CN108165613A - 一种检测外泌体tRFRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测外泌体tRF RNA的方法。本发明所述检测方法，在tRF RNA两端加上接头序列,针对接头序列设计通用预扩增引物可以对所有小RNA进行无差别扩增，然后再以预扩增产物为模板，针对接头序列和tRF RNA序列设计特异性扩增tRF RNA的引物序列，进行针对tRF RNA的特异性扩增反应。本发明提供的检测方法，可实现外泌体tRF RNA的定量PCR检测，且本检测方法既可以增加PCR检测tRF RNA的灵敏度，又可以通过跨接头设计PCR扩增引物来区分tRF RNA及其前体tRNA。此外，本发明设计的接头序列和引物序列灵敏度高，特异性好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测外泌体tRF RNA的方法。
背景技术
tRF RNA(tRNA-derived fragments)是一类来源于成熟tRNA或tRNA前体的非编码小RNA分子,长度约16-40nt。通过精确剪切过程产生的tRF RNA可分为两类：tRNA halves(或tiRNA)和tRFs(tRF-5，tRF-3，tRF-1)(图1)。tRF RNA在体内参与多种生理及病理过程：病毒感染、氧化应激、肿瘤、神经退行性疾病、遗传性代谢疾病等。目前大部分文献用检测miRNA的荧光定量PCR的方法来检测tRF RNA.但tRF RNA来源于tRNA,传统的荧光定量PCR无法区分tRF RNA与前体tRNA.
外泌体成分包含蛋白质、miRNAs、tRF RNA、lncRNA、circRNA，可调节多种生理或病理反应，包括肿瘤细胞侵袭与转移、血管生长、免疫应答等。外泌体中的small RNA分子比较稳定,含量相对丰富，是目前外泌体研究的重点。外泌体miRNA与多种肿瘤、心血管疾病、免疫疾病、神经系统疾病的发生、耐药密切相关，同时外泌体miRNA也可以作为肿瘤诊断及预后标志物。目前检测外泌体tRF RNA的方法主要是测序及荧光定量PCR。但由于外泌体中的核算含量远远低于组织、细胞中的丰度，传统定量PCR方法灵敏度、精度不适合于外泌体tRFRNA样本。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种灵敏度高，特异性好检测外泌体tRF RNA的方法。
本发明的一个目的是提供一种检测外泌体tRF RNA的方法，所述方法包括：在tRFRNA两端加上接头序列,针对接头序列和tRF RNA序列设计引物序列，进行扩增反应。
具体的，所述方法还包括：所述在tRF RNA两端加上接头序列后，先要针对所述接头序列设计预扩增引物，进行预扩增反应，然后再以预扩增产物为模板，针对接头序列和tRF RNA序列设计引物序列，进行扩增反应。
具体的，所述在tRF RNA两端加上接头序列包括：
1)提取待测样品的外泌体RNA；
2)进行3’端加接头序列反应；
3)根据3’端接头序列设计引物，进行3’端引物杂交反应；
4)进行5’端加接头序列反应；
5)进行逆转录反应。
具体的，所述进行扩增反应包括进行实时荧光定量PCR反应。
具体的，所述接头序列包括：序列表中SEQ ID №：1所示3’端接头核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：3所示5’端接头核苷酸序列；
所述序列表中SEQ ID №：1所示3’端接头核苷酸序列还包括：将序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列的第一位核苷酸进行预腺苷化，变为rApp，同时将氨基-NH2连接在序列的3′末端。
所述针对接头序列和tRF RNA序列设计的引物序列包括：序列表中SEQ ID№：6-SEQ ID №：12所示的至少一种正向引物核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：13-SEQ ID№：19所示反向引物核苷酸序列中的至少一种。
具体的，所述预扩增引物序列包括：序列表中SEQ ID №：4所示正向引物核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：5所示反向引物核苷酸序列。
具体的，所述步骤3)中根据3’端接头序列设计的引物包括序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测外泌体tRF RNA的接头序列或引物序列，所述接头序列包括序列表中SEQ ID №：1所示3’端接头核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：3所示5’端接头核苷酸序列；
所述序列表中SEQ ID №：1所示3’端接头核苷酸序列还包括：将序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列的第一位核苷酸进行预腺苷化，变为rApp，同时将氨基-NH2连接在序列的3′末端。
所述引物序列包括：序列表中SEQ ID №：6-SEQ ID №：12所示的至少一种正向引物核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：13-SEQ ID №：19所示反向引物核苷酸序列中的至少一种。
本发明的还一个目的是提供一种用于检测外泌体tRF RNA的组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包括下述1)-3)中的至少一种：
1)本发明所述的任一接头序列和引物序列；
2)序列表中SEQ ID №：4所示正向引物核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：5所示反向引物核苷酸序列；
3)序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列。
本发明的再一个目的是提供本发明任一所述方法、本发明任一所述接头序列或引物序列、本发明任一所述组合物或试剂盒在检测外泌体tRF RNA、或在制备检测外泌体tRFRNA相关产品中的应用。
具体的，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。
本发明提供的检测方法，在tRF RNA两端加上接头序列,针对接头序列设计通用预扩增引物可以对所有小RNA进行无差别扩增，然后再以预扩增产物为模板，针对接头序列和tRF RNA序列设计特异性扩增tRF RNA的引物序列，进行针对tRF RNA的特异性扩增反应。
本发明的有益效果包括：
本发明提供的检测方法，可实现外泌体tRF RNA的定量PCR检测。
本检测方法既可以增加PCR检测tRF RNA的灵敏度，又可以通过跨接头设计PCR扩增引物来区分tRF RNA及其前体tRNA。
本发明设计的接头序列和引物序列灵敏度高，特异性好。
附图说明
图1为tRF RNA结构示意图。
图2为本检测方法通过跨接头设计PCR扩增引物来区分tRF RNA及其前体tRNA的原理示意图。
图3为本检测方法实验流程示意图。
图4为tRF PCR扩增曲线。
图5为tRF PCR标准曲线。
图6为本检测方法和传统检测方法的CT值比较图。
图7为tRF RNA PCR产物溶解曲线图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、tRF检测过程
如图1-3所示，本发明提供的检测方法，在tRF RNA两端加上接头序列,针对接头序列设计通用预扩增引物可以对所有小RNA进行无差别扩增，然后再以预扩增产物为模板，针对接头序列和tRF RNA序列设计特异性扩增tRF RNA的引物序列，进行针对tRF RNA的特异性扩增反应。
(一)3’端加接头序列
3’端接头序列的核苷酸序列如下所示：
5′-rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2-3′
3’端接头序列购自NEB公司。上述3’端接头序列具体可通过将序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列的第一位核苷酸进行预腺苷化(rApp)，同时将氨基(-NH2)连接在序列的3′末端而得到的。
Trizol法提取待测样品中的外泌体RNA。
1、接头处理
反应体系：
| 外泌体RNA | 1μg |
| 3’端接头序列 | 1μl |
| 去核酸酶的水 | 补至7μl |
反应条件：于PCR仪中70℃孵育2min
2、接头连接反应
反应体系：
| 上一步产物 | 7μl |
| 3’连接反应缓冲液(2X) | 10μl |
| 3’连接酶混合物 | 3μl |
| 总体积 | 20μl |
反应条件：于PCR仪中25℃孵育1小时。
(二)3’端引物杂交
3’端引物序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列：
5′-AGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′
反应体系:
| 上一步连接产物 | 20μl |
| 3’引物 | 1μl |
| 去核酸酶的水 | 补至25.5μl |
反应条件:PCR仪中进行杂交反应,75℃孵育5min，然后37℃孵育15min，最后25℃孵育15min.
(三)5’端加接头序列
5’端接头序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列：
5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3′
5’端接头序列为RNA序列，购自NEB公司。
反应体系:
| 上一步反应体系 | 25.5μl |
| 5’端接头序列 | 1μl |
| 5’端连接反应缓冲液(10X) | 1μl |
| 5’端连接反应酶混合物 | 2.5μl |
| 总体积 | 30μl |
反应条件:于PCR仪中25℃孵育1小时。
(四)反转录
反应体系：
| 上一步连接体系 | 30μl |
| 首链合成反应缓冲液 | 8μl |
| RNA酶抑制剂 | 1μl |
| 反转录酶 | 1μl |
| 总体积 | 40μl |
反应条件:于PCR仪中50℃孵育1小时。
(五)预扩增
AMP正向引物序列如序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCG-3′
AMP反向引物序列如序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3′
反应体系：
| 上一步反应体系 | 40μl |
| Long Amp Taq 2X Master Mix | 50μl |
| AMP正向引物 | 2.5μl |
| AMP反向引物 | 2.5μl |
| 总体积 | 100μl |
反应条件:
PCR仪中进行预扩增反应：
(六)tRF PCR荧光定量检测
正向引物序列如序列表中SEQ ID №：6-SEQ ID №：12所示核苷酸序列：
反向引物序列如序列表中SEQ ID №：13-SEQ ID №：19-所示核苷酸序列：
反应体系：
| 预扩增产物 | 2μl |
| 2X Master Mix | 10μl |
| 正向引物 | 0.6μl |
| 反向引物 | 0.6μl |
| 去核酸酶的水 | 补至20μl |
反应条件:
q-PCR仪中进行荧光定量检测：
tRF PCR荧光定量检测的扩增曲线和标准曲线分别见图4和图5
实施例2、临床样品检测
为比较实施例1所述检测流程与传统检测流程的区别，从10结肠癌患者3ml血浆样本分离外泌体RNA，并用荧光PCR检测方法检测外泌体RNA中tRF RNA的表达情况。
如图6所示，两种检测方法的CT值比较结果表明，实施例1所述检测方法较传统检测方法更灵敏。图6结果中,传统检测方法中有四个指标CT值是40左右,说明没有检测出tRFRNA来，在检测的7个tRF RNA中，传统检测方法只检测出3个指标，而本检测方法检测出7个指标。
如图7所示，本检测方法得到PCR产物溶解曲线为单一峰,说明本检测方法每次实验只特异性扩增目标tRF RNA。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海英拜生物科技有限公司
<120> 一种检测外泌体tRFRNA的方法
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagatcggaa gagcacacgt ct 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agacgtgtgc tcttccgatc t 21
<210> 3
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
guucagaguu cuacaguccg acgauc 26
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttcagagttc tacagtccg 49
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtccgacga tctcccggc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtccgacga tcttccggct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtccgacgat ctcgaacccc 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagtccgacg atcgggttg 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acagtccgac gatcaagagg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acagtccgac gatcacaagt 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtccgacga tctcataatc t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcttccgatc ttggtgcatt 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctcttccgat cttggtcctt c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctcttccgat cttggtacca g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctcttccga tctaaaagac a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctcttccga tctaaaacaa c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcttccgat ctaaaaaacc g 21
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cttccgatct tggtgccc 18
Claims (10)
1.一种检测外泌体tRF RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：在tRF RNA两端加上接头序列,针对接头序列和tRF RNA序列设计引物序列，进行扩增反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：所述在tRF RNA两端加上接头序列后，先要针对所述接头序列设计预扩增引物，进行预扩增反应，然后再以预扩增产物为模板，针对接头序列和tRF RNA序列设计引物序列，进行扩增反应。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述在tRF RNA两端加上接头序列包括：
1)提取待测样品的外泌体RNA；
2)进行3’端加接头序列反应；
3)根据3’端接头序列设计引物，进行3’端引物杂交反应；
4)进行5’端加接头序列反应；
5)进行逆转录反应。
4.根据权利要求1、2和/或3任一所述的方法，其特征在于，所述进行扩增反应包括进行实时荧光定量PCR反应。
5.根据权利要求1、2、3和/或4任一所述的方法，其特征在于，
所述接头序列包括：序列表中SEQ ID№：1所示3’端接头核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：3所示5’端接头核苷酸序列；
所述针对接头序列和tRF RNA序列设计的引物序列包括：序列表中SEQ ID№：6-SEQ ID№：12所示的至少一种正向引物核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：13-SEQ ID№：19所示反向引物核苷酸序列中的至少一种。
6.根据权利要求2、3、4和/或5任一所述的方法，其特征在于，所述预扩增引物序列包括：序列表中SEQ ID№：4所示正向引物核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：5所示反向引物核苷酸序列。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中根据3’端接头序列设计的引物包括序列表中SEQ ID№：2所示核苷酸序列。
8.一种用于检测外泌体tRF RNA的接头序列或引物序列，其特征在于，
所述接头序列包括序列表中SEQ ID№：1所示3’端接头核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：3所示5’端接头核苷酸序列；
所述引物序列包括：序列表中SEQ ID№：6-SEQ ID№：12所示的至少一种正向引物核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：13-SEQ ID№：19所示反向引物核苷酸序列中的至少一种。
9.一种用于检测外泌体tRF RNA的组合物或试剂盒，其特征在于，所述组合物或试剂盒包括下述1)-3)中的至少一种：
1)权利要求8所述的接头序列和引物序列；
2)序列表中SEQ ID№：4所示正向引物核苷酸序列和序列表中SEQ ID№：5所示反向引物核苷酸序列；
3)序列表中SEQ ID№：2所示核苷酸序列。
10.权利要求1-7任一所述方法、权利要求8所述接头序列或引物序列、权利要求9所述组合物或试剂盒在检测外泌体tRF RNA、或在制备检测外泌体tRF RNA相关产品中的应用。
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