CN102453771B - 一种1型鸭病毒性肝炎rt-lamp检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明公开了1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于其包含2对引物，它们的核酸序列如SEQIDNO.1-4所示。本发明所述检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前鸭病毒性肝炎检测方法上的不足，可以满足当前该病的检测需求，易于大范围推广应用，可减少该病在鸭等动物中的流行，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis，DHV）是一种传播迅速、高度致死性雏鸭的病毒病由三种不同内型的病毒引起，分别是1型、2型和3型鸭肝炎病毒，其中，1型鸭肝炎流行最广，我国主要的流行株也是1型鸭肝炎。该病毒主要侵害1周龄内的雏鸭，主要病理变化是肝脏肿大，出血等，发病率高，病死率高，耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，造成极大的经济损失，是目前危害禽类养殖业的主要传染病之一。
目前，已有多种检测1型鸭肝炎抗原的方法，如病毒中和试验、免疫电镜和Dot-ELISA，也有许多免疫血方法，如ELISA、单克隆抗体-PAP法等，但上述方法所需检测时间长、特异性和灵敏性低且必须配备专用设备，操作复杂，常有非特异性出现，不利于快速、准确诊断，因而未得到广泛推广和应用。
近年来，由Notomi T等开发的一种简单、迅速、特异的核酸扩增方法环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），被广泛的应用于多种病毒性疾病和细菌性疾病的诊断中（Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., et al. Nucleic Acids Res. 2000(28),e63; K. Nagamine, T. Hase, T. Notomi. Molecular and Cellular Probes .2002(16):223-229）。该技术使用4条不同引物识别6个不同区域的靶基因，应用链置换扩增反应在恒温条件下完成扩增；具有很高的扩增效率，在15到60min内可将DNA扩大109-1010倍；不需要特殊试剂和精密设备。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异性和灵敏性高的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒和检测方法。
为此，本发明公开了一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其含有荧光染料、10×反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、AMV逆转录酶、Mg2+、TritonX-100和引物，其特征在于所述引物为2对引物：F3和B3；FIP和BIP；LF和LB，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO.1所示, 所述B3的核酸序列如SEQ ID NO.2所示, 所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO.3所示, 所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施例中，所述1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒还含有甜菜碱（Betaine solution，5M）和RNase酶抑制剂。
所述荧光染料为能与双链DNA结合产生荧光的染料，可为溴化乙锭、SYBR Green I荧光染料或Hoechst 33258，最优选为SYBR Green I荧光染料。
另一方面，本发明还公开了一种1型鸭病毒性肝炎的检测方法，包括下列步骤：
a) 取禽类的体液或组织液，抽提RNA，并以此为模板；
b) 利用2对引物：F3和B3、FIP和BIP进行LAMP反应，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO.1所示, 所述B3的核酸序列如SEQ ID NO.2所示, 所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO.3所示, 所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO.4所示,反应条件为63℃ 40-60分钟， 80℃ 灭活；
c) 检测RT-LAMP反应产物。
在一些实施例中，所述禽类为鸭。
在一实施例中，步骤b中所述反应条件为63℃ 45分钟，80℃ 灭活；
在一些实施例中，步骤c中所述检测RT-LAMP反应产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法、荧光显色法或分光光度计法。所述荧光显色法为SYBR Green I荧光显色法。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点：
1） 4条引物对序列的8个特异区域进行识别，扩增反应只有在4条引物完全识别靶序列的情况下才能进行，在很大程度上减少了扩增反应的背景，保证了RT-LAMP扩增的高度特异性。
2）对硬件设备基本无要求，在普通的生物学实验室就可完成检测工作，减少了污染的机会并方便了实验过程中的质控工作。
3）检测时间可以缩短到40分钟，最低可以检测到15pg RNA，提高了灵敏度。
4）可视化鉴定，向反应产物中加入荧光染料，如果有扩增，荧光染料就会和DNA结合，通过肉眼即可观察反应液呈现明亮的橙黄色，如反应液没有橙黄色，则说明呈阴性反应。
本发明所述检测试剂盒及其检测方法具有快速、敏感、特异、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前鸭病毒性肝炎检测方法上的不足，可以满足当前该病的检测需求，易于大范围推广应用，可减少该病在鸭等动物中的流行，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。
附图说明
图1 本发明设计的RT-LAMP引物对不同病毒、细菌RT-LAMP扩增结果；
图2 反应产物荧光染料显色示意图；
图3 RT-LAMP反应产物进行BamH I 酶切结果；
图4 不同作用时间对RT-LAMP检测1型鸭肝炎病毒的影响；
图5 RT-LAMP敏感性实验结果；
图6 RT-PCR敏感性实验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
实施例1：1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测
按下列组成配制鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测反应液：
（1）反应液A：含有10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTP（2.5mM each）、Betaine solution(5M)、AMV、RNase Inhibitor、0.1%TritonX-100，Mg2+、2对引物其序列为：
F3：3’ GCTATGACATCAACCAATGT 5’ (SEQ ID NO.1)
B3：3’ TCTATCTCCATAGGGGCTAG 5’ (SEQ ID NO.2)
FIP： 3’TAGTTTTGAGATATCGCGCACCTC--TGTCGTTAGTTATGGGGATGA 5’ (SEQ ID NO.3)
BIP：3’TCGCACTATTTCAAGCTTTTCTTTG--GTTATGTCACTTTCTTTGTCACTAG5’ (SEQ ID NO.4)
（2）反应液B：10000×SYBR green I
反应液A每管23μL体系组成为：
（3）1型鸭病毒性肝炎RNA模板制备
1型鸭病毒性肝炎FC64株接种9日龄SPF鸡胚，待鸡胚死亡后收集尿囊液，参照TRIzol Reagent（Invitrogen）使用说明和文献进行病毒RNA抽提，-70℃保存备用。
（4）1型鸭病毒性肝炎FC64株RT-LAMP检测结果
在反应液A中，加入制备的2μL鸭肝炎毒株FC64 RNA模板，混匀，63℃水浴45分钟，80℃水浴灭活10分钟，将反应产物分为2份，一份加入1μL荧光染料SYBR green I，观察检测结果，另外一份进行电泳检测。结果均呈现特异性的反应，见图1，泳道1-10分别为：Marker、1型鸭肝炎FC64株、DPV、禽大肠杆菌、1型鸭肝炎SH株、1型鸭肝炎MY株、1型鸭肝炎SY株、AIV、NDV-LaSota株,泳道10为阴性对照；图2中A显橙黄色为阳性，B为阴性。
（5）鸭肝炎病毒
对（4）中RT-LAMP反应产物进行BamH I 酶切，酶切产物电泳检测出现预期大小的2条特异性条带，测序结果表明上述2片段与3D序列100%同源，结果进一步表明本发明建立的方法可对3D基因进行特异性扩增，见图3。
（6）RT- LAMP 反应时间的确立
为验证本发明的最短检测时间，对63℃水浴步骤分别作了不同时间点的反应（分别为10、20、30、40、50、60分钟），其它试验步骤同（4）所述，琼脂糖凝胶电泳结果表明63℃水浴步骤作用40分钟，即可进行结果判定，见图4，图中泳道1-8分别为Marker、10、20、30、40、50、60分钟和阴性对照。
实施例2：RT-LAMP检测1型鸭肝炎的灵敏度
（1）鸭肝炎病毒模板制备
1型鸭病毒性肝炎FC64株接种9日龄SPF鸡胚，待鸡胚死亡后收集尿囊液，参照TRIzol Reagent（Invitrogen）使用说明和文献进行病毒RNA抽提，定量为1.45μg/μL，作为RT-LAMP 模板。同时，取5μL RNA 反转录成20μL cDNA，10倍倍比稀释，作为RT-PCR的模板。
（2）RT-LAMP和RT-PCR对1型鸭肝炎病毒灵敏度的检测比较
在反应液A中，加入上述实施例1制备的不同浓度的鸭肝炎病毒RNA 2μL作为模板，混匀，63℃水浴40分钟，80℃水浴灭活10分钟，进行电泳检测。结果表明本发明建立的RT-LAMP检测方法最低可以检测出15pg DHV-RNA见图5，图中泳道0-8检测的1型鸭病毒性肝炎病毒RNA量分别为：Marker、0.15μg、1.5×10-2μg、1.5×10-3μg、1.5ng、0.15ng、15pg、1.5pg、0.15pg；泳道9：阴性对照。
依据3D序列，设计１对特异性的引物：
3D-F: 5’ ACAATGACCCAGCCTTAG 3’
3D-R: 5’ CCACTGTATCTTCCCTTC 3’, 加入制备的不同浓度的鸭肝炎病毒c DNA 2μL作为模板，按照下列反应体系进行PCR：
| 反应组分 | 体积（μL） |
| 10×Taq Buffer（Mg2+ Free） | 2 |
| Taq（2.5U/μL） | 1 |
| MgCl2（25mM） | 2 |
| dNTP（2.5mM each） | 4 |
| 3D-F（10pM） | 1 |
| 3D-R（10pM） | 1 |
| 超纯水 | 12 |
| 模板 | 2 |
| 总体积 | 25 |
反应条件：94 ℃ 4min；94 ℃ 40s，50 ℃ 40s，72 ℃ 1min，30个循环；72 ℃10min。反应产物电泳检测的结果表明，PCR检测方法最低可以检测出7.2ng鸭肝炎病毒的RNA，见图6，其中图中泳道2-5检测的鸭肝炎病毒RNA分别为：0.72μg、0.072μg、7.2ng、0.72ng；泳道6：阴性对照。结果表明本发明建立的RT-LAMP技术灵敏度是RT-PCR技术的480倍。
实施例3：1型鸭病毒性肝炎病毒快速RT-LAMP检测试剂盒
一种1型鸭肝炎病毒快速检测试剂盒，包括下列试剂：
荧光染料SYBR green I、10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTP（2.5mM each）、Betaine solution(5M)、AMV、RNase inhibitor、Mg2+、0.1%TritonX-100、2对引物，其序列为：
F3：3’ GCTATGACATCAACCAATGT 5’ (SEQ ID NO.1)
B3：3’ TCTATCTCCATAGGGGCTAG 5’ (SEQ ID NO.2)
FIP： 3’TAGTTTTGAGATATCGCGCACCTC-TGTCGTTAGTTATGGGGATGA 5’ (SEQ ID NO.3)
BIP：3’TCGCACTATTTCAAGCTTTTCTTTG-GTTATGTCACTTTCTTTGTCACTAG 5’ (SEQ ID NO.4)
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
序 列 表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所
<120> 一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法
<130> 序列表
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 1
gctatgacat caaccaatgt 20
<210> 2
<211> 0
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 2
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 3
tagttttgag atatcgcgca cctctgtcgt tagttatggg gatga 45
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 4
tcgcactatt tcaagctttt ctttggttat gtcactttct ttgtcactag 50
Claims (5)
1.一种1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其含有荧光染料、10×反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、AMV逆转录酶、Mg2+、TritonX-100和引物，其特征在于所述引物为2对引物：F3和B3、FIP和BIP，其中所述F3的核酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述B3的核酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述FIP的核酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述BIP的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于其还含有甜菜碱和RNase酶抑制剂。
3.根据权利要求2所述的鸭1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为能与双链DNA结合产生荧光的染料。
4.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为溴化乙锭、SYBR Green I荧光染料或Hoechst33258中之一。
5.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述荧光染料为SYBR Green I荧光染料。
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