CN108467889A - 一种用于多重pcr的荧光探针及其应用 - Google Patents

一种用于多重pcr的荧光探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于多重PCR的荧光探针及含其的试剂盒及用于多重PCR的检测方法和制备诊断试剂的用途。所述荧光探针至少其5’末端的第一个核苷酸被2’‑(2,4‑二硝基苯)基团修饰。本发明还公开了一种含有2,4‑二硝基苯基团的化合物在制备用于多重PCR反应的荧光探针中的应用。利用本发明荧光探针能够有效避免PCR扩增过程中现有探针的水解，从而更好应用于PCR后的温度梯度荧光检测；而且本发明荧光探针的Tm值能被灵活地调节，使得多重PCR熔解曲线的峰图设计更加方便。利用本发明荧光探针的检测方法或诊断试剂或试剂盒具有探针设计方便灵活、检测速度快、检测通量高的特点，可以更好地适用于感染性疾病的检测。

Description

一种用于多重PCR的荧光探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种荧光探针，尤其涉及一种用于多重PCR的荧光探针及含其的试剂盒及用于多重PCR的检测方法和制备诊断试剂的用途。
背景技术
PCR技术的发明与改进极大地促进了分子诊断技术的发展，对于大多数常见疾病均有采用PCR技术进行检测的报导。1992年问世的实时荧光定量PCR技术不仅可实时监测整个PCR过程中产物量的变化，而且避免了容易导致污染的PCR后处理操作，是当前应用最为广泛的分子生物学检测技术。很多时候，由于样本得来不易，临床上有对一份样本进行多重PCR，同时检测多个靶位点的要求，为了满足这一要求，科学工作者开发出多种不同颜色的荧光探针代替嵌入型荧光染料，使得同一样本可以通过不同的荧光通道检测不同的靶位点。但由于过于相近的荧光通道间会产生相互干扰，荧光通道的数量不能无限增加，使得实时荧光定量PCR的检测通量成为了一个技术瓶颈，通常无法同时检测5个及以上的靶位点，而荧光探针熔解曲线技术的出现很好地弥补了实时荧光定量PCR技术在多重靶序列识别方面的不足：荧光探针熔解曲线技术原理为通过荧光探针与不同PCR产物杂交时熔点温度的差异来识别不同的PCR模板序列，从而大幅度提高每个荧光检测通道的检测通量。
荧光探针熔解曲线技术属于后PCR检测技术，需要在完成PCR程序后添加一个温度梯度荧光的熔解曲线检测步骤，但是并不需要重新开管检测和更多人工操作。由于每条探针的Tm值各不相同，通过熔解曲线产生的熔解峰亦不相同，假设有N个荧光通道，每个荧光通道可以检测出M个不同Tm值的熔解峰，则一次反应可以检测的靶位点数为N×M，大大高于实时荧光的检测效率。由此可见，荧光探针熔解曲线的技术要点在于设计和调节各个探针的Tm值，探针间的Tm值相差过小，则两个峰相隔过近，难以区分；探针间的Tm值相差过大，则同一个通道下能检出的靶序列过少，检测通量降低。探针的Tm值与探针长度和GC含量有关，探针越长，GC含量越高，则探针Tm值越高。
由于常规的Taqman荧光探针在PCR过程中会被水解，无法应用于PCR后的温度梯度荧光检测，故通常在荧光探针熔解曲线技术中都是将荧光探针制作成分子信标探针的形式，以避免探针在扩增过程中被水解，继而可用于PCR之后的温度梯度荧光检测。但是分子信标探针有以下3个缺点：(1)不能完全避免扩增过程中探针水解；(2)探针特有的颈环结构可能在熔解峰之外再形成一个杂峰；(3)只能通过调节探针的长短和GC含量来调节探针的Tm，即对于序列已经确定的探针，是无法改变Tm值的。而在很多时候，出于对检测覆盖度、灵敏度、特异性和反应效率等多个方面的综合考虑，探针的序列已经被牢牢限制，难以增减或移动。在这种情况下，探索一种新的途径来改变探针的Tm值，显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的Taqman荧光探针不能直接用于PCR后的温度梯度荧光检测以及分子信标探针Tm值无法灵活调节使得荧光探针熔解曲线的峰相隔过近、难以区分等缺陷，提供一种用于多重PCR的荧光探针及含其的试剂盒及用于多重PCR的检测方法和制备诊断试剂的用途。本发明还提供一种含有2,4-二硝基苯基团的化合物在制备用于多重PCR反应的荧光探针中的应用。利用本发明荧光探针能够有效避免PCR扩增过程中现有探针的水解，从而更好应用于PCR后的温度梯度荧光检测；而且本发明荧光探针的Tm值能被灵活地调节，使得多重PCR熔解曲线的峰图设计更加方便。本发明优选将该荧光探针用于多重PCR的检测方法或制备诊断试剂或试剂盒，具有探针设计方便灵活、检测速度快、检测通量高的特点，可以更好地适用于呼吸道感染、血液感染、尿路感染、消化道感染等由多种病原体引起的交叉感染的感染性疾病检测。
本发明人在研究不同的基团标记对荧光探针的影响时，意外发现2’-(2,4-二硝基苯)基团的修饰可以保护荧光探针不被DNA聚合酶水解。然后进一步的研究发现，不同数目的2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰还具有改变探针Tm的功能，每增加1个2’-(2,4-二硝基苯)基团的修饰可以提高探针Tm值0.4～0.6℃。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种用于多重PCR反应的荧光探针，所述荧光探针至少其5’末端的第一个核苷酸被2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰，能够极大程度地保护探针在PCR扩增过程中不被DNA聚合酶水解，保护效果优于分子信标探针。其中，本发明所述的“修饰”是指核苷酸的糖基(核糖或脱氧核糖)部分被修饰，具体为核糖的2’位所连-OH基团上的H被2,4-二硝基苯基团所取代或脱氧核糖的2’位的H被2,4-二硝基苯基团所取代。
较佳地，所述荧光探针至少其5’末端的前三个核苷酸被2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰，能够使防水解的保护效果达到最大化。
根据本发明，更佳地，所述荧光探针为taqman荧光探针。所述荧光探针还包括特异性的核酸序列、修饰于所述核酸序列的荧光基团、和修饰于所述核酸序列的荧光淬灭基团；较佳地，所述核酸序列为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)；较佳地，所述荧光基团为FAM、CY5，该荧光基团通常位于所述核酸序列的5’或3’末端；较佳地，所述荧光淬灭基团为DABCYL、TAMRA，该荧光淬灭基团通常位于核酸序列的3’或5’末端，与上述荧光基团位置相反。
根据本发明，每增加1个所述2’-(2,4-二硝基苯)基团的修饰，所述荧光探针的Tm值提高0.4～0.6℃；较佳地，所述荧光探针被2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰的核苷酸数量不高于探针总核苷酸数的60％，超过这一临界点后2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰数目进一步增加，熔解曲线的效果会逐步变差；更佳地，所述修饰是从荧光探针的核苷酸的5’末端开始依次修饰。以平均每条探针20个核苷酸计算，在不降低熔解曲线效果的前提下，单条探针最佳可以进行1～12个2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰，因此，当探针的序列固定以后，仍可以通过2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰灵活地将其煺火温度提高0.4～7℃，这为多重PCR熔解峰图的设计提供了极大的便利。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种用于多重PCR的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于多重PCR反应的荧光探针，不同的荧光探针间利用2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰数目的不同，将探针间Tm差控制在7～10℃，这个温度差既有利于区分不同探针产生的熔解峰，又有利于同一通道下检测多个靶标；较佳地，所述试剂盒同常规PCR试剂盒，还包括至少一种反应液，所述反应液可以包括一对或多对引物、PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸和Taq DNA聚合酶。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种非疾病诊断目的的多重PCR检测方法，所述检测方法使用上述用于多重PCR反应的荧光探针、或者上述用于多重PCR的试剂盒，该检测方法包括常规PCR扩增和温度梯度荧光两个步骤；较佳地，所述常规PCR扩增还包括一对或多对引物、PCR反应缓冲液、模板、2’-脱氧核苷三磷酸和Taq DNA聚合酶；较佳地，所述温度梯度荧光的设置步骤是本领域常规的设置步骤。
本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：一种上述用于多重PCR反应的荧光探针在制备疾病诊断的试剂或试剂盒中的应用。较佳地，所述疾病为多种病原体引起的交叉感染的感染性疾病。更佳地，所述感染性疾病为呼吸道感染、消化道感染、血液感染和/或尿路感染等。更佳地，用于咳嗽等症状相似的呼吸道感染中病菌的检测和确定，可以为流感病毒例如甲型流感病毒和/或乙型流感病毒、肺炎链球菌、人类偏肺病毒、百日咳杆菌、结核杆菌、支原体和/或衣原体等感染等。
所述疾病诊断的试剂或试剂盒具有探针设计方便灵活、检测速度快、通量高的特点。
本发明解决上述技术问题的技术方案之五是：含有2,4-二硝基苯基团的化合物在制备用于多重PCR反应的荧光探针中的应用；较佳地，所述化合物为1-氟-2,4-二硝基苯。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：如上所述，为了更好地适用于PCR后的温度梯度荧光检测，本发明将荧光探针进行2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰，使其不仅可以避免PCR过程中被DNA聚合酶水解，保护效果优于分子信标探针；而且可以灵活地改变Tm值，从而对不同探针间Tm差进行自由地调节，使得多重PCR熔解曲线的峰图设计更加方便。本发明某一较佳实施例中显示，PCR过程中修饰后的探针防水解的效率可达98％以上；本发明另一较佳实施例中显示，本发明对固定序列的探针Tm改变幅度为0.4～7℃，可以降低以荧光熔解曲线法为基础的多重PCR诊断方法或相关诊断试剂或试剂盒的开发难度，具有探针设计方便灵活、检测速度快、检测通量高的特点，可以更好地适用于呼吸道感染、血液感染、尿路感染、消化道感染等可能由多种病原体引起的交叉感染的感染性疾病检测。
附图说明
图1为2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰核苷酸的示意图。
图2为不同数目2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰的探针所对应的熔解曲线图，其中A～F分别表示0个、1个、5个、9个、13个和17个2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰的探针。
图3为两条探针Tm值相隔较近时(探针13、探针14)，熔解曲线产生的峰图。
图4为两条探针Tm值相隔较远时(探针13、探针15)，熔解曲线产生的峰图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明下述实施例中，PCR反应所用酶、Buffer、dNTP均选用Thermo公司产品，引物、探针的合成和鉴定均由南京金斯瑞生物科技有限公司(江苏省南京市江宁科学园雍熙路28号)完成。其中，同诸多现有技术揭示的核苷酸糖基2’位的修饰或取代反应类似，探针反应原理见图1，具体是核苷酸与1-氟-2,4-二硝基苯反应，然后其核糖的2’位所连-OH基团上的H被2,4-二硝基苯基团所取代或脱氧核糖的2’位的H被2,4-二硝基苯基团所取代制得本发明探针。
实施例1检测2’-(2,4-二硝基苯)基团的修饰对探针在PCR过程中防水解效果的影响
合成引物探针，具体序列见表1。
表1 各引物和探针具体组成
名称 核苷酸组成
引物1 5’-GGTCCATCAAGCTCCAGTTTTG-3’
引物2 5’-GCAAGCTGTAAGAAGAATGCT-3’
探针1 5’-FAM-AGACCTATTGCTCTAAGCAA-BHQ1-3’
探针2 5’-FAM-A*GACCTATTGCTCTAAGCAA-BHQ1-3’
探针3 5’-FAM-A*G*ACCTATTGCTCTAAGCAA-BHQ1-3’
探针4 5’-FAM-A*G*A*CCTATTGCTCTAAGCAA-BHQ1-3’
探针5 5’-FAM-A*G*A*C*CTATTGCTCTAAGCAA-BHQ1-3’
探针6 5’-FAM-CCGGGAGACCTATTGCTCTAAGCAACCCGG-BHQ1-3’
引物1和引物2分别为大肠杆菌正向引物和反向引物，探针1为相应的Taqman探针。探针2～5的核苷酸序列与探针1完全相同，同时在探针1的基础上做了数目不等的2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰，具体为探针2、探针3、探针4、探针5分别在探针1的基础上做了1个、2个、3个、4个2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰；探针6在探针1的基础上增加了两端的回文结构(下划线部分)，制作成分子信标探针。其中表中的“*”表示2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰在位于其前面的核苷酸上，例如“A*”表示碱基A对应的核苷酸上有2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰。
PCR反应体系中除探针外，所有其他组分的配制均完全相同，在6个PCR反应孔中分别加入探针1～6，测试探针在反应过程中的水解情况。具体PCR扩增反应体系见表2(模板Gene ID:948466)，PCR反应条件为：95℃5分钟，之后(95℃10秒、65℃30秒)进行40循环反应。反应停止后，利用HPLC技术检测剩余探针量，通过测定探针分子量所对应的峰面积，来代表探针的量，通过对比PCR前后探针量，计算PCR后剩余探针的百分比，所有实验重复三次，具体结果见表3。HPLC具体反应条件为：采用ODS2反向C18色谱柱(规格为4×250mm，填料粒径为5μm)进行测定。流动相为4％甲醇和96％20mM/L三乙胺-磷酸缓冲液，流速为1.2mL/min，检测波长为260nm，柱温37℃，进样量10μL，测定时间15min。
表2 PCR扩增反应体系(如无特殊说明，以下均相同)
组分 体积(μL)
10×PCR Buffer 2.5
引物-F 0.5
引物-R 0.5
探针 0.5
dNTP 1
模板 1
Taq酶 0.2
水 18.8
总计 25
表3 PCR40个循环后，剩余探针量
表3显示，普通Taqman探针在PCR过程中几乎被完全水解(剩余14.3％)，分子信标探针可以在一定程度上避免扩增过程中的水解，但仍有超过20％的探针在PCR 40个循环扩增后被降解掉(剩余78.5％)；2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰可以很好地保护探针，5’末端第一个核苷酸的2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰即可使93.2％的探针在PCR反应后仍保持完整，而5’末端3个及以上核苷酸的2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰，可以使98％以上的探针在PCR反应后保持完整。2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰可以在PCR过程中很好地保护探针不被聚合酶水解，效果优于分子信标探针(P<0.01)。
实施例2检测2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰的探针产生的熔解峰
合成引物探针，具体序列见表4。
表4 各引物和探针具体组成
引物3和引物4分别为肺炎链球菌正向引物和反向引物，探针7为相应的Taqman探针。探针8～12的核苷酸序列与探针7完全相同，同时在探针7的基础上做了数目不等的2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰，具体为探针8～12分别在探针7的基础上做了1个、5个、9个、13个和17个2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰。其中表中的“*”表示2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰在位于其前面的核苷酸上，例如“A*”表示碱基A对应的核苷酸上有2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰。
PCR反应体系中除探针外，所有其他组分的配制均完全相同。在6个PCR反应孔中分别加入探针7～12，测试探针在PCR反应后煺火产生的熔解曲线。具体PCR扩增反应体系见表2(模板Gene ID:934224)，PCR反应条件为：95℃5分钟，之后(95℃10秒、65℃30秒)进行45循环反应；再从40℃到80℃做温度梯度荧光检测，每隔0.05℃检测一次荧光，根据荧光值变化得出熔解曲线，结果如图2所示。探针7～12所对应的熔解曲线分别标记为A～F，具体结果统计如表5所示。
表5 2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰对探针熔解曲线的影响
表5显示，由于在PCR过程中被降解，普通探针无法通过PCR后的煺火产生熔解峰；带2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰的探针均可在PCR后的煺火过程中产生预期中的熔解曲线。随着修饰的2’-(2,4-二硝基苯)基团数量的增加，熔解曲线峰值对应的荧光探针Tm也随之升高，每增加一个2’-(2,4-二硝基苯)基团的修饰，荧光探针的Tm值提高大约0.4～0.6℃。此外，当探针中60％及以下的核苷酸(约13个)被2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰时，熔解曲线的效果(即峰高)随修饰基团的数量增加而提升；当修饰基团的数量大于60％核苷酸数时，熔解曲线的效果(即峰高)随修饰数量增加而降低。
实施例3利用2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰调节熔解峰间的距离
合成引物探针，具体序列见表6。
表6 各引物和探针具体组成
名称 核苷酸组成
引物5 5’-CAAACTTAATCACTCAAGGATG-3’
引物6 5’-CTGTTGTCRTTGATGTCATAGG-3’
引物7 5’-ACAGGAAGCATTGTRTCATCTGT-3’
引物8 5’-GTGTGTAATGCAGCTTGTTGTTG-3’
探针13 5’-FAM-C*AGATATAGGGAAGTCATA-BHQ1-3’
探针14 5’-FAM-C*CAATGGCAAAAATTCCAGT-BHQ1-3’
探针15 5’-FAM-C*C*A*A*T*G*G*C*A*A*A*AATTCCAGT-BHQ1-3’
引物5、引物6分别为检测甲型流感病毒的正、反向引物，探针13是与之相应的探针，带1个2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰；引物7、引物8为检测人偏肺病毒的正、反向引物，探针14是与之相应的探针，带1个2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰；探针15亦为人偏肺病毒的探针，与探针14序列完全相同，但在探针14的基础上，增加了10个2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰。
PCR反应体系中除探针外，所有其他组分的配制均完全相同。在1号反应孔中同时加入引物5～8以及甲型流感病毒和人偏肺病毒的DNA模板，并用探针13和探针14检测两种病毒。具体PCR扩增反应体系见表2(甲型流感病毒的模板Gene ID:956529，人偏肺病毒的模板Gene ID:2799939)，PCR反应条件为：95℃5分钟，之后(95℃10秒、65℃30秒)进行45个循环反应，再从40℃到80℃做温度梯度荧光检测，每隔0.05℃检测一次荧光，根据荧光值变化得出熔解曲线，结果如图3所示。
在2反应号孔中同时加入引物5～8以及甲型流感病毒和人偏肺病毒的DNA模板，并用探针13和探针15检测两种病毒。具体PCR扩增反应体系见表2，PCR反应条件为：95℃5分钟，之后(95℃10秒、65℃30秒)进行45个循环反应，再从40℃到80℃做温度梯度荧光检测，每隔0.05℃检测一次荧光，根据荧光值变化得出熔解曲线，结果如图4所示。
图3和图4显示，探针13～15都产生了预期的熔解曲线，即探针在2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰之后都具有防水解效果；此外，探针15由于比探针14多了10个2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰，导致其Tm值比探针14高出5℃，使得探针13和探针15两者的熔解峰更好地分开，有利于临床上出现甲型流感病毒和人偏肺病毒共感染的病例时，做出更加准确的诊断。

Claims (10)

1.一种用于多重PCR反应的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针至少其5’末端的第一个核苷酸被2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰。
2.如权利要求1所述的用于多重PCR反应的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针至少其5’末端的前三个核苷酸被2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰。
3.如权利要求1或2所述的用于多重PCR反应的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为taqman荧光探针。
4.如权利要求1～3任一项所述的用于多重PCR反应的荧光探针，其特征在于，每增加1个所述2’-(2,4-二硝基苯)基团的修饰，所述荧光探针的Tm值提高0.4～0.6℃。
5.如权利要求1～4任一项所述的用于多重PCR反应的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针被2’-(2,4-二硝基苯)基团修饰的核苷酸数量不高于探针总核苷酸数的60％；较佳地，所述修饰是从荧光探针的核苷酸的5’末端开始依次修饰。
6.一种用于多重PCR的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～5任一项所述的用于多重PCR反应的荧光探针。
7.如权利要求6所述的用于多重PCR的试剂盒，其特征在于，还包括至少一种反应液，所述反应液包括一对或多对引物、PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸和Taq DNA聚合酶。
8.一种非疾病诊断目的的多重PCR检测方法，其特征在于，使用权利要求1～5任一项所述的用于多重PCR反应的荧光探针、或者权利要求6或7所述的用于多重PCR的试剂盒，该检测方法包括常规PCR扩增和温度梯度荧光两个步骤。
9.一种权利要求1～5任一项所述的用于多重PCR反应的荧光探针在制备疾病诊断的试剂或试剂盒中的应用；较佳地，所述疾病为由多种病原体引起的交叉感染的感染性疾病；更佳地，所述感染性疾病为呼吸道感染、消化道感染、血液感染和/或尿路感染。
10.含有2,4-二硝基苯基团的化合物在制备用于多重PCR反应的荧光探针中的应用；较佳地，所述化合物为1-氟-2，4-二硝基苯。
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