CN109750118B

CN109750118B - 一种与辣椒核不育相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109750118B
Application number: CN201910114021.9A
Authority: CN
Inventors: 程蛟文; 吴智明; 董骥驰; 胡开林
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2019-02-14
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2039-02-14
Also published as: CN109750118A

Abstract

本发明属于蔬菜分子育种技术领域，具体涉及一种与辣椒核不育相关的SNP分子标记及其应用。所述的与辣椒核不育相关的SNP分子标记为SNP2、SNP3、SNP4、SNP7或SNP8，其SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示，该分子标记与辣椒育性表型共分离或紧密连锁。本发明还提供了一种鉴定上述SNP分子标记的KASP引物，该引物可以用于快速鉴定辣椒育性表型，能够极大地加快新的辣椒核雄性不育系的转育进程。而本发明开发的与辣椒核不育相关的SNP分子标记属于核不育基因共分离SNP标记，可以实现在辣椒幼苗期判定植株育性，从而减少制种成本。同时，也可以加速新的辣椒核雄性不育系的转育进程。

Description

一种与辣椒核不育相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于蔬菜分子育种技术领域，具体涉及一种与辣椒核不育相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

辣椒是世界范围内广泛栽培的一种茄科蔬菜作物。辣椒杂种优势明显，杂种一代种子是辣椒目前和今后生产用种的主要利用形式。利用雄性不育繁殖杂种一代种子可以免除人工去雄，从而降低种子生产成本，是辣椒杂种优势利用的理想途径。

用于辣椒杂种一代种子生产的雄性不育类型主要有两种，即质核互作雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)和细胞核雄性不育(genic male sterility，GMS)。后者比前者通常具有不育性更为稳定和不受恢保关系限制等优点，而且GMS不存在不育胞质负效应和胞质单一化的潜在风险。

自1969年Shifriss等发现第一个自然突变的辣椒GMS基因(命名为ms1)以来，国内外先后报道了20多个人工或自然突变的辣椒GMS基因。但是，仅有少数基因被确定基因座位，如ms1、ms3、ms8、ms_w、ms_nw和msc-1分别被定位于辣椒5、1、4、5、5和2号染色体上，其余辣椒GMS基因的物理位置以及它们之间的等位关系均尚不清楚。

此外，目前利用GMS两用系进行辣椒杂种一代种子生产时，仍采用常规的方法，即从开花初期开始，人工鉴别单株育性后，逐一拔除群体中的约50％的可育株，这极大地限制了GMS的大规模应用。通过开发辣椒GMS基因紧密连锁的分子标记，可以实现在种子或者苗期阶段对个体育性进行早期鉴别，对于GMS的高效转育以及提高杂种一代制种效率均具有重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种与辣椒核不育相关的SNP分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述与辣椒核不育相关的SNP分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物。

本发明的第四个目的在于提供上述鉴定与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种辣椒分子育种的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种与辣椒核不育相关的SNP分子标记，为SNP2、SNP3、SNP4、SNP7或SNP8，其中，SNP2的SNP位点对应于辣椒参考基因组Zunla-1 10号染色体上第3,425,281个核苷酸位点G>T突变；SNP3的SNP位点对应于辣椒10号染色体上第3,425,392个核苷酸位点G>T突变；SNP4的SNP位点对应于辣椒10号染色体上第3,425,965个核苷酸位点C>T突变；SNP7的SNP位点对应于辣椒10号染色体上第3,511,564个核苷酸位点G>A突变；SNP8的SNP位点对应于辣椒10号染色体上第3,512,704个核苷酸位点C>A突变；

所述的SNP2的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中序列中的M是G或T，导致辣椒育性表型的不同；

所述的SNP3的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中序列中的M是G或T，导致辣椒育性表型的不同；

所述的SNP4的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中序列中的M是C或T，导致辣椒育性表型的不同；

所述的SNP7的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中序列中的M是G或A，导致辣椒育性表型的不同；

所述的SNP8的SNP位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中序列中的M是C或A，导致辣椒育性表型的不同；

所述的与辣椒核不育相关的SNP分子标记在辣椒育种中的应用；

一种鉴定上述与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物，其核苷酸序列如下所示：

引物A1-SNP2：5’-CTCATCAACCATATCACTACAACTAC-3’；

引物A2-SNP2：5’-CTTCTCATCAACCATATCACTACAACTAA-3’；

通用引物SNP2：5’-CTGTTAGAYAATCGCGCTGCTGCTA-3’；

引物A1-SNP3：5’-AACTATATCAGTACTAATAGCAGCGC-3’；

引物A2-SNP3：5’-CAACTATATCAGTACTAATAGCAGCGA-3’；

通用引物SNP3：5’-GGTTGTTGAGACGACAAATGTACTGTTA-3’；

引物A1-SNP4：5’-GGAAATGACTGGAAATGTGCTGTC-3’；

引物A2-SNP4：5’-CGGAAATGACTGGAAATGTGCTGTT-3’；

通用引物SNP4：5’-GCATCAACTAACAAAATCACAAACTGAGTT-3’；

引物A1-SNP7：5’-CATATATTCCCCATCAATTATCCCAC-3’；

引物A2-SNP7：5’-CATATATTCCCCATCAATTATCCCAT-3’；

通用引物SNP7：5’-GAATGTAATCGGAAAAGTCAACCACGAT-3’；

引物A1-SNP8：5’-CACTGCTTGGCTTGGTTGAGC-3’；

引物A2-SNP8：5’-GCACTGCTTGGCTTGGTTGAGA-3’；

通用引物SNP8：5’-CACATGCAAAGTTGATCAACTCCATTGAA-3’；

所述的鉴定与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物在辣椒育种中的应用；

一种辣椒育性苗期分子标记鉴定的方法，包含如下步骤：

以辣椒幼苗样品DNA为模板，以上述鉴定与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物为扩增引物，进行PCR扩增，然后利用酶标仪读取PCR板上每个孔的荧光信号，根据荧光信号判定样品各SNP位点的基因分型信息，进而判定辣椒单株育性：

所述的PCR扩增的反应体系(总体积为1μL)优选为：0.36μL DNA溶液(50ng)，0.5μL2×KASP Master mix 1536，0.14μL Primer mix；

所述的PCR扩增的反应程序优选为：

95℃变性15min；94℃变性20s，61℃至55℃(每个循环降0.6℃，共10个循环)退火60s；94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；

所述的辣椒幼苗通过如下培育：

将辣椒种子利用清水浸种10h，甩干后用棉布包裹；30℃恒温催芽48h，露芽后播到营养杯中；待幼苗出土且子叶平展后，将幼苗假植到穴盘；待幼苗长至2～3片真叶平展后，得到辣椒幼苗样品；

所述的辣椒幼苗样品DNA可采取CTAB法提取；

所述的判定的具体方法为：

SNP2位点：T＝不育，G＝可育；(2)SNP3位点：T＝不育，G＝可育；(3)SNP4位点：T＝不育，C＝可育；(4)SNP7位点：A＝不育，G＝可育；(5)SNP8位点：A＝不育，C＝可育；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)为了进一步丰富辣椒GMS基因资源以及开发紧密连锁分子标记用于辣椒GMS两用系高效制种，本发明对两用系群体单株进行竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR,KASP)分析，得到5个与辣椒核不育相关的SNP分子标记，该分子标记与辣椒育性表型共分离或紧密连锁(图1)。

(2)本发明还提供了一种鉴定上述与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物，该引物可以用于快速鉴定辣椒育性表型，能够极大地加快新的辣椒核雄性不育系的转育进程。

(3)现有技术中，利用辣椒核雄性不育两用系进行杂种一代种子生产时，需要在开花期鉴定单株育性后人工拔除50％的可育株。而本发明开发的与辣椒核不育相关的SNP分子标记属于核不育基因共分离SNP标记，可以实现在辣椒幼苗期判定植株育性，从而减少制种成本。同时，也可以加速新的辣椒核雄性不育系的转育进程。

附图说明

图1是本发明的技术路线图。

图2是辣椒10号染色体1～4Mb区间的可育池和不育池SNP-index比较图；其中，黑线为不育池，灰线为可育池，灰色矩形所示为不育基因候选区域。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中辣椒GMS两用系(“SC13AB”)种子由华南农业大学园艺学院蔬菜系辣椒课题组提供；

KASP引物委托LGC公司(LGC Genomics，英国)合成；KASP 2*Master mix 1536，Standard Rox购自于LGC公司。

实施例1

(一)植物材料

将辣椒GMS两用系(“SC13AB”)种子(约250粒)浸种催芽和穴盘育苗。待幼苗长出5～6片平展真叶时，定植到华南农业大学增城试验基地，常规肥水管理。

(二)表型鉴定

待群体植株长至开花期，对单株逐一进行育性表型鉴定。先用肉眼观察花粉有无，随后采用花粉离体培养萌发法对植株逐一进行花粉育性的表型鉴定。将肉眼观察具有大量花粉，经离体花粉培养后能够正常萌发的判定为可育株；以肉眼观察无花粉，经显微镜观察确认无花粉的判定为不育株。群体最终确定育性表型的植株数为232株，其中可育株125株，不育株为107株，卡方检验表明可育：不育符合1:1分离。

(三)DNA提取

(1)称取1.0g新鲜幼嫩真叶，液氮中快速研磨成粉末，然后迅速将冷冻粉末转入10mL离心管；

(2)加入4mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀(65℃温浴45min，期间轻轻摇动3～5次)；

(3)稍冷却，加入等体积(4mL)酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，轻缓颠倒混匀5min；

(4)4℃条件下12000rpm离心5min；

(5)转上清液于另一新的10mL离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24：1)，上下颠倒混匀5min；

(6)4℃条件下12000rpm离心5min，上清液转移至另一新的10mL离心管；

(7)加2/3体积预冷的异丙醇，轻缓颠倒混匀，4℃放置30min或更长时间；

(8)4℃条件下12000rpm离心10min，弃去上清液；

(9)用体积分数为70％的乙醇溶液洗涤沉淀2次，吸去液滴，然后风干；

(10)加200μL的1×TE溶解DNA，再加RNase放到37℃恒温箱中3h，去除RNA；-20℃冰箱保存DNA溶液。

(四)DNA混池和建库测序

从辣椒GMS两用系(‘SC13AB’)群体随机选择30株可育株的DNA等量混合构建可育DNA池(命名为KYC)；随机选择30株不育株的DNA等量混合构建不育DNA池(命名为BYC)。将可育池和不育池连同一个不育单株的DNA(命名为BYZ)随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段，并加上接头进行进行cluster制备，最后在Illumina HiSeq X Ten上机测序。

(五)测序数据统计分析

经过对原始下机数据的过滤，BYC、BYZ和KYC三个样本获得的有效数据统计见表1。

表1三个样本有效数据产量统计

(六)SNP鉴定

使用GATK软件对三个样本组成的群体进行群体SNP检测，使用GATK中VariantFiltration功能，采用"DP<60||DP>160||QD<2.0||FS>20.0||MQ<40.0||ReadPosRankSum<-8.0||MQRankSum<-12.5"的过滤标准，得到群体SNP数9,850,973个。过滤掉有缺失的SNP位点以及三碱基SNP位点，共获得2,919,582个SNP位点。考虑到参考基因组Zunla-1为纯和可育株，所以首先筛选不育单株BYZ与Zunla-1为纯和多态性的位点。其次，根据深度过滤，位点中单个样本的深度必须满足“12<＝Depth<＝60”。此步骤后共获得SNP位点145,968个。

(七)SNP-index分析

1、以不育单株BYZ为参考基因型，将每一个标记位点支持不育型reads深度除以该位点总的reads深度，获得不育池BYC和可育池KYC所有位点不育型reads的SNP-index。

2、理论上，除了育性相关区域外，不育池和可育池其他区域基因型应该是相同的。在育性相关区域，不育池的SNP-index应该无限趋近于1，可育池的SNP-index应该在0.5左右浮动，而其他不相关区域两个池保留下来的位点应该都在0.5左右浮动。所以过滤掉两个混池中SNP-index都小于0.3以及都大于0.7的标记，另外，假如可育池或不育池基因型质量小于20，将过滤掉此标记。最后获得可用标记数量49,584。

3、在每一条染色体上，以5个SNP长度作为滑动窗口，取5个SNP的index的平均值。

4、利用两个池的SNP-index值和滑动窗口的平均频率值作图。

5、根据SNP-index值，确定辣椒核不育基因重要候选区域为第10号染色体的3.38M～3.55M大约170Kb的区域(图2)。

(八)候选区域分析

在候选区域共存在230个SNP位点，涉及到的蛋白编码基因为17个；其中落在基因内部的SNP有97个，所涉及到的基因共有9个；其中5个基因的CDS区域存在9个非同义SNP突变(表2)。进一步通过引入2个育性正常的辣椒参考基因组材料Chiltepin和CM334的基因型进行比较分析，排除4个在Zunla-1、Chiltepin和CM334之间存在差异的SNP位点，最终确定5个重要的SNP位点，涉及的候选基因为3个(表2)。

表2候选区域9个重要非同义SNP位点信息

(九)KASP基因分型

根据5个重要候选SNP位点两侧序列设计KASP引物，A1，A2和通用引物序列见表3。A1引物带有FAM荧光基团，A2引物带有HEX荧光基团，引物委托LGC公司(LGC Genomics，英国)合成。专利产品KASP 2*Master mix 1536，Standard Rox购自于LGC公司。

表3 KASP基因分型引物信息

PCR反应体系总体积为1μL，包含0.36μL DNA溶液(50ng)，0.5μL 2×KASP Mastermix 1536，0.14μL Primer mix。梯度PCR反应程序包括：95℃变性15min；94℃变性20s，61℃至55℃(每个循环降0.6℃，共10个循环)退火60s；94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。

利用酶标仪读取PCR板上每个孔的荧光信号，根据荧光信号判定样品基因分型信息确定232个辣椒单株的基因分型结果(表4)。通过与每个单株的育性表型比较分析，表明除了SNP2与育性表型存在1个交换(交换率为0.43％)以外，其他4个SNP均与育性表型共分离(表4)，验证了候选区间的可靠性。

表4候选区域5个重要SNP的KASP基因分型结果

SNP2的SNP位点的核苷酸序列如下所示，其中，序列中的M是G或T，导致辣椒育性表型的不同：

CTGTTAGATAATCGCGCTGCTGCTACTCMTAGTTGTAGTGATATGGTTGATGAG；

SNP3的SNP位点的核苷酸序列如下所示，其中，序列中的M是G或T，导致辣椒育性表型的不同；

GGTTGTTGAGACGACAAATGTACTGTTAGATAATCMCGCTGCTATTAGTACTGATATAGTT；

SNP4的SNP位点的核苷酸序列如下所示，其中，序列中的M是C或T，导致辣椒育性表型的不同；

GGAAATGACTGGAAATGTGCTGTMGAAAACTCAGTTTGTGATTTTGTTAGTTGATGC；

SNP7的SNP位点的核苷酸序列如下所示，其中，序列中的M是G或A，导致辣椒育性表型的不同；

GAATGTAATCGGAAAAGTCAACCACGATCGGAGCTCCGGCGAGTCGGCGGTMTGGGATAATTGATGGGGAATATATG；

SNP8的SNP位点的核苷酸序列如下所示，其中，序列中的M是C或A，导致辣椒育性表型的不同；

CACTGCTTGGCTTGGTTGAGMTTCAATGGAGTTGATCAACTTTGCATGTG。

实施例2一种辣椒育性苗期分子标记鉴定的方法

(一)育苗

(1)将辣椒种子利用清水浸种10h，甩干后用棉布包裹；

(2)30℃恒温箱中催芽48h，露芽后播到营养杯中；

(3)待幼苗出土且子叶平展后，将幼苗假植到穴盘；

(4)待幼苗长至2～3片真叶平展后，得到辣椒幼苗样品；然后采样提取DNA；

(二)基因分型

利用酶标仪读取PCR板上每个孔的荧光信号，根据荧光信号判定样品各SNP位点的基因分型信息，进而根据以下规则判定辣椒单株育性：(1)SNP2位点：T＝不育，G＝可育；(2)SNP3位点：T＝不育，G＝可育；(3)SNP4位点：T＝不育，C＝可育；(4)SNP7位点：A＝不育，G＝可育；(5)SNP8位点：A＝不育，C＝可育。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种与辣椒核不育相关的SNP分子标记及其应用

<130> 1

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SNP2的SNP位点的核苷酸序列

<400> 1

ctgttagata atcgcgctgc tgctactcmt agttgtagtg atatggttga tgag 54

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SNP3的SNP位点的核苷酸序列

<400> 2

ggttgttgag acgacaaatg tactgttaga taatcmcgct gctattagta ctgatatagt 60

t 61

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SNP4的SNP位点的核苷酸序列

<400> 3

ggaaatgact ggaaatgtgc tgtmgaaaac tcagtttgtg attttgttag ttgatgc 57

<210> 4

<211> 77

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SNP7的SNP位点的核苷酸序列

<400> 4

gaatgtaatc ggaaaagtca accacgatcg gagctccggc gagtcggcgg tmtgggataa 60

ttgatgggga atatatg 77

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SNP8的SNP位点的核苷酸序列

<400> 5

cactgcttgg cttggttgag mttcaatgga gttgatcaac tttgcatgtg 50

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A1-SNP2

<400> 6

ctcatcaacc atatcactac aactac 26

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A2-SNP2

<400> 7

cttctcatca accatatcac tacaactaa 29

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 通用引物SNP2

<400> 8

ctgttagaya atcgcgctgc tgcta 25

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A1-SNP3

<400> 9

aactatatca gtactaatag cagcgc 26

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A2-SNP3

<400> 10

caactatatc agtactaata gcagcga 27

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 通用引物SNP3

<400> 11

ggttgttgag acgacaaatg tactgtta 28

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A1-SNP4

<400> 12

ggaaatgact ggaaatgtgc tgtc 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A2-SNP4

<400> 13

cggaaatgac tggaaatgtg ctgtt 25

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 通用引物SNP4

<400> 14

gcatcaacta acaaaatcac aaactgagtt 30

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A1-SNP7

<400> 15

catatattcc ccatcaatta tcccac 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A2-SNP7

<400> 16

catatattcc ccatcaatta tcccat 26

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 通用引物SNP7

<400> 17

gaatgtaatc ggaaaagtca accacgat 28

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A1-SNP8

<400> 18

cactgcttgg cttggttgag c 21

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物A2-SNP8

<400> 19

gcactgcttg gcttggttga ga 22

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 通用引物SNP8

<400> 20

cacatgcaaa gttgatcaac tccattgaa 29

Claims

1.一种与辣椒核不育相关的SNP分子标记在辣椒育种中的应用，其特征在于所述的与辣椒核不育相关的SNP分子标记为SNP2、SNP3、SNP4、SNP7或SNP8；

所述的SNP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中序列中的M为SNP2的SNP位点，是G或T，导致辣椒育性表型的不同；

所述的SNP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中序列中的M为SNP3的SNP位点，是G或T，导致辣椒育性表型的不同；

所述的SNP4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中序列中的M为SNP4的SNP位点，是C或T，导致辣椒育性表型的不同；

所述的SNP7的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中序列中的M为SNP7的SNP位点，是G或A，导致辣椒育性表型的不同；

所述的SNP8的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中序列中的M为SNP8的SNP位点，是C或A，导致辣椒育性表型的不同。

2.一种鉴定权利要求1中所述的与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物，其特征在于其核苷酸序列如下所示：

引物A1-SNP2：5’-CTCATCAACCATATCACTACAACTAC-3’；

引物A2-SNP2：5’-CTTCTCATCAACCATATCACTACAACTAA-3’；

通用引物SNP2：5’-CTGTTAGAYAATCGCGCTGCTGCTA-3’；

引物A1-SNP3：5’-AACTATATCAGTACTAATAGCAGCGC-3’；

引物A2-SNP3：5’-CAACTATATCAGTACTAATAGCAGCGA-3’；

通用引物SNP3：5’-GGTTGTTGAGACGACAAATGTACTGTTA-3’；

引物A1-SNP4：5’-GGAAATGACTGGAAATGTGCTGTC-3’；

引物A2-SNP4：5’-CGGAAATGACTGGAAATGTGCTGTT-3’；

通用引物SNP4：5’-GCATCAACTAACAAAATCACAAACTGAGTT-3’；

引物A1-SNP7：5’-CATATATTCCCCATCAATTATCCCAC-3’；

引物A2-SNP7：5’-CATATATTCCCCATCAATTATCCCAT-3’；

通用引物SNP7：5’-GAATGTAATCGGAAAAGTCAACCACGAT-3’；

引物A1-SNP8：5’-CACTGCTTGGCTTGGTTGAGC-3’；

引物A2-SNP8：5’-GCACTGCTTGGCTTGGTTGAGA-3’；

通用引物SNP8：5’-CACATGCAAAGTTGATCAACTCCATTGAA-3’。

3.权利要求2所述的鉴定权利要求1中所述的与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物在辣椒育种中的应用。

4.一种辣椒育性苗期分子标记鉴定的方法，其特征在于包含如下步骤：

以辣椒幼苗样品DNA为模板，以权利要求2所述的鉴定权利要求1中所述的与辣椒核不育相关的SNP分子标记的KASP引物为扩增引物，进行PCR扩增，然后利用酶标仪读取PCR板上每个孔的荧光信号，根据荧光信号判定样品基因分型信息，并确定辣椒育性。

5.根据权利要求4所述的辣椒育性苗期分子标记鉴定的方法，其特征在于：

所述的PCR扩增的反应体系为：0.36 μL DNA溶液，0.5 μL 2×KASP Master mix 1536，0.14 μL Primer mix。

6.根据权利要求4所述的辣椒育性苗期分子标记鉴定的方法，其特征在于：

所述的PCR扩增的反应程序为：

95℃变性15 min；94℃变性20 s，61至55℃退火60 s, 每个循环降0.6℃，共10个循环；94℃变性20 s，55℃退火60 s，26个循环。

7.根据权利要求4所述的辣椒育性苗期分子标记鉴定的方法，其特征在于：

所述的辣椒幼苗通过如下培育：

将辣椒种子利用清水浸种10 h，甩干后用棉布包裹；30℃恒温催芽48 h，露芽后播到营养杯中；待幼苗出土且子叶平展后，将幼苗假植到穴盘；待幼苗长至2~3片真叶平展后，得到辣椒幼苗样品。

8.根据权利要求4所述的辣椒育性苗期分子标记鉴定的方法，其特征在于：

所述的判定的具体方法为：

（1）SNP2的SNP位点：T＝不育，G=可育；（2）SNP3的SNP位点：T=不育，G=可育；（3）SNP4的SNP位点：T=不育，C=可育；（4）SNP7的SNP位点：A=不育，G=可育；（5）SNP8的SNP位点：A=不育，C=可育。