CN105803050B - 检测cho细胞dna的引物及方法 - Google Patents

检测cho细胞dna的引物及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105803050B
CN105803050B CN201410840735.5A CN201410840735A CN105803050B CN 105803050 B CN105803050 B CN 105803050B CN 201410840735 A CN201410840735 A CN 201410840735A CN 105803050 B CN105803050 B CN 105803050B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primer
primer pair
sequence
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410840735.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105803050A (zh
Inventor
杨志行
吴婉欣
王滔
文明
俞燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huzhou Shenke Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
HUZHOU SHENKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HUZHOU SHENKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD filed Critical HUZHOU SHENKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority to CN201410840735.5A priority Critical patent/CN105803050B/zh
Publication of CN105803050A publication Critical patent/CN105803050A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105803050B publication Critical patent/CN105803050B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了检测CHO细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测CHO细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO:7所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分大肠杆菌或人类，甚至与仓鼠细胞高度同源的小鼠或大鼠的干扰性DNA。

Description

检测CHO细胞DNA的引物及方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及CHO细胞DNA的检测引物及方法。
背景技术
在现代，生物重组制品已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。这些生物制品包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等。重组生物制品的应用与人类健康事业息息相关，国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。
重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。
在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。
从1984年开始，国际官方机构陆续推出了针对生物制品残余DNA检测的各种限度标准，并且根据研究及应用的不断变化而逐步修改完善。1997年，WHO第46届生物制品标准化专家委员会(ECBS)会议上，与会专家通过对传代细胞系残余DNA风险的再评估，认为残余DNA虽然不是主要危险因素，但应视为细胞污染物，要求清除至最低水平。根据这一再评估，建议每人份传代细胞的纯化产品中可接受的DNA含量为10ng。任何生物制品的纯化工艺应经验证，证明其去除细胞DNA的能力，包括参入示踪剂研究。另外，产品批次间的均一性应通过临床效果观察，以及三批以上的检测结果予以证实。目前重组蛋白药物常 用的哺乳动物细胞系，如CHO、BHK、SP2/0、C127等，均有逆转录病毒颗粒阳性的报道。因此，对其残余DNA含量就需要严格控制。
目前，针对不同的生物制品，其相对应的检测限也略有不同。一般而言，FDA规定医药生物制品中DNA污染的检测限为100pg/剂，WHO和EU略为宽松，检测限可达10ng/剂。低浓度的检测限对检测的手段及技术提出了更高的要求。
关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。
Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。
在目前重组蛋白药物常用的哺乳动物细胞系中，CHO细胞，即，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)因具有无限增殖性，可以传代百代以上，而成为目前生物工程上广泛使用的细胞。当今批准正式应用于人类疾病治疗或预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产，其余所有产品均是由CHO细胞和大肠杆菌生产。与原核的大肠杆菌相比，CHO属于真核哺乳细胞，能形成有活性的二聚体和糖基化的功能，因此，CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主，其已广泛用于重组蛋白药物的制取，是一种重要的工程表达细胞株。
综上所述，本领域急需检测生物制品中残余CHO细胞DNA的引物对以及利用该引物对检测生物制品中残余CHO细胞DNA的方法，该方法应具备特异性、灵敏性、操作简便、标准统一等优点，从而能用于生物制品质量控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测生物制品中残余CHO细胞DNA的引物对以及包含所述引物对的检测体系和检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供利用本发明的引物对检测生物制品中残余CHO细胞DNA的方法。
本发明还有一目的是提供用于设计检测生物制品中残余CHO细胞DNA的引物对的多核苷酸序列。
在第一方面，本发明提供一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于合并序列的第1-58位；其中的反向引物结合于合并序列的第103-138位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为92-131bp；
其中所述合并序列为与SEQ ID NO:1-6所示序列有80％以上的序列相似性的核苷酸序列。
在优选的实施方式中，所述合并序列与SEQ ID NO:2-6所示序列有90％以上的序列相似性。
在优选的实施方式中，所述合并序列与SEQ ID NO:2-6所示序列有100％的序列相似性。
在优选的实施方式中，所述合并序列如SEQ ID NO:7所示。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第10-55位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第100-135位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-120bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第13-49位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第109-131位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-120bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第13-38位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第109-129位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为117bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第18-41位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第109-129位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为112bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第27-49位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第112-131位，并且所述引物对 所扩增获得的扩增产物的长度为105bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为20-25bp；优选20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，所述正向引物选自：SEQ ID NO:8-12，所述反向引物选自：SEQ ID NO:13-17。
在具体的实施方式中，所述引物对中，正向引物如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物如SEQ ID NO:14所示；或者，正向引物如SEQ ID NO:11所示，所述反向引物如SEQ ID NO:14所示；或者，正向引物如SEQ ID NO:12所示，所述反向引物如SEQ ID NO:13所示。
在具体的实施方式中，所述引物对中，正向引物如SEQ ID NO:11所示，所述反向引物如SEQ ID NO:14所示。
在第二方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包含本发明第一方面所述的引物对。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第10-55位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第100-135位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-120bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为20-24bp；优选20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，所述检测体系还包含探针。
在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:18所示。
在优选的实施方式中，所述检测体系的检测灵敏度为0.1fg/μL。
在第三方面，本发明提供一种检测CHO细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的检测体系，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。
在第四方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的引物对。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第10-55位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第100-135位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-120bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为20-24bp；优选20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。
在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:18所示。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。
在优选的实施方式中，所述标准品对照包含SEQ ID NO:1-6中任一项所示片段；优选地，所述标准品对照是SEQ ID NO:1所示片段。
在第五方面，本发明提供一种PCR方法，包括步骤：
在一PCR检测体系中，利用本发明第一方面所述的引物对扩增目标产物。
在优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第10-55位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第100-135位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-120bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为20-24bp；优选20bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在第六方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1-7中任一项所述的片段。
在优选的实施方式中，所述多核苷酸如SEQ ID NO:1-7中任一项所示。
在第七方面，本发明提供本发明第六方面所述的多核苷酸在制备检测CHO细胞基因组DNA的试剂中的应用。
在第八方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1-6所示序列有80％以上的序列相似性。
在优选的实施方式中，所述多核苷酸与SEQ ID NO:2-6所示序列有90％以上的序列相似性。
在优选的实施方式中，所述多核苷酸与SEQ ID NO:2-6所示序列有100％的序列相似性。
在优选的实施方式中，所述多核苷酸如SEQ ID NO:7所示。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的Alu序列与5条同源序列的ClustalX软件分析结果；
图2显示了本发明引物和探针在相应序列上的位置；
图3显示了SEQ ID NO:2-7的序列相似性比对结果；
图4显示了SEQ ID NO:3-7的序列相似性比对结果；
图5显示了SEQ ID NO:4-7的序列相似性比对结果；
图6显示了SEQ ID NO:5-7的序列相似性比对结果；
图7显示了SEQ ID NO:6-7的序列相似性比对结果；
图8显示了本发明以下引物组合的QPCR图谱：
Figure BDA0000647136240000061
图9显示了本发明各种引物组合的QPCR图谱：
Figure BDA0000647136240000062
图10显示了本发明各种引物组合的QPCR图谱：
Figure BDA0000647136240000071
图11显示了大肠杆菌干扰实验的结果。图中：方块为CHO标准曲线；圆形为加入大肠杆菌基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:12和13所示；
图12显示了人类干扰实验的结果。图中：方块为CHO标准曲线；圆形为加入人类基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:12和13所示；
图13显示了大鼠干扰实验的结果。图中：方块为CHO标准曲线；圆形为加入大鼠基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:12和13所示；
图14显示了小鼠干扰实验的结果。图中：方块为CHO标准曲线；圆形为加入小鼠基因的干扰曲线，其中利用的引物对如SEQ ID NO:12和13所示。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现，利用检索CHO的有关基因序列中获得的Alu序列片段(gggtgtagatggcacacgcctttaatcccaccattcgggaggaagaggcagatggatctttatgagttcaaggcctgcctggtccggcagatagaattctagaacaggctccaaagtcacagaaaaaccctgcctcagaaaga，SEQ ID NO:1)进行BLAST，对比在CHO基因组中的同源序列及其上下游序列，并选取了5条序列，分别是SEQ ID NO:2(AGACAGGGTTTCTCTGTGTAGTTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCCGGCCTCGAACTCAGAGATCTGCCTGCCTCTGCCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGCCTGCACCAACAACGCCC)、SEQ ID NO:3(TTTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTGGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTACCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGTGTGTTCCA)、SEQ ID NO:4(TTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTCAAACTCACAGAGACCCACCTGCCTCTGCCTCCCAGGTGCTGGGATTAAAGGC)、SEQID NO:5(TTTTTGTAGCTTTGGAGCCTGTCCTGGAACTCTGTAGACCAGGCTGGCCT TGAACTCAACAGAGACGCGCCTTTCTCTGCCTCCCAAGTGCTGGGATTAAAGGTGTGTTCCACC)、SEQ ID NO:6(TTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGGCTGGCCTCCAACTCACAGAGATCTGCTTGCCCCTGCCTCCCAAGTGCTGGGATTAAAGGTGTGTGCCACCAACGCCC)；再利用ClustalX软件进行分析，得到合并序列SEQ ID NO:7(GTTTGTTTTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCTGGCACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGCCTGGAACTCACAGAGATCCGCCTGCCTCTACCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGT)。
发明人发现利用上述序列设计的引物构成的多重PCR荧光检测体系能够进一步提高实验结果的精密度和检测灵敏度，降低样本处理损害DNA完整性所带来的漏检率。在此基础上完成了本发明。
合并序列
本文所述的“合并序列”是基于在CHO细胞基因组中的SEQ ID NO:1-6所示序列设计的，与SEQ ID NO:1-6所示序列具备相当序列相似性的一种虚拟序列。
在具体的实施方式中，本发明的合并序列为与SEQ ID NO:1-6所示序列有80％以上的序列相似性的核苷酸序列。在一优选例中，所述合并序列与SEQ ID NO:2-6所示序列有90％以上的序列相似性。在一优选例中，所述合并序列与SEQ ID NO:2-6所示序列有100％的序列相似性。
在具体的实施方式中，本发明的合并序列与SEQ ID NO:2-6具有94％的序列相似性。在具体的实施方式中，本发明的合并序列与SEQ ID NO:3-6具有100％的序列相似性。在具体的实施方式中，本发明的合并序列与SEQ ID NO:4-6具有94％的序列相似性。在具体的实施方式中，本发明的合并序列与SEQ ID NO:5-6具有86％的序列相似性。在具体的实施方式中，本发明的合并序列与SEQ ID NO:6具有90％的序列相似性。(如图3-7所示)
在优选的实施方式中，本发明的合并序列如SEQ ID NO:7所示。
发明人发现针对上述合并序列设计引物和探针，可以高度灵敏地检测CHO细胞基因组DNA，还具备高度特异性，能区分大肠杆菌或人类等干扰性DNA，甚至与仓鼠细胞高度同源的小鼠或大鼠的干扰性DNA。因此，本发明方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。
本发明的引物
本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的CHO细胞基因组DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对本发明的合并序列设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于本发明的合并序列，例如SEQ IDNO:7所示序列。
在具体的实施方式中，本发明的检测CHO细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于上述合并序列的第1-58位；其中的反向引物结合于上述合并序列的第103-138位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为92-131bp。
在优选的实施方式中，所述合并序列如SEQ ID NO:7所示。
在一优选的实施方式例中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第10-55位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第100-135位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-120bp。
在一优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第13-49位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第109-131位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为100-120bp。
在一优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第13-38位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第109-129位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为117bp。
在一优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第18-41位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第109-129位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为112bp。
在一优选的实施方式中，所述正向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第27-49位，所述反向引物结合于SEQ ID NO:7所示序列的第112-131位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为105bp。
在一优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为20-25bp；优选20bp。
在一优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，本发明设计的引物对如下表所示：
Figure BDA0000647136240000101
在优选的实施方式中，本发明的引物对中，正向引物如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物如SEQ ID NO:14所示；或者，正向引物如SEQ ID NO:11所示，所述反向引物如SEQ IDNO:14所示；或者，正向引物如SEQ ID NO:12所示，所述反向引物如SEQ ID NO:13所示。
在进一步优选的实施方式中，正向引物如SEQ ID NO:11所示，所述反向引物如SEQID NO:14所示。
本发明的检测体系
本发明还提供一种检测CHO细胞基因组DNA的检测体系，所述体系包含上述的本发明引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。
在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。在具体的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:18所示。
在具体的实施方式中，本发明检测体系的检测灵敏度达到0.1fg/μL。
在其它实施方式中，本发明还提供利用上述的本发明引物对或本发明检测体系检测CHO细胞基因组DNA的方法。
在其它实施方式中，本发明还提供PCR试剂盒，所述PCR试剂盒装有本发明引物对和用于实施PCR的其它所需成分以及使用该试剂盒作PCR检测的使用说明书。
在优选的实施方式中，为排除假阴性结果，本发明的PCR试剂盒还装有标准品对照。
在进一步的优选实施方式中，所述标准品对照包含SEQ ID NO:1-6中任一项所示片段；优选地，所述标准品对照是SEQ ID NO:1所示片段。
在其它实施方式中，本发明还提供利用本发明引物对实施的PCR方法。
本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1-7中任一项所述的片段。
在优选的实施方式中，所述多核苷酸如SEQ ID NO:1-7中任一项所示。
本领域技术人员知道，所述多核苷酸是一种特异性的CHO细胞基因组DNA检测标志物，即，可通过扩增该标志物特异性地检测体系中CHO细胞基因组DNA是否存在。
因此，本领域技术人员不难理解，上述多核苷酸可用于CHO细胞基因组DNA的检测。例如，如果具体的检测环境存在可能影响PCR扩增的因素，就有可能产生假阴性结果，因此，本发明的多核苷酸可在检测中用作标准品对照，以排除特定体系下产生的假阴性结果。
本发明的引物和方法的优点包括:
1.本发明的引物灵敏度高，能够检测出0.1fg/μL的DNA浓度；
2.本发明的引物特异性好，能够区分CHO细胞基因组DNA与其它干扰性DNA；
3.本发明的方法操作简便快捷。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明所用的材料与方法
1.基因组DNA提取：所用的试剂盒是磁珠法基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，目录号：DP329-01)
2.DNA检测体系：
Taqman mix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本发明引物及探针(如下表所示)等成分。
Figure BDA0000647136240000121
掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液
3.检测仪器：ABI 7500。
4.实验操作及过程
4.1基因组DNA提取纯化(根据试剂盒说明书操作步骤进行)
1)在1.5ml离心管中加入20μl Proteinase K(具体体积根据样本大小可调 整)。
2)加入样本，加入200μl缓冲液GB，抽打混匀或振荡混匀。
3)将离心管置于56℃，直至组织完全消化。
4)每孔加入200μl无水乙醇，抽打混匀或振荡混匀，室温放置5分钟。
5)每孔加入15μl磁珠悬浮液B，抽打混匀或振荡混匀。
6)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
7)将离心管从磁力架上取下，加入500μl缓冲液GD，抽打混匀或振荡混匀。
8)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
9)将离心管从磁力架上取下，加入600μl漂洗液PW，抽打混匀或振荡混匀。
10)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体；
11)重复操作步骤9、10，液体尽量去除干净。
12)离心管于磁力架上，室温晾干10-15分钟。
13)将离心管从磁力架上取下，加入50-100μl洗脱液TB，抽打混匀振荡混匀，
置于56℃，孵育10分钟。
14)将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至收集板，并于适当条件保存。
4.2检测
4.2.1准备工作：
购买自中国食品药品检定研究院的CHO细胞基因组DNA(93.6ng/μL，批号270026-201101)为标准品，用超纯水梯度稀释成以下7个浓度梯度，分别为100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL及0.1fg/μL。NTC为无样本阴性质控(DNA稀释液)。
检测体系：30ul
20μL Taqman mix+10μL样品＝30μL
标准曲线(pg/tube)
1000
100
10
1
0.1
0.01
0.001
NTC
实时荧光定量PCR反应程序优选为：95℃预变性2min；95℃15s，60℃1 min，40个循环。根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。
实施例
实施例1.评价本发明引物对组合的性能
在该实施例中，评价了以下引物对组合的灵敏度
Figure BDA0000647136240000141
QPCR CT值比较如下表：
浓度\CT值 组合1 组合2 组合3 组合4 组合5 组合6 组合7 组合8
100pg/μL 15.306 14.5332 14.1859 15.08 14.745 13.6949 13.8558 14.2733
10pg/μL 19.0467 18.1927 18.0459 18.9555 18.7326 17.7415 17.406 18.2247
1pg/μL 22.2185 21.2336 21.4493 22.1769 22.0835 20.7671 20.5323 21.5471
100fg/μL 25.586 24.8564 25.1424 25.4741 25.1242 24.1697 23.7302 24.5303
10fg/μL 28.5624 27.5292 27.4287 28.3448 28.1492 27.3141 27.2097 28.0964
1fg/μL 31.3381 30.7719 30.7565 32.1513 31.3579 30.707 30.2814 31.0509
0.1fg/μL 34.4217 34.1944 34.027 34.5166 34.4877 34.2328 33.4694 34.4429
实施例2.评价本发明引物对组合的性能
在该实施例中，评价了以下引物对组合的灵敏度：
Figure BDA0000647136240000142
QPCR CT值比较如下表：
浓度 组合9 组合10 组合11 组合12 组合13 组合14 组合15 组合16
100pg/μL 14.231 13.229 13.3215 14.0545 13.9749 12.9839 13.0195 14.0923
10pg/μL 17.8011 16.8897 16.5988 17.5361 17.7423 16.8124 16.9239 17.4938
1pg/μL 21.081 20.1269 20.2513 20.4793 20.8788 20.2462 20.1481 20.7569
100fg/μL 24.4928 23.8431 23.5652 24.2262 24.3667 23.6831 23.1047 24.1595
10fg/μL 27.917 27.1087 27.021 27.8241 27.7062 26.9355 26.5225 27.2585
1fg/μL 31.0707 30.5791 30.3585 30.9583 30.8945 30.2559 29.7674 30.6187
0.1fg/μL 35.2227 33.6947 33.2997 34.1437 34.3894 32.7961 32.4383 33.7207
实施例3.评价本发明引物对组合的性能
在该实施例中，评价了以下引物对组合的灵敏度：
Figure BDA0000647136240000143
QPCR CT值比较如下表：
浓度\CT值 组合17 组合18 组合19 组合20 组合21 组合22 组合23 组合24 组合25
100pg/μL 16.465 15.7725 15.1791 15.7905 15.4724 15.0789 14.7234 14.683 14.7196
10pg/μL 19.7916 19.1204 18.713 19.5046 19.015 18.3761 18.1733 18.1547 18.3058
1pg/μL 23.3382 22.1257 22.05 22.6634 22.1769 21.566 21.602 21.4562 21.7532
100fg/μL 26.2599 25.672 25.267 25.9239 25.6337 25.2155 25.0005 24.98 25.0576
10fg/μL 29.8044 29.2882 28.3919 29.7926 29.1554 28.5136 28.1897 27.9805 28.4643
1fg/μL 32.8621 31.7946 31.1037 / 32.2037 32.0592 31.4793 31.404 31.2231
0.1fg/μL 34.044 33.8297 36.9837 / 35.9191 35.152 34.3235 33.2182 33.1868
实施例4.评价本发明引物对组合的特异性
为评价SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示引物对的特异性，选取生产中常见的大肠杆菌及人类污染DNA以及与仓鼠细胞同源性高的大鼠、小鼠基因作体系干扰实验。具体为：
用参考品稀释10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL做标准曲线，等量分成两份，一份不加这4种干扰基因，一份加入这4种干扰基因100pg。其中，大肠杆菌基因(E.coil DH5α菌株来源于中国科学院微生物研究所，编号1.1595，用磁珠法基因组提取试剂盒提取)、人类基因(人肝癌细胞SK-HEP-1来源中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；用磁珠法基因组提取试剂盒提取)、大鼠基因(大鼠来源于浙江医学科学院实验动物中心，SD Wistar；取大鼠肝脏用磁珠法基因组提取试剂盒提取)、小鼠基因(小鼠来源于浙江医学科学院实验动物中心，昆明种，小鼠肝脏用用磁珠法基因组提取试剂盒提取)，作为样本进行检测。
实验结果如图11-14所示。从产生的曲线可以看出，人类和大肠杆菌DNA污染对SEQID NO:12和SEQ ID NO:13所示引物对的检测结果明显没有造成影响；即便是与仓鼠同源性很高的大鼠和小鼠DNA污染，对SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示引物对的检测结果也未造成实质性影响。
Figure BDA0000647136240000151
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure DEST_PATH_IDA0000728164960000011
Figure DEST_PATH_IDA0000728164960000021
Figure DEST_PATH_IDA0000728164960000031
Figure DEST_PATH_IDA0000728164960000041
Figure DEST_PATH_IDA0000728164960000051

Claims (9)

1.一种检测CHO细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于合并序列的第1-58位；其中的反向引物结合于合并序列的第103-138位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为92-131bp；
其中所述合并序列如SEQ ID NO:7所示；
所述正向引物选自：SEQ ID NO:8-12，所述反向引物选自：SEQ ID NO:13-17。
2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对中，正向引物如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物如SEQ ID NO:14所示；或者，正向引物如SEQ ID NO:11所示，所述反向引物如SEQ ID NO:14所示；或者，正向引物如SEQ ID NO:12所示，所述反向引物如SEQ IDNO:13所示。
3.如权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述引物对中，正向引物如SEQ ID NO:11所示，所述反向引物如SEQ ID NO:14所示。
4.一种检测体系，所述检测体系包含权利要求1-3中任一项所述的引物对。
5.如权利要求4所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包含探针。
6.一种检测CHO细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用权利要求1-3中任一项所述的引物对或权利要求4或5所述的检测体系，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。
7.一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1-3中任一项所述的引物对。
8.一种PCR方法，包括步骤：
在一PCR检测体系中，利用权利要求1-3中任一项所述的引物对扩增目标产物。
9.权利要求1-3中任一项所述的引物对在制备检测CHO细胞基因组DNA的试剂中的应用。
CN201410840735.5A 2014-12-29 2014-12-29 检测cho细胞dna的引物及方法 Active CN105803050B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410840735.5A CN105803050B (zh) 2014-12-29 2014-12-29 检测cho细胞dna的引物及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410840735.5A CN105803050B (zh) 2014-12-29 2014-12-29 检测cho细胞dna的引物及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105803050A CN105803050A (zh) 2016-07-27
CN105803050B true CN105803050B (zh) 2020-10-16

Family

ID=56980940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410840735.5A Active CN105803050B (zh) 2014-12-29 2014-12-29 检测cho细胞dna的引物及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105803050B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109837345B (zh) * 2017-11-24 2022-08-02 中国食品药品检定研究院 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法
CN109295193A (zh) * 2018-11-05 2019-02-01 苏州蝌蚪生物技术有限公司 检测cho核酸残留的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN112301028B (zh) * 2020-10-27 2021-06-08 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种用于鉴定cho细胞的scar标记及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154503A (zh) * 2011-04-20 2011-08-17 上海复宏汉霖生物技术有限公司 探针法检测cho细胞dna含量的方法
CN103074334A (zh) * 2012-11-20 2013-05-01 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 检测cho细胞dna的方法
CN103627781A (zh) * 2012-08-24 2014-03-12 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种检测cho培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154503A (zh) * 2011-04-20 2011-08-17 上海复宏汉霖生物技术有限公司 探针法检测cho细胞dna含量的方法
CN103627781A (zh) * 2012-08-24 2014-03-12 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种检测cho培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法
CN103074334A (zh) * 2012-11-20 2013-05-01 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 检测cho细胞dna的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Cricetulus longicaudatus unknown mRNA";Lambert ,B.G.等;《GenBank database》;20070512;Accession No. EF540878.1 *
Lambert ,B.G.等."Cricetulus longicaudatus unknown mRNA".《GenBank database》.2007,Accession No. EF540878.1. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105803050A (zh) 2016-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN112501268B (zh) 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用
CN103074334B (zh) 检测cho细胞dna的方法
CN105861641A (zh) 一种用于检测cho细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法
CN107828914B (zh) 传染性皮下及造血组织坏死病毒（ihhnv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN109837345B (zh) 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法
CN105803050B (zh) 检测cho细胞dna的引物及方法
CN112410472A (zh) 检测肺炎支原体、肺炎衣原体及腺病毒的引物探针组合及检测试剂盒
US10161005B2 (en) Method for detecting telomerase via washing-free anchored-extension and telomeric-binding amplification, and kit
CN113502354A (zh) 一种用于移植患者感染的病原体检测引物和探针组、试剂盒及应用
CN115961004A (zh) 用于定量检测mdck细胞dna片段大小分布的引物对及检测方法
CN109097454B (zh) 一种HEK293 gDNA残留量的检测方法
CN115418394A (zh) 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法
CN114807318A (zh) 用于检测Vero细胞基因组DNA的组合物、试剂盒及方法
CN113667743A (zh) 一种用于布地奈德代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用
CN106148483B (zh) 检测大肠杆菌细胞dna的引物及方法
CN106676163B (zh) 检测毕赤酵母细胞dna的引物及方法
CN114591945A (zh) Dna病毒核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用
CN104498509B (zh) Hmg1基因及其在家蚕微孢子虫分子检测中的应用
CN102827951A (zh) 一种基因c型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法
CN115287371B (zh) 一种检测产黄青霉菌基因组dna的方法
CN103509879A (zh) 一种鸭甲肝病毒通用的lamp检测试剂盒
CN114990261B (zh) 用于检测呼吸道感染性疾病病原体的多重qPCR检测试剂
CN112662746B (zh) 一种基因分型检测用的质控品及其制备方法
CN117417987A (zh) 用于定量检测pg13细胞dna片段大小分布的引物对及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20190805

Address after: Room 502, R&D Building, South Taihu Lake Science Creation Center, 1366 Hongfeng Road, Huzhou City, Zhejiang Province, 313000

Applicant after: HUZHOU SHENKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: Room B01-20, 4A Floor, 2300 Yangshupu Road, Yangpu District, Shanghai

Applicant before: SHANGHAI BOAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: 1007-1, Floor 10, Building 3, No. 1366, Hongfeng Road, Huzhou City, Zhejiang Province, 313001 (independent application)

Patentee after: Huzhou Shenke Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 313000 Room 502, R & D building, South Taihu science and technology center, 1366 Hongfeng Road, Huzhou, Zhejiang.

Patentee before: HUZHOU SHENKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.