CN109306373A - 用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒，建立了人类基因组成熟tRNA谱的检测方法。本发明克服了tRNA检测步骤冗余、基因组编码tRNA冗余和tRNA表达标准化等困难，只需要使用本发明的新型接头和引物组即可应用常规qPCR完成人类基因组中所有成熟tRNA水平的检测，实现快速、准确、高通量检测成熟tRNA谱的转录水平变化。

Description

用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及tRNA合成生物学、遗传学以及qPCR检测方法学，具体涉及用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒。

背景技术

tRNA是氨基酸的载体，主要参与遗传密码的识别，是联系基因组遗传信息和蛋白功能的重要分子。目前人类基因组中含有编码415个tRNA基因，由于tRNA分子片段较小，大约在70bp左右，常规方法不能检测此类小RNA分子。此外，还有如下几个原因导致检测这类小RNA分子存在困难：

第一、成熟tRNA需通过共价连接氨基酸分子才能行使功能，所以在接头连接之前需要首先去除连接的氨基酸；

第二、tRNA具有高度稳定的三叶草结构且含有大量的转录后碱基修饰，因此常规方法不能获得tRNA的cDNA分子；

第三、人类基因组编码了冗余的tRNA拷贝，高通量检测所有tRNA十分繁杂；

第四，由于tRNA分子短，结构复杂，常规方法获得cDNA步骤冗长，大大限制tRNA检测方法的应用。

目前tRNA检测的高通量测序的检测方法已经建立了，但是其试验设备依赖性强、试验周期长、价格昂贵，大大的限制了tRNA生物学的研究。

qPCR技术由美国Applied Biosystems公司于1996年推出，其作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。目前尚没有使用常规qPCR技术实现tRNA检测的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组、试剂盒及应用。

本发明还提供了相应的人类基因组成熟tRNA谱检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5phos/TCGTAGGGTCCGAGGTATTCACGATGrGrN，SEQ ID NO.1；5phos表示5’端起始碱基有磷酸基团修饰，TCGTAGGGTCCGAGGTATTCACGAT为脱氧核糖核酸序列，GrGr为核糖核酸序列，N为任意碱基。

用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组，包括如SEQ ID NO.2～115所示的57对引物，见表1。

表1.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组

注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T

用于人类基因组成熟tRNA谱检测的试剂盒，包括上述接头和引物组。

一种人类基因组成熟tRNA谱检测方法，具体步骤如下：

(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；

(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与上述接头混合，孵育，得含有连接tRNA的混合液；

(3)将步骤(2)所得混合液与特异性下游引物混合物混合配置成退火溶液，连接tRNA退火化；所述特异性下游引物混合物为上述引物组中的下游引物混合物；

(4)退火化的连接tRNA与mRNA共反转录；

(5)qPCR检测。

优选的，步骤(1)中，总RNA抽提过程中，洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE缓冲液洗脱，即可在总RNA抽提的同时实现tRNA去氨基酸。

优选的，步骤(2)中，抽提总RNA与接头的配比为20ng：1pm。

优选的，步骤(2)中，孵育的具体方法如下：

(2-1)配置退火溶液，90℃孵育3分钟；

(2-2)加入退火缓冲液，37℃孵育20分钟；

(2-3)配置连接反应体系，37℃孵育60分钟。

进一步优选的，步骤(2-1)中，退火溶液的组成如下：接头2μl(20pm)，总RNA400ng，无RNA酶水补充至9μl。

更进一步优选的，步骤(2-2)中，加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)。

更进一步优选的，步骤(2-3)中，连接反应体系的组成如下：步骤(2-2)所得溶液10μl，连接酶缓冲液(NEB,M0239L)2μl，T4RNA连接酶(NEB,M0239L)0.1μl，无RNA酶水7.9μl。

优选的，步骤(3)中，退火溶液的组成如下：步骤(2)所得混合液20μl，特异性下游引物混合物3.42μl，无RNA酶水0.58μl。

优选的，步骤(3)中，退火化的条件为：65℃孵育5分钟，立即冰上孵育5分钟。

优选的，步骤(4)的具体方法：加入共反转录反应液，按照说明书提供的步骤操作，37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。

进一步优选的，加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix共反转录反应液。

优选的，步骤(5)中，qPCR的反应体系如下：2×SYBRTM Green PCR Master Mix 5μl，cDNA 2μl，上游引物混合物(10pm)0.25μl，下游引物混合物(10pm)0.25μl，双蒸水2.5μl；反应程序如下：95℃预变性30s，95℃变性10s，58.3℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃。

上述接头、引物组或试剂盒在人类基因组成熟tRNA谱检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明利用荧光定量PCR仪检测SYBR荧光染料的特点，将根据GtRNA2.0公布的人类基因组tRNA基因序列设计用于荧光定量的PCR引物和新型接头，经反复试验，优化qPCR反应体系和反应参数，建立了检测人类基因组成熟tRNA谱的试剂盒及方法。

本发明简化了RNA提取和去氨基酸步骤，设计了新型接头用于成熟tRNA的连接，创新性的提出了tRNA和mRNA共反转录方法。本发明克服了tRNA检测步骤冗余、基因组编码tRNA冗余和tRNA表达标准化等困难，只需要使用本发明的新型接头和引物组即可应用常规qPCR完成人类基因组中所有成熟tRNA水平的检测，实现快速、准确、高通量检测成熟tRNA谱的转录水平变化。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明的试验原理图；

图2为戊型肝炎病毒(HEV)细胞感染模型tRNA谱差异比较分析。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例：

qPCR检测人类肝癌细胞系戊型肝炎病毒(HEV)细胞感染模型tRNA谱差异比较分析

1.试验材料

人肝癌细胞系(Huh7.0)(JCRB No.：JCRB0403)，Huh7.0-HEV细胞模型和Huh7.0-HEV-luc细胞模型是将HEV基因组全长RNA或HEV-luc RNA转染Huh7.0后获得，参考文献(Shukla,P.,et al.(2012)."Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus toefficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segmentacquired by recombination."J Virol 86(10):5697-5707.)制备，RNA抽提:NucleoSpin^@RNA(MACHEREY-NAGEL,740955.250)，脱酰基缓冲液(50ml):5×Tris-HCl(100mM,pH9.0)，退火缓冲液(50ml):10×Tris-HCl(50mM,PH8.0)，T4RNA连接酶(dsRNA连接酶)(NEB,M0239L)，5×Prime Script RT Master Mix(Takara,RR036Q)，Applied Biosystems SYBRTM GreenPCR Master Mix(Applied Biosystems:4344463)。

2.试验方法(参考图1)

2.1采用NucleoSpin^@RNA试剂盒抽提Huh7.0非感染细胞系和HEV-(Luc)感染细胞系

具体步骤与试剂盒说明书相同，本发明将去氨基酸步骤和RNA抽提合并以简化步骤，即在洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE缓冲液洗脱。

2.2将抽提的tRNA与新型接头连接

具体步骤如下：

1.取400ng总RNA，加入2μl(20pm)tRNA接头，最后加无RNA酶水补充至9μl，在90℃孵育3分钟。

2.在上述反应液体中加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)，37℃孵育20分钟。

3.在上述反应液中加入连接酶缓冲液2μl，T4RNA连接酶0.1μl，无RNA酶水7.9μl，37℃孵育60分钟。

2.3mRNA与tRNA共反转录

具体步骤如下：

1.在2.2中连接产物20μl，加入特异性下游引物混合液3.42μl，加入无RNA酶水0.58μl补充至24μl，在65℃孵育5分钟，立即冰上孵育。

2.在上述体液中加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix共反转录反应液，在37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。

2.4qPCR反应体系配置及程序

具体步骤如下：

1.利用 Premix Ex TaqTM II试剂对各tRNA和内参基因GAPDH的转录情况进行检测，tRNA谱检测的引物组序列如表1中所示，qPCR反应体系配置： PremixEx TaqTM II加入5μl；上下游引物(10pm)各0.25μl；cDNA模板2μl；加入双蒸水补充至10μl。2.Real-Time PCR反应条件：

预变性95℃30s；变性95℃10s；退火延伸58.3℃30s；延伸72℃30s，45次循环

95℃60s，65℃60s，65℃-95℃每个循环增加0.3℃，绘制溶解曲线以确定扩增产物是否为特异。

2.5采用2^-ΔΔCt法计算HEV细胞感染模型的tRNA谱差异

结论：

如图2所示，所有的基因组编码的成熟tRNA均可被检测到，且Ct值低于35(阈值为0.1)。在Huh7.0-HEV-luc细胞模型中，大部分的成熟tRNA表达量比非感染细胞低，然而在Huh7.0-HEV细胞模型中，大部分的成熟tRNA表达量比非感染细胞高。以上两种细胞系tRNA谱的比较分析可以表明，tRNA-Gly-CCC、tRNA-Pro-GGG和tRNA-Pro-UGG是共同上调的tRNA；tRNA-Arg-CCU和tRNA-Val-TAC共同下调的tRNA。这些数据对于揭示病毒调节细胞tRNA谱提供了重要的参考和技术支持。本发明可以广泛的应用于人类tRNA生物学的研究，以及相关的研究领域。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 四川农业大学

西北民族大学

<120> 用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒

<160> 115

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgtagggtc cgaggtattc acgatggn 28

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

rtryccgcgt gggttcga 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttaagtcca acgccttaac cactc 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttctggtctc crbatggagg c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagtctggcg ccttagacca 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctccagtctc ttcggrggc 19

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatccagcgc cttagaccgc tcggcc 26

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctccagtcw yttcgrdggc g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atccagcgcc ttagaccrct 20

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtcgcagtc tcccctg 17

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaacgcagcg ccttagacc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taacgccaag gtcgygggt 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tagcaccacg ctctraccaa ct 22

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ataacaccaa ggtcgcggg 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagcaccacg ctcttaccaa c 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

yratgccgag gttgtgagtt c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ataagtaccg cgcgctaacc 20

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ataacccaga ggtcgatgga tcgaaac 27

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcccagcac gcttcc 16

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aractgacgc gctgcchg 18

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

taatctgaar gtcstgagtt crarcctc 28

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atcagagggt ccagggttca a 21

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agtctgatgc tctaccaact gaact 25

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagcaacctc ggttcgaatc 20

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgcagagtac taaccactat acgatc 26

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agatctaaag gtccctggtt cratcc 26

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cagtctaacg ctctcccaac tga 23

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cacgcgaaag gtccccg 17

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

taggcgaacg tgataaccac tacac 25

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cacgcagaag gtcctggg 18

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaagcagayg tgataaccac tacactat 28

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cacgcgaaag gtccccg 17

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tgaggcgaac gtgataacca ct 22

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

agaaatccat tggggtytcc c 21

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

agtccatcgc cttaaccact cggc 24

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aatccattgg ggtytccccg 20

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aagtccawcg ccttaaccac tcg 23

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aaatccaatg gggkytcccc g 21

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gagtccaacr ccttaaccac tc 22

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ggtgcgagag gtcccgg 17

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

taagcgagaa tcatacccct agacca 26

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ggctgctgat cccaggc 17

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cagagcgcac atttctaacc actatg 26

<210> 44

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gtgcgagagg tcccggg 17

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aaagcgagaa tcatacccct agacc 25

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gggtgygaga ggtcccgg 18

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

aagcgagaat cataccccta gacc 24

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

taaacaggag atcctgggtt cgaatc 26

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ctagacaggc gctttaacca gctaa 25

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

taaaccaggg gtcgcgagtt 20

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

caagaccagy gctctaaccm ct 22

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

cgtaaacmgr agatcvyggg ttc 23

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

agacmgrcgc yttaacmaac trrg 24

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

atgtrygagg ycccgggttc r 21

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

aagcatgcgc tctaccactg 20

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

caaacaggag atgctggatt tcaatcc 27

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cagacaagta ctttaaccca caaagcc 27

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ygtrtgaggy cycgggttcr 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

aagcatgcgc tctaccactg 20

<210> 60

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

catgyaygag gyccygg 17

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

taagcaygcg ctcyaccrct 20

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

aatctaaaga cagaggtcaa gvyct 25

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

atagtctaat gcttactcag ccattttacc 30

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

catccttagg tcgctggttc ga 22

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gtcctccgct ctaccarctg a 21

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

catccttagg tcgctggttc ga 22

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gtcctccgct ctaccarctg a 21

<210> 68

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

atccagcrat ccgagttcra at 22

<210> 69

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

agtccagagt gctaaccatt acacc 25

<210> 70

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

atccagcgat ccgagttcra rt 22

<210> 71

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

agtccagagt gcthaccatt acacc 25

<210> 72

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

aaccgaacgg tgagtagttc aaga 24

<210> 73

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

tagccgaacg ctctgaccg 19

<210> 74

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

acygaaagat trgtggtkcr ag 22

<210> 75

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

acagycraay gcgctaac 18

<210> 76

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

ttaatctgag ggtccrgggt tc 22

<210> 77

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

agtctgatgc tctaccract gag 23

<210> 78

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

taatcycagg gtcgtgggtt cg 22

<210> 79

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

gagtcycatg ctctaccgac tgag 24

<210> 80

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

cacgaggtct tgggctgatt c 21

<210> 81

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

tgataagtac actctctacc actgagct 28

<210> 82

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

tcacgcggga gaccgg 16

<210> 83

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

aggcggggat actcaccact a 21

<210> 84

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

ttcaccsmsg yggcccg 17

<210> 85

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

arcsmsgaat cctarccrct agac 24

<210> 86

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

gattcggcgc tctcaccg 18

<210> 87

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

ctaaccacta gaccaccagg ga 22

<210> 88

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

ctttaaagtc atatgtagct gggttcaa 28

<210> 89

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

gttacatagc ttatagagtt gcttttga 28

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

gatcaagagg tcccyggttc a 21

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

agtcaaatgc tctaccmctg agc 23

<210> 92

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

gatcagaagg ttgcgtgttc aaatc 25

<210> 93

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

ggagtcagac gcgctacc 18

<210> 94

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

gatcagaaga ttcyaggttc gactcc 26

<210> 95

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

agtcagacgc gttatccatt gc 22

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

gatcagaaga ttgmrggttc gartc 25

<210> 97

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

agtcagacgc cttatccatt aggc 24

<210> 98

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

gakcwgrrga ttgwgggttc gagtcc 26

<210> 99

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

arkcwgaygc cttatccatt aggc 24

<210> 100

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

taatgccagg gtcgaggttt cg 22

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

agcagcacgc tctaaccaac 20

<210> 102

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

aatccattgt gctctgcacg c 21

<210> 103

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

agtccatcgc cttaaccact cg 22

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

aatycaragg ttcygggttc g 21

<210> 105

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

aagtccaryg cgctcrtc 18

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

taagccaggg attgtgggtt c 21

<210> 107

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

aggccartgc cttatccatt agg 23

<210> 108

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

acgcrggagg cccrggt 17

<210> 109

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

caggcragaa ttctaccact gaacc 25

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

caagcagttg acccgggttc 20

<210> 111

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

aaggcagcta tgcthaccac tatacc 26

<210> 112

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

ckkgmgmccc gggttcra 18

<210> 113

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

arkckwgmat kmtaccactr macc 24

<210> 114

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

aaacctgtag ctgtctagyg acaga 25

<210> 115

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

aagcctgcac cccagacc 18

Claims (9)

1.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO.2～115所示的57对引物。

3.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的接头和权利要求2所述的引物组。

4.一种人类基因组成熟tRNA谱检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；

(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与权利要求1所述接头混合，孵育，得含有连接tRNA的混合液；

(3)将步骤(2)所得混合液与特异性下游引物混合物混合配置成退火溶液，连接tRNA退火化；所述特异性下游引物混合物为权利要求2所述引物组中的下游引物混合物；

(4)退火化的连接tRNA与mRNA共反转录；

(5)qPCR检测。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，总RNA抽提过程中，洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE缓冲液洗脱，即可在总RNA抽提的同时实现tRNA去氨基酸。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，孵育的具体方法如下：

(2-1)配置退火溶液，90℃孵育3分钟；

(2-2)加入退火缓冲液，37℃孵育20分钟；

(2-3)配置连接反应体系，37℃孵育60分钟。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，退火化的条件为：65℃孵育5分钟，立即冰上孵育5分钟。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)中，qPCR的反应体系如下：2×SYBRTM Green PCR Master Mix 5μl，cDNA 2μl，上游引物混合物(10pm)0.25μl，下游引物混合物(10pm)0.25μl，双蒸水2.5μl；反应程序如下：95℃预变性30s，95℃变性10s，58.3℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃。

9.权利要求1所述接头、权利要求2所述引物组或权利要求3所述试剂盒在人类基因组成熟tRNA谱检测中的应用。