CN108330207B - 一种山楂est-ssr标记引物的制备方法及应用 - Google Patents
一种山楂est-ssr标记引物的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种山楂EST‑SSR标记引物的制备方法，包括以下步骤：1)从山楂转录组数据中筛选组装长度大于5000bp的片段序列；2)使用SSRHunter软件对每条片段进行SSR发掘，单一序列中挑出占富含二、三、四或五核苷酸重复且长度≥10bp的EST序列；3)使用primer3软件对SSR上游和下游各150bp的碱基序列进行EST‑SSR引物的筛选，即得山楂EST‑SSR标记引物。本发明提出山楂EST‑SSR标记引物的制备方法及应用，为今后山楂的相关研究提供参考，促进和提高山楂的基础研究水平。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记制备与应用技术领域，具体是一种山楂EST-SSR标记引物的制备方法及应用。
背景技术
山楂是蔷薇科(Rosa-ceae)山楂属(Crataegus L.)植物，原产于中国的山楂属植物有18个种，6个变种，经过长期培育和选择，形成了丰富的变异类型。对山楂资源进行准确的鉴定和分类，是进一步有效利用山楂资源的基础。目前山楂资源遗传基础研究比较落后，至今仍然是以形态分析方法进行资源评价鉴定为主，且在山楂上开展分子生物学研究的报道也较少，山楂基因组背景研究较少，通常只能利用近缘物种的相关信息进行参考，利用山楂转录组序列开发EST-SSR引物的研究也未见报道。
SSR又称简单重复序列，(Simple Sequence Repeat，SSR)，也可称为微卫星DNA，它以1-6个碱基序列为基本单位进行多次重复组成的DNA序列，因为每个SSR序列的基本单元重复次数在不同的基因型间有很大差异，进而形成了SSR的多态性。SSR具有很多优点：(1)分布在整个基因组中，具有随机性、均匀性以及广泛性；(2)SSR序列两端较为保守，同种而不同类型间基本相同；(3)为共显性标记；(4)操作简便且快速，结果较为稳定。(4)而EST-SSR来源于表达的基因组区域，可直接反映物种相关基因的多样性。基于此，SSR标记已被广泛应用于果树大量的遗传研究中(高志红，章镇，韩振海.2002.SSR技术及其在果树上的应用，果树学报.19(5)：281-285)。SSR也是果树分子遗传图谱构建中重要的标记类型(KijasJMH,et al.Integration of trinucleotide microsatellites into a linkage map ofcitrus.1997,94:701-706；Joobear T.et al.Development of a second generationlinkage map for almond using RAPD and SSR markers.Genome,2000,43:649-655)。本发明首次提出基于山楂转录组序列开发EST-SSR引物技术方法的建立及带有山楂基因组信息的EST-SSR引物的开发，为今后山楂的相关研究提供参考，促进和提高山楂的基础研究水平。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山楂EST-SSR标记引物的制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种山楂EST-SSR标记引物的制备方法，包括以下步骤：
1)从山楂转录组数据中筛选组装长度大于5000bp的片段序列；
2)使用SSRHunter软件对每条片段进行SSR发掘，单一序列中挑出占富含二、三、四或五核苷酸重复且长度≥10bp的EST序列；
3)使用primer3软件对SSR上游和下游各150bp的碱基序列进行EST-SSR引物的筛选，即得山楂EST-SSR标记引物。
作为本发明进一步的方案：步骤3)的引物长度为18-23bp，退火温度为55-63℃，GC含量为40-60％，PCR扩增产物的长度为150-300bp。
作为本发明进一步的方案：步骤3)的最适引物长度为20bp，退火温度为58℃，GC含量为50％，PCR扩增产物长度为200bp。
一种山楂EST-SSR标记引物的应用，所述的山楂EST-SSR标记引物用于进行山楂杂交群体进行分子标记分析。
一种山楂EST-SSR标记引物的应用，用设计完成的SSR引物对田间采回的山楂种间杂交F1群体及双亲进行SSR引物的筛选和扩增；计算每对SSR引物在山楂种间杂交群体中扩增的多态性信息。
一种山楂EST-SSR标记引物的应用，将在种间杂交F1群体以及双亲中扩增的EST-SSR数据进行整理，以双假侧交理论为依据进行山楂分子遗传图谱的构建。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提出山楂EST-SSR标记引物的制备方法及应用，为今后山楂的相关研究提供参考，促进和提高山楂的基础研究水平。
附图说明
图1为山楂EST-SSR标记引物“H32”在群体中的扩增效果图(作图群体单株1-24)。
图2为山楂EST-SSR标记引物“H32”在群体中的扩增效果图(作图群体单株25-48)。
图3为山楂EST-SSR标记引物“H32”在群体中的扩增效果图(作图群体单株49-72)。
图4为山楂EST-SSR标记引物“H32”在群体中的扩增效果图(作图群体单株73-96)。
图5为山楂EST-SSR标记引物构建的母本‘大绵球’遗传图谱。
图6为山楂EST-SSR标记引物构建的父本‘秋金星’的遗传图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-6，一种山楂EST-SSR标记引物的制备方法，包括以下步骤：
1)从山楂转录组数据中筛选组装长度大于5000bp的片段序列，用于后续山楂EST-SSR标记的开发；
2)使用SSRHunter软件对每条片段进行SSR发掘，单一序列中挑出占富含二、三、四或五核苷酸重复且长度≥10bp的EST序列；
3)使用primer3软件对SSR上游和下游各150bp的碱基序列进行EST-SSR引物的筛选，即得山楂EST-SSR标记引物。引物长度为18-23bp，退火温度为55-63℃，GC含量为40-60％，PCR扩增产物的长度为150-300bp。优选的，最适引物长度为20bp，退火温度为58℃，GC含量为50％，PCR扩增产物长度为200bp。
4)一种山楂EST-SSR标记引物的应用，所述的山楂EST-SSR标记引物用于进行山楂杂交群体进行分子标记分析。用设计完成的SSR引物山楂杂交F1群体及双亲进行SSR引物的筛选和扩增；计算每对SSR引物在山楂种间杂交群体中扩增的多态性信息。
5)一种山楂EST-SSR标记引物的应用，所述的山楂EST-SSR标记引物用于山楂分子遗传图谱的构建。将在种间杂交F1群体以及双亲中扩增的EST-SSR数据进行整理，以双假侧交理论为依据进行山楂分子遗传图谱的构建。
实施例1
1、供试材料：以山楂品种‘大绵球’为母本，‘秋金星’为父本创建杂交群体，选用92株杂交F1代为作图群体，采用SSR分子标记技术构建山楂分子遗传图谱；
2、选取山楂品种及杂交后代植株上嫩绿的叶片提取总DNA，基因组DNA提取依照马明等(2007)提出的改良CTAB法；
3、利用本发明的山楂EST-SSR标记引物进行分析，具体步骤如下：
3.1、EST-SSR筛选及扩增；
3.1.1、PCR反应体系：本试验的SSR-PCR反应体系为16μL，各组分如下：10×Buffer(含Mg2+)1.6μL，dNTP0.8μL(浓度2.5mM/μL)，引物2*0.8μL(浓度5nmol/μL)，Taq聚合酶1μL(1U/μL)，模板DNA 1μL(20ng/μL)，ddH2O 10μL；
3.1.2、PCR反应程序：SSR-PCR扩增在BIO-RAD T100TM Thermal Cycler上运行，程序如下：1阶段：94℃下预变性5min；2阶段：94℃下变性1min，X℃退火1min(X为退火温度，根据不同引物而不同，一般在50-63℃之间)，72℃延伸1min，重复25次；3阶段：72℃延伸7min，4℃下保存；
3.1.3、显色：①配制5％聚丙烯酰胺凝胶，倒入玻璃槽中，待其冷却凝固之后放到电泳仪上(北京市六一仪器厂生产的DYCZ-24A型电泳仪)；②预电泳，使电流提前在聚丙烯酰胺凝胶中流通，冲刷掉一些杂质，以防PCR产物在电泳时受到阻碍，使得带型不整齐；③点样，每个点样孔点6-7μL的PCR产物，点样速度要快，不然前边点的样品可能会扩散；④电泳，进行电泳的恒定电压为240V，时间为2h左右，具体时间根据PCR产物的大小来定；⑤显色，首先将电泳完成的聚丙烯酰胺凝胶放到1g/L的AgNO3溶液中染色10min，然后用蒸馏水清洗，之后将凝胶放到含0.5mol/L NaOH和4％甲醛的混合溶液中显色直到出现清晰的条带为止，最后用蒸馏水清洗；
3.1.4、EST-SSR标记筛选：根据已有山楂转录组数据设计了86对SSR引物，在北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成；SSR引物筛选是以双亲提供模板DNA，根据上文提到的SSR-PCR反应体系分别加入相应的物质，分别对双亲模板DNA进行扩增，退火温度设置为54℃；根据电泳结果分析符合SSR标记的条带(只有符合hk*hk、ab*cd、ab*cc、aa*bc、nn*np、lm*ll以及ef*eg此7种带型的引物才能用于山楂分子遗传图谱构建)，进而确定引物是否符合要求；已经确定的SSR引物有可能会因为退火温度不够而出现杂带，此时应该对这些SSR引物进行温度梯度筛选；每对引物设置8个温度梯度分别从63℃到50℃，依次为63.0℃、62.0℃、60.4℃、57.9℃、55.0℃、52.5℃、50.9℃以及50.0℃。经PCR扩增后，根据电泳结果找出与退火温度相对应的清晰、稳定且没有杂带的条带，以此确定退火温度；
3.2、SSR标记的统计：SSR分子标记在遗传图谱中是用引物名称来表示的；杂交群体在SSR分子标记上的条带带型只有符合hk*hk、ab*cd、ab*cc、aa*bc、nn*np、lm*ll以及ef*eg7种带型的才能用于遗传图谱的构建，hk*hk类型群体有hk、hh和kk 3种带型，ab*cd类型群体有ac、ad、bc和bd 4种类型，ab*cc类型群体有ac和bc 2种带型，aa*bc类型群体有ab和ac 2种带型，nn*np类型群体有nn和np 2种带型，lm*ll类型群体有lm和ll 2种带型，ef*eg类型群体有ee、ef、eg和fg 4种带型；
3.3、遗传图谱的构建：应用JoinMap3.0软件，设置LOD为4.0，最大重组值为0.4，分别将母本分离位点+双亲共有分离位点和父本分离位点+双亲共有分离位点进行运算，通过Kosambi函数将重组率转换为图距(cM)，并应用Mapchart2.2软件分别绘制出双亲的分子遗传图谱；
在构建的遗传图谱中，母本‘大绵球’的遗传图谱包括21个连锁群，有153个标记位点，覆盖总图距1085.4cM，位点之间平均遗传距离为7.05cM；连锁群的平均长度为51.69cM，每个连锁群平均包含7.33个位点。在21个连锁群中，位点数最多的连锁群(DMQ1)含76个位点，位点数最少的连锁群含有2个位点。最长的连锁群DMQ 3覆盖图距为138.987cM，最短的连锁群DMQ 17覆盖图距为7.285cM；父本‘秋金星’的遗传图谱包括22个连锁群，有170个标记位点，覆盖总图距1097.7cM，位点间平均遗传距离为6.45cM，连锁群平均长度49.89cM，每个连锁群平均包含7.73个位点。在22个连锁群中，位点数最多的连锁群(QJX1)含82个位点，位点数最少的连锁群分布含有2个位点。最长的连锁群QJX 1覆盖图距为135.156cM，最短的连锁群QJX 20覆盖图距为1.673cM。共包含EST-SSR标记4个，分别位于连锁群5、19、20和21。
表1山楂EST-SSR标记引物的序列
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 一种山楂EST-SSR标记引物的制备方法及应用
<160> 172
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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tggatttaca gctgttcgtc tc 22
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 53
cgcaaggagg aagaagatga a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 54
tgaatacatc tttggacgcc c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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acgccgaatt tagggtttag c 21
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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caaagagaga tgaaccgcga c 21
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agaagaaaac atcgaccaga cg 22
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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gccgttgatt gccctagaag 20
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<212> DNA
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ccctcgctct ctgtacatct c 21
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<212> DNA
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agagacaagt gacagagagg c 21
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atgtggttcg aattggccaa a 21
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gtggcgagat atctgcagtt c 21
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gtcacctgtg gcgagatatc t 21
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ccaactacca actccctcca t 21
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<213> 未知(Unknown)
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tgaacaagtc tccctcgtct t 21
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acatccaact accaactccc t 21
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atggcctgtg aaattgtagc g 21
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gcaaagctct acacaaatgg c 21
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ccttcctgtc ctctccaatc a 21
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aggaaagaga gagagagggg t 21
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tacacacaca cacacacaca c 21
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caaccgatac acacacacac a 21
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ccagattcaa ccgatacaca ca 22
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<212> DNA
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cacagcccta cagaccaaaa g 21
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cacagcccta cagaccaaaa g 21
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caaacaagcc tgaaagaagc g 21
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accgcaaaag aagcatcaag t 21
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cacaaaccgc aaaagaagca t 21
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cgcaaaagaa gcatcaagtt cc 22
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cctctctctc cttccacact c 21
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atccctctct ctccttccac a 21
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cgtacgattg cagaaaggga g 21
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acgtcgctgc tatcatcttt c 21
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aaccaccgcc ttctctttct a 21
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accatcaatt gtttcgctgc t 21
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cgcagcagaa gaaccatcaa t 21
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actacaaaag ccaaaccacc g 21
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gtggaagttg gagagcaact g 21
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ccacaggaaa agtcacaacc t 21
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actcctcgaa tcacctccat c 21
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tgagaaggca atggaatctg c 21
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tcttcccatt caaacagcac c 21
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caatgtccgt ctctctctcc a 21
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tgtctctctt tgtgcatgca g 21
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tctctttgtg catgcaggaa g 21
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ggtgaatcct ctcttgccct a 21
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agcgtgtggt tatggatctg a 21
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<212> DNA
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catttccttc tcgccatggt c 21
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gatcaagtat cccaaacccc g 21
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ctgctgtctc cttctttgct c 21
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ctcaacccaa gagttgctga c 21
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gttccctcaa cccaagagtt g 21
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cttaggtgca aactagccga c 21
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ggtgcaaact agccgacttg 20
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cgtcattgtc cctgtcagaa c 21
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ggcaaagaac catccatgtc a 21
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caggaagttg gatcgaagca g 21
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atccaaacga aaagcaacgg a 21
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cgtcgtgatc agtgagagag a 21
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ctggcaatga gaacggtttg a 21
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tctctcccaa tttctctggc a 21
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agagtagctc cactccccat a 21
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cggaagtgga agtggaagaa g 21
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catatactct gcccgctctc t 21
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tcattctctc tcttgcccct c 21
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cccgccggta gagaagtaaa 20
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agagagagag acgaacagct g 21
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tcatcttctt cctccttgcg t 21
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ttgagccgca tttacattgc t 21
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ccatataaaa ccttgagccg ca 22
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aaaccttgag ccgcatttac a 21
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ggggtaaaca gatccatgtg g 21
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ctgttcaaag atcggtaggc g 21
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gatgaacgag acgaactgtg g 21
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gctgttggga ttttgagcag a 21
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<212> DNA
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acaaggatgg gtgggataat ga 22
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<212> DNA
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cgaacaagga tgggtgggat a 21
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agatgtcagc ggaaggagaa g 21
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cgctgctgaa caagatctac c 21
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<212> DNA
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tagatttgcg ctgctgaaca a 21
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<212> DNA
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atttccctag atttgcgctg c 21
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<212> DNA
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gaagcccgat tcagaagcta c 21
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<212> DNA
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gcccgattca gaagctacaa a 21
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<211> 22
<212> DNA
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tctcactcct ccaacaatca tg 22
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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ggagagtaac gagaggaggt g 21
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 154
aacgagagga ggtgtcagat c 21
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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ggcagatctg ggtagggaaa t 21
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<212> DNA
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cagaagcagc atcagaaacc a 21
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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caccagaagc agcatcagaa a 21
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<212> DNA
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tggcgttagt ctccgagaat t 21
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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agatttacaa ccggtcactg c 21
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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gtcactgcca agaacactga t 21
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tcggtctctt cgatcttcct c 21
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<212> DNA
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<400> 162
tctcgaactg taactggacg t 21
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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gaactgtaac tggacgtagc g 21
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 164
tcctcctctc ccaccatcta a 21
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<211> 20
<212> DNA
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gttggtattg gacggctgtg 20
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<212> DNA
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ttcaatagga tgttgctggc g 21
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<212> DNA
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<400> 167
catatgtgaa cttgggcagg t 21
<210> 168
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 168
atgtgaactt gggcaggtaa g 21
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 169
caggtaagca gagtctcgct 20
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 170
gcaaacttgg ccttgaagag a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 171
tggccttgaa gagaagaacc t 21
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 172
agcatgtcaa agatgggaag c 21
Claims (3)
1.一种山楂EST-SSR标记引物，其特征在于，山楂EST-SSR标记引物的序列包括：
SSR名称 上游引物（5’-3’） 下游引物（5’-3’）
H1 TCTCCACTGCTCAATCGTCTT CGTACGATTGCAGAAAGGGAG
H2 GACCATCTCCACTGCTCAATC GAAGGGCCTCAGAATTAGGGT
H3 TGCCACCAATTTCTCCTTCAA ACGTCGCTGCTATCATCTTTC
H4 GCGAGAGATTGGCTGGAATTT AACCACCGCCTTCTCTTTCTA
H5 GAGATTGGCTGGAATTTGGGG ACCATCAATTGTTTCGCTGCT
H6 GCGAGAGAGTTGTTTGGAGAG CGCAGCAGAAGAACCATCAAT
H7 CAGTGAGAGGATTTCAGAGCG ACTACAAAAGCCAAACCACCG
H8 CCAACCTCTCCTCCTTCTGTT GTGGAAGTTGGAGAGCAACTG
H9 CGACCGGTGAATCGAACTTC TGTGCAAAAGTGGAAGTTGGA
H10 AGTCAAAGCTGCGAACTTGAA CCACAGGAAAAGTCACAACCT
H11 GTTTGTGATGCTTGTGGGGAT ACTCCTCGAATCACCTCCATC
H12 AGGTTTGTGCCATGTGAAACA TTTTCGAGGAGGCAAAAGGTG
H13 ACGAAGACATTGATCACGACG GGAGGCAAAAGGTGTGCATAT
H14 AATGGCCTGAAATCTGCACAA AGTGGCGATGGTGAAGAAGTA
H15 GTTTCTTCTACTCACTGCCGC AGCAAGAGGATCATCAGCAGA
H16 GGCCTGAAATCTGCACAACTA GATTGAGAGGTGGCATTGTGG
H17 CCGCCAACATTTCCTCTATCC AGGCAGTGACAGAAACAGAGA
H18 GCGAGAGATTGGCTGGAATTT ACATCATCGACGAGCTTCTCT
H19 GAGATTGGCTGGAATTTGGGG TGCTGGCCCAAGGACTAATAA
H20 CAGTGAGAGGATTTCAGAGCG TGAGAAGGCAATGGAATCTGC
H21 AGTGAGAGATTTCGGGTGGTT TTTCCGGCAATGTAAGATCGG
H22 GAACTACTAGTCCCACCCACC TCTTCCCATTCAAACAGCACC
H23 TACTTGCAGCCATCATCCGTA CCCATTCAAACAGCACCCATT
H24 GAAGTGGGAAGGAATGATGGC CAATGTCCGTCTCTCTCTCCA
H25 GCGAGGGATGGGATTTTGTAG CTCTCGATTCGACCGTCAATG
H26 GGAAGGAATGATGGCACCAAG TGTCTCTCTTTGTGCATGCAG
H27 ATAAGGGAGGGGATCAAGTGG TCTCTTTGTGCATGCAGGAAG
H28 TGAAGATCAGCATCACGGGTA GGTGAATCCTCTCTTGCCCTA
H29 CCCAAAAGCAAGCAAAGCATC AGCGTGTGGTTATGGATCTGA
H30 TTTAAGGTTGGTGGTGGGAGT CATTTCCTTCTCGCCATGGTC
H31 AGCACTTTGGCTTCTGAGTTG GATCAAGTATCCCAAACCCCG
H32 GGGATGAGGATGAAGGTAGCA CTGCTGTCTCCTTCTTTGCTC
H33 TCGCATTTACTCGAGTCTTGC CTCAACCCAAGAGTTGCTGAC
H34 GCTCAGGACATCGGAAACAAT GTTCCCTCAACCCAAGAGTTG
H35 CTCCCTGAACAGAACTCGGTA CTTAGGTGCAAACTAGCCGAC
H36 GCAGTGTGTTCGTGCTAATCA GGTGCAAACTAGCCGACTTG
H37 ACAGCACTCTCCCATTCTCTC CGTCATTGTCCCTGTCAGAAC
H38 GGTGTAAATGGGTGACTGCAG GGCAAAGAACCATCCATGTCA
H39 CACCTTTCATTCCGTCGATCC CAGGAAGTTGGATCGAAGCAG
H40 TTGTCCACCTTTCATTCCGTC ATCCAAACGAAAAGCAACGGA
H41 CGGAAGTGGAAGTGGAAGAAG CGTCGTGATCAGTGAGAGAGA
H42 TTGCTACAGGGGAAGATAGCC CTGGCAATGAGAACGGTTTGA
H43 TTCCATTGCTACAGGGGAAGA TCTCTCCCAATTTCTCTGGCA
H44 TGTGGGGAATATGGCAGAGAA AGAGTAGCTCCACTCCCCATA
H45 ATCAATGGAAGGGGAAGAGGG CGGAAGTGGAAGTGGAAGAAG
H46 CTGAGGGCATGTGGGGAATAT CATATACTCTGCCCGCTCTCT
H47 AGGAAGAGAACAGTGGGAGTG TCATTCTCTCTCTTGCCCCTC
H48 CCAAATTGAAGGCAGGGATGT CCCGCCGGTAGAGAAGTAAA
H49 ATCTCCTTCAAGCTCTGCACA AGAGAGAGAGACGAACAGCTG
H50 CTCTCCCGCTCATTCTCTCTC TCATCTTCTTCCTCCTTGCGT
H51 CAGCTGTTCGTCTCTCTCTCT TTGAGCCGCATTTACATTGCT
H52 TGGATTTACAGCTGTTCGTCTC CCATATAAAACCTTGAGCCGCA
H53 CGCAAGGAGGAAGAAGATGAA AAACCTTGAGCCGCATTTACA
H54 TGAATACATCTTTGGACGCCC GGGGTAAACAGATCCATGTGG
H55 ACGCCGAATTTAGGGTTTAGC CTGTTCAAAGATCGGTAGGCG
H56 CAAAGAGAGATGAACCGCGAC GATGAACGAGACGAACTGTGG
H57 AGAAGAAAACATCGACCAGACG GCTGTTGGGATTTTGAGCAGA
H58 GCCGTTGATTGCCCTAGAAG ACAAGGATGGGTGGGATAATGA
H59 CCCTCGCTCTCTGTACATCTC CGAACAAGGATGGGTGGGATA
H60 AGAGACAAGTGACAGAGAGGC AGATGTCAGCGGAAGGAGAAG
H61 ATGTGGTTCGAATTGGCCAAA CGCTGCTGAACAAGATCTACC
H62 GTGGCGAGATATCTGCAGTTC TAGATTTGCGCTGCTGAACAA
H63 GTCACCTGTGGCGAGATATCT ATTTCCCTAGATTTGCGCTGC
H64 CCAACTACCAACTCCCTCCAT GAAGCCCGATTCAGAAGCTAC
H65 TGAACAAGTCTCCCTCGTCTT GCCCGATTCAGAAGCTACAAA
H66 ACATCCAACTACCAACTCCCT TCTCACTCCTCCAACAATCATG
H67 ATGGCCTGTGAAATTGTAGCG GGAGAGTAACGAGAGGAGGTG
H68 GCAAAGCTCTACACAAATGGC AACGAGAGGAGGTGTCAGATC
H69 CCTTCCTGTCCTCTCCAATCA GGCAGATCTGGGTAGGGAAAT
H70 AGGAAAGAGAGAGAGAGGGGT CAGAAGCAGCATCAGAAACCA
H71 CGGAGGAAAGAGAGAGAGAGG CACCAGAAGCAGCATCAGAAA
H72 TACACACACACACACACACAC TGGCGTTAGTCTCCGAGAATT
H73 CAACCGATACACACACACACA AGATTTACAACCGGTCACTGC
H74 CCAGATTCAACCGATACACACA GTCACTGCCAAGAACACTGAT
H75 CACAGCCCTACAGACCAAAAG TCGGTCTCTTCGATCTTCCTC
H76 CACAGCCCTACAGACCAAAAG TCTCGAACTGTAACTGGACGT
H77 CAAACAAGCCTGAAAGAAGCG GAACTGTAACTGGACGTAGCG
H78 CAGAGGGATGAGAGAGACAGC TCCTCCTCTCCCACCATCTAA
H79 ATCCTGCCCAAACCTTCAAAC GTTGGTATTGGACGGCTGTG
H80 GGCTGTAAAACAAAGAAAACCCC TTCAATAGGATGTTGCTGGCG
H81 ACCGCAAAAGAAGCATCAAGT CATATGTGAACTTGGGCAGGT
H82 CACAAACCGCAAAAGAAGCAT ATGTGAACTTGGGCAGGTAAG
H83 CGCAAAAGAAGCATCAAGTTCC CAGGTAAGCAGAGTCTCGCT
H84 CCTCTCTCTCCTTCCACACTC GCAAACTTGGCCTTGAAGAGA
H85 ATCCCTCTCTCTCCTTCCACA TGGCCTTGAAGAGAAGAACCT
H86 TCTCCTTCCACACTCACTCTC AGCATGTCAAAGATGGGAAGC。
2.一种根据权利要求1所述的山楂EST-SSR标记引物的应用，其特征在于，用设计完成的SSR引物对田间采回的山楂种间杂交F1群体及双亲进行SSR引物的筛选和扩增；计算每对SSR引物在山楂种间杂交群体中扩增的多态性信息。
3.一种根据权利要求1所述的山楂EST-SSR标记引物的应用，其特征在于，将在种间杂交F1群体以及双亲中扩增的EST-SSR数据进行整理，以双假侧交理论为依据进行山楂分子遗传图谱的构建。
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