CN111172307B - 一种与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蔬菜分子育种技术领域，特别涉及一种与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记及其应用。所述的分子标记为分子标记S‑177、S‑33、S‑280或S‑113，位于辣椒第10号染色体，本发明还提供了鉴定上述标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示。本发明提供的与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记及其鉴定引物可以用于辣椒分子标记辅助选择育种，可以加速成熟果实易脱落辣椒新品种的培育，大大提高该性状遗传改良的效率，降低选育成本，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。

Description

一种与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记及 其应用
技术领域
本发明涉及蔬菜分子育种技术领域，特别涉及一种与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记及其应用。
背景技术
辣椒(Capsicum spp.)属于茄科辣椒属一年生或多年生植物。辣椒果实风味独特、色形多样，除用作鲜食外，也可以用于辣椒粉、辣椒酱、辣椒油等调味品的初加工以及进行辣椒素和辣椒红素提取等精深加工。据农业农村部大宗蔬菜产业体系统计，近年来，我国目前干制和加工型辣椒年均种植面积约为900万亩，辣椒加工产业发展迅猛，辣椒加工制品远销全球，加工专用型辣椒品种市场需求日趋旺盛。
成熟果实脱把是辣椒进行采后加工的首要环节，当前主要依靠人工剪柄和机械去把，前者费时耗力、成本高，后者效率虽较高但是常常存在果把去除不干净进而影响品质以及损耗过大的问题。因此，从遗传育种改良的角度来选育一个成熟果实自然易脱把的辣椒品种可能将是解决上述问题的有效途径。
辣椒成熟果实脱把性，是指辣椒果实红熟后，从萼片处分离的特性(如图1)。成熟果实易脱把是野生辣椒的一个典型性状，可能有利于野外自然环境下辣椒种子的自然传播。经过人工驯化的辣椒5个主要栽培种中，仅有C.frutescens部分种质仍保留了该野生种性，其他栽培种则均表现为成熟果实难脱把的特性。
遗传分析结果表明，辣椒成熟果实易脱把对难脱把表现为受单基因显性遗传控制，其中，易脱把对难脱把表现为显性，而且该基因被初步定位于辣椒第10号染色体。但是，迄今可用于辅助选择育种的辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离分子标记的开发尚未见报道。通过开发辣椒成熟果实脱落基因紧密连锁的分子标记，可以实现在种子或者苗期阶段对辣椒单株果实脱把性进行早期鉴别，对提高加工专用型辣椒新品种的培育效率具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记。
本发明的另一目的在于提供上述与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记的应用。
本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记的引物。
本发明的第四个目的在于提供上述鉴定与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记的引物的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种辣椒分子育种的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记，为分子标记S-177、S-33、S-280或S-113，位于辣椒第10号染色体，其中，各分子标记对应的物理坐标如下所示：
Figure BDA0002295757410000021
上述分子标记存在插入或缺失，导致辣椒成熟果实脱把性的不同；
所述的与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记在辣椒育种领域中的应用；
一种鉴定上述与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记的引物，其核苷酸序列如下所示：
S-177-F：5′-CCATCACAAAATACGAAGGC-3′；
S-177-R：5′-TAGGAAGCAAAATCGTGTCA-3′；
S-33-F：5′-TGATTAAGTGGATAAGCTAAGC-3′；
S-33-R：5′-AGTTAAACTACGCTCTGAGG-3′；
S-280-F：5′-TGGCCCGACGATTATTAAAA-3′；
S-280-R：5′-CCATGTTATCCGGATCAACT-3′；
S-113-F：5′-CCAATAAGTAGATGAAGGGCA-3′；
S-113-R：5′-AAGGAAAGCTTCAACATGGA-3′；
所述的鉴定与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记的引物在辣椒育种领域中的应用；
一种鉴定辣椒成熟果实脱把性的试剂盒，包含上述引物；
所述的试剂盒优选还包含PCR Buffer、MgCl2溶液、dNTP、Taq酶和ddH2O；
所述的试剂盒在辣椒育种领域中的应用；
一种辣椒分子育种的方法，包含如下步骤：
(1)提取待测植株的基因组DNA；
(2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用上述鉴定与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记的引物进行PCR扩增反应，同时以表型为成熟果实易脱把、基因型为纯合子的辣椒和表型为成熟果实难脱把的辣椒的DNA分别为对照1和对照2；
(3)电泳检测PCR扩增产物，并进行分析：
如待测样品的电泳条带仅与对照1的电泳条带大小相同，则待测植株的辣椒成熟果实易脱把；
如待测样品的电泳条带同时出现对照1和对照2大小的电泳条带，则待测植株的辣椒成熟果实易脱把；
如待测样品的电泳条带仅与对照2条带电泳大小相同，则待测植株的辣椒成熟果实难脱把；
所述的表型为成熟果实易脱把、基因型为纯合子的辣椒优选为野生辣椒‘Chiltepin’；
所述的表型为成熟果实难脱把的辣椒优选为辣椒自交系‘BB3’；
所述PCR扩增反应的反应体系优选为：10×PCR Buffer 2.0μL，25mM MgCl2溶液2.0μL，10mM dNTP 0.2μL，1U Taq酶0.2μL，1μM上游引物1μL，1μM下游引物1μL，50ng/μL模板DNA2.0μL，ddH2O补足20μL；
所述PCR扩增反应的反应程序优选为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共计32个循环；72℃5min；
本发明的原理：
本发明以本课题组已公开发表的高密度SNP遗传图谱(Cheng J,Qin C,Tang X,etal.Development of a SNP array and its application to genetic mapping anddiversity assessment in pepper(Capsicum spp.).Scientific Reports,2016,6:33293.)为基础，结合‘BA3’(C.annuum)בYNXML’(C.frutescens)F2分离群体(n＝79)单株的果实脱把表型数据，首先对辣椒成熟果实脱把基因进行初定位。然后以果实成熟后不脱把的栽培辣椒自交系‘BB3’(C.annuum)和果实成熟后易脱把的近缘野生辣椒‘Chiltepin’分别为母本和父本，构建回交一代群体[‘BB3’×(‘BB3’בChiltepin’)]，利用该群体对果实脱把基因初定位区间进行标记加密，获得与辣椒成熟果实脱把基因紧密连锁的分子标记并在F2小群体中进行验证(图11)，为实现辣椒果实脱把性分子标记辅助选择奠定基础。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明开发了7个与辣椒成熟果实脱把紧密连锁的标记，并进行了初步的可靠性验证，其中2个与表型共分离，2个与表型紧密连锁。利用上述分子标记可以实现在辣椒幼苗阶段准确判定植株果实脱把性，可以大大提高该性状遗传改良的效率，降低选育成本，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。
(2)本发明提供的与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记及其鉴定引物可以用于辣椒分子标记辅助选择育种，可以加速成熟果实易脱落辣椒新品种的培育，进而降低辣椒食品加工的人力成本。
(3)本发明还提供了一种鉴定辣椒成熟果实脱把性的试剂盒，该试剂盒成分简单，使用方便，可以用于辣椒分子标记辅助选择育种，具有高效、准确等优点。
附图说明
图1是辣椒脱把性示意图；其中，A：果实成熟后不易脱把型辣椒，B：为成熟后易脱把型辣椒。
图2是辣椒成熟果实脱把性QTL定位结果分析图；其中，虚线为LOD阀值线，以左边纵坐标为参考，从5.4处水平引出到右边纵坐标；实线为K*阀值线，以右边纵坐标为参考，从18.64处水平引出到左边纵坐标。
图3是采用标记S-13对BB3、Chiltepin、F1和BC1群体基因分型的电泳结果图；其中，1：BB3，2：Chiltepin，3：F1代，4～23：BC1群体。
图4是采用标记S-19对BB3、Chiltepin和BC1群体基因分型的电泳结果图；其中，1～19：BC1群体，右上角为BB3、Chiltepin亲本。
图5是采用标记S-27对BB3、Chiltepin、F1和BC1群体基因分型的电泳结果图；其中，1：BB3，2：Chiltepin，3：F1代，4～23：BC1群体。
图6是采用标记S-177对BB3、Chiltepin、F1和BC1群体基因分型的电泳结果图；其中，1：BB3，2：Chiltepin，3：F1代，4～23：BC1群体。
图7是采用标记S-33对BB3、Chiltepin、F1和BC1群体基因分型的电泳结果图；其中，1：BB3，2：Chiltepin，3：F1代，4～23：BC1群体。
图8是采用标记S-280对BB3、Chiltepin、F1和BC1群体基因分型的电泳结果图；其中，1：BB3，2：Chiltepin，3：F1代，4～22：BC1群体。
图9是采用标记S-113对BB3、Chiltepin和BC1群体基因分型的电泳结果图；其中，1～22：BC1群体，右上角为BB3、Chiltepin亲本。
图10是BC1群体中12个交换株基因分型结果分析图；其中，a：果实成熟后不脱落的基因型，h：杂合单株基因型，其中，颜色加深部分为基因型为h。
图11是本发明的技术路线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，辣椒不育系‘BA3’、YNXML、辣椒自交系‘BB3’、野生辣椒‘Chiltepin’已在参考文献(程蛟文.辣椒全基因组SSR和SNP标记开发及应用[D].2016.)中公开。
实施例1
(一)植物材料
①以成熟果实不脱把的辣椒不育系‘BA3’和成熟后易脱把的YNXML分别为母本和父本，构建F2群体(n＝79株)用于成熟果实脱把性状的QTL初定位研究。
②以成熟果实不脱把的辣椒自交系‘BB3’和成熟果实易脱把的野生辣椒‘Chiltepin’分别为母本和父本，通过杂交和回交构建包含254个单株的BC1群体[‘BB3’×(‘BB3’בChiltepin’)]，利用该群体对初定位区间可靠性进行验证以及进行标记加密。
辣椒种子经浸种催芽和穴盘育苗，待幼苗长出5～6片平展真叶时，定植到华南农业大学跃进北试验基地，常规肥水管理。
(二)表型鉴定
待辣椒植株果实至红熟期，对单株逐一进行脱把表型鉴定。以轻轻触碰后果实与萼片立马分离的植株记为易脱把植株，以用力拉动果实后，果实与萼片仍不分离的植株记为难脱把植株。
(三)DNA提取
(1)称取100mg新鲜幼嫩真叶，液氮中快速研磨成粉末，然后迅速将冷冻粉末转入2mL离心管。
(2)加入800μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀，65℃水浴45min，期间轻轻摇动3～5次)。
(3)稍冷却，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，轻缓颠倒混匀5min。
(4)4℃条件下12000rpm离心5min。
(5)转上清液于另一新的2mL离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24∶1)，上下颠倒混匀5min。
(6)4℃条件下12000rpm离心5min，上清液转移至另一新的2mL离心管。
(7)加2/3体积预冷的异丙醇，轻缓颠倒混匀，4℃放置30min或更长时间。
(8)4℃条件下12000rpm离心10min，弃去上清液。
(9)用体积分数为70％的乙醇洗涤沉淀2次，吸去液滴，然后风干。
(10)加40μL的1×TE溶解DNA，再加RNase放到37℃恒温箱中3h，去除RNA；-20℃冰箱保存DNA溶液。
(四)辣椒成熟果实脱把性QTL初定位
基于本课题组已构建完成的高密度BY-SNP图谱(Cheng J,Qin C,Tang X,etal.Development of a SNP array and its application to genetic mapping anddiversity assessment in pepper(Capsicum spp.).Scientific Reports,2016,6:33293.程蛟文.辣椒全基因组SSR和SNP标记开发及应用[D].2016.)，采用MapQTL6.0软件，结合BA3(C.annuum)×YNXML(C.frutescens)F2果实脱落分离群体表型数据(n＝79)进行QTL分析。综合K值(KW检验)和LOD值(IM检验)结果：设置区间划定条件：K≥45，LOD≥15.65(降5个LOD值)，最终找出辣椒第10号染色体的197.78Mb～202.84Mb之间大约5.06Mb的区域为果实脱把基因的唯一候选区域(图2)。
(五)辣椒成熟果实脱把QTL初定位区间标记验证与加密
基于本课题组主要负责完成的已经公开发表的辣椒参考基因组测序序列和重测序数据http://peppersequence.genomics.cn/.，在初定位区间开发‘BB3’和‘Chiltepin’间存在多态的引物(部分多态性引物见表1)，然后用多态性引物对[‘BB3’×(‘BB3’בChiltepin’)]回交一代群体单株进行基因分型，其中，反应体系为：10×PCR Buffer 2.0μL，25mM MgCl2溶液2.0μL，10mM dNTP 0.2μL，1U Taq酶0.2μL，1μM上游引物1μL，1μM下游引物1μL，50ng/μL模板DNA2.0μL，ddH2O补足20μL，反应程序为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共计32个循环；72℃5min，12℃保存。PCR反应结束后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，部分结果见图3～图9。
通过基因分型，最终在初定位区间开发了7个发生交换事件的Indel标记(表1)，其中标记S-33和S-280在包含254个单株回交群体中与果实脱把性交换率为0，其余5个标记交换数为1～7(图10)。
表1初定位区间开发的Indel多态性标记引物信息
Figure BDA0002295757410000071
实施例2标记应用
基于实施例1群体开发的连锁标记，将其中2个紧密连锁(S-177，S-113)和2个共分离的标记(S-33，S-280)对以成熟果实不脱把的辣椒自交系‘BB3’和成熟果实易脱把的野生辣椒‘Chiltepin’为母本和父本构建的包含56个单株的F2群体进行基因分型(表2)，具体PCR反应体系和反应程序见实施例1，PCR反应结束后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行如下结果判定：
①如样品的电泳条带仅与母本‘Chiltepin’的电泳条带大小相同，则待测植株的辣椒成熟果实易脱把；
②如样品的电泳条带同时出现母本‘Chiltepin’和父本‘BB3’大小的电泳条带，则待测植株的辣椒成熟果实易脱把；
③如样品的电泳条带仅与父本‘BB3’条带电泳大小相同，则待测植株的辣椒成熟果实难脱把。
根据上述基因分型及判定结果，结合每个单株的实际表型，统计出了S-177，S-33，S-280，S-113(显性标记)4个分子标记在群体中的准确率分别为96.4％，100％，100％和98.2％，因此，本专利开发的分子标记可应用于辣椒幼苗阶段植株果实脱把性的鉴定。
表2候选区域4个紧密连锁标记的分型结果
Figure BDA0002295757410000072
Figure BDA0002295757410000081
注：a：果实成熟后不脱落的基因型；b：果实成熟后易脱落的基因型；h：杂合单株基因型。灰色标记为表型和基因型不符合的单株。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记及其应用
<130> 1
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (5)

1.一种鉴定与辣椒成熟果实脱把性紧密连锁或共分离的分子标记的引物在辣椒成熟果实脱把性性状育种中的应用，其特征在于所述的引物的核苷酸序列如下所示：
S-177-F：5´-CCATCACAAAATACGAAGGC-3´；
S-177-R：5´-TAGGAAGCAAAATCGTGTCA-3´；
S-33-F：5´-TGATTAAGTGGATAAGCTAAGC-3´；
S-33-R：5´-AGTTAAACTACGCTCTGAGG-3´；
S-280-F：5´-TGGCCCGACGATTATTAAAA-3´；
S-280-R：5´-CCATGTTATCCGGATCAACT-3´；
S-113-F：5´-CCAATAAGTAGATGAAGGGCA-3´；
S-113-R：5´-AAGGAAAGCTTCAACATGGA-3´；
所述的应用以表型为成熟果实易脱把、基因型为纯合子的辣椒和表型为成熟果实难脱把的辣椒分别为对照1和对照2；
所述的表型为成熟果实易脱把、基因型为纯合子的辣椒为野生辣椒‘Chiltepin’；
所述的表型为成熟果实难脱把的辣椒为辣椒自交系‘BB3’；
如待测样品采用上述引物扩增得到的电泳条带仅与对照1的电泳条带大小相同，则待测植株的辣椒成熟果实易脱把；
如待测样品的电泳条带同时出现对照1和对照2大小的电泳条带，则待测植株的辣椒成熟果实易脱把；
如待测样品的电泳条带仅与对照2的电泳条带大小相同，则待测植株的辣椒成熟果实难脱把。
2.一种鉴定辣椒成熟果实脱把性的试剂盒在辣椒成熟果实脱把性性状育种中的应用，其特征在于所述的试剂盒包含权利要求1中所述的引物。
3.根据权利要求2所述的鉴定辣椒成熟果实脱把性的试剂盒在辣椒成熟果实脱把性性状育种中的应用，其特征在于：
所述的试剂盒还包含PCR Buffer、MgCl2溶液、dNTP、Taq酶和ddH2O。
4.一种辣椒分子育种的方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）提取待测植株的基因组DNA；
（2）以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述的引物或权利要求2或3中所述的试剂盒进行PCR扩增反应，同时以表型为成熟果实易脱把、基因型为纯合子的辣椒和表型为成熟果实难脱把的辣椒的DNA分别为对照1和对照2；
（3）电泳检测PCR扩增产物，并进行分析：
如待测样品的电泳条带仅与对照1的电泳条带大小相同，则待测植株的辣椒成熟果实易脱把；
如待测样品的电泳条带同时出现对照1和对照2大小的电泳条带，则待测植株的辣椒成熟果实易脱把；
如待测样品的电泳条带仅与对照2的电泳条带大小相同，则待测植株的辣椒成熟果实难脱把；
所述的表型为成熟果实易脱把、基因型为纯合子的辣椒为野生辣椒‘Chiltepin’；
所述的表型为成熟果实难脱把的辣椒为辣椒自交系‘BB3’。
5.根据权利要求4所述的辣椒分子育种的方法，其特征在于：
所述PCR扩增反应的反应体系为：10×PCR Buffer 2.0μL，25mM MgCl2溶液2.0μL，10mMdNTP 0.2μL，1U Taq酶0.2μL，1μM上游引物1μL，1μM下游引物1μL，50ng/μL模板DNA 2.0μL，ddH2O补足20μL；
所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，共计32个循环；72℃ 5min。
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