CN105525012A - 一种花生杂交种的分子鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生杂交种的分子鉴定方法。它是对花生杂交种的父本和母本的简化基因组测序，通过对测序结果进行分析，鉴定父本和母本之间SNP分子标记并设计父母本通用引物；提取花生杂交种的基因组DNA，通过PCR反应和酶切的方法验证花生杂交种是否同时具有父本和母本的共同特征片段。该方法能快速、准确鉴定花生杂交种。

Description

一种花生杂交种的分子鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种利用分子生物学手段鉴定花生杂交种，属于生物技术领域。

背景技术

中国是世界上生产花生最多的国家，花生生产在国民经济中占重要地位。花生是我国重要的油料作物和经济作物，也可以用来提取重要的工业原料。花生还是我国传统的大宗出口商品，以及重要的营养保健品，在农业种植结构中占据重要地位。

杂交育种是国内外应用最普遍、成效最突出的花生育种方法。杂交育种就是利用不同基因型亲本进行杂交，通过基因重组，使杂交后代出现不同的变异类型，再经过选择培育，形成新品种。新中国成立以来培育并推广的260多个花生新品种，70％以上是通过杂交的方法培育的。在杂交育种过程中，快速准确的筛选到具有父本和(或)母本优良性状的子代个体是非常重要的。

传统的杂交育种方法筛选子代种子主要通过表现型观察杂交是否成功。然而，隐性基因控制的某些表型是通过多代繁殖后才能变现出来，筛选过程长，需要2-3年甚至更长。分子生物学和高通量基因测序技术的快速发展为作物杂交育种的分子鉴定提供了基础，分子鉴定方法快速可靠，可以快速鉴定子代杂交种子的真伪，剔除杂交不成功的种子，极大减少后期的田间管理的工作量。然而，目前为止花生杂交后代分子鉴定还未见相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种花生杂交种的分子鉴定方法。该方法能快速、准确地鉴定花生杂交种。

本发明的技术方案是：一种花生杂交种的分子鉴定方法，其特征是，对花生杂交种的父本和母本的简化基因组测序，通过对测序结果进行分析，鉴定父本和母本之间单核苷酸多态性(SNP)分子标记并设计父母本通用引物；提取花生杂交种的基因组DNA，通过PCR反应和酶切的方法验证花生杂交种是否同时具有父本和母本的共同特征片段。具体如下：

1)父本和母本花生简化基因组测序

收集花生杂交种的父本和母本叶片材料，提取DNA，进行简化基因组测序。简化基因组测序服务包含两种类型建库测序策略，分别为RAD(restrictionassociationsiteDNA)测序和GBS(genotypingbysequencing)，两种方法各有优势。本发明采用可以通过对测序数据进行拼接来提高获得更长的序列信息的RAD测序法，从而应用于SSR标记开发、引物设计等。

2)父本和母本花生单核苷酸多态性开发

单核苷酸多态性是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列的多态性，这个变异主要是由于单个碱基的转换或者颠换所引起的。通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C←→T，在其互补链上则为G←→A)，也可能是颠换(C←→A，G←→T，C←→G，A←→T)。通过对父本和母本的RAD测序结果的生物系信息分析，开发在父本和母本之间的SNP分子标记。

3)PCR及PCR产物酶切鉴定

采用改良的CTAB法提取花生杂交种的基因组DNA，作为PCR反应的模板；根据SNP分子标记设计父母本通用引物；通过PCR反应，扩增花生杂交种特异的DNA片段，对该片段酶切，由于所选择的PCR片段只有父本或者母本具有酶切位点，杂交成功的花生杂交种经酶切后应该有大小两个片段，一个来自父本另外一个来自母本。

本发明鲁花14(以下简写为LH14)×Tifrunner杂交种的分子鉴定方法，其特征是，收集LH14和Tifrunner花生叶片材料，提取DNA，RAD测序法进行简化基因组测序；寻找用限制性内切酶HindⅢ酶切来区分LH14和Tifrunner两个花生品种的SNP分子标记并设计父母本通用引物；提取LH14×Tifrunner杂交种的基因组DNA，通过PCR反应，扩增其特异的DNA片段，对该片段酶切；杂交成功的LH14×Tifrunner杂交种经酶切后具有大小两个片段，一个来自父本另外一个来自母本。

优选的，所述的SNP分子标记如SEQNo.1-4所示，限制性内切酶HindⅢ识别的序列为AAGCTT，在Tifrunner中的序列为AAGCTT，可以被限制性内切酶HindⅢ切开，而在LH14中的序列变异为AAGTTT不能被限制性内切酶HindⅢ识别。更优选的，所述父母本通用引物如SEQNo.6-7所示。

优选的，LH14×Tifrunner杂交种的分子鉴定方法，其特征是，提取LH14×Tifrunner杂交种的花生基因组DNA作为模板，采用如SEQNo.6-7所示的引物进行PCR扩增，回收目的片段，经限制性内切酶HindⅢ酶切后再采用琼脂糖凝胶电泳检测，出现755bp和393bp片段的判定为杂交种。

优选的PCR反应体系为：20μL体系中包含10μLPCR-mix(1UTaqDNA聚合酶，2.5μL10×PCR缓冲液，2.5mMMgCl₂，200μMdNTPs)，正向引物、反向引物各0.2μM，50ng模板DNA，7μL无菌ddH₂O。

优选的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃1min，55℃30s，72℃1min，共共35个循环；72℃延伸10min；16℃保存。

本发明的有益效果是：该方法简单快速，而且不受种植环境影响，能快速、准确鉴定花生杂交种，可实现早期选种。

附图说明

图1为PCR产物经HindⅢ酶切后的电泳检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1：鲁花14(以下简写为LH14)×Tifrunner为亲本的杂交种的分子鉴定方法

1.LH14×Tifrunner花生简化基因组测序

收集LH14和Tifrunner花生叶片材料，提取DNA，RAD测序法进行简化基因组测序。

2.LH14×Tifrunner花生单核苷酸多态性开发

根据RAD测序结果，寻找可以用HindⅢ酶切来区分LH14和Tifrunner两个花生品种的SNP(单核苷酸多态性)分子标记，表1列出其中的部分SNP(4条不同序列)，其中黑体AAGYTT部分为AAGTTT或者AAGCTT。HindⅢ识别的序列为AAGCTT，在Tifrunner中的序列为AAGCTT，可以被HindⅢ切开，而在LH14中的序列变异为AAGTTT不能被HindⅢ识别，因此可以用来区别LH14和Tifrunner。

表1用HindⅢ酶切来区分LH14和Tifrunner两个花生品种的部分SNP

3.CTAB法提取花生基因组DNA

采用改良的CTAB法提取花生基因组DNA，具体步骤如下：

(1)取新鲜幼嫩的叶片2g，置于研钵中，用液氮研磨成粉状，用2.0mL的预冷的离心管分装，每管2/3；

(2)加入700μL65℃预热的CTAB抽提缓冲液，充分混合，于65℃恒温水浴锅水浴1h，期间摇动数次；

(3)4℃，10000rpm离心10min；取上清液600μL转入另一2.0mL的离心管中；加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1，v：v：v)，缓慢颠倒混匀；

(4)4℃，10000rpm离心10min；吸取上清液500μL转入另一2.0mL的离心管中；加入等体积氯仿/异戊醇(24：1，v：v)，缓慢颠倒混匀；

(5)4℃，10000rpm离心10min；吸取上清液400μL转入1.5mL离心管中；加入1倍体积的冰冻无水乙醇和1/3体积的3molL^-1的醋酸钠溶液，置于-20℃冰箱中30min；

(6)4℃，12000rpm离心10min，弃上清液，用800μL70％乙醇漂洗2次，风干；用100μL无菌水溶解DNA，置于4℃冰箱中备用。

以灭菌ddH₂O为空白对照，将DNA样品稀释50倍，使用Eppendorf-Bio-Photometer核酸蛋白含量测定仪检测DNA质量，读取A260/280和DNA含量2个数值。计算出样品DNA稀释前的浓度，然后稀释到50-100ng/μL，用于PCR扩增。

4.引物的设计

采用表1中的序列SEQNo.1在http://www.peanutbase.org网页中的Blast进行比对，寻找除了SNP位点外完全匹配的序列，然后分别向两侧扩展1000bp，得到如SEQNo.5所示的完整序列。用此序列利用primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计距离SNP位点300-600bp引物，上游引物为：TTTGCCAAGAGTACAAGCACA(SEQNo.6)，下游引物为：CGCAAGTAGTTTCGCAAATG(SEQNo.7)。

5.PCR反应及PCR产物酶切结果分析

(1)PCR反应体系

20μL体系中包含10μLPCR-mix(1UTaqDNA聚合酶，2.5μL10×PCRBuffer，2.5mMMgCl₂，200μMdNTPs)，正向引物、反向引物各0.2μM，50ng模板DNA，7μL无菌ddH₂O。

(2)PCR扩增

在美国MJ公司PTC100型扩增仪上进行。具体步骤如下：

Step1：94℃3min；

Step2：94℃1min；

Step3：55℃30s，

Step4：72℃1min，

Step5：GotoStep2，35cycles；

Step6：72℃10min；

Step7：16℃。

(4)电泳检测

用0.5×TBE溶液(44.5mMTris-硼酸，20mMEDTA)配制1％(W/V)的琼脂糖凝胶，加入0.05μgmL^-1GoldView荧光染料；向20μL反应终产物中加入4μL6×LoadingBuffer后混匀，取7μL混合液点样，在0.5×TBE电泳缓冲液中进行水平电泳，液面浸没凝胶表面5mm。电泳过程电压100V，时间15min。电泳结束后在凝胶成像仪进行观察并拍照。

在紫外光下对照Maker观察电泳结果，用干净的小刀从胶板上切下目的条带。使用Magen琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒对目的DNA片段进行回收与纯化，把纯化后的PCR片段用HindⅢ酶切。

酶切后再经琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图1所示，杂交F1植株1，2的PCR片段只有来自Tifrunner(父本)可以被酶切的DNA片段，没有来自LH14(母本)不能被酶切的片段，被认为非杂交种子。杂交F1植株3，4，5的PCR片段既有来自LH14(母本)不能被酶切的DNA片段，也有来自Tifrunner(父本)能被酶切的片段，被认为是杂交种子。

本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种花生杂交种的分子鉴定方法，其特征是，对花生杂交种的父本和母本的简化基因组测序，通过对测序结果进行分析，鉴定父本和母本之间SNP分子标记并设计父母本通用引物；提取花生杂交种的基因组DNA，通过PCR反应和酶切的方法验证花生杂交种是否同时具有父本和母本的共同特征片段。

2.如权利要求1所述的一种花生杂交种的分子鉴定方法，其特征是，

1)收集花生杂交种的父本和母本叶片材料，提取DNA，采用RAD测序法进行简化基因组测序；

2)通过对父本和母本RAD测序结果的生物系信息分析，开发父本和母本之间的SNP分子标记，根据SNP分子标记设计父母本通用引物；

3)提取花生杂交种的基因组DNA，作为PCR反应的模板，采用步骤(2)的父母本通用引物，通过PCR反应，扩增花生杂交种特异的DNA片段，对该片段酶切；杂交成功的花生杂交种经酶切后具有大小两个片段，一个来自父本另外一个来自母本。

3.一种鲁花14×Tifrunner杂交种的分子鉴定方法，其特征是，收集鲁花14和Tifrunner花生叶片材料，提取DNA，RAD测序法进行简化基因组测序；寻找用限制性内切酶HindⅢ酶切来区分鲁花14和Tifrunner两个花生品种的SNP分子标记并设计父母本通用引物；提取鲁花14×Tifrunner杂交种的基因组DNA，通过PCR反应，扩增其特异的DNA片段，对该片段酶切；杂交成功的鲁花14×Tifrunner杂交种经酶切后具有大小两个片段，一个来自父本另外一个来自母本。

4.如权利要求3所述的一种鲁花14×Tifrunner杂交种的分子鉴定方法，其特征是，所述SNP分子标记如SEQNo.1-4所示，限制性内切酶HindⅢ识别的序列为AAGCTT；在Tifrunner中的序列为AAGCTT，能被限制性内切酶HindⅢ切开，在鲁花14中的序列为AAGTTT，不能被限制性内切酶HindⅢ识别。

5.如权利要求4所述的一种鲁花14×Tifrunner杂交种的分子鉴定方法，其特征是，所述父母本通用引物如SEQNo.6-7所示。

6.如权利要求5所述的一种鲁花14×Tifrunner杂交种的分子鉴定方法，其特征是，提取鲁花14×Tifrunner杂交种的花生基因组DNA作为模板，采用如SEQNo.6-7所示的引物进行PCR扩增，回收目的片段，经限制性内切酶HindⅢ酶切后再采用琼脂糖凝胶电泳检测，出现755bp和393bp片段的判定为杂交种。

7.如权利要求6所述的一种鲁花14×Tifrunner杂交种的分子鉴定方法，其特征是，所述PCR扩增采用20μL扩增体系，它包含10μLPCR-mix，正向引物、反向引物各0.2μM，50ng模板DNA，7μL无菌ddH₂O；所述10μLPCR-mix含有以下成分：1UTaqDNA聚合酶，2.5μL10×PCR缓冲液，2.5mMMgCl₂，200μMdNTPs。

8.如权利要求6或7所述的一种鲁花14×Tifrunner杂交种的分子鉴定方法，其特征是，所述PCR扩增的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃1min，55℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃延伸10min；16℃保存。