CN103627781A

CN103627781A - 一种检测cho培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103627781A
Application number: CN201210303846.3A
Authority: CN
Inventors: 刘晓志; 周兴军; 董向峰; 常亮; 陈雪静; 刘素霞; 赵伟; 高健; 段宝玲
Original assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Current assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明涉及一种检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法，属于生物技术检测领域。该试剂盒包括置于同一PCR体系中的特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对。在PCR检测支原体污染的同时，可同时完成检测结果可靠性的判定。该发明大大提高了CHO培养细胞中支原体污染检测结果的可靠性，且操作简单，检验周期短，具有良好的样品检测的操作性。

Description

一种检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术检测领域中进行支原体检测的试剂盒及其检测方法，具体涉及一种利用PCR技术快速准确鉴定CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法。

背景技术

自从1956年Robinson LB等首次报道细胞培养中的支原体污染以来，国内外关于支原体污染细胞和疫苗等生物制品的报道屡见不鲜。支原体是微生物中最简单和最小的生命形式，它是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5μm之间。支原体由于体积较小，可以穿过CHO细胞培养时用于过滤微生物的常规滤器；而且支原体感染后只产生少量可见的混浊和细胞伤害，导致支原体的感染在几次传代甚至几个月的时间内都不易被觉察；加上支原体对于细胞培养中常规应用的抗生素具有良好的耐受性，使得支原体感染成为细胞培养中普遍存在的、隐蔽的、恶性的污染源。支原体对宿主的生理生长影响严重，CHO细胞一旦受支原体感染后，便出现生理水平远远偏离正常的情况，而CHO细胞又是重组蛋白质药物生产的首要体系，因此对CHO细胞培养体系中支原体污染的快速准确检测显得尤为重要。

PCR检测方法应用特异性引物扩增支原体基因组序列，具有灵敏、准确的特点，并且检测周期短，4个小时即可以看到检验结果，被越来越广泛的用于检测CHO细胞中的支原体污染，2006年欧洲药典已将PCR作为常规检测方法。尽管PCR检测方法具有如此多的优点，但也有不足之处。由于PCR实验设计、实验操作、实验试剂等方面的问题，容易造成PCR检测结果出现假阳性和假阴性。出现假阳性主要由于多重扩增所致，而出现假阴性的主要原因是反应体系尤其是样品中存在的物质阻碍了反应的进行，例如蛋白质、高盐或pH条件的不适宜导致反应的终止。由此带来的误判、错判会给实际生产带来巨大的经济损失，因此需要进一步增强PCR支原体污染检测方法的可靠性及准确性。一般的支原体污染的PCR检测方法中多以去核酸水为阴性对照模板，阳性对照模板为支原体基因组DNA，以此来判定检测结果。如下表所示。

这样检测中要单独设置阳性对照，不仅浪费试剂，而且PCR过程和电泳检测过程都会更加繁琐。同时还要单独制备支原体基因组DNA，更加增加了检测的繁琐程度；最重要的问题是检测体系与阳性对照体系分处于不同的PCR体系，即使阳性对照正常，也有可能出现错判的情况。

发明内容

本发明的目的在于开发一种操作简便、可靠性高的利用PCR技术检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒及其检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒，它包括置于同一PCR体系中的特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对。

本发明的进一步改进在于，所述的特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对为：

上游引物GF：5’- CAAAGGCACAGTCAAGGCTGA -3’；

下游引物GR：5’- TGGTGAAGACGCCAGTAGATT -3’。

本发明进一步改进在于：所述特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对为：

上游引物MF：5’- ACACCATGGGAGCTGGTAAT -3’；

下游引物MR：5’- GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT -3’。

本发明进一步改进在于：所述特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对的扩增产物长度为400～500 bp。

本发明进一步改进在于：所述PCR体系中特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对的浓度比为1:2。

本发明进一步改进在于：所述PCR体系中含有PCR反应缓冲液、dNTPs溶液、 rTaq聚合酶和超纯水。

本发明还提供了一种利用所述的试剂盒检测CHO培养细胞中支原体污染的方法，包括如下步骤:

1)提取待检CHO培养细胞的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应；

3)以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照；

4)所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳；

5)观察琼脂糖凝胶电泳检测图，判定检测结果的方法如下所述：

A)当特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物出现，阴性对照没有出现扩增产物时，说明PCR体系正常工作，此时的PCR检测结果准确可靠：

A-Ⅰ)此时，如果没有出现特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中没有出现支原体污染；

A-Ⅱ)此时，如果出现了特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中出现了支原体污染。

B)如果特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物没有出现，说明PCR体系没有正常工作，此时检测结果无效。

C)如果阴性对照出现扩增产物，说明PCR体系受到污染，此时检测结果无效。

本发明进一步改进在于：所述步骤1)中所述提取待检CHO培养细胞DNA的方法为：取待检CHO培养细胞液离心沉淀；用PBS缓冲液充分悬浮沉淀物，离心沉淀；弃上清，加入TE缓冲液，再次充分悬浮沉淀物，煮沸；离心沉淀，取上清作为PCR反应模板。

本发明进一步改进在于：所述步骤1)中所述提取待检CHO培养细胞DNA的方法为：取CHO培养细胞总数1～3×10⁵个，6,000 转/分钟的转速离心 5分钟；用 PBS缓冲液充分悬浮沉淀物，6,000 转/分钟的转速离心 5分钟；弃上清，加入 50 μL TE缓冲液，充分悬浮沉淀物，沸水浴 5 分钟；13,000转/分钟的转速离心10分钟，取上清 4 μL作为 PCR 反应模板。

本发明进一步改进在于：步骤2)中所述PCR体系总体积为20μL，包括10×PCR反应缓冲液2μL，4种dNTP每种终浓度各200μmol/L，特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对在PCR扩增反应体系中的终浓度为2.5～10μmol/L，特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对在PCR扩增反应体系中的终浓度为10μmol/L，PCR 反应模板4μL，rTaq酶0.1μL，超纯水补至总体积为20μL。

本发明进一步改进在于：步骤3)中所述PCR体系除模板为去核酸水外，其余成分与步骤2) 中所述PCR体系完全相同。

本发明进一步改进在于：步骤2)与步骤3)中所述PCR扩增反应的反应条件为94℃ 预变性 5分钟，然后 94℃ 变性30秒，50℃～53 ℃ 退火 30秒，72 ℃ 延伸 40 秒，35个循环后，72 ℃恒温 10分钟。

由于采用了上述技术方案，本发明所取得的技术进步在于：

以PCR方法检测CHO培养细胞中支原体污染的时候，本发明首次将特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对置于同一个PCR体系中，阳性对照与检测在同一个PCR体系中完成扩增。在检测CHO培养细胞是否被支原体污染时，要提取培养的CHO细胞的DNA作为PCR体系中的反应模板，而模板中有大量的CHO细胞基因组DNA，在检测PCR体系中加入特异性扩增CHO细胞基因组中管家基因细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）DNA序列的引物对，即可以当成检测PCR反应体系是否正常工作的阳性对照，就可以省去单独设置阳性对照的步骤，而且阳性对照和检测在同一PCR体系中进行，进而保证了实验的可靠性和稳定性，比单独设置阳性对照，其结果更加可靠、直观。

本发明所述试剂盒与市售检测支原体污染的试剂盒相比具有如下优点（具体实例见实施例4）：

附图说明

图1 PCR反应体系引物浓度条件优化设置的三组引物浓度组合。

图2 PCR体系的优化结果，最左侧泳道为DNA Marker，分子量从低到高分别为250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、10000bp，泳道1、2、3分别表示在实施例2①②③的所述的方案中加入阳性对照模板。泳道4、5、6分别表示在实施例2①②③所述的方案中加入阴性对照模板。

图3 用本发明所述试剂盒检测不同批次CHO培养细胞琼脂糖电泳图，最右侧泳道为DNA Marker，分子量从低到高分别为250bp、 500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、10000bp，泳道1为阴性对照，泳道2-15为所检测的样品，其中泳道3、5、6、8、11、14为被支原体污染的样品，其他样品没有被支原体污染。

图4用在售试剂盒检测不同批次CHO培养细胞琼脂糖电泳图，最右侧泳道为DNA Marker，分子量从低到高分别为250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、10000bp，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3-16为所检测样品（依次对应实施例3所检测的第1-14批样品），其中泳道4、6、7、9、12、15为被支原体污染的样品，其他样品没有被支原体污染。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所使用的CHO细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；不同培养批次的CHO细胞由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供；本发明使用的PCR仪为 5333型，Eppendorf 公司；凝胶电泳仪为PowerPac 3000型，Bio-rad公司；dNTP、rTaq 酶、10×PCR反应缓冲液等购自Takara公司。

为使叙述简明，下文将特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对称为引物对A，将特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物称为引物对B。

实施例1 一种检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒的制备

1）引物对A与引物对B

其中引物对A

上游引物GF：5’- CAAAGGCACAGTCAAGGCTGA -3’；

下游引物GR：5’- TGGTGAAGACGCCAGTAGATT -3’。

引物对B

上游引物MF：5’- ACACCATGGGAGCTGGTAAT -3’；

下游引物MR：5’- GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT -3’。

引物对A与引物对B碱基序列均参考文献：Eldering JA, Felten C, Veilleux CA, Potts BJ. Development of a PCR method for mycoplasma testing of Chinese hamster ovary cell cultures used in the manufacture of recombinant therapeutic proteins，Biologicals，2004, 32 (4) :183-193。

引物对B是特异性扩增支原体16s rRNA保守区域的引物对，实现一次检测就可以覆盖多种支原体的目的，可以覆盖CHO培养细胞中常见的支原体感染种类。本试剂盒能够检测的支原体种类包括 M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，M. orale，M. salivarium，M. hominis，M. pulmonis，M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等48种支原体。

虽然引物与靶序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5＇端)的情况下，也能够特异性的扩增出所需的片段。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明的范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明所述的靶序列或其片段。

2）将引物对A与引物对B置于同一个PCR体系中。

3） PCR体系还包括10×PCR反应缓冲液2μL，4种dNTP每种各终浓度200 μmol/L，引物对A在PCR扩增反应体系中的终浓度为2.5～10μmol/L，引物对B在PCR扩增反应体系中的终浓度为10μmol/L，rTaq酶0.1μL，超纯水补至总体积为16μL。

实施例2 PCR反应体系引物浓度条件优化

1）为了使检测中阳性对照的相应扩增条带粗细适宜，而检测支原体污染的条带不会因为引物浓度不够而不出现相应扩增条带的情况，调整所述PCR扩增反应体系中引物对A和引物对B的浓度比例，共设置三种组合，见附图1，分别为①②③。

2）提取确定支原体污染的CHO培养细胞的DNA和确定没有支原体污染的CHO培养细胞的DNA，方法为：取两种CHO培养细胞各总数1～3×10⁵个，6,000 转/分钟的转速离心 5分钟；用PBS缓冲液充分悬浮沉淀物，6,000 转/分钟的转速离心 5分钟；弃上清，加入 50 μL TE缓冲液，充分悬浮沉淀物，沸水浴 5 分钟；13,000转/分钟的转速离心10分钟，各取上清 4 μL加入PCR体系中作为模板。

3）进行PCR扩增反应。扩增反应的反应条件为：

4）进行琼脂糖凝胶电泳。

5）观察琼脂糖凝胶电泳检测图（附图2），判定检测结果。

从附图1的琼脂糖凝胶电泳检测结果可以看出：引物对A为5μmol/L、引物对B为10μmol/L时（也就是组合

），PCR系统中的两对引物浓度的配伍比例较为合适，因为两对引物扩增的目的条带都比较清晰，且粗细适宜，所以选择这个引物对浓度比例进行下面的检测。

实施例3 使用制备的试剂盒对CHO培养细胞进行检测

提取14组不同培养批次的处于对数生长期的待检CHO细胞的DNA，方法见实施例2步骤2）,将提取的DNA反应模板4 μL加入实施例2描述的PCR反应扩增体系

中，将去核酸水加入另一个PCR反应扩增体系

中，作为阴性对照。进行PCR扩增，扩增反应的反应条件见实施例2步骤3），之后进行琼脂糖凝胶电泳。

检测结果见附图3。泳道1为阴性对照，没有出现扩增产物；泳道2-15为所检测样品，依次对应所检测的第1-14批样品。从图中可以看出150bp大小的引物对A相应的扩增产物都有出现，这说明PCR体系正常工作，且PCR体系没有污染，检测结果准确可靠。其中泳道3、5、6、8、11、14出现了引物对B相应的扩增产物，说明这些批次CHO培养细胞出现了支原体污染，而泳道2、4、7、9、10、12、13、15没有出现引物对B相应的扩增产物，说明这些批次没有出现支原体污染。

实施例4 使用市售支原体检测试剂盒进行检测

使用Applichem公司的PCR Mycoplasma Test Kit试剂盒对CHO培养细胞进行检测。检测步骤按照试剂盒说明书进行。

A. 待检样品制备

取与实施例3中相同的14批待检CHO细胞，提取DNA，方法如下：

对样品离心去除细胞碎片，上清转移到一个新的无菌离心管中，以15,000～20,000 g离心力离心10min，吸出上清，用50μl Buffer Solution（试剂盒中提供）充分重悬沉淀， 95°C加热3min，取5 μL加入PCR体系中作为模板。

B. PCR扩增

1) 在reaction mixture（10μL，试剂盒中提供）的EP管中加入超纯水35μl ，模板5μL 。

2) 于PCR反应体系中覆盖矿物油（约40μL），以避免反应过程中混合物的蒸发。

3) 进行PCR扩增反应。扩增反应的反应条件为：

[0049] C. 进行琼脂糖凝胶电泳

取20μL PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，使用本试剂盒的特异性引物扩增的DNA片段大小为270bp。

D. 控制模板

通过使用1μL阳性模板(试剂盒中提供)检测PCR扩增的可靠性，扩增的DNA片段大小为270bp。

E. 观察琼脂糖凝胶电泳检测图（附图4），判定检测结果：泳道1为阴性对照，没有出现扩增产物；泳道2为阳性对照，出现了预期的阳性扩增产物。泳道3-16为所检测样品，依次对应实施例3中所检测的第1-14批样品，其中泳道4、6、7、9、12、15出现了阳性扩增产物，说明这些批次CHO培养细胞出现了支原体污染，而泳道3、5、8、10、11、13、14、16没有出现阳性扩增产物，说明这些批次没有出现支原体污染。这一检测结果与实施例3中的检测结果相同。

Claims

1.一种检测CHO培养细胞中支原体污染的试剂盒，它包括置于同一PCR体系中的特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对。

2.如权利要求1所述的试剂盒，所述特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对为：

上游引物GF：5’- CAAAGGCACAGTCAAGGCTGA -3’；

下游引物GR：5’- TGGTGAAGACGCCAGTAGATT -3’。

3.如权利要求1所述的试剂盒，所述特异性扩增支原体16srRNA保守区域DNA序列的引物对为：

上游引物MF：5’- ACACCATGGGAGCTGGTAAT -3’；

下游引物MR：5’- GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT -3’。

4.如权利要求3所述的试剂盒，所述特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对的扩增产物长度为400～500 bp。

5.如权利要求1所述的的试剂盒，所述PCR体系中特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对与特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对的浓度比为1:2。

6.如权利要求1所述的试剂盒，所述PCR体系中含有PCR反应缓冲液、dNTPs溶液、 rTaq聚合酶和超纯水。

7.利用权利要求1～6任一项所述试剂盒检测CHO培养细胞中支原体污染的方法，包括如下步骤:

1)提取待检CHO培养细胞的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板加入PCR体系，进行扩增反应；

3)以去核酸水为模板加入PCR体系，进行扩增反应，作为阴性对照;

4)所有扩增反应结束后，同时进行琼脂糖凝胶电泳；

A)当特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物出现，阴性对照没有出现扩增产物时，说明PCR体系正常工作，此时的PCR检测结果准确可靠；

A-Ⅱ)此时，如果出现了特异性扩增支原体16s rRNA保守区域DNA序列的引物对相应的扩增产物，说明CHO培养细胞中出现了支原体污染；

B)如果特异性扩增CHO细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA序列的引物对相应的扩增产物没有出现，说明PCR体系没有正常工作，此时检测结果无效；

8.如权利要求7所述的检测方法，步骤1)中所述提取待检CHO培养细胞DNA的方法为：取待检CHO培养细胞液离心沉淀；用PBS缓冲液充分悬浮沉淀物，离心沉淀；弃上清，加入TE缓冲液，再次充分悬浮沉淀物，煮沸；离心沉淀，取上清作为PCR反应模板。

9.如权利要求7所述的检测方法，步骤2)与步骤3)所述扩增反应的反应条件为：94℃ 预变性 5分钟，然后 94℃ 变性30秒，50℃～53 ℃ 退火 30秒，72 ℃ 延伸 40 秒，35个循环后，72 ℃恒温 10分钟。