CN107354227A - microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测方法。本发明提供了一种一步法实时荧光定量PCR检测待测microRNA的引物和探针，包括特异性长链引物RP1、特异性长链引物RP2、短链引物P1、短链引物P2和特异性探针PR；本发明在两步法荧光定量的基础上优化为一步法荧光定量PCR，所有反应所需试剂一次加入反应体系中，实验过程简单易操作；逆转录和qPCR过程在一个反应管中进行，避免了反复开盖过程，降低了污染的风险；整个反应时间相对于两步法荧光定量PCR大大缩短，节省了实验时间；实验过程步骤减少，降低了人为误差，使反应灵敏度也大大提高。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，涉及microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术
近几年来,微小核糖核酸(microRNA，miRNA)已经成为广大生物研究者关注的热点之一。miRNA是一类长度在19-24个核苷酸(nt)左右的内源性非编码小分子单链RNA,在进化过程中高度保守,能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译,广泛地负调控靶基因的表达。自1993年被报道以来,已在动物、植物和病毒中发现了上万种miRNA。miRNA的异常表达将会导致生理的异常和疾病的产生,在许多癌细胞如大肠癌和乳腺癌细胞中,miRNA的表达水平会发生改变,有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外,在许多其他病变组织或细胞中也检测到了miRNA的异常表达。因此,对定量检测组织或细胞样本中miRNA方法的深入研究将有助于人们进一步了解miRNA与疾病发生发展的关系,为疾病的早期诊断提供新的思路。
成熟miRNA片段较小，一般只有20-23个nt，没有poly(A)尾巴,家族成员间通常只有一两个碱基的差别,并且在细胞中的表达水平普遍较低，这些特性给miRNA定量检测方法的建立带来了困难和挑战。尽管如此,科学家还是研究出了多种miRNA检测方法,如Northern blotting法、微阵列法、克隆和测序法、实时荧光定量PCR法等。
目前对于miRNA的定量技术最成熟、使用最广泛的仍然是实时荧光定量PCR技术。所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
实时荧光定量PCR采用的信号检测模式主要有两种:SYBR Green荧光染料法和TaqMan探针法。
SYBR Green是一种只能与DNA双链结合的荧光染料，当它与DNA双链结合时，发出荧光信号，并被仪器检测到；当DNA变性成单链时，SYBR Green染料解离出来，荧光信号急剧减弱。在一个PCR反应体系中，开始反应时，SYBR Green染料和DNA双链结合产生荧光信号；DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光信号急剧减少；在聚合延伸过程中，引物退火并形成扩增产物，SYBR Green荧光染料与DNA双链产物结合，PCR系统检测到荧光信号的净增量加大。
TaqMan探针法是一种高度特异的定量PCR技术，其基本原理就是利用了Taq酶5’—3’核酸外切酶活性，在延伸的过程中对特异性探针进行切断，从而产生荧光信号，所以荧光信号的强弱直接反应了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针，探针的结合位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等；3’端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMARA、BHQ等。当探针完整的时候，报告基团和淬灭基团离得比较近，其发出的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，在链延伸的过程中Taq酶遇到与模板结合的探针，其5’-3’核酸外切酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其荧光能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以经过PCR循环，荧光信号和目的片段一样有一个同步指数增长的过程。检测到的荧光信号的强度即代表了基因的拷贝数。
TaqMan探针根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同可以分为普通的TaqMan探针和TaqMan-修饰探针。修饰探针又可以分为MGB修饰探针和LNA修饰探针。MGB修饰探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder，小沟结合物)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此在获得同样的Tm值情况下，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，从而提高了探针的灵敏度。
锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)是新型的核酸类似物，它包含了2'-氧4'碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，能够将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此又称为锁核酸。LNA探针是在探针合成的时候进行LNA修饰，又称锁核酸修饰。
LNA单分子的化学结构决定了其探针与目标序列杂交后的稳定性，每增加一个单体LNA分子将导致其熔点提升8℃，强化后的杂交性能可以显著的扩大实验检测的环境限制，可以通过调整LNA碱基在探针中的位置来调节最佳熔点(Tm)和杂交的特异性。对实时定量PCR探针进行LNA化学修饰能够增强双链体的热稳定性，同时加强对目标序列杂交的特异性。
由于LNA强化的杂交特征和对熔点温度的影响，含有LNA修饰的实时定量PCR探针，长度较短，可以增加设计的灵活性，因此普通DNA探针某些设计的局限或无法解决的问题都可被减少或消除。
因为miRNA序列较短，不能够直接进行qPCR反应，所以一般在对miRNA序列逆转录的同时进行延长。目前用于识别并合成miRNA第一链的方法主要有两种，第一种是加尾法，先用poly(A)聚合酶(PAP)处理总RNA，使miRNA的3'端加上一段poly(A)尾巴，然后用5'端含有接头序列的poly(T)引物进行反转录，使第一链cDNA加上一段接头，长度达到可以进行qPCR的需要，并为随后的扩增提供通用反向引物，再利用一条与microRNA序列特异的正向引物就可实现PCR扩增。如图1所示；
加尾法一次逆转录理论上能够得到全部的microRNA成熟体、microRNA前体以及mRNA的cDNA，所以是没有选择性的，导致了PCR结果显示的是microRNA成熟体和前体的总量，因此加尾法的特异性比较低，但引物设计以及实验操作简单。
第二种方法是茎环法，利用特异的茎-环状引物反转录miRNA，也称为stem-loopRT-qPCR检测法，茎-环状反转录引物中除含有一段与miRNA互补的特异性序列外，还含有一段较长的具茎环结构的通用序列，与靶miRNA退火反转录后，能得到一个较长的反转录扩增子(cDNA)，共有序列提供了一个通用引物结合位点，然后通过一个与miRNA序列特异的正向引物和一个通用反向引物进行PCR扩增。如图2所示：
茎环法理论上只针对microRNA成熟体，因此特异性较高，可精确区分同一家族中序列高度同源的microRNA，能检测只有一个碱基差别的不同miRNA的表达水平；该法的灵敏度也很高,样品消耗量少，能检测出低丰度靶miRNA，定量线性范围宽。
此两种方法都需要对microRNA进行先逆转录得到延长的cDNA，然后再进行qPCR定量，过程繁琐，耗时长，增加实验员的工作量，而且实验过程中多次开盖，增加实验污染的风险。
发明内容
本发明一个目的是提供一种一步法实时荧光定量PCR检测待测microRNA的引物和探针。
本发明提供的引物和探针，包括特异性长链引物RP1、特异性长链引物RP2、短链引物P1、短链引物P2和特异性探针PR；
所述特异性长链引物RP1的核苷酸序列从5’至3’末端依次由非特异性的通用序列A和特异性序列A’组成；
所述非特异性的通用序列A为不与所述待测microRNA结合的片段；
所述特异性序列A’为与所述待测microRNA 3’末端起10到12个碱基组成的片段互补的序列；
所述特异性长链引物RP2的核苷酸序列从5’至3’末端依次由非特异性的通用序列B和特异性序列B’组成；
所述非特异性的通用序列B为不与所述待测microRNA结合的片段；
所述特异性序列B’为与所述待测microRNA 5’末端起10到12个碱基组成的片段相同的序列；
所述短链引物P1的序列与所述非特异性的通用序列A的序列相同或互补相同；
所述短链引物P2的序列与所述非特异性的通用序列B的序列相同或互补相同；
所述特异性探针PR从5’末端起依次由C和D组成，C为与所述特异性长链引物RP2核苷酸序列3’末端起1-18个碱基序列相同或反向互补，D为与所述待测miRNA序列5’末端起第1-18个碱基序列相同或反向互补。
上述引物和探针中，
所述特异性长链引物RP1为线性引物或茎环结构引物。
上述引物和探针中，
所述特异性探针PR为修饰探针，
所述特异性探针PR的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。
上述引物和探针中，
所述修饰探针为LNA修饰特异性探针或MGB修饰特异性探针；
所述LNA修饰特异性探针中含LNA修饰碱基数量为1-5个，ATCG 4种碱基均可被LNA修饰；所述LNA修饰碱基具体分布于D序列；
所述MGB修饰特异性探针中MGB修饰所述淬灭基团。
上述引物和探针中，
所述特异性长链引物RP1和RP2的长度均为30-80nt；
所述短链引物P1的长度为13-25nt，TM值为56-62℃；
所述短链引物P2的长度为13-25nt，TM值为56-62℃；
所述特异性探针PR的长度为12-18nt，TM值为66-72℃。
上述引物和探针中，
所述待测microRNA为Hsa-mir-126-3p，其核苷酸序列为序列1；
所述Hsa-mir-126-3p对应的引物和探针如下：
Hsa-mir-126-3p-RP1，其核苷酸序列为序列2或7；
Hsa-mir-126-3p-RP2，其核苷酸序列为序列3；
Hsa-mir-126-3p-P1，其核苷酸序列为序列4；
Hsa-mir-126-3p-P2，其核苷酸序列为序列5；
Hsa-mir-126-3p-PR，其核苷酸序列为序列6；
或所述待测microRNA为Hsa-mir-27a-3p，其核苷酸序列为序列8；
所述Hsa-mir-27a-3p对应的引物和探针如下：
Hsa-mir-27a-3p-RP1，其核苷酸序列为序列9；
Hsa-mir-27a-3p-RP2，其核苷酸序列为序列10；
Hsa-mir-27a-3p-P1，其核苷酸序列为序列11；
Hsa-mir-27a-3p-P2，其核苷酸序列为序列12；
Hsa-mir-27a-3p-PR，其核苷酸序列为序列13；
或，所述待测microRNA为Hsa-mir-29a，其核苷酸序列为序列14；
所述Hsa-mir-29a-3p对应的引物和探针如下：
Hsa-mir-29a-3p-RP1，其核苷酸序列为序列15；
Hsa-mir-29a-3p-RP2，其核苷酸序列为序列16；
Hsa-mir-29a-3p-P1，其核苷酸序列为序列17；
Hsa-mir-29a-3p-P2，其核苷酸序列为序列18；
Hsa-mir-29a-3p-PR，其核苷酸序列为序列19；
或，所述待测microRNA为Hsa-mir-34a-5p，其核苷酸序列为序列20；
所述Hsa-mir-34a-5p对应的引物和探针如下：
Hsa-mir-34a-5p-RP1，其核苷酸序列为序列21；
Hsa-mir-34a-5p-RP2，其核苷酸序列为序列22；
Hsa-mir-34a-5p-P1，其核苷酸序列为序列23；
Hsa-mir-34a-5p-P2，其核苷酸序列为序列24；
Hsa-mir-34a-5p-PR，其核苷酸序列为序列25；
所述待测microRNA为Hsa-let-7i-5p，其核苷酸序列为序列27；
所述Hsa-let-7i-5p对应的引物和探针如下：
Hsa-let-7i-5p-RP1，其核苷酸序列为序列30；
Hsa-let-7i-5p-RP2，其核苷酸序列为序列31；
Hsa-let-7i-5p-P1，其核苷酸序列为序列32；
Hsa-let-7i-5p-P2，其核苷酸序列为序列33；
Hsa-let-7i-5p-PR，其核苷酸序列为序列34。
本发明另一个目的是提供一种一步法实时荧光定量PCR检测待测microRNA的PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂，包括上述特异性长链引物RP1、所述特异性长链引物RP2、所述短链引物P1、所述短链引物P2和所述特异性探针PR，
所述特异性长链引物RP1、所述特异性长链引物RP2、所述短链引物P1、所述短链引物P2和所述特异性探针PR的摩尔比为1:1:5:5:5；
或，所述特异性长链引物RP1在所述PCR试剂中的浓度具体为2mM；
所述特异性长链引物RP2在所述PCR试剂中的浓度具体为2mM；
所述短链引物P1在所述PCR试剂中的浓度具体为10mM；
所述短链引物P2在所述PCR试剂中的浓度具体为10mM；
所述特异性探针PR在所述PCR试剂中的浓度具体为10mM。
本发明第3个目的是提供一种一步法实时荧光定量PCR检测待测microRNA的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的引物和探针或上述的PCR试剂。
上述引物和探针或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测或定量检测待测microRNA中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第4个目的是提供一种检测待测microRNA方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的引物和探针实时荧光定量PCR待测microRNA，实现检测待测microRNA。
上述方法中，所述实时荧光定量PCR序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
本发明在两步法荧光定量的基础上优化为一步法荧光定量PCR，所有反应所需试剂一次加入反应体系中，实验过程简单易操作；逆转录和qPCR过程在一个反应管中进行，避免了反复开盖过程，降低了污染的风险；整个反应时间相对于两步法荧光定量PCR大大缩短，节省了实验时间；实验过程步骤减少，降低了人为误差，使反应灵敏度也大大提高。
附图说明
图1为加尾法微小核糖核酸荧光定量PCR扩增原理示意图。
图2为茎环法微小核糖核酸荧光定量PCR扩增原理示意图。
图3为本发明一步法实时荧光定量PCR反应原理示意图。
图4为微小核糖核酸探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-126-3p标准品(线性引物)。
图5为微小核糖核酸探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-126-3p标准品(茎环引物)。
图6为微小核糖核酸探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-27a-3p标准品。
图7为微小核糖核酸探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-29a-3p标准品。
图8为微小核糖核酸探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-34a-5p标准品。
图9为Hsa-mir-126-3p探针一步法实时荧光定量PCR灵敏度分析。
图10为Hsa-mir-34a-5p探针一步法实时荧光定量PCR灵敏度分析。
图11为Hsa-mir-27a-3p探针一步法实时荧光定量PCR特异性分析。
图12为Hsa-let-7i-5p探针一步法实时荧光定量PCR特异性分析。
图13为Hsa-mir-34a-5p探针一步法实时荧光定量PCR特异性分析。
图14为两例乳腺癌病人血清样本RNA用本发明Hsa-mir-27a-3p探针一步法实时荧光定量PCR检测结果。
图15为两例乳腺癌病人血清样本RNA用本发明Hsa-mir-29a-3p探针一步法实时荧光定量PCR检测结果。
图16为两例乳腺癌病人血清样本RNA用本发明Hsa-mir-34a-5p探针一步法实时荧光定量PCR检测结果。
图17为标准品建立的Has-mir-126-3p一步法(线性引物)实时荧光定量PCR标准曲线。
图18为标准品建立的Has-mir-126-3p一步法(茎环引物)实时荧光定量PCR标准曲线。
图19为标准品建立的Hsa-mir-27a-3p一步法(线性引物)实时荧光定量PCR标准曲线。
图20为标准品建立的Hsa-mir-29a-3p一步法(线性引物)实时荧光定量PCR标准曲线。
图21为标准品建立的Hsa-mir-34a-5p一步法(线性引物)实时荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立
一、microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测所需的引物和探针设计
根据待检测microRNA按照如下原则设计如下两条特异性长链引物(RP1和RP2)，两条短链引物(P1和P2)以及一条特异性探针(PR)。
特异性长链引物RP1(即为逆转录引物)长度为30-80nt，可以是线性引物也可以是茎环结构引物，其核苷酸序列从5’-3’末端依次由非特异性的通用序列A(不与待测microRNA结合的片段)和与目的miRNA序列3’末端起10到12个碱基互补配对的特异序列A’组成；
特异性长链引物RP2长度为30-80nt，其核苷酸序列从5’-3’末端依次由非特异性的通用序列B和与目的miRNA序列5’末端起10到12个碱基相同的特异性序列B’组成；
短链引物P1长度为13-25nt，TM值为56-62℃，序列与特异性长链引物RP1非特异性的通用序列A相同或部分相同；
短链引物P2长度为13-25nt，TM值为56-62℃，序列与特异性长链引物RP2非特异性的通用序列B相同或部分相同。
特异性探针(PR)序列长度在12-18bp范围内，TM值为66-72℃，用于确保高特异性,从5’末端起依次由C和D组成，序列C为与特异性长链引物RP2核苷酸序列3’末端起1-18个碱基序列相同或反向互补，序列D为与目的miRNA序列5’末端起第1-18位个碱基序列相同或反向互补；特异性探针(PR)可以是LNA修饰特异性探针，也可以是MGB修饰特异性探针,LNA修饰特异性探针含LNA修饰数量为1-5个，ATCG 4种碱基单体均可LNA修饰，5’和3’末端分别标记荧光基团和淬灭基团,修饰碱基分布于D序列为优；MGB修饰探针5’末端标记荧光基团，3’末端标记和MGB偶联的淬灭基团或者带淬灭功能的MGB基团(MGB本身是一个小沟结合物，它本身可以在合成的时候偶联一个猝灭基团，整体再接到探针3’末端，也可以不偶联淬灭基团，先将淬灭基团单独接到探针3’末端，再接MGB)。
二、microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测方法
1、一步法实时荧光定量PCR反应原理
一步法实时荧光定量PCR反应原理图3所示：
第一步，长链引物RP1和目的miRNA在26℃-30℃温度下特异性结合，并在M-MLV逆转录酶作用下进行逆转录，得到cDNA第一链，对miRNA进行了首次加长；
第二步，长链引物RP2和cDNA第一链在36℃-39℃条件下特异性结合，之后热启动Taq酶在72℃作用下以cDNA第一链为模板对RP2进行延伸，得到双链cDNA，并对miRNA进行了第二次加长；
第三步，引物P1、P2以及探针PR和双链cDNA在热启动Taq酶作用下，在95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles条件下进行荧光定量PCR反应，并进行采集信号，通过对最终信号的分析，进行miRNA的定量。
2、一步法实时荧光定量PCR反应方法的建立
一步法实时荧光定量PCR检测待测样本中的目的microRNA，具体如下：
提取待测样本的RNA作为模板，加入如下反应体系中：
PCR反应体系各成分和终浓度为：5×M-MLV Buffer 0.75×，10×PCR Buffer 1×，dNTP 0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P10.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR0.1mM，M-MLV逆转录酶2.5U/ul，Taq HS热启动酶2.5U/ul，300×ROX 9×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。
将上述反应体系置于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
检测待测样本是否含有目的microRNA判断标准如下：
若荧光定量PCR反应为如下条件：有明显S曲线且ct小于等于35，则待测样本中含有或候选含有目的microRNA，若荧光定量PCR反应不符合上述条件，则待测样本中不含有或候选不含有目的microRNA；
检测待测样本中目的microRNA的绝对含量的的方法如下：
以10倍梯度稀释的已知浓度目的microRNA标准品作标准曲线，将待测样本中目的microRNA ct值带入标准曲线中，计算得到待测样本中目的microRNA绝对含量。
实施例2、microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-126-3p标准品，所使用的逆转录引物为茎环引物
一、引物和探针设计及合成
通过苏州吉玛基因股份有限公司合成Hsa-mir-126-3p标准品，序列如下：
hsa-mir-126-3p：UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG(序列1)。
根据实施例1的设计原则，设计检测Hsa-mir-126-3p的引物及探针，并合成如下：
所使用的逆转录引物RP1为线性引物。
通过上海捷瑞生物工程有限公司合成Has-mir-126-3p-RP1/RP2/P1/P2四条引物，序列分别如下：
Hsa-mir-126-3p-RP1:GGAGCGTAGCAAGCAAAGAGTGTTCGCATTATTA(序列2)，
Hsa-mir-126-3p-RP2：GGGATTCTGGAAGATGATGATGAGGCTCCGTCGTACCGTGAG(序列3)，
Hsa-mir-126-3p-P1：GGAGCGTAGCAAGCAAAGAGTGT(序列4)，
Hsa-mir-126-3p-P2：GGGATTCTGGAAGATGATGATGAG(序列5)。
通过苏州吉玛基因股份有限公司合成LNA修饰特异性探针(PR)，序列及修饰如下：
Hsa-mir-126-3p-PR：FAM-TC+C+GTC+GTA+CCGTGAG-BHQ1(序列6)，其中“+”为LNA修饰。
二、荧光定量PCR检测Has-mir-126-3p标准品
1OD Hsa-mir-126-3p标准品干粉加300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14；使用100ng/uL酵母tRNA(北京中生瑞泰,Lot:9014-25-9)作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e11到e8(分别对应稀释1011copy/ml-108copy/ml)为标准品模板。
分别将上述e11到e8标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLV Buffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果图4(NTC为不加入任何模板)所示，可以看出，扩增产物有典型S型曲线(其中e11的Ct值为11.84，e10的Ct值为15.46，e9的Ct值为19.17，e8的Ct值为22.96)，表明所使用的逆转录引物为线性引物时，能够实现Hsa-mir-126-3p标准品e11-e8一步法荧光定量PCR检测，建立Has-mir-126-3p一步法实时荧光定量PCR标准曲线：Ct＝-3.707lgX0+52.57(图17，XO为模板的浓度即拷贝数)。
实施例3、microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-126-3p标准品，所使用的逆转录引物为茎环引物
一、引物和探针设计及合成
通过苏州吉玛基因股份有限公司合成Hsa-mir-126-3p标准品，序列如下：
Hsa-mir-126-3p：UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG(序列1)。
根据实施例1的设计原则，设计检测Hsa-mir-126-3p的引物及探针，并合成如下：
通过上海捷瑞生物工程有限公司合成Hsa-mir-126-3p-RP3/RP4/P3/P4四条引物，其中所使用的逆转录引物Hsa-mir-126-3p-RP1’为茎环结构引物，序列分别如下，
Hsa-mir-126-3p-RP1’:GACACTCTATGCTTGGAGCGTAGCAAGCATAGAGTGTCCGCATTATTA(序列7)，
Hsa-mir-126-3p-RP2：GGGATTCTGGAAGATGATGATGAGGCTCCGTCGTACCGTGAG，Hsa-mir-126-3p-P1：GGAGCGTAGCAAGCAAAGAGTGT，
Hsa-mir-126-3p-P2：GGGATTCTGGAAGATGATGATGAG。
通过苏州吉玛基因股份有限公司合成LNA探针，序列及修饰如下：
Hsa-mir-126-3p-PR：FAM-TC+C+GTC+GTA+CCGTGAG-BHQ1，其中“+”为LNA修饰。
二、荧光定量PCR检测Hsa-mir-126-3p标准品
1OD Hsa-mir-126-3p标准品干粉加300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e11到e8为标准品模板。
分别将上述e11到e8标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLV Buffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如图5所示，可以看出，扩增产物有典型的S型扩增曲线，其中e11的Ct值为12.48，e10的Ct值为15.96，e9的Ct值为19.41，e8的Ct值为22.65，表明所使用的逆转录引物为茎环引物时，能够实现Hsa-mir-126-3p标准品e11-e8一步法荧光定量PCR检测，建立Has-mir-126-3p一步法实时荧光定量PCR标准曲线：Ct＝-3.396lgX0+49.89(图18，XO为模板的浓度即拷贝数)。
实施例4、microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-27a-3p标准品
一、引物和探针设计及合成
在苏州吉玛基因股份有限公司按照Hsa-mir-27a-3p序列合成miRNA干粉1OD，其序列如下：
Hsa-mir-27a-3p：UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC(序列8)。
根据实施例1的设计原则，设计检测Hsa-mir-27a-3p的引物及探针，并合成如下：
通过上海捷瑞生物工程有限公司合成Hsa-mir-27a-3p-RP1/RP2/P1/P2四条引物，其序列分别如下，
Hsa-mir-27a-3p-RP1：GATGCGTAGCAATACCTTAGCGTTCGTGCGGAACTTA(序列9)
Hsa-mir-27a-3p-RP2：GCGATTCTGGTAGATGATGCTGACATCTCCTTCACAGTGGCT(序列10)
Hsa-mir-27a-3p-P1：GATGCGTAGCAATACCTTAGCGTT(序列11)
Hsa-mir-27a-3p-P2：GCGATTCTGGTAGTTGATGCTGA(序列12)
通过苏州吉玛基因股份有限公司合成LNA探针，序列及修饰如下：
Hsa-mir-27a-3p-PR：FAM-TCTCC+TT+CA+CA+GT+GGC-BHQ1(序列13)，其中“+”为LNA修饰。
二、荧光定量PCR检测Hsa-mir-27a-3p标准品
1OD Hsa-mir-27a-3p标准品干粉加300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e11到e8为标准品模板。
分别将上述e11到e8标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLV Buffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如下图6所示，可以看出，扩增产物有典型的S型扩增曲线，其中e11的Ct值为15.91，e10的Ct值为19.29，e9的Ct值为22.47，e8的Ct值为26.09，能够实现Hsa-mir-27a-3p标准品e11-e8一步法荧光定量PCR检测，建立Hsa-mir-27a-3p一步法实时荧光定量PCR标准曲线：Ct＝-3.372lgX0+52.97(图19，XO为模板的浓度即拷贝数)。
实施例5、microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-29a-3p标准品
一、引物和探针设计及合成
通过苏州吉玛基因股份有限公司按照Hsa-mir-29a-3p序列合成miRNA干粉1OD，其序列如下：Hsa-mir-29a-3p：UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA(序列14)。
根据实施例1的设计原则，设计检测Hsa-mir-29a-3p的引物及探针，并合成如下：
所使用的逆转录引物为线性引物。
通过上海捷瑞生物工程有限公司合成Hsa-mir-29a-3p-RP1/RP2/P1/P2四条引物，序列分别如下，
Hsa-mir-29a-3p-RP1：GGAAGCGTAGCAAGCATAGTGAGTAGTAACCGATT(序列15)
Hsa-mir-29a-3p-RP2：GGGATTCTGAACGATGATGATGATCTCCTAGCACCATCTGA(序列16)
Hsa-mir-29a-3p-P1：GGAAGCGTAGCAAGCATAGTGAGTA(序列17)
Hsa-mir-29a-3p-P2：GGGATTCTGAACGATGATGATGAT(序列18)
其中Hsa-mir-29a-3p-RP1为直链结构引物；
通过Invitrogen公司合成MGB探针，序列及修饰如下。
Hsa-mir-29a-3p-PR：5’-CCGTAGCACCATCTGA-3’(序列19)，其中5’端为FAM修饰，3’端为MGB修饰。
二、荧光定量PCR检测Hsa-mir-29a-3p标准品
1OD Hsa-mir-29a-3p标准品干粉加300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e11到e8为标准品模板。
分别将上述e11到e8标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLV Buffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如下图7所示，可以看出，扩增产物有典型的S扩增型曲线,其中e11的Ct值9.05，e10的Ct值为12.16，e9的Ct值为15.09，e8的Ct值为18.87，能够实现Hsa-mir-29a-3p标准品e11-e8一步法荧光定量PCR检测，建立Hsa-mir-29a-3p一步法实时荧光定量PCR标准曲线：Ct＝-3.239lgX0+44.56(图20，XO为模板的浓度即拷贝数)。
实施例6、microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测Hsa-mir-34a-5p标准品
一、引物和探针设计及合成
通过苏州吉玛基因股份有限公司按照Hsa-mir-34a-5p序列(序列20)合成miRNA干粉1OD，其序列如下：
Hsa-mir-34a-5p：UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(序列20)
根据实施例1的设计原则，设计检测Hsa-mir-34a-5p的引物及探针，并合成如下：
所使用的逆转录引物为线性引物。
通过上海捷瑞生物工程有限公司合成四条引物，序列分别如下，
Hsa-mir-34a-5p-RP1:GGAGCGTAGCATAGCATAGTCTGACGACAACCAGCT(序列21)
Hsa-mir-34a-5p-RP2:GGGATTCTGGATGATGATGATGAACCTCTGGCAGTGTCTT(序列22)
Hsa-mir-34a-5p-P1:GGAGCGTAGCATAGCATAGTCTGA(序列23)
Hsa-mir-34a-5p-P2:GGGATTCTGGATGATGATGATGA(序列24)
通过苏州吉玛基因股份有限公司合成LNA探针，序列及修饰如下：
Hsa-mir-34a-5p-PR:FAM-CTC+T+G+G+CA+GT+GTCTT-BHQ1(序列25)，其中“+”为LNA修饰。
二、荧光定量PCR检测Hsa-mir-34a-5p标准品
300ul无RNase水溶解Hsa-mir-34a-5p后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e11到e8为标准品模板。
分别将上述e11到e8标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLV Buffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如下图8所示，可以看出，扩增产物有典型的S型扩增曲线，其中e11的Ct值为15.29，e10的Ct值为18.98，e9的Ct值为22.87，e8的Ct值为25.97,，能够实现Hsa-mir-34a-5p标准品e11-e8一步法荧光定量PCR检测，建立Hsa-mir-34a-5p一步法实时荧光定量PCR标准曲线：Ct＝-3.593lgX0+54.91(图21，XO为模板的浓度即拷贝数)。
实施例7、灵敏度分析
一、Hsa-mir-126-3p进行灵敏度分析
按照实施例2的Hsa-mir-126-3p进行灵敏度分析，具体如下：
将1OD Hsa-mir-126-3p标准品干粉加300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e12到e3为标准品模板进行miRNA探针一步法灵敏度分析。
将上述e12到e3标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLVBuffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如下图9所示，可以看出，扩增产物有S型曲线，能够实现荧光定量PCR检测Hsa-mir-126-3p标准品，灵敏度达e3。
二、Hsa-mir-34a-5p进行灵敏度分析
按照实施例6的Hsa-mir-34a-5p进行灵敏度分析，具体如下：
在苏州吉玛基因股份有限公司按照Hsa-mir-34a-5p序列合成miRNA干粉1OD，300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e12-e3为标准品模板进行miRNA探针一步法灵敏度分析。
将上述e12-e3标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLVBuffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如下图10所示，可以看出，扩增产物有S型曲线，能够实现荧光定量PCR检测Hsa-mir-34a-5p标准品，灵敏度达e4。
实施例8、特异性分析
一、Hsa-mir-27a-3p进行特异性分析
按照实施例3的Hsa-mir-27a-3p进行灵敏度分析，具体如下：
在苏州吉玛基因股份有限公司按照Hsa-mir-27a-3p和Hsa-mir-27b-3p序列合成miRNA干粉1OD作为标准品，序列分别如下：
Hsa-mir-27a-3p：UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC(序列8)
Hsa-mir-27b-3p：UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC(序列26)
分别取Hsa-mir-27a-3p和Hsa-mir-27b-3p标准品干粉各1OD，各加300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e10作为模板。
使用Hsa-mir-27a-3p-RP1/RP2/P1/P2/PR为引物探针分别检测Hsa-miRNA-27a-3p和Hsa-miRNA-27b-3p e10标准品模板。
将上述e10标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLVBuffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如下图11所示，仅单碱基差异的干扰序列Hsa-mir-27b-3p检测的Ct值和同浓度的目的序列Hsa-miRNA-27a-3p检测Ct相差16，表示Hsa-mir-27b-3p对Hsa-miRNA-27a-3p的检测干扰仅为0.01％，可特异检测Hsa-mir-27a-3p。
二、Hsa-let-7i-5p进行特异性分析
对Hsa-let-7i-5p进行特异性分析，具体如下：
在苏州吉玛基因股份有限公司按照Hsa-let-7i-5p、Hsa-let-7g-5p以及Hsa-let-7b-5p序列合成miRNA干粉作为标准品，序列分别如下：
Hsa-let-7i-5p：UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU(序列27)
Hsa-let-7g-5p：UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU(序列28)
Hsa-let-7b-5p：UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU(序列29)
根据实施例1的设计原则，设计检测Hsa-let-7i-5p的引物及探针，并合成如下：
通过上海捷瑞生物工程有限公司合成四条引物，序列分别如下，
Hsa-let-7i-5p-RP1:GGAGCGTAGCAAGCATAGAGTCCTCTCTGAACAGCACAAA(序列30)
Hsa-let-7i-5p-RP2:GGGATTCTGGAAGATGATGATGAGTCTGAGGTAGTAG(序列31)
Hsa-let-7i-5p-P1:GGAGCGTAGCAAGCATAGAGTCC(序列32)
Hsa-let-7i-5p-P2:GGGATTCTGGAAGATGATGATGAG(序列33)
通过苏州吉玛基因股份有限公司合成LNA探针，序列及修饰如下：
Hsa-let-7i-5p-PR:FAM-TC+T+GAA+CA+G+CA+CAAA-BHQ1(序列34)，其中“+”为LNA修饰。
Hsa-let-7i-5p、Hsa-let-7g-5p以及Hsa-let-7b-5P的标准品干粉分别加入300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，都选取e10作为模板，使用Hsa-let-7i-5p-RP1/RP2/P1/P2/PR为引物探针分别检测Hsa-let-7i/7g/7b基因。
将上述e10标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度为：5×M-MLVBuffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如下图12所示，干扰序列Hsa-let-7g-5p和目的序列Hsa-let-7i-5p之间仅有两个碱基的差异，但检测的Ct值和同浓度的目的序列Hsa-let-7i-5p检测Ct相差18以上，表示Hsa-let-7g-5p对Hsa-let-7i-5p的检测干扰仅为0.001％，而干扰序列Hsa-let-7b-5p和目的序列Hsa-let-7i-5p之间有四个碱基的差异，其检测的Ct值和同浓度的目的序列Hsa-let-7i-5p检测Ct相差20以上，表示Hsa-let-7b-5p对Hsa-let-7i-5p的检测基本没有干扰，可特异检测Hsa-let-7i-5p。
三、Hsa-mir-34a-5p进行特异性分析
用实施例5中的Hsa-mir-34b-5p进行特异性分析，具体如下：
在苏州吉玛基因股份有限公司按照Hsa-mir-34a-5p和Hsa-mir-34b-5p序列合成miRNA干粉1OD作为标准品，序列分别如下：
Hsa-mir-34a-5p：UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(序列20)
Hsa-mir-34b-5p：UAGGCAGUGUCAUUAGCUGAUUG(序列35)
分别向Hsa-mir-34a-5p和Hsa-mir-34b-5p标准品干粉中加入300ul无RNase水溶解后为1014copy/ml，标记为e14，使用100ng/uL酵母tRNA作为RNA稀释液按照10倍浓度梯度稀释一系列溶液，选取e10作为模板。使用Hsa-mir-34a-5p-RP1/RP2/P1/P2/PR为引物探针分别检测Hsa-mir-34a-5p和Hsa-mir-34b-5p基因。
将上述e10标准品模板加入如下反应体系中,各成分和终浓度分别为：5×M-MLVBuffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P2 0.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如下图13所示：干扰序列Hsa-mir-34b-5p和目的序列Hsa-mir-34a-5p之间有三个碱基的差异，但其检测的Ct值和同浓度的目的序列Hsa-mir-34a-5p检测Ct值相差25以上，表示Hsa-mir-34b-5p对Hsa-mir-34a-5p的检测几乎不存在干扰，可以特异检测Hsa-mir-34a-5p。
实施例9、使用微小核糖核酸探针一步法荧光定量PCR检测乳腺癌病人血清中微小核糖核酸
一、乳腺癌病人血清总核糖核酸的抽提
1、取两列乳腺癌病人(编号样本1和样本2)血清200μL分别加入1.5ml离心管中；
2、向离心管中分别加入1ml(5倍血清体积)的Ezol裂解液，剧烈摇晃30s后，室温静置5min；
3、向离心管中分别加入200μL三氯甲烷，剧烈摇晃30s，室温静置5min；
4、冷冻高速离心机12000g，4℃离心20分钟，小心吸取上清水相于新的2ml离心管中，约700μL；
5、向离心管中加入吸取上清液体1.5倍体积(约1050ml)的无水乙醇，用枪吹打混匀后；
6、吸取700μL加入到吸附柱中(吸附柱底部已经套入2ml收集管)，室温静置1min，冷冻高速离心机10000g，4℃离心1分钟，弃去下部收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中；
7、剩余液体同步骤6同样处理，直至所有液体处理完；
8、向吸附柱中加入700μL 80％乙醇，冷冻高速离心机10000g，4℃离心1分钟，弃去下部收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中；重复此步骤一次；
9、吸附柱放到新的2ml收集管中，冷冻高速离心机10000g，4℃离心2分钟；
10、吸附柱放到新的1.5ml离心管中，在吸附柱中央滴加50μL无RNase水，室温静置2min；
11、冷冻高速离心机10000g，4℃离心2分钟，弃去吸附柱，离心管底部液体即为含有血清RNA的溶液。
二、对乳腺癌血清样本RNA进行一步法荧光定量PCR
对两例乳腺癌病人血清样本RNA(样本1和样本2)，分别检测Hsa-mir-126-3p、Hsa-mir-27a-3p、Hsa-mir-29a-3p以及Hsa-mir-34a-5p共四个miRNA基因，引物见前面的实施例。分别对四个基因进行反应体系配制,各成分和终浓度分别为：5×M-MLV Buffer(promega,Lot:M1701)0.75×，10×PCR Buffer(Vazyme,Lot:P122-d2)1×，dNTP 0.2mM，MgCl2 1.5mM，长链引物RP1 0.1mM，长链引物RP2 0.1mM，短链引物P1 0.5mM，短链引物P20.5mM，探针PR 0.1mM，M-MLV逆转录酶(promega,Lot:M1701)2.5U/ul，Taq HS热启动酶(Vazyme，P122-d2)2.5U/ul，50×ROX(Invitrogen 12223-012)5×，不足18ul用无RNase水补齐-，模板2ul，总体积20ul。于ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
实验结果如图14所示，两例乳腺癌病人血清样本RNA(样本1和样本2)检测Hsa-mir-27a-3p，样本1的Ct值为23.04，样本2的Ct值为27.84，分别代入到实施例4的标准曲线Ct＝-3.707lgX0+52.57中，其绝对定量结果为样本1的Hsa-mir-27a-3p拷贝数为7.52E8copies/mL，样本2的Hsa-mir-27a-3p拷贝数为2.83E7copies/mL；
实验结果如下图15所示，检测两例乳腺癌病人血清样本RNA(样本1和样本2)中Hsa-mir-29a-3p，样本1的Ct值为17.54，样本2的Ct值为20.28，代入到实施例5的标准曲线Ct＝-3.239lgX0+44.56中，其绝对定量结果为样本1的Hsa-mir-29a-3p拷贝数为4.41E6copies/mL，样本2的Hsa-mir-29a-3p拷贝数为1.45E5copies/mL；
实验结果如下图16所示，检测两例乳腺癌病人血清样本RNA(样本1和样本2)中Hsa-mir-34a-5p，样本1的Ct值为21.05；样本2的Ct值为25.21，代入到实施例6的标准曲线Ct＝-3.593lgX0+54.91中，其绝对定量结果为样本1的Hsa-mir-34a-5p拷贝数为7.41E8copies/mL，样本2的Hsa-mir-34a-5p拷贝数为3.42E7copies/mL。
序列表
<110>苏州吉玛基因股份有限公司
<120> microRNA探针一步法实时荧光定量PCR检测方法
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ucguaccgug aguaauaaug cg 22
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
ggagcgtagc aagcaaagag tgttcgcatt atta 34
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gggattctgg aagatgatga tgaggctccg tcgtaccgtg ag 42
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ggagcgtagc aagcaaagag tgt 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
gggattctgg aagatgatga tgag 24
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
tccgtcgtac cgtgag 16
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
gacactctat gcttggagcg tagcaagcat agagtgtccg cattatta 48
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
gatgcgtagc aataccttag cgttcgtgcg gaactta 37
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
gcgattctgg tagatgatgc tgacatctcc ttcacagtgg ct 42
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
gatgcgtagc aataccttag cgtt 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
gcgattctgg tagttgatgc tga 23
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
tctccttcac agtggc 16
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
ggaagcgtag caagcatagt gagtagtaac cgatt 35
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
gggattctga acgatgatga tgatctccta gcaccatctg a 41
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
ggaagcgtag caagcatagt gagta 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
gggattctga acgatgatga tgat 24
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
ccgtagcacc atctga 16
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
ggagcgtagc atagcatagt ctgacgacaa ccagct 36
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
gggattctgg atgatgatga tgaacctctg gcagtgtctt 40
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
ggagcgtagc atagcatagt ctga 24
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
gggattctgg atgatgatga tga 23
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
ctctggcagt gtctt 15
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
uucacagugg cuaaguucug c 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
ugagguagua guuugugcug uu 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
ugagguagua guuuguacag uu 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 29
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 30
ggagcgtagc aagcatagag tcctctctga acagcacaaa 40
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 31
gggattctgg aagatgatga tgagtctgag gtagtag 37
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 32
ggagcgtagc aagcatagag tcc 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 33
gggattctgg aagatgatga tgag 24
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 34
tctgaacagc acaaa 15
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 35
uaggcagugu cauuagcuga uug 23
Claims (10)
1.一种一步法实时荧光定量PCR检测待测microRNA的引物和探针，包括特异性长链引物RP1、特异性长链引物RP2、短链引物P1、短链引物P2和特异性探针PR；
所述特异性长链引物RP1的核苷酸序列从5’至3’末端依次由非特异性的通用序列A和特异性序列A’组成；
所述非特异性的通用序列A为不与所述待测microRNA结合的片段；
所述特异性序列A’为与所述待测microRNA 3’末端起10到12个碱基组成的片段互补的序列；
所述特异性长链引物RP2的核苷酸序列从5’至3’末端依次由非特异性的通用序列B和特异性序列B’组成；
所述非特异性的通用序列B为不与所述待测microRNA结合的片段；
所述特异性序列B’为与所述待测microRNA 5’末端起10到12个碱基组成的片段相同的序列；
所述短链引物P1的序列与所述非特异性的通用序列A的序列相同或互补相同；
所述短链引物P2的序列与所述非特异性的通用序列B的序列相同或互补相同；
所述特异性探针PR从5’末端起依次由C和D组成，C为与所述特异性长链引物RP2核苷酸序列3’末端起1-18个碱基序列相同或反向互补，D为与所述待测miRNA序列5’末端起第1-18个碱基序列相同或反向互补。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：
所述特异性长链引物RP1为线性引物或茎环结构引物。
3.根据权利要求1或2所述的引物和探针，其特征在于：
所述特异性探针PR为修饰探针，
所述特异性探针PR的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的引物和探针，其特征在于：
所述修饰探针为LNA修饰特异性探针或MGB修饰特异性探针；
所述LNA修饰特异性探针中含LNA修饰碱基数量为1-5个，ATCG 4种碱基均可被LNA修饰；所述LNA修饰碱基具体分布于D序列；
所述MGB修饰特异性探针中MGB修饰所述淬灭基团。
5.根据权利要求1-4中任一所述的引物和探针，其特征在于：。
所述特异性长链引物RP1和RP2的长度均为30-80nt；
所述短链引物P1的长度为13-25nt，TM值为56-62℃；
所述短链引物P2的长度为13-25nt，TM值为56-62℃；
所述特异性探针PR的长度为12-18nt，TM值为66-72℃。
6.根据权利要求1-5中任一所述的引物和探针，其特征在于：。
所述待测microRNA为Hsa-mir-126-3p，其核苷酸序列为序列1；
所述Hsa-mir-126-3p对应的引物和探针如下：
Hsa-mir-126-3p-RP1，其核苷酸序列为序列2或7；
Hsa-mir-126-3p-RP2，其核苷酸序列为序列3；
Hsa-mir-126-3p-P1，其核苷酸序列为序列4；
Hsa-mir-126-3p-P2，其核苷酸序列为序列5；
Hsa-mir-126-3p-PR，其核苷酸序列为序列6；
或所述待测microRNA为Hsa-mir-27a-3p，其核苷酸序列为序列8；
所述Hsa-mir-27a-3p对应的引物和探针如下：
Hsa-mir-27a-3p-RP1，其核苷酸序列为序列9；
Hsa-mir-27a-3p-RP2，其核苷酸序列为序列10；
Hsa-mir-27a-3p-P1，其核苷酸序列为序列11；
Hsa-mir-27a-3p-P2，其核苷酸序列为序列12；
Hsa-mir-27a-3p-PR，其核苷酸序列为序列13；
或，所述待测microRNA为Hsa-mir-29a，其核苷酸序列为序列14；
所述Hsa-mir-29a-3p对应的引物和探针如下：
Hsa-mir-29a-3p-RP1，其核苷酸序列为序列15；
Hsa-mir-29a-3p-RP2，其核苷酸序列为序列16；
Hsa-mir-29a-3p-P1，其核苷酸序列为序列17；
Hsa-mir-29a-3p-P2，其核苷酸序列为序列18；
Hsa-mir-29a-3p-PR，其核苷酸序列为序列19；
或，所述待测microRNA为Hsa-mir-34a-5p，其核苷酸序列为序列20；
所述Hsa-mir-34a-5p对应的引物和探针如下：
Hsa-mir-34a-5p-RP1，其核苷酸序列为序列21；
Hsa-mir-34a-5p-RP2，其核苷酸序列为序列22；
Hsa-mir-34a-5p-P1，其核苷酸序列为序列23；
Hsa-mir-34a-5p-P2，其核苷酸序列为序列24；
Hsa-mir-34a-5p-PR，其核苷酸序列为序列25；
所述待测microRNA为Hsa-let-7i-5p，其核苷酸序列为序列27；
所述Hsa-let-7i-5p对应的引物和探针如下：
Hsa-let-7i-5p-RP1，其核苷酸序列为序列30；
Hsa-let-7i-5p-RP2，其核苷酸序列为序列31；
Hsa-let-7i-5p-P1，其核苷酸序列为序列32；
Hsa-let-7i-5p-P2，其核苷酸序列为序列33；
Hsa-let-7i-5p-PR，其核苷酸序列为序列34。
7.一种一步法实时荧光定量PCR检测待测microRNA的PCR试剂，包括权利要求1-6任一种的所述特异性长链引物RP1、所述特异性长链引物RP2、所述短链引物P1、所述短链引物P2和所述特异性探针PR，
所述特异性长链引物RP1、所述特异性长链引物RP2、所述短链引物P1、所述短链引物P2和所述特异性探针PR的摩尔比为1:1:5:5:5；
或，所述特异性长链引物RP1在所述PCR试剂中的浓度具体为2mM；
所述特异性长链引物RP2在所述PCR试剂中的浓度具体为2mM；
所述短链引物P1在所述PCR试剂中的浓度具体为10mM；
所述短链引物P2在所述PCR试剂中的浓度具体为10mM；
所述特异性探针PR在所述PCR试剂中的浓度具体为10mM。
8.一种一步法实时荧光定量PCR检测待测microRNA的试剂盒，包括权利要求1-6中任一所述的引物和探针或权利要求7所述的PCR试剂。
或，权利要求1-6中任一所述的引物和探针或权利要求7所述的PCR试剂或所述的试剂盒在检测或定量检测待测microRNA中的应用。
9.一种检测待测microRNA方法，包括如下步骤：用权利要求1-6中任一所述的引物和探针实时荧光定量PCR待测microRNA，实现检测待测microRNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述实时荧光定量PCR序为26-28℃5min，45℃5min；95℃30s，37℃30s，72℃30s；95℃15s，62℃30s，72℃30s，40cycles。
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