CN103509879B - 一种鸭甲肝病毒通用的lamp检测试剂盒 - Google Patents

一种鸭甲肝病毒通用的lamp检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒。本发明采用环介导等温扩增（LAMP）技术，根据鸭甲肝病毒3D基因的保守序列设计一对外引物和一对内引物（如SEQ NO.1-4），建立鸭甲肝病毒的的检测试剂盒，包含以下成分：TRIZol；反应液；SYBR Green Ⅰ；阳性对照；DEPC处理水。本发明试剂盒具有操作简便、检测快速、敏感性高、特异性好等优点，特别是对仪器的要求低，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。

Description

一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒，专用于鸭甲肝病毒的诊断，属于生物技术领域。
背景技术
鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的鸭病毒性肝炎是影响我国养鸭业发展的主要疾病之一。该病毒主要感染3周龄内的雏鸭，感染率高、发病快、死亡率高，若不及时治疗，死亡率可达50%以上。该病波及面广、发病率高、危害严重，每年都会给我国的养鸭业造成严重的经济损失。鸭甲肝病毒分为A、B、C三个基因型，它们之间无抗原交叉性，目前在我国流行的主要是A型和C型。
对于鸭甲肝病毒的实验室诊断，可以采取传统的血清中和实验，但该方法存在耗时长、不易标准化等缺点。也可以采取快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术，如RT-PCR、荧光定量PCR等，但这些方法需要PCR仪或者荧光定量PCR仪、电泳系统等较为复杂的仪器设备，大多数小型或个体的养殖场，缺乏此类硬件条件，使得这些方法的推广与应用受到限制。
环介导等温扩增（LAMP）技术是一种新的体外扩增特异性基因的分子生物学方法。该方法只需要简单的水浴锅，在30-90min内即可扩增大量的目的基因，而且可以不需要核酸电泳的方法来判断结果，仅通过在紫外线下肉眼观察就能判断结果。LAMP检测技术具有操作简便、检测快速、高效实用等优点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。
发明内容
本发明的目的是利用LAMP技术建立一种鉴别鸭甲肝病毒通用的检测试剂盒，该试剂盒具有快速、准确、敏感性高、特异性好、成本低等特点，完全能够满足基层现场快速检测鸭甲肝病毒感染的需要。
本发明的技术方案是：一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒，其特征是，包括以下组分（50次量）：
1）TRIZol：50ml；
2）反应液：2000μL，包括10×Bst buffer250μL、dNTP(10mmol/L)100μL、MgCl2(25mmol/L)300μL、betaine(5mol/L)200μL、外引物DHV-F3、DHV-B3(10μmol/L)各50μL、内引物DHV-FIP、DHV-BIP(40μmol/L)各100μL、RNA酶抑制剂(40U/μL)100μL、反转录酶AMV(5U/μL)100μL、Bst DNA聚合酶(8U/μL)100μL、DEPC处理水550μL；
3）SYBR GreenⅠ：100μL；
4）阳性对照：重组质粒T-DH250μL，浓度为0.1ng/μL；
5）DEPC处理水：1ml。
上述试剂除SYBR GreenⅠ购自Invitrogen公司外，其余均购自大连宝生物（TAKARA）公司。
所述检测引物DHV-F3、DHV-B3、DHV-FIP、DHV-BIP依次为：
DHV-F3：5'-ATCTGGYTGTGCTGTTGGRAT-3'（SEQ NO.1）
DHV-B3：5'-CATARCAYTGRTTGATGTCATAKCC-3'（SEQ NO.2）
DHV-FIP：5'-ACTCARAGABCCATCRAAWCCAGTTTTGAGTGGGAYAATYTGTTRGC-3'（SEQ NO.3）
DHV-BIP：5'-CHCAYTATGTAACTGATGAGATHTGGTTTTACAGTRGTRCAKGGDGATCCTGA-3'（SEQ NO.4）
（R＝A或G；Y＝C或T；H＝A,T或C；D=G,A或T；W＝A或T；B＝G,T或C；K＝G或T）
所述重组质粒T-DH的详细制备方法：
按照TRIZol试剂说明提取A型鸭甲肝病毒RNA，利用引物DHV-F3/DHV-B3进行RT-PCR，扩增目的条带，反应条件如下：
RT反应体系（20μL）：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL的引物DHV-B31.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水11.5μL；置于PCR扩增仪进行反应，5U/μL反转录酶AMV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min。
PCR反应体系（50μL）：ddH2O39μL、20pmol/μL的引物DHV-F31.0μL、10×PCR缓冲液4.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、RT产物5.0μL；置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃2min预变性；94℃变性15sec、60℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
回收目的条带，与载体pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，PCR鉴定阳性后送上海博尚生物工程有限公司测序。序列正确的质粒标记为T-DH作为鸭甲肝病毒的阳性对照。
所述检测试剂盒的操作步骤：
1）RNA提取：取200μL待检鸭病料匀浆液，加入1ml TRIZol，充分震荡，静置10min后加入200μL氯仿，充分混匀，静置5min后，12000rpm离心10min，取上清加入等体积的异丙醇，充分混匀后，放-20℃静置1h以上。然后12000rpm离心15min，弃掉上清，加入75%酒精500μL，12000rpm离心5min，弃掉上清，RNA沉淀干燥后加入10μL DEPC处理水，备用；
2）LAMP反应：取20μL反应液，加入5μL待检RNA，混匀后按下面的程序进行反应：60℃90min，85℃2min；
3）阳性对照：取20μL反应液，加入5μL阳性对照物，混匀后按下面的程序进行反应：60℃90min，85℃2min；
4）结果判断：可采取两种方法判断结果。
一是电泳观察：取5μL PCR产物加入1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳观察，若出现阶梯状条带，可判断为鸭甲肝病毒阳性；若未出现，则可判断为鸭甲肝病毒阴性。
二是肉眼观察：反应结束后，取1μL SYBR GreenⅠ加入产物中，混匀后在紫外线下观察结果。若有白色荧光，可判断为鸭甲肝病毒阳性；若无，则可判断为鸭甲肝病毒阴性。
本发明具有下列优点：
1.本发明建立的LAMP检测方法对鸭甲肝病毒RNA的最低检出量为0.1pg，敏感性比RT-PCR方法提高10倍；
2.本发明建立的LAMP检测技术具有操作简便、检测快速、高效实用等优点，特别是对仪器的要求低，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。
附图说明
图1是检测试剂盒的特异性检测结果。
图1-1为电泳结果；图1-2为SYBR GreenⅠ染色结果。其中M为DNA Marker DL2000；1-7所对应的病毒分别为A型鸭甲肝病毒、B型鸭甲肝病毒、C型鸭甲肝病毒、新型鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭坦布苏病毒。
图2是A型鸭肝炎病毒敏感性检测结果。
图2-1为电泳结果；2-2为SYBR GreenⅠ染色结果；图2-3为RT-PCR扩增的电泳结果。其中M为DNA Marker DL2000；1-6所对应的病毒RNA的含量分别为100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg。
图3是B型鸭肝炎病毒敏感性检测结果。
图3-1为电泳结果；3-2为SYBR GreenⅠ染色结果；图3-3为RT-PCR扩增的电泳结果。其中M为DNA Marker DL2000；1-6所对应的病毒RNA的含量分别为100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg。
图4是C型鸭肝炎病毒敏感性检测结果。
图4-1为电泳结果；4-2为SYBR GreenⅠ染色结果；图4-3为RT-PCR扩增的电泳结果。其中M为DNA Marker DL2000；1-6所对应的病毒RNA的含量分别为100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg。
具体实施方式
1.检测引物的设计
根据Genbank中已登录DHAV的3D基因利用Primer5.0软件分别设计一对外引物和一对内引物，用于鸭甲肝病毒的LAMP检测，序列见表1。
表1LAMP检测引物
注：R＝A或G；Y＝C或T；H＝A,T或C；D=G,A或T；W＝A或T；B＝G,T或C；K＝G或T。
2.反应条件的优化
通过调整引物浓度、反应温度、反应时间等方面对反应条件进行优化。优化后的反应条件为：
反应体系（25μL）：10×Bst buffer2.5μL、dNTP(10mmol/L)1μL、MgCl2(25mmol/L)3μL、betaine(5mol/L)2μL、外引物DHV-F3、DHV-B3(10μmol/L)各0.5μL、内引物DHV-FIP、DHV-BIP(40μmol/L)各1μL、RNA酶抑制剂(40U/μL)1μL、反转录酶AMV(5U/μL)1μL、BstDNA聚合酶(8U/μL)1μL、RNA模板5μL、DEPC处理水5.5μL。
反应程序：60℃90min，85℃2min。
3.特异性试验
按照TRIZol试剂说明分别提取鸭甲肝病毒（A、B、C三个亚型）、新型鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭坦布苏病毒的RNA，以此为模板利用上述反应条件分别进行LAMP检测，反应结束后，各取5μL产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察，出现特征性阶梯状条带判为阳性。结果（如图1所示）：该LAMP检测方法仅对A、B、C型鸭甲肝病毒扩增结果为阳性，而对新型鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭坦布苏病毒均扩增不出条带。
4.敏感性试验
按照TRIZol试剂说明分别提取A、B、C型鸭甲肝病毒的RNA，利用分光光度计测定RNA的含量，并将这些RNA稀释至20pg/μL、2pg/μL、0.2pg/μL、0.02pg/μL、0.002pg/μL、0.0002pg/μL等六个浓度（即LAMP检测体系中RNA含量分别为100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg），然后进行LAMP检测。反应结束后，取5μL产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察，出现特征性阶梯状条带判为阳性，或者在产物中加入1μL SYBR GreenⅠ，混匀后在紫外线下观察，若有白色荧光，可判断为阳性。同时以上述不同含量的RNA为模板，以DHV-F3/DHV-B3为引物进行RT-PCR，比较这两种方法的敏感性。结果（如图2-4所示）：利用该LAMP检测方法，A、B、C型鸭甲肝病毒RNA的最低检出量均为0.1pg；利用RT-PCR方法，这三型鸭甲肝病毒RNA的最低检出量均为1pg。可见，该LAMP检测方法的敏感性是常规RT-PCR检测的10倍。
5.在上述LAMP检测方法的基础上，组装出相应的试剂盒（50次），包括以下成分：
1）TRIZol：50ml；
2）反应液：2000μL，包括10×Bst buffer250μL、dNTP(10mmol/L)100μL、MgCl2(25mmol/L)300μL、betaine(5mol/L)200μL、外引物DHV-F3、DHV-B3(10μmol/L)各50μL、内引物DHV-FIP、DHV-BIP(40μmol/L)各100μL、RNA酶抑制剂(40U/μL)100μL、反转录酶AMV(5U/μL)100μL、Bst DNA聚合酶(8U/μL)100μL、DEPC处理水550μL；
3）SYBR GreenⅠ：100μL；
4）阳性对照：重组质粒T-DH250μL，浓度为0.1ng/μL；
5）DEPC处理水：1ml。
6.试剂盒操作步骤：
1）RNA提取：取200μL待检鸭病料匀浆液，加入1ml TRIZol，充分震荡，静置10min后加入200μL氯仿，充分混匀，静置5min后，12000rpm离心10min，取上清加入等体积的异丙醇，充分混匀后，放-20℃静置1h以上。然后12000rpm离心15min，弃掉上清，加入75%酒精500μL，12000rpm离心5min，弃掉上清，RNA沉淀干燥后加入10μL DEPC处理水，备用；
2）LAMP反应：取20μL反应液，加入5μL待检RNA，混匀后按下面的程序进行反应：60℃90min，85℃2min；
3）阳性对照：取20μL反应液，加入5μL阳性对照物，混匀后按下面的程序进行反应：60℃90min，85℃2min；
4）结果判断：可采取两种方法判断结果。
一是电泳观察：取5μL PCR产物加入1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳观察，若出现阶梯状条带，可判断为鸭甲肝病毒阳性；若未出现，则可判断为鸭甲肝病毒阴性。
二是肉眼观察：反应结束后，取1μL SYBR GreenⅠ加入产物中，混匀后在紫外线下观察结果。若有白色荧光，可判断为鸭甲肝病毒阳性；若无，则可判断为鸭甲肝病毒阴性。
7.临床应用
临床应用检验的样品为不同时期不同鸭场送检的样品40份。应用本试剂盒和病毒分离鉴定同时检测送检样品，比较两种方法的符合率。
本试剂盒检出鸭甲肝病毒阳性病料22份，阳性检出率为55.0%，而病毒分离鉴定检出阳性病料19份，阳性检出率为47.5%，两种方法的符合率为92.5%（如表2所示）。
表2试剂盒与病毒分离鉴定比较
注：检出符合率=（共同阳性数+共同阴性数）/总样品数×100%

Claims (2)

1.一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒，其特征在于，按50次量计包括以下组分： 
1)TRIZol：50ml； 
2)反应液：2000μL，包括10×Bst buffer250μL、10mmol/L的dNTP100μL、25mmol/L的MgCl2300μL、5mol/L的betaine200μL、10μmol/L的外引物DHV-F3、DHV-B3各50μL、40μmol/L的内引物DHV-FIP、DHV-BIP各100μL、40U/μL的RNA酶抑制剂100μL、5U/μL的反转录酶AMV100μL、8U/μL的Bst DNA聚合酶100μL、DEPC处理水550μL； 
3)阳性对照：重组质粒T-DH250μL，浓度为0.1ng/μL； 
4)DEPC处理水：1ml； 
各引物如下： 
正向外引物DHV-F3：5'-ATCTGGYTGTGCTGTTGGRAT-3'； 
反向外引物DHV-B3：5'-CATARCAYTGRTTGATGTCATAKCC-3'； 
正向内引物DHV-FIP：5'-ACTCARAGABCCATCRAAWCCAGTTTTGAGTGGGAYAATYTGTTRGC-3'； 
反向内引物DHV-BIP：5'-CHCAYTATGTAACTGATGAGATHTGGTTTTACAGTRGTRCAKGGDGAT CCTGA-3'； 
其中R＝A或G；Y＝C或T；H＝A,T或C；D＝G,A或T；W＝A或T；B＝G,T或C；K＝G或T； 
所述重组质粒T-DH的详细制备方法为：提取A型鸭甲肝病毒RNA，利用外引物DHV-F3/DHV-B3进行RT-PCR，扩增目的条带，反应条件如下： 
RT反应体系：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL的引物DHV-B31.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水11.5μL；置于PCR扩增仪进行反应，5U/μL反转录酶AMV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min； 
PCR反应体系：ddH2O39μL、20pmol/μL的引物DHV-F31.0μL、10×PCR缓冲液4.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、RT产物5.0μL；置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃2min预变性；94℃变性15sec、60℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min； 
回收目的条带，与载体pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，PCR鉴定阳性后进行测序，序列正确的质粒标记为T-DH作为鸭甲肝病毒的阳性对照。 
2.如权利要求1所述的一种鸭甲肝病毒通用的LAMP检测试剂盒，其特征在于，它还包括SYBR Green Ⅰ为100μL。 
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