CN101619357A - 一种获得est-ssr标记的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种开发EST－SSR标记的方法。该方法包括如下步骤：1)获得基因组内含有简单序列重复的EST序列；2)在步骤1)得到的含有简单序列重复的EST序列中，将含有相同简单序列重复单元的EST序列归为一类；3)将步骤2)得到的同类的EST序列进行序列拼接，得到简单序列重复单元数目变异的重叠群、简单序列重复单元数目无变异的重叠群和没有形成重叠群的EST序列；4)根据步骤3)中简单序列重复单元数目变异的重叠群内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，再进行引物多态性检测，得到多态性引物，即为EST－SSR标记。与比常规方法相比，开发效率可提高2－4倍，减少工作量和经费消耗，从而缩短了研发时间、降低了开发成本，同时降低了错过多态性SSR位点的可能性。

Description

一种获得EST-SSR标记的方法

技术领域

本发明涉及一种获得EST-SSR标记的方法。

背景技术

SSR简单序列重复标记(Simple sequence repeat，简称SSR标记)，也叫微卫星序列重复，是长达几十个核苷酸的串联重复序列，其重复单位一般为2-6个核苷酸，它们广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，而且分布比较均匀，平均每10kb的DNA序列中就会出现一个微卫星序列，SSR标记因为具有共显性、高度重复性、高度丰富的多态性等优点，成为构建遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、目标性状分子标记筛选和法医鉴定的理想工具。表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)中也含有SSR序列，被称为EST-SSR，基于EST的SSR标记(即EST-SSR标记)是近年发展起来的新型分子标记，与基因组SSR标记(即genomic-SSR标记)相对应。与基因组SSR标记相比，EST-SSR标记有其独特的优越性：从标记开发的角度来说，省去了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用了现有测序数据，降低了开发成本；从应用的效果角度考虑，EST-SSR来自基因转录区段，可以反映出基因表达的信息，为功能基因提供“绝对”的标记，可直接定位决定重要表型性状的等位基因(Chen X，Salamini F，Gebhardt C.2001.A potato molecular functionmap for carbohydrate metabolism and transport.Theoretical and AppliedGenetics.102(2)：284-295)；由于EST-SSR两翼序列保守性好，因此在不同物种间有较好的通用性(Cordeiro G M，Casu R，McIntyre C L，et al.2001.Microsatellite markers from sugarcane(Saccharum spp.)ESTs crosstransferable to erianthus and sorghum.Plant Sci.160：1115-1123；DecroocqV，Fave M G，Hagen L，et al.2003.Development and transferability of apricotand grape EST microsatellite markers across taxa.Theor Appl Genet.106(5)：912-922)。EST-SSR标记的诸多优点和许多物种的大量EST序列获得为EST-SSR标记开发提供基础，然而不同的开发方法对标记开发的效率有一定影响。研究表明，10％的mRNA 3’端有重复序列，这可以作为SSR标记(Hatey F，Yano M，ShomuraA，et al.1998.Expressed sequence tags for genes：a review.Gnent.Sel.Evol.30(1)：521-541；Yammanoto K，Sasaki T.1997.Large scale EST sequencingin rice.Plant Molecular Biology，35(1)：135-144)。研究表明，由于EST-SSR标记来自高度保守的基因转录区，其多态性水平低于基因组SSR标记(Scott K D，Eggler P，Seaton G，et al.2000.Analysis of SSRs derived from grape ESTs.Theor.Appl.Genet，100：723-726)。来自3’EST的SSR标记高于来自5’EST的SSR标记(Scott K D，Eggler P，Seaton G，et al.2000.Analysis of SSRsderived from grape ESTs.Theor.Appl.Genet，100：723-726)，3’EST可能包含cDNA的3’转录非翻译区(3’UTR)，这个区域的变异频率要远大于5’EST，所以大多数研究是从3’EST入手开发EST-SSR以提高出现多态性标记的可能性，但这种方法容易错过存在于5’EST的SSR标记；也有报道认为SSR随着重复次数的增多，其产生多态性的可能性会增大，所以许多研究把目标锁定SSR重复次数达到一定的数量以上的序列，而这种方法也会错过一些具有多态性的SSR短序列。总之，目前的SSR标记的开发方法都存在效率不高、费时费力的问题。目前，还没有一种高效开发EST-SSR标记方法的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种获得EST-SSR标记的方法。

本发明所提供的获得EST-SSR标记的方法，包括如下步骤：

1)获得基因组内含有简单序列重复的EST序列；

2)在步骤1)得到的含有简单序列重复的EST序列中，将含有相同简单序列重复单元的EST序列归为一类；

3)将步骤2)得到的同类的EST序列进行序列拼接，得到简单序列重复单元数目变异的重叠群、简单序列重复单元数目无变异的重叠群和没有形成重叠群的EST序列；

4)根据步骤3)中简单序列重复单元数目变异的重叠群内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，再进行引物多态性检测，得到多态性引物，即为EST-SSR标记。

上述方法中，在步骤3)后，还可包括如下步骤：根据步骤3)中简单序列重复单元数目无变异的重叠群内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，进行引物多态性检测，得到多态性引物。

上述方法中，在步骤3)后，还可包括如下步骤：根据步骤3)中没有形成重叠群的EST序列内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，进行引物多态性检测，得到多态性引物。

上述方法中，所述基因组可为植物基因组、动物基因组或微生物的基因组。

上述方法中，所述植物为大豆。

在可获得一定数量的EST数据的基础上，本发明的方法适用于所有物种EST-SSR标记的开发，具体如大豆；EST数据越丰富，利用本方法的开发标记的效果越好。

本发明的另一个目的是提供一种EST-SSR标记，其中的一条序列如序列表中序列10所示，另一条序列如序列表中序列11所示。

上述所述EST-SSR标记在构建SSR多态性图谱中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种大豆SSR多态性图谱。

本发明所提供的大豆SSR多态性图谱，是按照包括如下步骤的方法得到的：

1)提取大豆的基因组DNA；

2)以基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的EST-SSR标记进行PCR扩增；

3)将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到大豆SSR多态性图谱。

在众多EST-SSR序列中开发SSR多态性标记，选择用以设计引物序列的策略对于开发效率是一个很关键的环节。本发明表明，单纯区分3’、5’EST-SSR序列，并选择公认变异频率较高的3’EST-SSR序列设计引物，其效果并不理想，多态性的比率并不高，同时不能充分利用5’EST-SSR序列的开发潜力。相比之下，利用冗余序列拼接寻找可能的SSR变异位点开发多态性标记的策略不必区分EST序列类型，而且鉴定出多态性引物的可能性更大，从而提高了从EST数据资源中开发SSR标记的效率。

本发明在常规EST-SSR开发方法的基础上，对序列的前处理环节进行改进，有效的利用EST数据库高度冗余的特性，寻找含有潜在的SSR变异位点的冗余EST序列群，将其拼接成序列重叠群后进行引物设计及引物多态性检测，与比常规方法相比，开发效率可提高2-4倍，减少工作量和经费消耗，从而缩短了研发时间、降低了开发成本，同时降低了错过多态性SSR位点的可能性。

本发明所提供的标记可用于构建动植物的SSR多态性图谱，进而用于动植物的QTL定位，寻找与其对应的性状；标记还可用于研究动植物系统进化关系；标记还可用来鉴定物种。因此，本发明的方法及标记将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为拼接结果及简单序列重复单元数目变异的重叠群的选择示意图。

图2大豆SSR多态性图谱。(图中泳道编号分别与表1中品种编号对应)

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、获得大豆的EST-SSR标记

一、引物的设计

1、获取大豆基因组内的EST序列

从NCBI生物信息资源数据库中下载大豆EST序列，共获得了458220条大豆EST序列。

2、搜索含有SSR(即简单序列重复)的EST序列

用SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool)软件对步骤1得到的所有EST序列进行在线搜索，得到含有简单重复序列的EST序列(称作SSR-EST序列)；搜索的标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复单元的重复次数分别大于或等于6、5、4、4、4。

3、将SSR-EST序列进行归类

根据简单序列重复单元种类的不同，将步骤2得到的所有SSR-EST序列进行分类，将含有相同种类简单序列重复单元的SSR-EST序列归为一类。如将含有AT重复单元的序列归为一类。

4、同类SSR-EST序列拼接

使用软件CExpress对归为同类的SSR-EST序列进行拼接，冗余SSR-EST序列被拼接在一起，形成重叠群。得到简单序列重复单元数目变异的重叠群、简单序列重复单元数目无变异的重叠群和没有形成重叠群的EST序列。

5、根据SSR重复数目变异的重叠群进行设计引物

从拼接结果中选择具有SSR重复数目变异的重叠群(Contig)，根据重叠群内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物(图1)，得到EST-SSR标记。再根据没有形成重叠群的EST序列内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，得到EST-SSR标记。

此步骤中，将每个SSR重复数目变异的重叠群(Contig)均进行引物设计，包括同类的SSR-EST序列形成几个contig、且各contig内的重复数目都是有变异的情况；如简单序列重复单元为AT，形成了2个contig，第一个contig内AT重复数目有5、6的，第二个contig内AT重复数目有7、8的，则两个contig都进行引物设计。

每个contig中重复序列两端的侧翼序列都是很保守的，根据保守序列进行引物设计。

二、引物多态性检测

(一)材料

所用的植物材料如表1所示，表1中的所有品种均可以从国家种质库获得。

表1、EST-SSR标记多态性验证材料名称及编号

编号	供试材料	编号	供试材料	编号	供试材料
						1	建96	11	宝交98-5016	21	黑河30
2	建97	12	黑农45	22	黑河19
						3	哈99	13	垦丰9	23	哈北46-1
4	黑河97	14	阳02	24	黑交99
						5	吉育47	15	农大5918-2	25	北江94-641
6	黑河18	16	东农46	26	黑河31
						7	黑河17	17	黑农44	27	Charleston
8	北丰16	18	合丰45	28	东农594
						9	黑福97-43	19	绥农11	29	垦鉴1
10	黑河22	20	北98-97-4	30	红丰11

(二)实验方法

1、大豆基因组DNA的提取

采用CTAB法提取植物材料的基因组DNA。

(1)CTAB提取液的配制

a)1M Tris-HCl(pH 8.0)：称取121.1g Tris溶于800ml水中，搅拌条件下加入37％浓盐酸。pH接近8.0时，用稀HCl准确调至8.0，加入重蒸水至总体积1L，分装，高压灭菌。

b)5M NaCl：称取292.2g NaCl，溶于800ml蒸馏水中。完全溶解后用蒸馏水定容至1L，分装，高压灭菌。

c)0.5M EDTA(pH 8.0)：称取186.1g EDTA-Na2·2H2O加入800ml双蒸水，用磁力搅拌器搅拌，加入NaOH(10M)调pH至8.0。待EDTA-Na2·2H2O完全溶解后，再用稀NaOH准确调pH＝8.0，加入双蒸水定容至1L，灭菌。

(2)基因组DNA提取流程

取1克新鲜叶片(除去大叶脉)放于液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨均匀至细粉状。然后转到50ml离心管中，加入15-20ml的65℃预热的DNA提取液，混匀后放于65℃水浴锅中水浴2小时，水浴期间要将离心管每隔约15分钟左右倒置几次，使叶片粉末与提取液充分接触。水浴后，在室温下冷却5min，加入15ml氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液，倒置几次。

在室温下，轻轻摇动5-10min。将50ml离心管放入离心机，2000-2800rpm，10min。取上清液，加入15ml氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液倒置几次，重复上次的操作。取上清后，加入50μl RNase(10mg/ml)室温下放置30min，在加入等体积异丙醇(-20℃保存)倒置15次以上，静置30分钟，将异丙醇倒出，得到白色絮状沉淀，用70％乙醇洗去抽体液，得到纯净DNA，自然风干后用灭菌的超纯水溶解，4℃保存，备用。

2、DNA质量检测

采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。把溶解好的DNA母液稀释10倍，取出2μl加入8μl0.25％溴酚蓝，在0.8％的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，以λDNA(50ng/μl)作为标准，设置浓度梯度，将待测DNA与λDNA比较产物浓度，确定PCR反应的最适宜浓度。

3、PCR反应体系及程序

采用梯度PCR方法确定引物的最佳退火温度(本研究使用TECHNE PCR仪，型号为TC-512)。采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测梯度PCR扩增产物。

表2梯度PCR反应体系

反应体系(16ul)	试剂用量
		模版DNA(50-100ng)	2.4μl
PCR buffer	1.6μl
		MgCl2(25mM)	1.2μl
dNTP(2.5mM)	0.24μl
		Tag DNA合成酶(5units/μl)	0.24μl

正反向引物(4μM)	4μl
		超纯水	6.32μl

表3梯度PCR反应程序

步骤	反应过程	温度	反应时间
				Step 1	预变性	94℃	10min
Step 2	变性	94℃	30s
				Step 3	退火	47-62℃	1min
Step 4	延伸	72℃	30s
				Step 5	35cycles	go to step 2
Step 6	终延伸	72℃	5min

所设计的引物经梯度PCR确定退火温度之后，用特异退火温度PCR对引物多态性验证材料进行扩增，最后采用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物(100W恒功率，电泳约1小时)，确定引物多态性。特异退火温度PCR体系与梯度PCR相同，其反应程序如下：

表4梯度PCR反应程序

步骤	反应过程	温度	反应时间
				Step 1	预变性	94℃	10min
Step 2	变性	94℃	30s
				Step 3	退火	引物最佳退火温度	1min
Step 4	延伸	72℃	30s
				Step 5	35cycles	go to step 2
Step 6	终延伸	72℃	5min

4、电泳检测方法

在16ul PCR产物中加入6ul甲酰胺双色Loading Buffer(98％的甲酰胺，10mM的EDTA，0.25％的溴酚蓝，0.25％的二甲苯菁)，置于PCR仪中在94℃下变性10min，使产物解链。然后立即放入冰水混合物中冷却。PCR产物在6％聚丙烯酰胺凝胶(PA)测序胶上分离，在100W恒功率下电泳约2小时，银染检测。电泳仪采用Biolab垂直电泳仪，变性PCR产物进样量为6ul。具体步骤如下：

(1)玻璃板清洗及制胶前处理：用温水加上洗涤剂把玻璃板反复擦洗，用蒸馏水冲一遍，再用酒精擦净并晾干。制胶前用70％酒精擦拭凹口玻璃板，均匀涂抹2％剥离硅烷(10ml Repel Saline溶于490ml三氯甲烷)后；在另一块玻璃板用70％酒精擦拭后均匀涂抹0.5％(10μl Binding Saline和10μl冰乙酸溶于2ml 95％乙醇)，双板晾干后，进行玻璃板的组装、灌胶。

(2)灌胶：把配制好的胶液50ml(含有200μl过硫酸铵和20μl TEMED)混匀，排出气泡后沿灌胶口边缘灌进，边灌边轻轻敲打，防止出现气泡。待胶流动至底部边缘，插入齿梳(梳齿向外侧平端向内侧)，静置至少30min，使胶液充分聚合凝固。

(3)电泳：拔出梳子，立即用蒸馏水冲洗点样口，刮去附着在点样口上多余的胶，插入梳子，点适量Loading Buffer，预电泳约20分钟，加变性后PCR产物6μl，电泳时间依据SSR扩增产物的分子量加以调整。

(4)固定：电泳结束后取下玻璃板，把玻璃凹口板取下，附着胶体的玻璃板放入固定液中固定20分钟(固定液：100ml冰醋酸和900ml蒸馏水的混合液)。

(5)水洗：取出固定液中的玻璃板，放入蒸馏水中，水洗10分钟。

(6)银染：把水洗后的玻璃板放入银染液中染色20-30分钟(银染液：1000ml蒸馏水和2ml硝酸银溶液的混合液)，硝酸银见光易分解，因此银染过程中应注意避光。

(7)水洗：蒸馏水水洗7-8秒钟，洗去胶面残留的硝酸银溶液。

(8)显影：于上步的水洗槽中把玻璃板迅速取出，放入显影液中，进行显影。(显影液：1000ml蒸馏水、30g无水碳酸钠、200μl硫代硫酸钠溶液和1500μl甲醛溶液的混合液)。

(9)固定：待影像清晰后，取出玻璃板，放入固定液中进行固定。

(10)水洗，风干：用自来水洗去固定液残留在胶面的酸味，将胶板置于通风处风干后，统计数据。

结果如表5所示。多态性引物的比率＝多态性引物数目/所有引物数目。

以获得的多态性引物中的1例为例，说明检测结果。该多态性引物(即EST-SSR分子标记)的一条序列如序列表中序列10所示，另一条序列如序列表中序列11所示。

用该引物对表1中所示材料分别进行PCR扩增，进行多态性检测，结果如图2所示。实验设3次重复，均得到相同的结果。图2也就是大豆品种的SSR多态性图谱。说明本发明标记可以用于构建大豆SSR多态性图谱。

表5、来自Contig序列的EST-SSR多态性统计

检测项目	序列数	所有引物数目	多态引物数目	多态性引物比率(％)
					EST总数目	110	110	50	45.45
总3’EST	27	27	14	62.96
					总5’EST	75	75	36	48
总其他EST	8	8	5	62.5

三、EST-SSR标记的可靠性检测

为了验证所开发的EST-SSR标记的多态性确属SSR序列的重复次数改变，进行如下多态性引物在不同基因型上的PCR产物测序比较。

从上述开发的具有多态性的EST-SSR标记中选择3对：SES71、SES74和SES176；对同一引物，选择多态性验证中扩增产物有长度差异的两份材料；具体如下：

以SES71为引物，分别以吉育47、垦鉴1的基因组为模板，PCR扩增，将扩增产物进行测序；

以SES74为引物，分别以红丰11、黑农44的基因组为模板，PCR扩增，将扩增产物进行测序；

以SES176为引物，分别以Charleston、东农594的基因组为模板，PCR扩增，将扩增产物进行测序。

测序结果如下：

1、引物ses71的源序列：

>gi|18729506|gb|BM525336.1|BM525336 sal22f10.y1Gm-c1059 Glycine soja cDNA clone

SOYBEAN CLONE ID：Gm-c1059-29715′，mRNA sequence

CAGTGCCAAAGTTTCAAAGCCGATTCATTTTTCATGGATCTGGGTGTGTTGTTCCTG

ATCTTACAACATTAAAAATGATCAACTGAGGAATCTAAGATTTTACTGGCAAAAGG

CTACTGCTATAGCTCTATCCAGAGTTAAAGAAAGCTAAATGCAATTTGGTATGAGCT

AAGACAGGCATTGCAGATGGGCCTTTGGGAATTCTGTTGAGGAGTTAAAAAAGAAA

AGGAAAAAGTAAAGCCTCTGTTTCTTTTTCCATTCGCAGCT

TTTGCAGCTAGAGATGAAAAATGATAGAAATTTTGCATAGCCAAGACCCTATCT

TTTTATTTTCGTTT

TTTTTTCTCTGGCTCAG

ATNGGGTGGGGATACAATTGAATTGATTGAACTTGACCAGT

TCTTAGTCAGAAATGACGATCTGTAATGGAGAGTGGATTTCCACCATTGCGTATTAA

AATGATTATTCTGAATTGATTTCTTAACCCAAAAAAA(序列1)

ses71在吉育47中的扩增产物测序结果：

TTGCAGCTAGAGATGAAAAATGATAGAAATTTTGCAT

AGCCAAGACCCTATCTGTTTATTTTCGTTTTTTTTTCTCTGGCTCAG

(序列2)

ses71在垦鉴1中的扩增产物测序结果：

TTGCAGCTAGAGATGAAAAATGATAGAAATTTTGCAT

AGCCAAGACCCTATCTGTTTATTTTCGTTT

TTTTTT

CTCTGGCTCAG

(序列3)

2、引物ses74的源序列：

gi|7028158|gb|AW457941.1|AW457941 sh97g07.y1 Gm-c1016 Glycine max cDNA clone

GENOME SYSTEMS CLONE ID：Gm-c1016-81495’，mRNA sequence

TTTATGCAAATCCTCTGCCAGGATGTATTTGTGAAACAAGATAGTAGTAGAGACTTC

CCTGAAGGTTGTCTGTCTTTTGATGGAATGGCCGAGCTGTAATCAAAAGGCGATGTG

GCTATGCCGTGATATTTTTTTAACCCTTCTGTCTTGAGGAGATAGCAATGTGCTGGG

CTATCCGGTAAGGTGCTATTAATTGCCTGGCTGTTGGGATAAGATTACAAATGGCCA

AGGTGGGGGCAAGAATCTGAGATTCCTAGCTACATTATTAAAATTAA

CTGAGTATACCACTGTCAATACAATAGAAATTAAACACCTTACATT

TTTAAGCAAACCTCATCTCTAACCTCACTTTTGAATGA

TTGA

TTAAATTTTATTCATTACTTGTACCAATAGCAA

AT

TCTTATTGTACAA(序列4)

ses74在红丰11中的扩增产物测序结果：

CTGAGTATACCACTGTCAATACAATAGAAATTAAACA

CCTTACATTTTTAAGCAAACCTCATCTCTAACCTCACTTTTGAATGA

TTG

ATTAAATTTTATTCATTACTTGTACCAATAGCAA

(序列5)

ses74在黑农44中的扩增产物测序结果：

CTGAGTATACCACTGTCAATACAATAGAAATTAAACA

CCTTACATTTTTAAGCAAACCTCATCTCTAACCTCACTTTTGAATGA

TTGATTAAATTTTATTCATTACTTGTACCAATAGCAA

(序列6)

3、引物SES176的源序列：

>gi|7588597|gb|AW704389.1|AW704389 sk30e03.y1 Gm-c1028 Glycine max cDNA clone

GENOME SYSTEMS CLONE ID：Gm-c1028-37015′，mRNA sequence

ACGAGCACAAAGTTCGCGTCGGTTGGAGTAACGGGTTGGTTAAGCC

CTGAAACACCGATTACTATTACTTACAAGCGTTTTTGT

CTCCATTTCCTCATCGATCAGATCTGAATCAATCTCACATTCTTCAATTTAA

TTTCTCTCGTAATTCCTGGCCGCCAAACCCTATTACCT

TTGTATAGATCATCTCAACTTTGCTGCTCAGGAGAAATAACAAACGAAATTAGCGG

AGGAATATCTCCGCCATTGACGACAATTGACAACCGATGTAGGTTATCACTTTGGGT

AAAGAAGATAAAGGTGAGGGAAGAGATGGTAAGCAGAGGCTCGTACAGCTCTAGC

AGCCTCTTGACTGGTAGATTTCATGCTAGAAAGCTATCTCCTAGCATTATCACTNTC

TACACCATGTTCATATTTGCTNTCTCCATCTTCATGTTCT(序列7)

ses176在Charleston中的扩增产物测序结果：

CTGAAACACCGATTACCATTACTTACAAGCGTTTTTG

TCTCCATTTCCTCATCGATCAGATCTGAATCAATCTCACATTCTTC

AATTTAATTTCACTCGTAATTC

(序列8)

Ses176在东农594中的扩增产物测序结果：

CTGAAACACCGATTACCATTACTTACAAGCGTTTTTG

T

CTCCATTTCCTCATCGATCAGATCTGAATCAATCTCACATTC

TTCAATTTAATTTCACTCGTAATTC

(序列9)

表6、多态性引物扩增产物抽样测序结果

分析测序结果，所选三对表现多态性的引物(SES71，SES74，SES176)分别以三对不同大豆基因型基因组DNA为模板的扩增，其引物序列在测序结果中均能找到匹配位置，通过测序结果与源序列进一步对比发现，三对引物扩增得到的产物序列与EST序列源除SSR的长度有差异外其他区域均能完全匹配，说明产物长度多态来自SSR重复次数差异，此结论表明本发明的SSR标记开发结果是可靠的。

实施例2：本发明的EST-SSR标记开发方法与常规方法的比较

现有方法：从实施例1中得到的所有EST-SSR序列中，随机挑取191条进行引物开发设计，每条序列得到一对引物，共得到191对引物。然后用实施例1中实验二中所述方法检测每对引物的多态性，并统计多态性引物的比率，结果如表7。多态性引物的比率＝多态性引物数目/所有引物数目。

表7、现有方法的EST-SSR多态性统计

检测项目	序列数	所有设计的引物数目	多态性引物数目	多态性引物比率(％)
					EST总数目	191	191	30	15.71
3’EST数目	32	32	7	21.88
					5’EST数目	144	144	22	15.28
其他EST	15	15	1	6.67

比较表5和表7的研究结果，可以看出：两种方法的共同特点是3’EST产生多态性引物的比率均高于5’EST和其他来源EST，但不显著；横向比较两种方法，可以发现本发明方法产生多态引物的比例明显高于前者。现有的随机选择EST-SSR序列进行引物设计，所得到的多态性引物占引物总数的比例约为15.71％。单纯选择3’SSR-EST序列设计引物，多态性引物比率为21.88％，单纯选择5’SSR-EST序列设计引物，多态性引物比率为15.28％，其他类型EST序列产生多态性引物的比率为6.67％。而发明的的EST-SSR标记开发方法的最低效率也可达到45.45％，是普通方法平均开发效率的3倍。

序列表

<110>东北农业大学

<120>一种获得EST-SSR标记的方法

<160>11

<210>1

<211>551

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

cagtgccaaa gtttcaaagc cgattcattt ttcatggatc tgggtgtgtt gttcctgatc     60

ttacaacatt aaaaatgatc aactgaggaa tctaagattt tactggcaaa aggctactgc    120

tatagctcta tccagagtta aagaaagcta aatgcaattt ggtatgagct aagacaggca    180

ttgcagatgg gcctttggga attctgttga ggagttaaaa aagaaaagga aaaagtaaag    240

cctctgtttc tttttccatt cgcagctcta ttccctcttc cccttttttt gcagctagag    300

atgaaaaatg atagaaattt tgcatagcca agaccctatc tttttatttt cgttttttct    360

ttctttcttt ctttctttct tttttctctg gctcagccaa caaaacatgg gtgtatatng    420

ggtggggata caattgaatt gattgaactt gaccagttct tagtcagaaa tgacgatctg    480

taatggagag tggatttcca ccattgcgta ttaaaatgat tattctgaat tgatttctta    540

acccaaaaaa a                                               551

<210>2

<211>136

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cttttccctc ttccgctttt ttgcagctag agatgaaaaa tgatagaaat tttgcatagc     60

caagacccta tctgtttatt ttcgtttttt ctttctttct tttttctctg gctcagccaa    120

caaaacaagg gcgtat                                           136

<210>3

<211>148

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cttttccctc ttccgctttt ttgcagctag agatgaaaaa tgatagaaat tttgcatagc     60

caagacccta tctgtttatt ttcgtttttt ctttctttct ttctttcttt cttttttctc    120

tggctcagcc aacaaaacaa gggcgtat                                 148

<210>4

<211>468

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tttatgcaaa tcctctgcca ggatgtattt gtgaaacaag atagtagtag agacttccct     60

gaaggttgtc tgtcttttga tggaatggcc gagctgtaat caaaaggcga tgtggctatg    120

ccgtgatatt tttttaaccc ttctgtcttg aggagatagc aatgtgctgg gctatccggt    180

aaggtgctat taattgcctg gctgttggga taagattaca aatggccaag gtgggggcaa    240

gaatctgaga ttcctagcta cattattaaa attaaggatc aagcacggac aggcctgagt    300

ataccactgt caatacaata gaaattaaac accttacatt tttaagcaaa cctcatctct    360

aacctcactt ttgaatgatt tctttctttc tttcttgatt aaattttatt cattacttgt    420

accaatagca aggggtggga ctgaataagt tgtattctta ttgtacaa               468

<210>5

<211>170

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gtatcaagca cggacaggcc tgagtatacc actgtcaata caatagaaat taaacacctt     60

acatttttaa gcaaacctca tctctaacct cacttttgaa tgatttcttt cttgattaaa    120

ttttattcat tacttgtacc aatagcaagg ggtgggtctg aataagttgt             170

<210>6

<211>178

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

ggatcaagca cggacaggcc tgagtatacc actgtcaata caatagaaat taaacacctt     60

acatttttaa gcaaacctca tctctaacct cacttttgaa tgatttcttt ctttctttct    120

tgattaaatt ttattcatta cttgtaccaa tagcaagggg tgggactgaa taagttgt      178

<210>7

<211>494

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

acgagcacaa agttcgcgtc ggttggagta acgggttggt taagccgcgt aacaatgaac     60

aaacactgaa acaccgatta ctattactta caagcgtttt tgtctttctt tctttctttc    120

tccatttcct catcgatcag atctgaatca atctcacatt cttcaattta atttctctcg    180

taattcactt atcgtgattt ccgaatctgg ccgccaaacc ctattacctt tgtatagatc    240

atctcaactt tgctgctcag gagaaataac aaacgaaatt agcggaggaa tatctccgcc    300

attgacgaca attgacaacc gatgtaggtt atcactttgg gtaaagaaga taaaggtgag    360

ggaagagatg gtaagcagag gctcgtacag ctctagcagc ctcttgactg gtagatttca    420

tgctagaaag ctatctccta gcattatcac tntctacacc atgttcatat ttgctntctc    480

catcttcatg ttct                                             494

<210>8

<211>156

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gcggaacaat gaacaaacac tgaaacaccg attaccatta cttacaagcg tttttgtctt     60

tctttctttc tccatttcct catcgatcag atctgaatca atctcacatt cttcaattta    120

atttcactcg taattcactt atcgtgattg ccgaat                          156

<210>9

<211>160

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

gcggaacaat gaacaaacac tgaaacaccg attaccatta cttacaagcg tttttgtctt     60

tctttctttc tttctccatt tcctcatcga tcagatctga atcaatctca cattcttcaa    120

tttaatttca ctcgtaattc acttatcgtg attgccgaat                      160

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

tgtcgtccac attcctcata                                             20

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

aacaacaagc cgcatcac                                               18

Claims (8)

1、一种获得EST-SSR标记的方法，包括如下步骤：

1)获得基因组内含有简单序列重复的EST序列；

2)在步骤1)得到的含有简单序列重复的EST序列中，将含有相同简单序列重复单元的EST序列归为一类；

3)将步骤2)得到的同类的EST序列进行序列拼接，得到简单序列重复单元数目变异的重叠群、简单序列重复单元数目无变异的重叠群和没有形成重叠群的EST序列；

4)根据步骤3)中简单序列重复单元数目变异的重叠群内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，再进行引物多态性检测，得到多态性引物，即为EST-SSR标记。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，在步骤3)后，包括如下步骤：根据步骤3)中简单序列重复单元数目无变异的重叠群内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，进行引物多态性检测，得到多态性引物。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，在步骤3)后，包括如下步骤：根据步骤3)中没有形成重叠群的EST序列内简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，进行引物多态性检测，得到多态性引物。

4、根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述基因组为植物基因组、动物基因组或微生物的基因组。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述植物为大豆。

6、一种EST-SSR标记，其中的一条序列如序列表中序列10所示，另一条序列如序列表中序列11所示。

7、权利要求6中所述EST-SSR标记在构建SSR多态性图谱中的应用。

8、一种大豆SSR多态性图谱，是按照包括如下步骤的方法得到的：

1)提取大豆的基因组DNA；

2)以基因组DNA为模板，利用权利要求6中所述的EST-SSR标记进行PCR扩增；

3)将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到大豆SSR多态性图谱。

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