CN112080580B - 一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的snp标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的SNP标记，所述SNP标记分别在青花菜HDEM参考基因组C4染色体第2445952位置、在青花菜HDEM参考基因组C7染色体第53444680位置和在青花菜HDEM参考基因组C7染色体第53644592位置的碱基为T或A。还提供了用于检测所述SNP标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～9所示。本发明SNP标记及其引物可基于KASP技术体系对‘浙青60’杂交种纯度进行鉴定，结果稳定、准确，可高通量鉴定‘浙青60’种子的纯度和真实性。

Description

一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的SNP标记
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，设计一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的SNP标记，具体为一种基于KASP技术开发的用于青花菜品种‘浙青60’纯度或真实性鉴定的SNP标记。
背景技术
青花菜(Brassica oleracea L.var.italica)，又名绿菜花、西兰花，起源于地中海沿岸，于上世纪80年代引入我国。青花菜因其次生代谢物芥子油苷具有抗癌功效而被广大消费者所青睐，种植面积也逐年增加。但是，30多年来我国栽培的青花菜品种以国外引进为主且引进品种以雄性不育的杂交种为主(李占省,刘玉梅,方智远,杨丽梅,庄木,张扬勇,吕红豪,王勇等.我国青花菜产业发展现状、存在问题与应对策略.《中国蔬菜》,2019(4):1-5)。因此，培育具有自主知识产权的青花菜新品种，对促进我国青花菜产业发展具有重要意义。近年来，我国青花菜育种家经过多年的努力选育出了一系列的青花菜新品种。为了切实保护新品种的自主知识产权，需要对种子进行真伪鉴别。另外，由于青花菜杂交种在制种过程中，蜜蜂等昆虫造成的串粉会使品种纯度下降。再加上青花菜杂交种的种子品种间差异肉眼不易识别，在收获和包装过程中也可能造成混杂。遗传纯度混杂或机械混杂均会降低产量和商品品质。因此，快速准确地鉴定品种真伪和纯度分析至关重要。传统的田间表型鉴定费时、费工、占地，且受季节限制。利用现代分子生物学技术则能对杂交种的纯度和真伪进行快速、精准鉴定。
SNP标记被国际植物新品种保护联盟(International Union for theProtection of New Varieties of Plants,UPOV)推荐为农作物品种鉴定和指纹数据库的方法之一。该标记具有以下几个优点：共显性，显示DNA序列差异，易实现数据整合共享，位点在基因组上分布密度高且均匀，单个数据点成本低(田红丽,杨扬,王璐,王蕊,易红梅,许理文,张云龙,葛建镕,王凤格,赵久然.兼容型maizeSNP384标记筛选与玉米杂交种DNA指纹图谱构建.作物学报,2020,46(7):1006-1015)。因此，SNP标记被广泛应用。SNP标记可通过KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)技术进行高通量检测。
青花菜品种‘浙青60’是由浙江省农业科学院蔬菜研究所自主选育的优质早熟青花菜杂交种。2020年4月通过浙江省主要农作物品种认定委员会认定(浙认蔬2020002)。‘浙青60’定植后约60天采收。生长势强，株型中等，分枝少；花球紧实圆整，花梗长绿，蕾粒中细均匀，蕾色蓝绿、低温不易发紫，商品性好。适宜我国大部分地区秋季种植。为确保‘浙青60’杂交种的种子纯度以及规范青花菜杂交种种业，需要开发一种准确和稳定的检测方法进行遗传纯度、品种身份和真实性鉴定。本申请通过开发KASP标记引物并建立其鉴别方法，为实现该青花菜品种的遗传纯度鉴定、真伪鉴别及保护提供技术支持。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于KASP技术的SNP标记，用于鉴定‘浙青60’种子纯度和真实性，该方法结果稳定、准确，可高通量鉴定‘浙青60’种子的纯度和真实性。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明利用23份青花菜核心种质的重测序数据，获得了百万计的SNP位点，根据每个SNP位点的多态性指数(PIC)、最小等位基因频率(MAF)、在染色体上的分布等，筛选出100个SNP位点，利用KASP技术对392份青花菜材料基因分型，建立了青花菜指纹图谱库数据。
本发明基于青花菜杂交种‘浙青60’及其双亲的基因分型结果，确定了3对引物组合，可用于‘浙青60’杂交种的种子纯度和真实性鉴定。
本发明一方面，提供了一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的SNP标记，所述的SNP标记包括：
编号SNP6001的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C4染色体第2445952位置的碱基为T或A；
编号SNP6002的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C7染色体第53444680位置的碱基为T或A；
编号SNP6003的标记，该标记在青花菜HDEM参考基因组C7染色体第53644592位置的碱基为T或A。
在本方明的另一方面，提供了用于检测上述SNP标记的引物组合，所述的引物组合包括：
用于检测SNP6001标记的引物对，由正向引物F1、H1和反向引物C1组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示；
用于检测SNP6002标记的引物对，由正向引物F2、H2和反向引物C2组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示；
用于检测SNP6003标记的引物对，由正向引物F3、H3和反向引物C3组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～9所示。
进一步的，上述各标记引物对中两条正向引物只在3’末端存在碱基差异性，可以竞争性地与目标位点结合，显示相应的FAM或HEX荧光，经信号放大后可判读目标位点基因型。
基于KASP技术体系对‘浙青60’杂交种纯度进行鉴定，在本发明的实施例中，采用2条上游引物并在上游引物5'端分别增加通用接头序列。上游引物F1～3增加的通用接头序列如SEQ ID NO.10所示；上游引物H1～3增加的通用接头序列如SEQ ID NO.11所示。
基于KASP基因分型技术体系，本发明SNP标记对应引物针对青花菜‘浙青60’及其双亲的基因型如下：
样品名称 SNP6001 SNP6002 SNP6003
浙青60 AT AT AT
父本 TT TT TT
母本 AA AA AA
在本发明的另一方面，还提供了用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的试剂盒，所述的试剂盒包括SEQ ID NO.1～9所示的引物组合。
优选的，所述的试剂盒还包括如SEQ ID NO.10～11所示的通用接头序列。
在本发明的另一方面，还提供了一种鉴定青花菜品种‘浙青60’的方法，包括以下步骤：
1)提取待测青花菜基因组DNA；
2)利用上述引物组合和通用接头进行PCR扩增；
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
进一步的，所述PCR反应体系为：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL，其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL。
进一步的，所述PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
进一步的，根据基因分型结果，判定待测样本为亲本、杂交种或异型株。
判定标准如下：
每个样本中，若3个SNP标记的基因型结果均为TT或均为AA，则可判定该样本为父本(TT)或母本(AA)；若基因型结果均为AT，则可判定该样本为‘浙青60’杂交种F1；若基因型结果中同时出现AT、AA或者同时出现AT、TT，则可判定该样本为异型株。
根据判定结果，统计亲本、杂交种和异型株的数目，可计算‘浙青60’的种子纯度。纯度计算公式如下：
Pur(％)＝[(N-P-H)/F]×100％
其中，Pur为种子纯度；N为待测样本数；P为亲本单株数；H为异型株数；F为杂交种数。
在本发明的另一方面，还提供了所述的SNP标记或引物组合在鉴定‘浙青60’杂交种纯度中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明基于前期392份青花菜代表性材料的指纹图谱数据，基于高通量的KASP基因分型平台，对100个SNP位点进行筛选，根据多态性指数、最小等位基因频率、基因分型的质量、结果的重复性等，筛选出适用于‘浙青60’种子纯度鉴定的3个SNP位点，并设计出用于检测SNP位点的共9条引物序列。利用这9条引物序列，可实现‘浙青60’种子的高通量、高效率纯度鉴定。本发明还提供了判定种子为亲本、杂交种或异型株，并计算纯度的方法，为青花菜品种‘浙青60’的推广提供了强有力的技术支撑。
附图说明
图1为用于‘浙青60’种子纯度鉴定的SNP6001位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图；图中，左上角一簇的基因型为AA，中间一簇的基因型为AT，右下角一簇的基因型为TT；
图2为用于‘浙青60’种子纯度鉴定的SNP6002位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图；图中，左上角一簇的基因型为AA，中间一簇的基因型为AT，右下角一簇的基因型为TT；
图3为用于‘浙青60’种子纯度鉴定的SNP6003位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图；图中，左上角一簇的基因型为AA，中间一簇的基因型为AT，右下角一簇的基因型为TT。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 SNP分子标记及引物的确定
1)备选位点：100个用于对392份青花菜材料(由国内11家西兰花育种联合攻关单位提供)指纹图谱构建的SNP位点。
2)位点的筛选：从100个SNP位点中，根据位点的多态性指数、最小等位基因频率、对‘浙青60’杂交种及其双亲的基因分型结果，挑选了3对重复性好、分型结果明晰的特异性位点组合，用于‘浙青60’的纯度鉴定。
3)3个SNP标记的编号分别为SNP6001、SNP6002和SNP6003，它们的位点信息如下：
表1青花菜品种‘浙青60’的SNP位点信息
编号 染色体 SNP物理位置(HDEM参考基因组) 等位基因
SNP6001 C4 2445952 [T/A]
SNP6002 C7 53444680 [T/A]
SNP6003 C7 53644592 [T/A]
4)本发明确定的基于KASP技术检测上述SNP位点的引物序列，以及对392份材料基因分型后的PIC、MAF和杂合率信息如下：
表2基于KASP技术检测青花菜SNP位点的信息
Figure BDA0002736371440000071
每对引物包括3条引物序列，其中F1～3和H1～3分别为正向引物，C1～3为反向引物。两条正向引物只在3’末端存在碱基差异性，可以竞争性地与目标位点结合，显示相应的FAM或HEX荧光，经信号放大后可判读目标位点基因型。
基于KASP技术体系对‘浙青60’杂交种纯度进行鉴定，在本发明的实施例中，采用两条上游引物，并在上游引物5'端分别增加通用接头序列。上游引物F1～3增加的通用接头序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；上游引物H1～3增加的通用接头序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
5)青花菜‘浙青60’及其双亲在3对SNP引物上的基因型数据如下：
表3‘浙青60’及其双亲的基因型
样品名称 SNP6001 SNP6002 SNP6003
浙青60 AT AT AT
父本 TT TT TT
母本 AA AA AA
实施例2‘浙青60’青花菜杂交种纯度的鉴定
本实施例具体提供了一种鉴定‘浙青60’青花菜杂交种纯度的方法，包括以下步骤：
1.DNA的提取
随机挑选待测的‘浙青60’杂交种种子180粒、父母本各2粒，进行DNA制备。
(1)将种子播种于穴盘，两周后取1cm大小的叶片于2ml离心管中，放入4mm直径的玻璃珠。
(2)加入500ul的2％的CTAB，用研磨机充分研磨。
(3)65℃水浴45min后，加入等体积的氯仿－异戊醇(体积比24:1)，颠倒混匀。
(4)12000rpm离心15min，取上清(约400ul)于新的1.5ml管中。
(5)向上清中加入2倍体积的无水乙醇，待DNA析出。
(6)10000rpm离心2min,倒掉上清液后，加75％的乙醇清洗3次，风干。
(7)加入200μl TE(pH 8.0)或ddH2O，充分溶解备用。
2.利用KASP技术进行基因分型检测
利用标记SNP6001、SNP6002和SNP6003组成的特异性KASP标记对‘浙青60’进行纯度鉴定。
具体步骤为：
1)提取待测青花菜基因组DNA；
2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Mastermix，进行PCR扩增；
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
KASP Mastermix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2。
用于KASP检测的PCR反应体系如下：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL；其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL；
用于PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
3.结果分析
通过检测，获得180个待测杂交种‘浙青60’种子及其亲本在编号为SNP6001、SNP6002和SNP6003的SNP标记基因分型结果。
表4 180个待测样品的KASP基因分型结果
样品名 SNP6001 SNP6002 SNP6003
Sample1 AT AT AT
Sample2 AT AT AT
Sample3 AT AT AT
…… …… …… ……
…… …… …… ……
Sample179 AT AT AT
Sample180 AT AT AT
NTC DropOut DropOut DropOut
P1 TT TT TT
P2 AA AA AA
统计结果表明：180个待测样本用3个标记基因分型结果均为AT，父本为TT，母本为AA，杂交种纯度为100％(图1～3)。
实施例3‘浙青60’的鉴定
随机挑选待测青花菜种子与‘浙青60’标准样品种子各48粒，按照实施例2中的方法制备DNA，同时利用本发明涉及的3个SNP标记进行基因分型检测。PCR反应体系和反应条件如实施例2。
表5待测品种与标准样品‘浙青60’在3个SNP位点上的分型结果
编号 待测种子 标准样品
SNP6001 AT AT
SNP6002 AA AT
SNP6003 TT AT
结果分析：通过上述检测，获得待测的青花菜种子与‘浙青60’在3个SNP位点上分型结果，比对分析表明：待测杂交种在2个SNP位点与‘浙青60’存在差异，表明待测杂交种不是‘浙青60’的真实杂交种。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的SNP标记
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcagaagag aaacacttaa catt 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcagaagag aaacacttaa cata 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catgttggtt cccagtctga tactagc 27
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agacttggaa gatgatcct 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agacttggaa gatgatcca 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gactcagtct ttgtagacat ca 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcttccgtt ccggtctttt tcatt 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcttccgtt ccggtctttt tcata 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atataagcag taccaataat gt 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims (7)

1.一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的引物组合，其特征在于，所述的引物组合为：
由正向引物F1、H1和反向引物C1组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~3所示；引物F1、H1、C1扩增的分子标记为SNP6001，分子标记SNP6001具有A/T多态性；
由正向引物F2、H2和反向引物C2组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4~6所示；引物F2、H2、C2扩增的分子标记为SNP6002，分子标记SNP6002具有A/T多态性；
由正向引物F3、H3和反向引物C3组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7~9所示；引物F3、H3、C3扩增的分子标记为SNP6003，分子标记SNP6003具有A/T多态性。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，引物F1、F2、F3的5'端连接有序列如SEQ ID NO.10所示的通用接头，引物H1、H2、H3的5'端连接有序列如SEQ ID NO.11所示的通用接头。
3.一种用于鉴定青花菜品种‘浙青60’的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有SEQID NO.1~9所示的引物组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，引物F1、F2、F3的5'端连接有序列如SEQID NO.10所示的通用接头，引物H1、H2、H3的5'端连接有序列如SEQ ID NO.11所示的通用接头。
5.一种鉴定青花菜品种‘浙青60’的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测青花菜基因组DNA；
2）利用权利要求2所述引物组合进行PCR扩增；
3）采用荧光检测仪分析PCR扩增产物；当SNP6001、SNP6002、SNP6003的基因型结果均为TT或均为AA，则可判定待测青花菜为‘浙青60’父本或‘浙青60’母本；当SNP6001、SNP6002、SNP6003的基因型结果均为AT，则可判定待测青花菜为‘浙青60’杂交种F1；当SNP6001、SNP6002、SNP6003的基因型结果中同时出现AT、AA或者同时出现AT、TT，则可判定待测青花菜为异型株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL，其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
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