CN116083626B - 一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用 - Google Patents
一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116083626B CN116083626B CN202211606714.8A CN202211606714A CN116083626B CN 116083626 B CN116083626 B CN 116083626B CN 202211606714 A CN202211606714 A CN 202211606714A CN 116083626 B CN116083626 B CN 116083626B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- wheat
- species
- molecular marker
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 62
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 241000894007 species Species 0.000 title claims abstract description 32
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 abstract description 74
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 11
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 5
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 17
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 241001668545 Pascopyrum Species 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 241000511731 Leymus Species 0.000 description 6
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 4
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 4
- 241000209125 Thinopyrum elongatum Species 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- 238000009394 selective breeding Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- 241000612166 Lysimachia Species 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 241000209137 Agropyron cristatum Species 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241001220539 Leymus multicaulis Species 0.000 description 2
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 2
- 241001522979 Psathyrostachys huashanica Species 0.000 description 2
- 108091035242 Sequence-tagged site Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 240000003690 Callicarpa japonica Species 0.000 description 1
- 235000017595 Callicarpa japonica Nutrition 0.000 description 1
- 241000037488 Coccoloba pubescens Species 0.000 description 1
- 241000122204 Dasypyrum villosum Species 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001522109 Elymus libanoticus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 244000286380 Leymus racemosus Species 0.000 description 1
- 235000017111 Leymus racemosus Nutrition 0.000 description 1
- 241001646834 Mesona Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 241000209046 Pennisetum Species 0.000 description 1
- 241000209122 Psathyrostachys Species 0.000 description 1
- 241000209123 Psathyrostachys juncea Species 0.000 description 1
- 241000577963 Psathyrostachys kronenburgii Species 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 241001261506 Undaria pinnatifida Species 0.000 description 1
- 241000510764 Villosa Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 101150073223 hisat gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000014075 nitrogen utilization Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用，涉及分子标记辅助育种技术领域，该分子标记引物包含两个引物组，分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的引物组KP1A‑440448839，和核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示的引物组KP4D‑349184744。本发明提供的KASP分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中Ns基因组的快速检测，也可用于小麦族所有包含Ns基因组物种的染色体或染色体片段鉴定，且能准确鉴定区分Ns和其他小麦近缘物种基因组，这为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上种植面积最大、总产量仅次于玉米的粮食作物(葛江燕，2012)，为全球约40％的人口提供了能量来源(Li et al.2019)。但是近年来随着耕作制度的变化及育种中少数亲本的反复使用，导致小麦的遗传多样性降低，对生物胁迫和非生物胁迫抗性降低，制约了小麦产量和品质的提高，难以育成突破性品种(Jianget al.1993；何中虎等，2011)。小麦近缘物种中蕴藏着丰富的优良基因，通过远缘杂交的方式将其优良基因导入到普通小麦，可以丰富小麦的遗传多样性(刘成等，2020)。
小麦族物种包含多种重要种属，涉及多种基因组组成。新麦草属是小麦族中非常重要的Ns基因组供体属，赖草属则为异源多倍体的大属，含有来自新麦草属物种的Ns基因组(颜济，杨俊良，2011)。我国现有4种新麦草属物种，包括华山新麦草(Psathyrostachyshuashanica)、毛穗新麦草(Psathyrostachys lanuginose)、单花新麦草(Psathyrostachyskronenburgii)和新麦草(Psathyrostachysjuncea)，现有研究主要集中于华山新麦草和新麦草(盛誉，2020)。华山新麦草因其具有抗病(条锈病、秆锈病、白粉病、全蚀病)、抗逆(耐寒、耐旱、耐盐碱)、早熟、矮秆、多分蘖等优良特性已被广泛应用于小麦遗传改良(Baden1991，黄娟等，2019)。新麦草分蘖多、叶量大、抗性好、早春且反青和再生性能好，其资源利用研究主要集中与牧草和小麦改良(范亚坤等，2020；陈勤等，1988)。赖草属包含60多种，广泛分布与全球各地。该属植物多数物种为草原和草甸的主要组成成分；许多种类因具有较高的饲用价值已作为优良牧草利用(张立，2015)。同时，因赖草属植物常生长在盐碱地和干旱地区，对寒冷、干旱、盐碱土等环境具有高度适应性，部分物种还具有抗病虫、穗大、粒多、高光效、高氮素利用率等优良特性(葛荣朝等，2001；Subbarao et al.2021)。目前，大赖草(Leymus racemosus)、多枝赖草(Leymus multicaulis)和滨麦PI567896(Leymus mollis)已经和小麦成功杂交并获得了部分农艺性状优异的附加系、代换系和渗入系等异染色体系(Liu et al.2002；Zhao et al.2013；Subbarao et al.2021；Yang etal.2020；Li etal.2021；Jin et al.2021)。
在种质资源利用过程中，分子标记已被广泛用于外源染色体或染色体片段的检测与跟踪，加速种质创新(Fedak et al.1999)。目前，Ns基因组物种特异分子标记主要有华山新麦草RAPD(RandomAmplifiedPolymorphic DNA)标记、SCAR(SequenceCharacterizedAmplified Regions)标记和普通PCR(Polymerase Chain Reaction)标记；新麦草特异RAPD标记；大赖草特异RAPD标记、SNP(Single nucleotide polymorphism)标记和普通PCR标记以及滨麦EST-SSR(Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeat)标记、STS(Sequence-tagged site)标记、普通PCR标记和SNP标记(陈林刚等，2010；Du etal.2013；Tan et al.2022；Edet et al.2018a；2018b)。目前，转录组测序技术已广泛应用于SNP挖掘并开发KASP标记引物(Wang et al.2017；Zhou et al.2017；Okada etal.2018)，而利用转录组测序技术获得SNP变异并开发小麦族物种中Ns基因组特异KASP标记引物还未见报道，这严重阻碍小麦族物种中Ns基因组物种优异基因资源的开发与利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用，该分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中Ns基因组的快速检测，也可用于小麦族所有包含Ns基因组物种的染色体或染色体片段的鉴定，且能准确鉴定区分Ns和其他小麦近缘物种基因组，为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了重要途径。
为了达到上述目的，本发明提供了一种华山新麦草Ns染色体特异KASP分子标记引物，该分子标记引物包含两个引物组，分别为引物组KP1A-440448839和引物组KP4D-349184744，这两个引物组分别包含F-FAM、F-HEX、R三条引物，其中，引物组KP1A-440448839包含的引物，其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；引物组KP4D-349184744包含的引物，其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种华山新麦草Ns染色体的基因分型方法，该方法通过采用上述的两个引物组对待测株系的基因组DNA进行PCR扩增。
优选地，上述基因分型方法中的PCR扩增条件如下：
PCR反应体系为10μL：200ng/μL的DNA模板1μL，10μM的混合引物1.4μL，2×KaspMasterMix 5μL，ddH2O 2.6μL。
PCR反应程序为：95℃10min；95℃20s，61℃45s，10个循环，每个循环降低0.6℃；95℃20s，55℃45s，32个循环；25℃1min；95℃20s,55℃40s，3个循环；30℃30s。
其中，上述混合引物的体系为100μL：包含F-FAM和F-HEX引物各12μL，R引物30μL，H2O 46μL。
本发明还提供了一种用于鉴定华山新麦草Ns染色体的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物组KP1A-440448839和引物组KP4D-349184744。
本发明提供的KASP分子标记引物可被用于以下任意一种：
①检测华山新麦草Ns染色体；
②检测含有华山新麦草Ns染色体的产品；
③追踪华山新麦草Ns染色体；
④追踪含有华山新麦草Ns染色体的产品；
⑤分子标记辅助选择育种；
⑥制备分子标记辅助选择育种的产品；
⑦小麦分子育种；或
⑧制备小麦分子育种的产品。
本发明的小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物，解决了小麦族物种Ns基因组的鉴定问题，具有以下优点：
本发明利用RNA测序技术对华山新麦草进行测序，通过序列比对分析，挖掘了华山新麦草与小麦中国春间的SNP变异，基于SNP位点信息和普通小麦中国春参考基因组信息，设计引物并在普通小麦、华山新麦草和10种小麦族物种中验证，获得小麦族物种Ns基因组特异的KASP分子标记引物。本发明开发的KASP分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中Ns基因组的快速检测，也可用于小麦族所有包含Ns基因组物种的染色体或染色体片段鉴定，且能准确鉴定区分Ns和其他小麦近缘物种基因组，这为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了重要途径。
附图说明
图1为本发明中的引物组KP1A-440448839在普通小麦和小麦近缘物种中的分型结果。
图2为本发明中的引物组KP4D-349184744在普通小麦和小麦近缘物种中的分型结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中用到的实验材料如下所示：
普通小麦中国春(CS，Triticum aestivum L.，AABBDD，2n＝6x＝42)、普通小麦中国春ph2b突变体(CSph2b，AABBDD，Triticum aestivum L.，2n＝6x＝42)、华山新麦草ZY3157(Psathyrostachys huashanica，NsNs，2n＝2x＝14)、新麦草PI314082(Psathyrostachysjuncea，NsNs，2n＝2x＝14)、二倍体长穗偃麦草PI531750(Thinopyrumelongatum，EeEe，2n＝2x＝14)、簇毛麦PI47027(Dasypyrum villosum，VV，2n＝2x＝14)、大麦Y1819(Hordeum，HH，2n＝2x＝14)、冰草PI499389(Agropyron cristatum，PP，2n＝2x＝14)、黑麦QL(Secale cereale，RR，2n＝2x＝14)、拟鹅观草PI228391(Pseudoroegnerialibanotica，StSt，2n＝2x＝14)、多枝赖草PI440325(Leymus multicaulis，NsNsXmXm，2n＝4x＝28)、大赖草ZY07023(Leymus racemosus，NsNsXmXm，2n＝4x＝28)、沙生赖草PI294582(Leymus arenarius，NsNsNsNsXmXmXmXm，2n＝8x＝56)。
实验例1SNP位点的获得
取适量华山新麦草ZY3157叶和根的幼嫩组织送往北京贝瑞和康生物技术有限公司测序。利用Hisat2将华山新麦草reads比对至中国春参考基因组(iwgsc_refseqv1.0)；通过Samtools和Picard-tools工具对比对结果进行排序、去重；通过Gatk进行SNP挖掘，过滤质量低于30、覆盖度小于等于4的SNP位点，最终获得790759个高质量SNP位点，并利用软件Annovar对所有的SNP进行注释，获得SNP在中国春基因组的位置信息。
实验例2KASP分子标记引物的开发
根据SNP注释信息，随机选择一部分位于外显子区域且上游30bp、下游100bp无其他SNP变异的SNP位点，提取SNP位点上游30bp下游100bp序列，利用在线引物设计平台PolyMarker(https://www.polymarker.info)对所选的SNP位点进行KASP分子标记引物设计。最终选择的分子标记引物序列为在中国春同一基因内且不跨越内含子区域的引物，共43对，所有引物均由成都擎科伟业生物技术有限公司合成。
实验例3KASP分型验证
利用实验例2中开发的KASP分子标记引物，在普通小麦亲本CS、CSph2b，华山新麦草、新麦草、大赖草、多枝赖草、沙生赖草、二倍体长穗偃麦草、冰草、簇毛麦、大麦、黑麦、拟鹅观草中进行KASP基因分型验证。根据验证结果，得到2个Ns基因组特异KASP分子标记引物，包含引物组KP1A-440448839和引物组KP4D-349184744，具体序列如下所示。引物组KP1A-440448839对应中国春1A染色体第440448839个碱基由T突变为C(华山新麦草)，引物组KP4D-349184744对应中国春4D染色体第349184744个碱基由G突变为C(华山新麦草)。其中，引物组KP1A-440448839的KASP分型结果如图1所示，引物组KP4D-349184744的KASP分型结果如图2所示。
其中，两个引物组的KASP分子标记引物序列如下(5’→3’)：
引物组KP1A-440448839包含：
F-FAM(SEQ ID NO.1)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCACCTGCTTAGCTTTGGCT
F-HEX(SEQ ID NO.2)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCACCTGCTTAGCTTTGGCC
R(SEQ ID NO.3)：
CAGGCTGTGGAAGGGCTA
引物组KP4D-349184744包含：
F-FAM(SEQ ID NO.4)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGATAACCTCCAGATGATTGCG
F-HEX(SEQ ID NO.5)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGATAACCTCCAGATGATTGCC
R(SEQ ID NO.6)：
GGCATCCCAGTAGCAACATAT。
其中，KASP基因分型时的PCR扩增具体条件包括如下：
PCR反应体系(10μL)：DNA模板(200ng/μL)1μL，混合引物1.4μL(10μM)，2×KaspMasterMix 5μL，ddH2O 2.6μL。混合引物体系(100μL)：两个引物组的F-FAM和F-HEX引物(上游引物)各12μL，R引物(下游引物)30μL，H2O 46μL。
PCR反应程序为:程序分为4个阶段，第一阶段：95℃10min；第二阶段：95℃20s,61℃45s,10个循环，每个循环降低0.6℃；第三阶段：95℃20s,55℃45s,32个循环；第四阶段：25℃1min。第五阶段：95℃20s,55℃40s，3个循环；30℃30s。基因分析由Bio-Rad CFXManger完成。
根据检测，两个分子标记引物组在二倍体长穗偃麦草、冰草、簇毛麦、大麦、黑麦、拟鹅观草中扩增信号表现为橙色(Allele 1)荧光信号，在华山新麦草、新麦草中表现为蓝色(Allele 2)荧光信号，在大赖草、多枝赖草中表现为绿色(Heterozygote)荧光信号，表明该KASP分子标记引物是Ns基因组特异的。本发明提供的KASP分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中Ns基因组的快速检测，也可用于小麦族所有包含Ns基因组物种的染色体或染色体片段鉴定，且能准确鉴定区分Ns和其他小麦近缘物种基因组，具体包括以下任意一种或几种：①检测华山新麦草Ns染色体；②检测含有华山新麦草Ns染色体的产品；③追踪华山新麦草Ns染色体；④追踪含有华山新麦草Ns染色体的产品；⑤分子标记辅助选择育种；⑥制备分子标记辅助选择育种的产品；⑦小麦分子育种；⑧制备小麦分子育种的产品。这为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了基础。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (5)
1.一种小麦族物种Ns染色体特异KASP分子标记引物，其特征在于，该分子标记引物包含两个引物组，分别为引物组KP1A-440448839和引物组KP4D-349184744，所述的两个引物组分别包含F-FAM、F-HEX、R三条引物，所述引物组KP1A-440448839包含的引物，其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述引物组KP4D-349184744包含的引物，其核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
2.一种小麦族物种Ns染色体的KASP鉴定方法，其特征在于，该方法采用如权利要求1所述的KASP分子标记引物对待测株系的基因组DNA进行PCR扩增,将小麦族中含有Ns基因组的物种与不含Ns基因组的物种区分开。
3.根据权利要求2所述的KASP鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件如下：
PCR反应体系为10μL：200ng/μL的DNA模板1μL，10μM的混合引物1.4μL，2×KaspMasterMix 5μL，ddH2O 2.6μL；PCR反应程序为：95℃10min；95℃20s，61℃45s，10个循环，每个循环降低0.6℃；95℃20s，55℃45s，32个循环；25℃1min；
95℃20s,55℃40s，3个循环；30℃30s；
其中，所述混合引物的体系为100μL：包含F-FAM和F-HEX引物各12μL，R引物30μL，H2O 46μL。
4.一种用于鉴定小麦族物种Ns染色体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如权利要求1所述的KASP分子标记引物。
5.如权利要求1所述的KASP分子标记引物在以下任意一种中的应用：
①检测小麦族物种Ns染色体；
②检测含有小麦族物种Ns染色体的产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211606714.8A CN116083626B (zh) | 2022-12-13 | 2022-12-13 | 一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211606714.8A CN116083626B (zh) | 2022-12-13 | 2022-12-13 | 一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116083626A CN116083626A (zh) | 2023-05-09 |
| CN116083626B true CN116083626B (zh) | 2024-02-09 |
Family
ID=86211169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211606714.8A Active CN116083626B (zh) | 2022-12-13 | 2022-12-13 | 一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116083626B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116144824A (zh) * | 2022-12-13 | 2023-05-23 | 四川农业大学 | 一种华山新麦草2Ns染色体特异KASP分子标记引物及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103243164A (zh) * | 2013-05-06 | 2013-08-14 | 西北农林科技大学 | 一种小麦基因组中华山新麦草外源物质的鉴定方法 |
| CN104975108A (zh) * | 2015-08-04 | 2015-10-14 | 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 | 华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物及其使用方法 |
| CN108950044A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-12-07 | 西北农林科技大学 | 华山新麦草分子特异性标记引物及其应用 |
| CN114574482A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-06-03 | 西北农林科技大学 | 一种华山新麦草全基因组液相芯片及应用 |
| CN115011724A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-09-06 | 河南科技大学 | 一种华山新麦草染色体特异nd-fish探针及其应用、试剂盒 |
-
2022
- 2022-12-13 CN CN202211606714.8A patent/CN116083626B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103243164A (zh) * | 2013-05-06 | 2013-08-14 | 西北农林科技大学 | 一种小麦基因组中华山新麦草外源物质的鉴定方法 |
| CN104975108A (zh) * | 2015-08-04 | 2015-10-14 | 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 | 华山新麦草Ns基因组特异分子标记引物及其使用方法 |
| CN108950044A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-12-07 | 西北农林科技大学 | 华山新麦草分子特异性标记引物及其应用 |
| CN114574482A (zh) * | 2022-02-11 | 2022-06-03 | 西北农林科技大学 | 一种华山新麦草全基因组液相芯片及应用 |
| CN115011724A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-09-06 | 河南科技大学 | 一种华山新麦草染色体特异nd-fish探针及其应用、试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116083626A (zh) | 2023-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106868131B (zh) | 陆地棉6号染色体与纤维强度相关的snp分子标记 | |
| Mun et al. | Construction of a reference genetic map of Raphanus sativus based on genotyping by whole-genome resequencing | |
| Ashkani et al. | Allele mining strategies: principles and utilisation for blast resistance genes in rice (Oryza sativa L.) | |
| CN108060261B (zh) | 一种对玉米snp标记组合进行捕获测序的方法及其应用 | |
| Wang et al. | From genome to gene: a new epoch for wheat research? | |
| CN110923352B (zh) | 小麦抗白粉病基因PmDTM的KASP标记及其应用 | |
| CN110578015A (zh) | 甘蓝型油菜高矮性状紧密连锁的snp标记及其应用 | |
| CN112195265B (zh) | 一种鉴定辣椒杂交种纯度的snp位点、引物组及应用 | |
| CN116083626B (zh) | 一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用 | |
| CN108642201B (zh) | 与谷子株高性状相关的snp标记及其检测引物和应用 | |
| CN109811074A (zh) | 一种用于辅助检测小麦高单穗小穗数性状的标记及其应用 | |
| WO2023208078A1 (zh) | 调控番茄果实可溶性固形物含量的基因组结构变异及相关产品和应用 | |
| CN113278723B (zh) | 合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用 | |
| CN113832251B (zh) | 用于检测番茄花叶病毒病抗性的snp位点组合及其应用 | |
| CN115786564A (zh) | 一种水稻Pi-ta和Ptr显性功能分子标记及其应用 | |
| CN111793706B (zh) | 一种豇豆InDel分子标记检测引物组及试剂盒 | |
| Smulders et al. | High throughput marker development and application in horticultural crops | |
| CN108715901B (zh) | 一种与谷子株高性状相关的snp标记及其检测引物和应用 | |
| CN112779350A (zh) | 与小麦小穗粒数QTLQGns．sicau-2D紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| CN111635957A (zh) | 一种检测小麦抗条锈病qtl的分子标记及其在抗病育种中的应用 | |
| CN113308566B (zh) | 大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物和应用 | |
| CN114606341B (zh) | 希尔斯山羊草基于基因组重测序SNP的dCAPS分子标记及应用 | |
| CN116144824A (zh) | 一种华山新麦草2Ns染色体特异KASP分子标记引物及其应用 | |
| CN116590453B (zh) | 一个与莲植株矮化性状相关的snp分子标记及其应用 | |
| Zhang et al. | RNA-seq analysis revealed considerable genetic diversity and enabled the development of specific KASP markers for Psathyrostachys huashanica |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |