은 제2 반응성 기이고;
    R5는 수소 또는 알킬이고;
    L2는 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    δ는 0 내지 10 범위의 정수이다.
  111. 제110항에 있어서, L2는 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 잔기 또는 이의 조합인 중합체.
  112. 제110항에 있어서, L2는 존재하지 않는 중합체.
  113. 제110항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, δ는 1인 중합체.
  114. 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, R5는 H인 중합체.
  115. 제86항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 반응성 기의 반응성은 각각의 경우에 독립적으로 포획 프로브 내의 아민기에 특이적인 중합체.
  116. 제86항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 N-하이드록시숙신이미드(NHS)에스테르, N-하이드록시설포숙신이미드(설포-NHS)에스테르, 숙신이미딜 아세틸티오아세테이트(SATA), 카르보디이미드, 하이드록시메틸 포스핀, 말레이미드, 아릴에스테르, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 프소랄렌, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아즈락톤 또는 벤조페논인 중합체.
  117. 제116항에 있어서, 제2 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 NHS 에스테르, 아즈락톤 또는 아릴에스테르인 중합체.
  118. 제117항에 있어서, 제2 반응성 기는 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 중합체:
    Figure pct00165
    또는
    Figure pct00166

    상기 식에서,
    R6, R7, R8 및 R9는 각각 독립적으로 H 또는 알킬이고;
    R10, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 H, 전자 끄는 기, -NCS, -NCO, -C02H, -SO3H, -L'-폴리 또는 그의 염이고, 여기서 L'는 길이가 100개 원자까지의 임의 선택적 링커이고 폴리는 수용성 중합체이다.
  119. 제118항에 있어서, R6, R7, R8 및 R9의 각각을 H인 중합체.
  120. 제118항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, R10, R11, R12, R13 또는 R14 중 적어도 하나는 전자 끄는 기인 중합체.
  121. 제120항에 있어서, R10, R11, R12, R13 또는 R14의 각각은 전자 끄는 기인 중합체.
  122. 제118항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전자 끄는 기는 할로겐, 니트로, 또는 니트릴인 중합체.
  123. 제122항에 있어서, 상기 전자 끄는 기는 플루오로인 중합체.
  124. 제123항에 있어서, 상기 제2 반응성 기가 하기 구조식을 갖는 중합체:
    Figure pct00167
  125. 제86항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 중합체:
    Figure pct00168

    Figure pct00169
    또는
    Figure pct00170
  126. 제125항에 있어서, 상기 C 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 중합체.
    Figure pct00171
    또는
    Figure pct00172
  127. 제118항에 있어서, 폴리는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아미드, 폴리(디메틸아크릴아미드), 폴리(아크릴산), 폴리비닐알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리(메틸비닐에테르), 폴리(에틸비닐에테르), 폴리(N-비닐포름아미드), 폴리(N-비닐아세트아미드) 또는 폴리(N-메틸-N-비닐아세트아미드)인 중합체.
  128. 제86항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 C 서브유닛은 말단 위치에서 T2에 공유결합되어 있는 것인 중합체.
  129. 제128항에 있어서, T2는 H인 중합체.
  130. 제86항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식(V)를 갖는 중합체:
    Figure pct00173

    상기 식에서,
    R15는 친수성 작용기이고;
    R16은 수소 또는 알킬이고;
    L3는 길이가 100 원자까지의 임의 선택적 링커이고;
    ε은 0 내지 10 범위의 정수이다.
  131. 제130항에 있어서, L3은 알킬렌, 에스테르, 알킬렌 옥사이드, 아미드, 이미드, 에테르 또는 디티오 잔기, 또는 그의 조합인 중합체.
  132. 제130항에 있어서, L3는 존재하지 않는 중합체.
  133. 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, ε은 1인 중합체.
  134. 제130항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, R16은 H인 중합체.
  135. 제86항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 작용기가 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 중합체:
    Figure pct00174

    Figure pct00175
    또는
    Figure pct00176

    상기 식에서,
    R17, R18, R19, R20, R21, R22 및 R23은 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 하이드록실 알킬이고;
    φ는 1 내지 200 범위의 정수이다.
  136. 제135항에 있어서, R17, R18, R19, R20, R21, R22 및 R23은 각각 독립적으로 H 또는 메틸인 중합체.
  137. 제135항에 있어서, 상기 친수성 작용기는 하기 구조식을 갖는 중합체:
    Figure pct00177
  138. 제86항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 서브유닛은 각각의 경우에 독립적으로 하기 구조식 중의 하나를 갖는 중합체:
    Figure pct00178
    또는
    Figure pct00179
  139. 제86항에 있어서, 상기 중합체는 하기 구조식 중의 하나를 갖는 중합체:
    Figure pct00180

    Figure pct00181

    Figure pct00182

    Figure pct00183


    Figure pct00184

    Figure pct00185
    또는
    Figure pct00186

    상기 식에서,
    A, B 및 C 서브유닛은 중합체 내에 적어도 한번 존재하고;
    OPFP는 펜타플루오로펜옥시를 나타내고;
    T1 및 T2는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 또는 H 및 알킬로부터 선택된 중합체 말단기이고;
    x, y 및 z는 각각 독립적으로 1 내지 350,000의 정수이다.
  140. 제86항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 내의 서브유닛의 적어도 30%가 B 서브유닛인 중합체.
  141. 제86항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 내의 서브유닛의 적어도 75%가 B 서브유닛인 중합체.
  142. 제86항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 내의 서브유닛의 적어도 90%가 B 서브유닛인 중합체.
  143. 제86항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 내의 서브유닛의 적어도 95%가 B 서브유닛인 중합체.
  144. 제86항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 단지 하나의 A 서브유닛을 포함하는 중합체.
  145. 제144항에 있어서, 상기 A 서브유닛이 중합체의 말단부에 있는 것인 중합체.
  146. 제86항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 탄수화물인 중합체.
  147. 제146항에 있어서, 상기 포획 프로브는 폴리뉴클레오티드인 중합체.
  148. 제147항에 있어서, 상기 포획 프로브는 DNA인 중합체.
  149. 외부 표면을 포함하는 고체 기판으로서, 상기 고체 기판이 외부 표면에 공유 결합된 아지드 또는 알킨 잔기를 포함하는 고체 기판.
  150. 제149항에 있어서, 상기 고체 기판은 하기 구조식 중의 하나를 갖는 고체 기판:
    Figure pct00187
    또는
    Figure pct00188

    상기 식에서,
    Q는 고체 기판의 외부 표면을 나타내고;
    L4은 임의 선택적 링커이고;
    ι은 0 내지 10 범위의 정수이다.
  151. 제150항에 있어서, L4는 존재하지 않는 것인 고체 기판.
  152. 제150항에 있어서, L4는 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 고체 기판.
  153. 제149항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, ι은 1, 2 또는 3인 고체 기판.
  154. 포획 프로브가 지지체에 결합된 고체 지지체를 제조하는 방법에 있어서, 제149항 내지 제153항 중 어느 한 항의 고체 지지체를 제86항 내지 제148항 중 어느 한 항의 중합체와 접촉시켜 지지체에 결합된 중합체를 포함하는 고체 지지체를 얻는 것을 포함하는 방법.
  155. 제154항에 있어서, 제149항 내지 제153항 중 어느 한 항의 고체 지지체 및 제86항 내지 제148항 중 어느 한 항의 중합체와 Cu(I) 촉매를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  156. 제154항 또는 제155항에 있어서, 아민 작용기를 갖는 포획 프로브를 지지체에 결합된 중합체를 포함하는 고체 지지체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  157. 하기 a) 내지 c)를 포함하는 표적 분석물 분자의 존재 또는 부존재를 결정하는 방법:
    a) 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항의 고체 지지체를 제공하는 단계, 여기서 서브유닛은 여기에 공유결합된 포획 프로브를 포함함;
    b) 상기 고체 지지체에 분석물 프로브를 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 포획 프로브와 상기 분석물 프로브의 상호작용으로부터 생성된 신호의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계.
  158. 제157항에 있어서, 상기 고체 지지체가 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항의 고체 지지체인 방법.
  159. 제157항 또는 제158항에 있어서, 상기 포획 프로브가 폴리뉴클레오티드인 방법.
  160. 제157항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분석물 분자가 폴리뉴클레오티드인 방법.
  161. 제157항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호가 형광 신호인 방법.
  162. 제161항에 있어서, 상기 형광 신호가 포획 프로브와 상기 분석물 프로브의 특이적 하이브리드화의 결과로 생성되는 것인 방법.
  163. 제157항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물 프로브가 형광물질 또는 형광 소광물질인 방법.
  164. 하기 구조식(IX)를 갖는 화합물:
    Figure pct00189

    상기 식에서,
    X는 아지드 또는 알킨 잔기이고;
    L5 및 L6는 각각 독립적으로 알킬렌, 알킬렌 옥사이드, 이미드, 에테르, 에스테르 또는 아미드 잔기, 또는 그의 조합을 포함하는 임의 선택적 링커이고;
    R26, R27, R28 및 R29는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로, 니트릴, 니트로 또는 암모늄이고;
    P는 -(OCH2CH2)- 또는 -(CH2)-이고;
    A는 직접결합 또는 -S(0)2-이고;
    ι은 0 내지 10 범위의 정수이고;
    γ는 1 내지 2000 범위의 정수이다.
  165. 제164항에 있어서, R26, R27, R28 및 R29의 각각은 H인 화합물.
  166. 제164항 또는 제165항에 있어서, A가 직접결합인 화합물.
  167. 제164항에 있어서, 상기 화합물이 하기 구조식 중 하나를 갖는 화합물:
    Figure pct00190

    Figure pct00191

    Figure pct00192
    또는
    Figure pct00193
  168. 제167항에 있어서, γ는 1 내지 90 범위인 화합물.
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