ES2555379T3 - Planta de pimiento mejorada - Google Patents

Abstract

Una planta de pimiento híbrida estéril masculina, que desarrolla frutos sin semillas comestibles, de aspecto normal por toda la planta, en donde dichos frutos sin semillas se caracterizan por ser al menos 95% sin semillas, en donde el rasgo "sin semillas" es controlado por un determinante genético y es independiente del proceso de polinización y fecundación, es independiente del tratamiento con hormonas vegetales inductoras de partenocarpia, incluyendo auxinas, giberelinas y citoquinas, inhibidores del transporte de auxina, u otros y/u otros factores exógenos inductores de partenocarpia y/o agentes inductores de partenocarpia administrados exógenamente tales como sustancias reguladoras del crecimiento, ya sean naturales o sintéticas, o extractos vegetales tales como, por ejemplo, extracto de polen muerto, y también es independiente de condiciones climáticas externas y en donde dicho rasgo "sin semillas" se puede obtener a partir de una planta de pimiento seleccionada del grupo que consiste en Capsicum annuum AR07-F1-56-b; Capsicum annuum AR07-F1-87-b; Capsicum annuum AR07-F1-166-b; Capsicum annuum AR07-F1-171-X; y Capsicum annuum AR07-F1-172-X, desarrollada a partir de semillas depositadas ante la NCIMB, Aberdeen AB21 9YA, Escocia, Reino Unido el 26 de mayo de 2008, bajo el número de acceso NCIMB 41558, NClMB 41559, NCIMB 41560, NCIMB 41561 y NCIMB 41562, respectivamente.

Description

DESCRIPCION

Planta de pimiento mejorada

La presente invencion se refiere, en general, a pimiento sin semillas (SLP); y mas espedficamente, se refiere al pimiento sin semillas masculino esteril que tiene caractensticas unicas como se expone a continuacion.

5 Los frutos son el resultado del desarrollo del ovario. En el desarrollo normal del fruto, el inicio de la fructificacion depende de la finalizacion con exito del proceso de polinizacion y de fecundacion, el inicio del desarrollo del fruto es generalmente reprimido hasta que se produzca la fecundacion.

En general, el desarrollo completo del fruto sigue a la polinizacion y la fecundacion, y coincide con la maduracion de las semillas. Un fruto proporciona un entorno adecuado para el desarrollo de las semillas.

10 Factores externos o internos pueden interferir ocasionalmente con el proceso normal de desarrollo del fruto, que luego puede volverse independiente de la polinizacion y la fecundacion tal como en la fructificacion partenocarpica. En plantas partenocarpicas, el desarrollo del fruto y la iniciacion estan desligados de la fecundacion. La caractenstica partenocarpica puede conducir al desarrollo de frutos sin semillas o con semillas reducidas sin la polinizacion y la fecundacion. Por lo tanto, partenocarpia se refiere al desarrollo del ovario en frutos sin semillas 15 independientemente del proceso de polinizacion y/o fecundacion.

La caractenstica partenocarpica es bien conocida en muchas especies vegetales y puede producirse de forma natural o puede inducirse artificialmente con una diversidad de esrtmulos externos tales como, por ejemplo, aplicacion de diferentes hormonas. En la mayona de las especies, la fuente del fenomeno partenocarpico, que resulta en la produccion de frutos sin semillas o con semillas reducidas, puede tener una base genetica y/o 20 epigenetica. La partenocarpia en vegetales puede ser vista como una mutacion que reduce las posibilidades de la planta de sobrevivir y multiplicarse. Se podna logicamente suponer que las plantas "quieren" ahorrar su energfa solo para las frutos que aumentan sus posibilidades de multiplicacion, y que, por lo tanto, la evolucion buscana eliminar las plantas que producen frutos sin semillas o frutos iniciados puede caer en el caso de que no se produzca la fecundacion. Esta es quizas la razon por la cual el fenomeno partenocarpico es tan raro. En los cultivos, se utiliza 25 esencialmente para dos fines: A): para producir frutos sin semillas, en donde las semillas se consideran indeseables (sandfa, pepino) y B): para aumentar el rendimiento cuando las condiciones de fecundacion son adversas (tomate, berenjena).

Con frecuencia, la partenocarpia va acompanada de esterilidad tal como en el caso de la sandfa, pero la caractenstica tambien se encuentra como un rasgo independiente tal como, por ejemplo, en el pepino y el tomate.

30 La partenocarpia se puede producir de forma natural o puede ser inducida artificialmente. La partenocarpia natural puede tener una base genetica y, por lo tanto, puede ser controlada por determinantes geneticos. El rasgo “sin semillas" puede ser obligatorio u opcional, es decir se puede expresar en todo momento o en funcion de las condiciones ambientales.

Una partenocarpia inducida artificialmente puede ser el resultado del tratamiento de la planta y/o de la flor y/o del 35 ovario con agentes exogenos tales como extracto de polen muerto, o de la aplicacion de sustancias que regulan el crecimiento, ya sean naturales o sinteticas. De hecho, en el cultivo protegido tal como, por ejemplo, en invernaderos, las aplicaciones exogenas de reguladores del crecimiento se utilizan con frecuencia con el fin de inducir la formacion de frutos sin semillas con el objetivo de mejorar el rendimiento y la calidad del fruto, pero tambien en el cultivo a campo abierto para prevenir las perdidas de produccion bajo condiciones adversas. Sin embargo, estas medidas son 40 costosas y requieren mucha mano de obra y, a menudo, tambien conducen solo a una partenocarpia parcial. Ademas de ello, el tratamiento qmmico tambien puede resultar en un incremento de residuos qmmicos en los frutos y en el suelo y tambien se observan, a menudo, malformaciones de los frutos.

Cultivares de pimiento dulce sin semillas basados en la partenocarpia natural no estan disponibles todavfa; por lo tanto, se utilizo la manipulacion qmmica para inducir artificialmente la partenocarpia. Auxinas, giberelinas y 45 citoquininas (Sjut y Bangerth, 1982/83; Kim et al., 1992), asf como inhibidores del transporte de auxina (Beyer y Quebe- deaux, 1974; Kim et al., 1992), han sido aplicadas todas con exito a varios cultivos de vegetales con fruto.

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La calidad del fruto y el rendimiento dependen generalmente de la cantidad de semillas presentes en el fruto. Los altos numeros de semillas conducen generalmente a un aumento en el tamano y la calidad del fruto. El rendimiento y la calidad del fruto del pimiento son particularmente bien conocidos por ser altamente dependiente de la cantidad de semillas. Por otra parte, el pimiento es generalmente muy sensible a la fructificacion. Una vez que la planta comienza este proceso, emplea la mayona de su energfa para la fructificacion. Como resultado de esta competencia por recursos limitados de energfa y asimilacion, se inhibe la subsiguiente fructificacion y desarrollo de los frutos, asf como el crecimiento de las hojas, ramas y rafces. Un numero creciente de semillas reduce adicionalmente el crecimiento de las plantas.

Esta sensibilidad de las plantas de pimiento a la fructificacion es una de las razones del fenomeno de "lavado", lo que conduce a fluctuaciones dclicas de fructificacion y, por lo tanto, en la cosecha del pimiento alternando semanas de alta cosecha con semanas de baja cosecha. Este modelo de recoleccion irregular es un problema importante para los productores de pimiento, ya que hace que sea diffcil para los productores satisfacer la demanda del mercado durante las campanas de crecimiento y, ademas, conduce a fluctuaciones en la demanda de trabajo en los invernaderos.

En otras especies, tomate, por ejemplo, la sensibilidad a la fructificacion es mucho menor. Los tomates pueden producir una cosecha relativamente buena y de frutos de buena calidad, incluso cuando estos tienen pocas semillas, o pueden continuar creciendo incluso cuando los frutos tienen una gran cantidad de semillas. Herramientas artificiales pueden garantizar una fructificacion en algunas especies en donde las condiciones de fertilidad son adversas. En el tomate, la pulverizacion de una hormona especial (auxina) puede inducir la fructificacion, incluso sin semillas.

Heuvelink y Korner (2001) pusieron a prueba la hipotesis de trabajo de que el cultivo de frutos partenocarpicos en plantas de pimiento puede al menos reducir el problema de lavado en el crecimiento del pimiento y proporcionar ademas frutos de pimiento de alta calidad.

Heuvelink y Korner (2001) indujeron el crecimiento de frutos partenocarpicos en pimiento al impedir la auto- polinizacion y la aplicacion de auxina al estigma. Pudieron confirmar que el crecimiento partenocarpico del fruto resulto en una fructificacion y una cosecha mas regular y, por lo tanto, tiene el potencial de reducir el problema de lavado.

La induccion del crecimiento partenocarpico por aplicacion externa de hormonas vegetales u otros agentes inductores es, sin embargo, laboriosa y costosa y puede plantear problemas medioambientales debido a cantidades incrementadas de residuos qrnmicos sobre o en los frutos o el suelo. Este enfoque, por tanto, no es practico para la produccion comercial del pimiento. Exisrta, por tanto, una necesidad de soluciones geneticas que eviten las fluctuaciones dclicas en la cosecha del pimiento, pero que en su lugar garanticen un suministro continuo de frutos de pimiento de alta calidad.

La presente invencion ofrece ahora una solucion que es adecuada para el uso comercial, proporcionando una planta de pimiento partenocarpica que desarrolla frutos sin semillas, en donde la fructificacion de frutos sin semillas es independiente del proceso de polinizacion y de fecundacion y/o del tratamiento con agentes exogenos, pero es controlada por un determinante genetico que es estable y, por lo tanto, puede ser heredado de forma estable por plantas de la progenie e introgresado en variedades comerciales de pimiento.

Esta invencion tambien ofrece la ventaja de mejores opciones para controlar insectos y enfermedades. Enfermedades virales del pimiento se transmiten generalmente por pulgones. Estos insectos pueden ser controlados con el uso de medios mecanicos tales como redes de tejido. Estas medidas de control de insectos tienen, sin embargo, el inconveniente de que tambien a los insectos beneficiosos se les impide el acceso a las plantas de pimiento y, por lo tanto, no se puede producir una polinizacion mediada por insectos. La presente invencion permite ahora proteger plantas de pimiento frente a infestaciones de afidos y, por lo tanto, de las infecciones por virus transmitidos por afidos, sin interferir en la fructificacion normal y en la recoleccion de frutos y sin necesidad de plaguicidas qrnmicos, reduciendo asf los costos de control de insectos y enfermedades.

En particular, la presente invencion proporciona una planta de pimiento, que desarrolla frutos sin semillas, en el que el rasgo "sin semillas" es controlado por un determinante genetico independiente del proceso de polinizacion y fecundacion y tambien independiente del tratamiento con hormonas vegetales inductoras de partenocarpia, incluyendo auxinas, giberelinas y citoquinas, inhibidores del transporte de auxina, u otros y/u otros factores exogenos inductores de partenocarpia y/o agentes inductores de partenocarpia administrados exogenamente tales

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como sustancias reguladoras del crecimiento, ya sean naturales o sinteticas, o extractos vegetales tales como, por ejemplo, extracto de polen muerto.

En una realizacion de la invencion, se proporciona una planta de pimiento, que desarrolla frutos sin semillas, en donde el rasgo “sin semillas" es controlado por un determinante genetico e independiente del tratamiento exogeno con hormonas vegetales inductoras de partenocarpia.

En una realizacion, dicha planta de pimiento de acuerdo con la invencion desarrolla frutos sin semillas independientes de tratamiento con hormonas vegetales seleccionadas del grupo que consiste en auxinas, giberelinas y citoquinas, inhibidores del transporte de auxina, y otros.

En una realizacion de la invencion, se proporciona una planta de pimiento, que desarrolla frutos sin semillas, en donde el rasgo “sin semillas" es independiente del proceso de polinizacion y fecundacion.

En una realizacion, dicha planta de pimiento de acuerdo con la invencion desarrolla frutos sin semillas, que son al menos 95%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% sin semillas.

En una realizacion, dicha planta de pimiento de acuerdo con la invencion desarrolla frutos sin semillas, que son 100% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 40%, particularmente al menos el 50%, particularmente al menos el 60%, particularmente al menos el 70%, particularmente al menos el 80%, particularmente al menos el 90%, pero especialmente el 100% de las frutos desarrollados en dicha planta son sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 40%, particularmente al menos el 50%, particularmente al menos el 60%, particularmente al menos el 70%, particularmente al menos el 80%, particularmente al menos el 90%, pero especialmente el 100% de las frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 40% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 60% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 70% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 80% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 90% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 95% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

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En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde al menos el 99% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde el 100% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son al menos el 95%, particularmente al menos el 98%, particularmente al menos el 99% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde el 40% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son 100% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde el 60% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son 100% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde el 80% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son 100% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde el 90% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son 100% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde el 95% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son 100% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde el 98% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son 100% sin semillas.

En una realizacion, se proporciona una planta de acuerdo con la invencion y como se describe antes en esta memoria, en donde el 100% de los frutos desarrollados en dicha planta son frutos sin semillas, que son 100% sin semillas.

En particular, la presente invencion proporciona una planta pimiento de acuerdo con la invencion y como se describe en esta memoria, que desarrolla frutos sin semillas que son comestibles y de alta calidad.

En una realizacion, la presente invencion proporciona una planta de pimiento que desarrolla frutos sin semillas que son comestibles y de alta calidad, y son adecuados para ser utilizados como productos frescos, como productos cortados frescos o para el procesamiento tal como, por ejemplo, el enlatado.

En una realizacion, dicha planta de pimiento de acuerdo con la invencion es capaz de hacer fructificar frutos sin semillas en toda la planta. En particular, la fructificacion se inicia en los primeros nudos de una rama y progresa a lo largo de la longitud de toda la rama. En una realizacion, dicha planta desarrolla particularmente dos frutos por nudo en aproximadamente el 20%, en particular en aproximadamente el 40%, en particular en aproximadamente el 60% de los nudos.

En una realizacion, dicha planta de pimiento de acuerdo con la invencion muestra fructificacion en todas las campanas, es decir, tambien en condiciones desfavorables en el contexto de las condiciones climaticas de Israel o climas equiparables.

En una realizacion, dicha planta de pimiento de acuerdo con la invencion desarrolla frutos de aspecto normal, que cumplen con las normas de calidad comercial tal como se define, por ejemplo, en los Normas para Calidad de Pimientos de los Estados Unidos (USDA, Agricultural Marketing Service, Fruit and Vegetable Programs, Fresh Products Branch).

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Todavfa en otro aspecto de la invencion, la planta de acuerdo con la invencion y tal como se describe antes en esta memoria porta frutos que, en la madurez, pesan mas de 2 gramos o son mas largos que 1 cm y tienen un diametro de mas de 0,5 cm, cuando dicha planta es cultivada bajo condiciones de crecimiento generalmente utilizadas por los cultivadores de la practica regular de cultivo, en campo abierto o en cultivo protegido.

La planta de pimiento de acuerdo con la invencion y tal como se describe antes en esta memoria puede desarrollar un pimiento dulce incluyendo un pimiento de tipo dolce, un pimiento campana, un pimiento rectangular grande, un pimiento conico, un pimiento largo conico o un pimiento de tipo blocky. El fruto de dicha planta en la madurez puede ser siempre verde, un fruto amarillo, naranja, marfil, marron, purpura o rojo.

La planta de acuerdo con la invencion puede ser una planta de chile picante, p. ej., un pimiento ligeramente picante utilizado para el mercado en fresco y para procesamiento, incluido el pimiento largo, en forma de corazon, de pulpa fina tipo Ancho y el pimiento largo, de extremos romos, de pulpa fina de tipo Tuscan, el fruto de pimiento Chile ligeramente mas picante con un grosor medio de la pulpa, y un pimiento picante utilizado tanto en el mercado de productos frescos como de procesamiento, incluido el Jalapeno largo, de pulpa gruesa cilindrica, el Serrano pequeno, delgado, ahusado y el pimiento Cayenne de pulpa fina y de forma irregular.

La planta de acuerdo con la invencion y tal como se describe antes en esta memoria puede ser endogamica, dihaploide o hnbrida y/o macho esteril.

En una realizacion, dicha planta de pimiento de acuerdo con la invencion y tal como se describe en esta memoria es macho esteril.

En una realizacion, se proporciona una planta de pimiento, particularmente una planta de pimiento sin semillas de acuerdo con la invencion y tal como se describe en esta memoria, que desarrolla frutos de pimiento que son pigmentados de color rojo en la fase de madurez y pigmentados de color verde en la fase de pre-madurez (sin madurar).

En una realizacion de la invencion, dicho frutos de pimiento en la madurez tienen un sabor muy dulce con un Brix entre aproximadamente 7° y aproximadamente 14°, en particular entre aproximadamente 7,5° y aproximadamente 12°, en particular entre aproximadamente 8° y aproximadamente 11°.

En una realizacion de la invencion, dichos frutos de pimiento tienen una forma similar a conica, es decir, entre campana y conica clasica y un tamano de entre aproximadamente 2 y 4 cm por aproximadamente 3 a 4 crn de diametro.

En una realizacion, se proporciona una planta de pimiento, particularmente una planta de pimiento sin semillas de acuerdo con la invencion y tal como se describe en esta memoria, que desarrolla un fruto de pimiento que esta pigmentado de color rojo en la fase de madurez y pigmentados de color verde oscuro en la fase de pre-madurez (sin madurar); tiene un sabor muy dulce con un Brix entre aproximadamente 7° y aproximadamente 14°, en particular entre aproximadamente 7,5° y aproximadamente 12°, en particular entre aproximadamente 8° y aproximadamente 11°; tiene una forma similar a conica, es decir, entre campana y conica clasico y un tamano entre aproximadamente 2 y 4 cm por aproximadamente 3 a 4 cm de diametro.

En una realizacion, la planta de pimiento de acuerdo con la invencion y tal como se describe en esta memoria contiene un rasgo “sin semillas”, que se puede obtener a partir de una planta de pimiento hnbrido seleccionado del grupo de hnbridos que consisten en Capsicum annuum AR07-F1-56-b; Capsicum annuum AR07-F1-87-b; Capsicum annuum AR07-F1-166-b; Capsicum annuum AR07-F1-171-X; y Capsicum annuum AR07-F1-172-X. Semillas para el cultivo de estas plantas hnbridas han sido depositadas ante la NCIMb, Aberdeen AB21 9YA, Escocia, Reino Unido el 26 de mayo de 2008, bajo el numero de acceso NCIMB 41558, NClMB 41559, NCIMB 41560, NCIMB 41561 y NCIMB 41562, respectivamente.

En una realizacion de la invencion, el rasgo "sin semillas" o una planta que comprende dicho rasgo se puede obtener a partir de cualquiera de las lmeas hnbridas cultivadas a partir de las semillas depositadas por el desarrollo de la progenie F2 de dicho hnbrido. En particular, el rasgo "sin semillas" o una planta que comprende dicho rasgo se puede obtener a partir de cualquiera de las lmeas hnbridas depositados i) mediante germinacion de semillas de dichas lmeas y hacer crecer una, planta fertil y madura a partir de la misma; ii) mediante induccion de la auto- polinizacion de dicha planta desarrollada bajo (i), desarrollo de frutos y recoleccion de las semillas fertiles de los

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mismos, y iii) cultivo de plantas de las semillas recolectadas bajo ii) y la seleccion de plantas que desarrollan frutos sin semillas.

En una realizacion, la invencion se refiere a material vegetal que se puede obtener a partir de una planta de acuerdo con la invencion y tal como se describe en esta memoria antes de incluir, pero sin limitarse a los mismos, hojas, tallos, rafces, flores o partes de flores, frutos, polen, celulas huevo, zigotos , semillas, esquejes, callos o cultivos de tejidos, o cualquier otra parte o producto de la planta que todavfa exhiba el fenotipo sin semillas de acuerdo con la invencion, particularmente cuando se cultiva en una planta.

La invencion se refiere, ademas, a partes de las plantas que se pueden obtener a partir de una planta de acuerdo con la invencion y tal como se describe en esta memoria antes de incluir, pero sin limitarse a los mismos, semillas de plantas, organos de plantas tales como, por ejemplo, una rafz, tallo, hoja, brote de flor, o embrion, etc, ovulos, microesporas de polen, celulas vegetales, tejido vegetal, cultivos de celulas vegetales tales como, por ejemplo, protoplastos, celulas de cultivo celular, celulas en tejidos vegetales, polen, tubos de polen, ovulos, sacos embrionarios, zigotos y embriones en diversos etapas de desarrollo, etc; que todavfa exhiben el fenotipo sin semillas de acuerdo con la invencion, particularmente cuando se cultiva en una planta.

La invencion se refiere, ademas, a un metodo agronomico de la produccion de frutos sin semillas de pimiento, que comprende las etapas de

i) proporcionar una planta de pimiento de acuerdo con la invencion y tal como se caracteriza antes en esta memoria;

ii) multiplicar/propagar dicha planta de pimiento;

iii) permitir que la planta desarrolle frutos de pimiento sin semillas; y

iv) recolectar dichos frutos de pimiento.

En una realizacion de la invencion, la multiplicacion o propagacion de la planta de pimiento se realiza por propagacion vegetativa.

En una realizacion, la semilla hnbrida utilizada en dicho metodo de acuerdo con la invencion es la semilla hnbrida, que se puede obtener a partir de una planta de pimiento hnbrido seleccionada del grupo de hnbridos que consisten en Capsicum annuum AR07-F1-56-b; Capsicum annuum AR07-F1-87-b; Capsicum annuum AR07-F1-166-b; Capsicum annuum AR07-F1-171-X; y Capsicum annuum AR07-F1-172-X, que se desarrollan a partir de semillas depositadas ante el NCIMB, Aberdeen AB2l 9YA, Escocia, Reino Unido el 26 de mayo de 2008, bajo los numeros de acceso NCIMB 41558, NCIMB 41559, NClMB 41560, NCIMB 41561 y NCIMB 41562, respectivamente.

Breve Descripcion de las Figuras

Figura 1: Planta SLP en el invernadero, pueblo Netiv Haasara Israel. La variedad tipo “one bite” "AR06-F3-

255-1". Esta variedad se utilizo como fuente de SLP en los hnbridos depositados.

Figura 2: Frutos de la variedad SLP Yellow blocky "SD07-3-5", como resultado del hnbrido entre "AR06-F3-

255-1" y una planta F2 de una variedad de pimiento yellow blocky.

Figura 3: Frutos de la variedad SLP Red conic "SD07-2-77", como resultado del hnbrido entre "AR06-F3-255-

1" y una planta F2 de un variedad de pimiento rojo tipo Kapya.

Definiciones

Los terminos y expresiones tecnicos utilizados en el ambito de esta solicitud se dan generalmente con el significado general aplicado a ellos en la tecnica pertinente de cna y cultivo de plantas si no se indica lo contrario en esta memoria en lo que sigue.

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Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", y "el", “la” incluyen referentes en plural, a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una o mas plantas, y la referencia a "una celula" incluye mezclas de celulas, tejidos y similares.

"Partenocarpia", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la produccion de frutos sin fecundacion y permite obtener frutos sin semillas. La partenocarpia es favorecida por ciertas condiciones ambientales tales como temperaturas diurnas o nocturnas altas o bajas, un bajo nivel de luz y alta humedad. La partenocarpia puede producirse de forma natural o puede inducirse artificialmente. La partenocarpia natural es producida por causas (epi)geneticas y puede ser obligatoria u opcional, en otras palabras, dependiendo de las condiciones medioambientales.

"Fruto de pimiento sin semillas", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un fruto de pimiento obtenido independientemente del proceso de polinizacion y/o fecundacion, y/o independientemente del tratamiento con hormonas vegetales inductoras de partenocarpia y/u otros factores exogenos inductores de partenocarpia y/o agentes inductores de partenocarpia exogenamente administrados.

Una fruto de pimiento sin semillas que es "XX%" sin semillas, se refiere a un fruto en el que solo "100 - XX%" de los ovarios presentes en dicha fruto se desarrollan en semillas. Por ejemplo, un fruto de pimiento sin semillas que es "95%" sin semillas se refiere a un fruto que solo el "100 - 95%" de los ovarios presentes en dicha fruto, es decir, el 5% de los ovarios se desarrollan en semillas.

Una "planta de pimiento sin semillas", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una planta de pimiento que desarrolla un fruto de pimiento sin semillas tal como se define en esta memoria, incluyendo una planta de pimiento que solamente "100 - XX%" de los frutos presentes en dicha planta de pimiento son sin semillas, en especial 95% y hasta 100% sin semillas.

Tal como se utiliza en esta memoria, "fruto comestible" y "fruto comestible fresco" se refieren a frutos recogidos de la planta que son adecuados para el consumo humano.

Tal como se utiliza en esta memoria, "factores o agentes exogenos" se refieren a factores o agentes que tras la aplicacion exogena a la planta, particularmente a las partes reproductoras de la planta tales como, por ejemplo, el estigma, son capaces de inducir una partenocarpia artificial en la planta tratada. Tales "factores o agentes exogenos" pueden ser, por ejemplo, extracto de polen muerto, sustancias reguladoras del crecimiento, ya sea naturales o sinteticas tales como hormonas vegetales que incluyen auxinas, giberelinas y citoquinas, inhibidores del transporte de auxina, u otros.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "rasgo" se refiere a la caractenstica o fenotipo, p. ej., el color del fruto maduro o una resistencia a las enfermedades tales como la resistencia a TSWV. Un rasgo puede ser heredado de una manera dominante o recesiva, o de manera parcial o incompleta dominante. Un rasgo puede ser monogenico (es decir, determinado por un solo locus) o poligenico (es decir, determinado por mas de un locus) o tambien puede resultar de la interaccion mutua entre los genes o la interaccion de uno o mas genes con el medio ambiente. Un rasgo dominante resulta en una manifestacion fenotfpica completa en el estado homocigoto o heterocigoto; un rasgo recesivo se manifiesta solo cuando estan presentes en estado homocigoto.

El termino "pericarpio" tal como se conoce en la tecnica se refiere a la pared de un ovario madurado. Espedficamente, el pericarpio del fruto del pimiento se refiere a la pared del fruto, que es la parte coloreada y comestible del fruto del pimiento. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "pericarpio grueso" se refiere a una anchura del pericarpio de al menos 5 mm, preferiblemente de al menos 8 mm. Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "autofecundacion" se refiere a una auto-polinizacion controlada de una planta, es decir, el contacto del polen y el ovulo producidos por la misma planta. El termino "cruce" se refiere a una polinizacion cruzada controlada, es decir, el contacto del polen y el ovulo cada uno de ellos producidos por una planta diferente.

La expresion "vigor de la planta" se utiliza en esta memoria en su sentido mas amplio, refiriendose a la resistencia general de la planta.

Tal como se utiliza en esta memoria, una "cosecha de frutos" se refiere a la cosecha de una sola planta o, preferiblemente, a la cosecha de frutos obtenidos a partir de plantas de pimiento cultivadas a escala comercial.

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La expresion "lmea o variedad de pimiento comercial", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una planta de pimiento que esta disponible comercialmente tal como, por ejemplo, la variedad de pimiento con un fruto dulce, comestible con un pericarpio grueso. Tfpicamente, la variedad de pimiento comercial puede tener fruto con una forma del fruto blocky, de tipo California. Ejemplos de variedades de pimiento comerciales incluyen, pero sin limitarse a, por ejemplo, cultivares comerciales de pimiento dulce del tipo "bell" (campana) tal como Cannon (Zeraim Gedera); Vergasa (Syngenta Seeds); Bardenas (Syngenta Seeds), Roxy (Syngenta Seeds), Yolo Wonder (Syngenta Seeds), etc.

"Baja temperatura" con respecto al crecimiento de la planta de pimiento de acuerdo con la presente invencion se refiere a la temperatura en el intervalo de 10o-12°C y por debajo, dependiendo de la variedad utilizada.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "alelo o alelos" significa cualquiera de una o mas formas alternativas o formas variantes de diversas unidades geneticas identicas o asociadas con las diferentes formas de un gen o de cualquier tipo de elemento genetico identificable, todos cuyos alelos se refieren a al menos un rasgo o caractenstica. En una celula diploide, los dos alelos de un gen dado ocupan correspondientes loci en un par de cromosomas homologos y son, por lo tanto, alternativos en la herencia.

Tales formas alternativas o variantes pueden ser el resultado de un solo polimorfismo de nucleotidos, inserciones, inversiones, translocaciones o deleciones, o la consecuencia de la regulacion genica causada, por ejemplo, por modificacion qmmica o estructural, regulacion de la transcripcion o modificacion/regulacion post-traduccion.

En algunos casos puede ser mas preciso referirse a "haplotipo" (es decir, un haplotipo es una combinacion de alelos de varios o multiples loci enlazados (en el mismo cromosoma) que se transmiten juntos) en lugar de "alelo", sin embargo, en esos casos, el termino "alelo" debe entenderse que comprende el termino "haplotipo". Los alelos se consideran identicos cuando expresan un fenotipo similar, pero en algunos casos puede suceder que diferentes alelos tambien expresen un fenotipo similar. Son posibles diferencias en la secuencia, pero de menor importancia en tanto no influyan en el fenotipo.

Un alelo asociado con un rasgo cuantitativo puede comprender formas alternativas o variantes de diversas unidades geneticas incluyendo las que son identicas o estan asociadas a un solo gen o a multiples genes o a sus productos o incluso una disrupcion del gen o controlado por un factor genetico que contribuye en el fenotipo representado por dicho QTL.

Un "determinante genetico" se define aqrn como una secuencia de nucleotidos, preferiblemente una secuencia de ADN que puede comprender secuencias genomicas con diversas funciones, tales como genes y regiones de elementos reguladores. Determinante genetico tambien puede referirse a un constructo de nucleotidos y puede estar comprendido en un vector. Alternativamente, un determinante genetico puede ser transferido de una planta a otra por recombinacion cromosomica despues de cruzar dichas plantas. Un determinante genetico puede comprender, en principio, material genetico procedente de una o mas especies.

En particular, determinante genetico, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un solo gen o a multiples genes, un QTL o un haplotipo, que determina la expresion del fenotipo sin semillas en una planta de pimiento.

Un "gen" se define en esta memoria como una unidad hereditaria que consiste en una secuencia de ADN que ocupa una ubicacion espedfica en un cromosoma y que contiene la instruccion genetica para una caractenstica o rasgo particular en un organismo.

Un "locus" se define en esta memoria como la posicion en un mapa genetico que ocupa un determinado gen o cualquier otro elemento genetico o factor que contribuye en un rasgo en un cromosoma de una especie dada.

Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "individuo diploide" se refiere a un individuo que tiene dos juegos de cromosomas, tfpicamente uno de cada uno de sus dos padres. Sin embargo, se entiende que en algunas realizaciones un individuo diploide puede recibir sus conjuntos de cromosomas “maternos” y “paternos” del mismo organismo solo, tal como cuando una planta se autofecunda para producir una posterior generacion de plantas.

El termino "cromosoma" se entiende que incluye, por lo que se utiliza aqrn como sinonimo de las expresiones "grupo de enlace" y/o "equivalente cromosoma del grupo de enlace", respectivamente

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Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "heterocigoto" significa una condicion genetica existente cuando diferentes alelos residen en loci correspondientes en cromosomas homologos.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "homocigoto" significa una condicion genetica existente cuando alelos identicos residen en loci correspondientes en cromosomas homologos. Homocigosis se define como ausencia de segregacion despues de la autofecundacion de una planta individual o, si es cruzada, la ausencia de segregacion en F1.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino/expresion "Idbrido", "planta hforida" y "progenie hforida" se refiere a un individuo producido a partir parentales geneticamente diferentes o distintos (p. ej., un individuo geneticamente heterocigoto o mayormente heterocigoto) (Rieger et al, 1968).

Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "hforido F1 de un solo cruce" se refiere a un Idbrido F1 producido a partir de un cruce entre dos lmeas puras.

Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "lmea endogamica " se refiere a una poblacion geneticamente homocigota o casi homocigota. Una lmea endogamica, por ejemplo, se puede derivar a traves de varios ciclos de cruces hermano/hermana o de autofecundacion o en la produccion de dihaploides. En algunas realizaciones, las lmeas endogamicas se cultivan para uno o mas rasgos fenotfpicos de interes. Un "endogamico", "individuo endogamico", o "progenie endogamica" es un individuo muestreado de una lmea endogamica.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "lmea dihaploide", se refiere a una lmea endogamica estable producida por cultivo de anteras. Algunos granos de polen (haploides) cultivados en el medio y las circunstancias espedficas pueden desarrollar plantulas que contienen n cromosomas. Estas plantulas son luego "duplicadas" y contienen cromosomas 2n. La progenie de estas plantulas se denomina "dihapioide" y son esencialmente ya no segregantes (estables).

Tal como se utiliza en esta memoria , el termino "progenie" se refiere a la o las descendencias de un cruce particular. Tfpicamente, la progenie resulta de la cna de dos individuos, aunque algunas especies (en particular algunas plantas y animales hermafroditas) pueden ser autofecundados (es decir, la misma planta actua como el donante de gametos tanto masculinos como femeninos). El o los descendientes pueden ser, por ejemplo, de F1, F2, o cualquier otra generacion posterior,

Tal como se utiliza en esta memoria, los terminos "introgresion", "introgresado" e "introgresar" se refieren al proceso mediante el cual genes, un QTL o haplotipo de una especie, variedad o cultivar se introducen en el genoma de otra especie, variedad o cultivar, por cruzamiento de esas especies. El cruce puede ser natural o artificial. El proceso puede ser completado opcionalmente por retrocruzamiento con el parental recurrente, en cuyo caso introgresion se refiere a la infiltracion de los genes de una especie en la agrupacion de genes de otra a traves de retrocruzamiento repetido de un Idbrido interespedfico con uno de sus parentales. Una introgresion tambien se puede describir como un material genetico heterologo integrado de forma estable en el genoma de una planta receptora.

"Ingeniena genetica", "transformacion" y "modificacion genetica" se utilizan todos en esta memoria como sinonimos para la transferencia de cualquier tipo de informacion genetica en el ADN de la planta diana, habitualmente, pero no exclusivamente el ADN cromosomico o genoma, de otro organismo. La ingeniena genetica es un metodo de integrar de forma estable material genetico heterologo en el genoma de una planta receptora y puede incluir un procedimiento que comprende la transformacion de celulas o tejido de una planta con un ADN recombinante que contiene un ADN heterologo que incluye una secuencia de nucleotidos extranos que codifica una variante genica o alelica de los mismos, asf como los elementos reguladores seleccionados entre aquellos que son capaces de provocar la integracion estable de ADN heterologo en celulas de plantas o tejidos y de permitir la expresion de secuencias de nucleotidos extranas en celulas vegetales o tejido vegetal.

Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "marcador genetico o molecular" se refiere a una caractenstica del genoma de un individuo (p. ej., un nucleotido o una secuencia de polinucleotidos que esta presente en el genoma de un individuo) que esta asociado con uno o mas loci de interes. En algunas realizaciones, un marcador genetico es polimorfica en una poblacion de interes, o el locus ocupado por el polimorfismo, dependiendo del contexto. Marcadores geneticos incluyen, por ejemplo, los polimorfismos de nucleotido sencillos (SNPs), indeles (es decir, inserciones/deleciones), repeticiones de secuencias simples (SSRs), polimorfismos de restriccion de longitud de fragmentos (RFLPs), ADNs polimorficos amplificados al azar (RAPDs), marcadores de secuencias polimorficas

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amplificadas escindidas (CAPS) marcadores de la Tecnolog^a de Matrices de Diversidad (DArT) y polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLPs), entre muchos otros ejemplos. Los marcadores geneticos pueden utilizarse, por ejemplo, para localizar loci geneticos que contienen alelos en un cromosoma que contribuyen a la variabilidad de los rasgos fenoffpicos. La frase "marcador genetico" tambien puede referirse a una secuencia de polinucleotidos complementaria a una secuencia genomica, tal como una secuencia de un acido nucleico utilizado como sondas.

Un marcador genetico o molecular puede estar localizado ffsicamente en una posicion en un cromosoma que esta dentro o fuera del locus genetico con el que esta asociado (es decir, es intragenico o extragenico, respectivamente). Dicho de otra manera, mientras que los marcadores geneticos se emplean ffpicamente cuando no se ha identificado la ubicacion en un cromosoma del gen o de una mutacion funcional, p. ej., dentro de un elemento de control fuera de un gen, que se corresponde con el locus de interes, y hay una muy baja tasa de recombinacion entre el marcador genetico y el locus de interes, la materia objeto aqu descrita tambien puede emplear marcadores geneticos que estan ffsicamente dentro de los ffmites de un locus genetico (p. ej., dentro de una secuencia genomica que corresponde a un gen tal como, pero no limitado a un polimorfismo dentro de un intron o un exon de un gen). En algunas realizaciones de la materia objeto descrito en esta memoria, el uno o mas marcadores geneticos comprenden entre uno y diez marcadores, y en algunas realizaciones los uno o mas marcadores geneticos comprenden mas de diez marcadores geneticos.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccion" o "RFLP" significa una variacion entre los individuos en los tamanos de los fragmentos de ADN cortados por enzimas de restriccion espedficas. Secuencias polimorficas que resultan en RFLPs se utilizan como marcadores en los mapas geneticos de ligamiento.

"Seleccion basada en marcadores" se entiende dentro del alcance de la invencion para referirse a, p. ej., el uso de marcadores geneticos para detectar uno o mas acidos nucleicos de la planta, en que el acido nucleico esta asociado con un rasgo deseado para identificar las plantas que portan genes , QTL o haplotipo de rasgos deseables (o indeseables), de modo que esas plantas se pueden utilizar (o evitar) en un programa de cna selectiva.

"Microsatelites o Marcadores SSRs (Repeticiones de secuencias simples)" se entiende dentro del alcance de la invencion para referirse a un tipo de marcador genetico que consiste en numerosas repeticiones de secuencias cortas de bases de ADN, que se encuentran en loci en todo el genoma de la planta y tienen una probabilidad de ser altamente polimorficos,

Un "polimorfismo de nucleotido unico" (SNP) es una variacion de la secuencia de ADN que ocurre cuando un solo nucleotido, A, C, G, T en el genoma (u otras secuencias compartidas como ADN mitocondrial) difiere entre un conjunto de cromosomas (pareados) de un individuo o difiere entre miembros de una especie.

"PCR (Reaccion en cadena de la polimerasa)" se entiende dentro del alcance de la invencion para aludir a un metodo para producir cantidades relativamente grandes de regiones espedficas de ADN o subconjunto(s) del genoma, haciendo posible con ello diversos analisis que se basan en esas regiones.

"Cebador de PCR" se entiende dentro del alcance de la invencion para aludir a fragmentos relativamente cortos de ADN monocatenario utilizado en la amplificacion por PCR de regiones espedficas del ADN.

"Polimorfismo" se entiende dentro del alcance de la invencion para aludir a la presencia en una poblacion de dos o mas formas diferentes de un gen, marcador genetico, o rasgo heredado o un producto genico que se puede obtener, por ejemplo, a traves de corte y empalme alternativo, metilacion del ADN, etc.

"Cultivo selectivo" se entiende dentro del alcance de la invencion para aludir a un programa de cultivo que utiliza plantas que poseen o exhiben rasgos deseables como parentales.

Planta de “ensayo” se entiende dentro del alcance de la invencion para aludir a una planta del genero Capsicum utilizada para caracterizar geneticamente un rasgo en una planta a ser sometida a ensayo. Tfpicamente, la planta a ensayar se cruza con una planta de “ensayo" y se puntua la relacion de segregacion de la caractenstica en la progenie del cruce.

"Sonda”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grupo de atomos o moleculas que es capaz de reconocer y unirse a una molecula diana espedfica o estructura celular y, por lo tanto, de permitir la deteccion de la molecula o estructura diana. En particular, "sonda" se refiere a una secuencia de ADN o ARN marcado que se puede utilizar para detectar la presencia de y cuantificar una secuencia complementaria por hibridacion molecular.

5 Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "poblacion" significa una coleccion geneticamente homogenea o heterogenea de plantas que comparten una derivacion genetica comun.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "variedad" o "cultivar" significa un grupo de plantas similares que por las caractensticas estructurales y el rendimiento pueden ser identificadas de otras variedades de la misma especie. El termino "variedad", tal como se utiliza en esta memoria, tiene un significado identico a la definicion 10 correspondiente en el Convenio Internacional para la Proteccion de las Obtenciones Vegetales (tratado UPOV) de 2 de diciembre de 1961, revisado en Ginebra el 10 de noviembre de 1972, el 23 de octubre de 1978 y el 19 de marzo de 1991. Por lo tanto, "variedad” significa un conjunto de plantas de un solo taxon botanico del rango mas bajo conocido que, con independencia de que se cumplan plenamente las condiciones para la concesion del derecho de obtentor, pueda i) definirse por la expresion de los caracteres resultantes de un genotipo o combinacion de 15 genotipos dados, ii) distinguirse de cualquier otro conjunto de plantas por la expresion de al menos uno de dichos caracteres y iii) considerarse como una unidad, con respecto a su aptitud a propagarse sin alteracion.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "pimiento" o "Capsicum" significa cualquier especie, variedad, cultivar o poblacion del genero Capsicum.

Una planta "Capsicum cultivada" se entiende dentro del alcance de la invencion para aludir a una planta que ya no 20 esta en el estado natural, pero que ha sido desarrollada por el cuidado humano y para el uso y/o consumo humano.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "cultivo" y variantes gramaticales del mismo, se refiere a cualquier proceso que genera un individuo de progenie. Los cultivos pueden ser sexua!es o asexuales, o cualquier combinacion de los mismos. Ejemplos de tipos no limitativos de cultivos incluyen cruces, autofecundaciones, generacion derivada de haploides duplicada y combinaciones de los mismos.

25 Tal como se utiliza en esta memoria, la frase "poblacion de cultivo establecida" se refiere a un conjunto de potenciales participates en el cultivo producidos por y/o utilizados como parentales en un programa de cultivo; p. ej., un programa de cultivo comercial. Los miembros de la poblacion de cultivo establecido estan bien caracterizados genetica y/o fenotfpicamente. Por ejemplo, varios rasgos fenotfpicos de interes podnan haber sido evaluados, p. ej., en diferentes condiciones ambientales, en multiples lugares, y/o en momentos diferentes. Alternativamente, o 30 ademas, podnan haber sido identificados uno o mas loci geneticos asociados con la expresion de los rasgos fenotfpicos y uno o mas de los miembros de la poblacion de cultivo podna haber sido genotipado con respecto a uno o mas loci geneticos, asf como con respecto a uno o mas marcadores geneticos que estan asociados con el uno o mas loci geneticos.

"Retrocruzamiento" se entiende dentro del alcance de la invencion para referirse a un proceso en el que una 35 progenie hnbrida se cruza varias veces de nuevo a uno de los parentales. En retrocruzamientos sucesivos se pueden utilizar diferentes parentales recurrentes.

La siguiente descripcion se proporciona, junto con todos los capftulos de la presente invencion, a fin de permitir a cualquier persona experta en la tecnica hacer uso de dicha invencion. Diversas modificaciones, sin embargo, resultaran evidentes para los expertos en la tecnica, ya que los principios genericos de la presente invencion se han 40 definido espedficamente para proporcionar un pimiento sin semilla esteril macho con caractensticas unicas tal como se expone a continuacion.

En el proceso de la produccion de semillas hnbridas endogamos esteriles machos se utilizan habitualmente como la lmea parental femenina con el fin de aumentar la eficiencia de la produccion de hnbridos. Plantas de pimiento esteriles crecen muy altas y muy rapidamente. En la parte superior de la planta, fructificaron muy pequenos frutos 45 sin semillas, deformados. La pulverizacion de hormonas sobre este tipo de plantas no ha tenido exito en la induccion de una fructificacion "normal". Sin embargo, como en muchos rasgos del pimiento existe una variacion genetica a este fenomeno. Lmeas esteriles machos difieren en la cantidad y calidad de sus pimientos sin semillas.

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Dentro del alcance de la presente invencion se descubrieron lmeas de pimiento que eran capaces de dar frutos sin semillas de alto rendimiento cualitativo, particularmente frutos que no mostraron deformaciones. Deformacion en este contexto significa que un fruto muestra una forma irregular y no usual, p. ej., no es uniforme, no es simetrico o es irregular o no muestra segmentaciones.

El tamano de un fruto SLP puede ser menor que el de un fruto normal, portador de semillas, si se compara en un fondo genetico por lo demas identico. El hermano portador de semillas puede ser hasta 5 veces mayor que su pariente SLP. Sin embargo, es posible mediante el cruce en diferentes fondos geneticos compensar este tamano mas pequeno y obtener frutos de pimiento sin semillas que tengan el mismo o esencialmente el mismo tamano que un tamano comercial del fruto de pimiento dulce.

En particular, el fruto SLP en la madurez puede pesar entre 2 gramos y 10 gramos, particularmente entre 2,5 g y 5 g, o tiene un tamano de 1 cm a 4 cm, particularmente de 1,5 cm a 3 cm por 0,5 cm a 5 cm, particularmente por 2 cm a 4 cm de diametro.

El rasgo "sin semillas" esta bajo el control de un determinante genetico y se expresa de forma permanente en las plantas de pimiento de acuerdo con la presente invencion independientemente del tratamiento artificial con agentes inductores tales como, por ejemplo, hormonas vegetales o extractos vegetales, que se utilizan comunmente en el cultivo del pimiento protegido en el invernadero para inducir artificialmente la partenocarpia en el pimiento. La expresion del rasgo "sin semillas" en las plantas de acuerdo con la invencion es tambien en gran medida independiente de otros factores exogenos, incluyendo el proceso de polinizacion o la fecundacion, las condiciones climaticas o variabilidades estacionales.

Como resultado, las plantas de acuerdo con la presente invencion muestran una excelente fructificacion en todas las estaciones, es decir, tambien en condiciones de crecimiento desfavorables, como las presentes en la temporada de invierno en la region de Arava en Israel (clima mediterraneo), en donde la temperatura media promedio esta en el intervalo de entre 4°C y 14°C, en particular entre 6°C y 12°C.

En una realizacion de la invencion, se desarrollo una planta de pimiento sin semillas esteril (SLP) masculina que se caracteriza por su capacidad de dar frutos sin semillas en toda la planta. Los frutos son de un tamano pequeno de modo que, por lo general, se pueden consumir en un solo bocado.

En particular, la lmea aislada de planta de pimiento sin semillas esteril masculina exhibe rasgos caractensticos que incluyen los seleccionados del grupo formado por (i) excelente fructificacion en todas las estaciones; (ii) planta fuerte y resistente; (iii) debil dominancia apical en comparacion con pimientos no esteriles que resultan en muchas ramas laterales y ramificaciones de las ramas; (iv) tendencia a dar dos frutos por nudo en aproximadamente el 20% de los nudos; (v) tamano y forma bastante uniformes; (vi) intervalos cortos entre nudos, aprox. de 10 cm de largo; (vii), la produccion de frutos comienza a partir de los primeros nudos y progresa a lo largo de la longitud de las ramas, de manera similar a las plantas no esteriles; y (viii) la flor tiene pequenas anteras sin polen.

Ademas, los frutos de pimiento que crecen en dicha lmea aislada de plantas exhibe rasgos caractensticos que incluyen los seleccionados del grupo que consiste en (i) frutos sin semillas; (ii) pigmentacion roja en frutos maduros y verde en frutos pre-maduros (inmaduros); (iii) forma tipo conica, es decir, entre campana y conica clasica; (iv) tamano entre aproximadamente 2 y 4 cm de largo por aproximadamente 3 a 4 cm de diametro; y (v) sabor muy dulce (Brix aproximadamente 8 a aproximadamente 11°).

La presente invencion proporciona evidencia experimental que sugiere que el rasgo "sin semillas" mostrado por las plantas de esta invencion esta controlado geneticamente. En particular, parece que el rasgo “sin semillas" es multigenico y facultativo. Cuando estas plantas y variedades son polinizadas, ya sea por insectos o manualmente, la fructificacion y el desarrollo se producen normalmente. Sin embargo, bajo condiciones en las que la polinizacion es diffcil o no se produce, estas plantas y variedades, no obstante, dan fruto que se desarrolla con normalidad, mientras que las plantas y variedades convencionales de la tecnica anterior podnan no dar fruto en absoluto, o danan fruto, pero a menudo se deforma y/o inmediatamente comienza a pudrirse desde el extremo de la flor, y el desarrollo de la fruto es pobre en el mejor de los casos, siendo finalmente superado por la putrefaccion que prosigue desde el extremo de la flor.

El rasgo “sin semillas” puede ser introgresado en cualquier otra planta o lmea de planta del genero Capsicum, mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en el cultivo, la conversion y la transformacion del rasgo

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unico. En particular, el rasgo “sin semillas” puede ser introgresado en lmeas y variedades de pimiento comerciales por metodos conocidos por los expertos en la tecnica del cultivo de plantas.

Pimientos comerciales son generalmente hnbridos producidos por el cruce de dos lmeas parentales (endogamias). El desarrollo de hnbridos requiere, en general, el desarrollo de lmeas endogamicas homocigoticas, el cruce de estas lmeas y la evaluacion de los cruces.

El cultivo de seleccion y metodos de cultivo de seleccion recurrentes se utilizan para desarrollar las lmeas endogamicas de las poblaciones de cultivo. Los programas de endogamia combinan las bases geneticas a partir de dos o mas lmeas endogamicas o diversas otras fuentes de germoplasma en agrupaciones de cultivo a partir de la que las nuevas lmeas endogamicas se desarrollan por autofecundacion y seleccion de fenotipos deseados. Las nuevas lmeas endogamicas se cruzan con otras lmeas endogamicas y los hnbridos de estos cruces son evaluados para determinar cuales de ellos tiene un potencial comercial. El cultivo de plantas y el desarrollo de hnbridos son procesos costosos y laboriosos.

El cultivo de seleccion comienza con el cruce de dos genotipos, cada uno de los cuales puede tener una o mas caractensticas deseables que faltan en la otra o que complementan a la otra. Si los dos parentales originales no proporcionan todas las caractensticas deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la poblacion de cultivo. En el metodo de seleccion, las plantas superiores se autofecundan y se seleccionan en generaciones sucesivas. En las generaciones venideras la condicion heterocigotica da paso a lmeas homogeneas como resultado de la autopolinizacion y seleccion. Tfpicamente, en el metodo de seleccion del cultivo se ponen en practica cinco o mas generaciones de autofecundacion y seleccion: F1 a F2; F3 a F4; F4 a F5, etc. Resulta un hnbrido de un solo cruce del cruce de dos lmeas endogamicas, cada una de las cuales tiene un genotipo que complementa el genotipo de la otra. La progenie hnbrida de la primera generacion se designa F1. En el desarrollo de hnbridos comerciales se buscan solamente las plantas hnbridas F1. Hfbridos F1 preferidos son mas vigorosos que sus parentales endogamicos. Este rendimiento tnbrido (vigor tnbrido o heterosis), se puede manifestar en muchos rasgos poligenicos, incluyendo el aumento del crecimiento vegetativo y aumento del rendimiento. El cultivo en pimientos se puede acelerar mediante el uso de haploides dobles obtenidos por cultivo de anteras. Esta tecnica ofrece la posibilidad de asegurar el proceso mediante la produccion de lmeas puras en un penodo de tiempo mas corto que el proceso regular del cultivo de seleccion. Plantas del genero Capsicum pueden ser facilmente polinizadas de forma cruzada. Un rasgo tambien se transfiere facilmente de una planta de pimiento a otra planta, incluyendo plantas de pimiento de diferentes tipos usando tecnicas convencionales de cultivo, por ejemplo, para obtener lmeas comerciales adicionales. La introgresion de un rasgo en la lmea de elite se consigue, por ejemplo, por el cultivo de seleccion recurrente, por ejemplo, por retrocruzamiento. En este caso, la lmea de elite (parental recurrente) se cruza primero a un donante endogamico (el parental no recurrente) que porta el rasgo, particularmente el rasgo "sin semillas" de acuerdo con la presente invencion. La progenie de este cruce se aparea entonces de nuevo con el progenitor recurrente seguido por la seleccion en la progenie resultante para el rasgo. Despues de tres, preferiblemente cuatro, mas preferiblemente cinco o mas generaciones de retrocruzamientos con el parental recurrente con la seleccion para el rasgo, particularmente el rasgo "sin semillas", de acuerdo con la presente invencion, la progenie es heterocigotica para el locus que alberga la resistencia, pero es como el parental recurrente para la mayona o casi todos los otros genes (vease, por ejemplo, Poehlman y Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4a Ed, 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique 360-376. La seleccion para el rasgo se lleva a cabo despues de cada uno de los cruces. La esterilidad masculina esta disponible en la pimiento. En particular, la esterilidad masculina genetica es ampliamente utilizada en lmeas comerciales, p. ej., lmeas de pimiento dulce (vease, por ejemplo Daskatoff S. (1972), mientras que en el pimiento de chile picante tambien se utiliza la esterilidad masculina citoplasmatica (Peterson, 1958). Mutantes de pimiento esteriles masculinos y su utilizacion en el cultivo de heterosis. Eucarpia, meetings on genetic and breedings. Turin 1971, 205210).

El pimiento es una especie auto-polinada, por lo que normalmente una planta puede ser facilmente reconocida como sin semillas solo si tambien es esteril. En teona, estos 2 fenomenos no estan interconectados entre sf, en el sentido de estar vinculados geneticamente, pero en la practica, la partenocarpia pueden ser facilmente identificada cuando la planta tiene las 2 rasgos juntos. El uso de plantas fertiles requerina cortar y abrir el fruto para determinar si las semillas estan presentes o no.

En un aspecto de la invencion, las plantas que expresan el rasgo “sin semillas” y, por lo tanto, desarrollan frutos de pimiento sin semillas, pueden ser identificadas y seleccionadas mediante una simple observacion visual de las flores y la identificacion de individuos esteriles masculinos. Despues de distinguir las plantas esteriles, estas se vuelven a plantar y se estima para su capacidad de dar frutos sin semillas. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante el examen de la planta por las siguientes caractensticas fenotfpicas:

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1. La fructificacion se ha iniciado en los primeros nudos, como en plantas fertiles.

2. La fructificacion se produce independientemente del proceso de polinizacion y/o fecundacion en todas las estaciones del ano, cuando tambien fructifican normalmente plantas fertiles.

3. La fructificacion se produce independientemente del proceso de polinizacion y/o fecundacion en condiciones desfavorables.

En la alternativa, se puede emplear el cultivo asistido por marcadores para identificar a los individuos en donde loci relevantes para la invencion y/o loci marcadores flanqueantes o loci marcadores geneticamente vinculados a los mismos tienen genotipos favorables, particularmente genotipos homocigotos favorables.

Por lo tanto, los marcadores se pueden desarrollar mediante metodos conocidos por la persona experta y se pueden utilizar para identificar y seleccionar plantas de acuerdo con la presente invencion y tal como se describe antes en esta memoria, con un alelo o un conjunto de alelos de locus o loci que representan el rasgo sin semillas.

Existen varios metodos o enfoques disponibles, conocidos por los expertos en la tecnica, que pueden ser utilizados para identificar y/o desarrollar marcadores en desequilibrio de vinculacion y/o vinculados a y/o localizados en la region de genoma donde residen el gen o los genes, QTL o haplotipo para el rasgo sin semillas, asf como marcadores que representan las mutaciones causales reales subyacentes el rasgo sin semillas. Sin ser totalmente exhaustivos algunos enfoques, conocidos por los expertos en la tecnica, incluyen:

- enfoque de genes candidatos; secuencias de genes candidatos o secuencias vinculadas a genes candidatos se pueden rastrear en cuanto a polimorfismo asociado y/o geneticamente relacionado con el rasgo de interes y una vez asociados y/o geneticamente vinculados esos polimorfismos se pueden utilizar en aplicaciones de cultivo asistido por marcadores.

- enfoque de analisis segregante a granel (BSA) (Michelmore et al., 1991); despues de fenotipar una poblacion, las plantas (por lo general entre 5-40) con fenotipos contrastantes del rasgo de interes se agrupan, con los grupos que forman masas que representan los extremos terminales fenotfpicos de la poblacion. A continuacion, las masas se ensayan para determinar la presencia o ausencia de alelos de marcadores moleculares. Puesto que se supone que las masas contrastan para los alelos que contribuyen a los extremos terminales fenotfpicos, cualquier polimorfo marcador entre las masas es un candidato marcador geneticamente vinculado, p. ej., vinculado a la caractenstica de interes y puede utilizarse en aplicaciones de cultivo asistidas por marcadores o, alternativamente, se puede utilizar para mapear geneticamente el rasgo de interes.

- enfoque de mapeo de QTL o mapeo de asociacion: una poblacion de un panel de plantas puede ser caracterizado para el rasgo de interes (fenotipado) y genotipado utilizando marcadores de preferencia muy bien distribuidos por todo el genoma. Despues de los datos de genotipo y de los datos fenotipo obtenidos se buscaron patrones de asociacion entre los datos de genotipo y los datos de fenotipo mediante analisis de datos de genotipo y de fenotipo utilizando las herramientas mapeo de QTL y/o el software de mapeo de asociacion. Marcador asociado con el rasgo de interes se puede utilizar posteriormente en aplicaciones de cultivo asistido por marcadores.

Despues del mapeo de QTL y/o el mapeo de asociacion, o despues del mapeo genetico de los marcadores vinculados con el rasgo de interes, otros marcadores o genes que se sabe que se encuentran en la misma region genomica (y por lo tanto estan vinculados geneticamente) pueden ser identificados y utilizados para desarrollar marcadores adicionales en la region de interes y/o se pueden utilizar en aplicaciones de cultivo asistidas por marcadores.

Marcadores o secuencias de marcadores geneticamente vinculados tambien se pueden utilizar para aislar otras secuencias de acidos nucleicos que flanquean los marcadores por enfoques de hibridacion, PCR y/o ‘in-silico’. Esas secuencias de acidos nucleicos flanqueantes se pueden utilizar para buscar nuevos y/o polimorfismos adicionales asociados y/o geneticamente vinculados con el rasgo de interes que tambien se puede utilizar en poblaciones de cultivo asistido por marcadores.

Secuencias de acido nucleico asociadas y/o geneticamente vinculadas con el rasgo de interes tambien se pueden utilizar en enfoques de genoma comparativo y/o mapeo de sintema para identificar region o regiones homologas y secuencias homologas y/o ortologas y/o genes candidatos.

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La seleccion basada en marcadores ya puede utilizarse en las primeras fases del desarrollo endogamico, a menudo en combinacion con los metodos de cribado que se basan en gran medida en las caractensticas fenotipicas que se pueden determinar visualmente y estan relacionadas con el rasgo de interes, es decir, el rasgo “sin semillas” y, ademas, a los mdices de rendimiento clave tales como, por ejemplo, vigor de la planta, longitud de entrenudos, ramificaciones, resistencia a insectos, resistencias a virus tales como TMV (virus del mosaico del tabaco) y TSWV (virus del bronceado del tomate), etc., que son relevantes de la idoneidad de la planta para ser utilizado en la produccion de hnbridos comerciales. La seleccion tambien se puede basar en los marcadores moleculares, que pueden o no estar vinculados con los rasgos de interes.

En particular la seleccion, basada en marcadores puede ser aplicada en combinacion con o a continuacion de una seleccion fenotipica para identificar a aquellos individuos en donde todos los loci relevantes para la invencion tienen genotipos favorables homocigotos o heterocigotos.

Existen varios tipos de marcadores moleculares que se pueden utilizar en la seleccion basada en marcadores, incluyendo, pero no limitados a, polimorfismos de restriccion de longitud de fragmentos (RFLP), ADN polimorfico amplificado al azar (RAPD), polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion amplificados (AFLP), repeticiones de secuencia sencilla (SSR) y polimorfismos de nucleotido unico SNPs.

RFLP implica el uso de enzimas de restriccion para cortar el ADN cromosomico en sitios espedficos de restriccion cortos, los polimorfismos son el resultado de duplicaciones o deleciones entre los sitios o las mutaciones en los sitios de restriccion.

RAPD utiliza la amplificacion mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de baja rigurosidad con cebadores individuales de secuencia arbitraria para generar matrices espedficas de la cepa de fragmentos de ADN anonimo. El metodo requiere solo pequenas muestras de ADN y analiza un gran numero de loci polimorficos.

AFLP requiere la digestion del ADN celular con una enzima o enzimas de restriccion antes de utilizar PCR y nucleotidos selectivos en los cebadores para amplificar fragmentos espedficos. Con este metodo, utilizando tecnicas de electroforesis para visualizar los fragmentos obtenidos, se pueden medir hasta 100 loci polimorficos por combinacion de cebadores y solo se requiere una pequena muestra de ADN para cada ensayo.

El analisis SSR esta basado en secuencias de microsatelites de ADN (de repeticion corta) que son ampliamente dispersadas por todo el genoma de los eucariotas, que se amplifican selectivamente para detectar variaciones en repeticiones de secuencias simples. Solo se requieren pequenas muestras de ADN para un analisis SSR.

SNPs utilizan ensayos de extension por PCR que recogen eficientemente mutaciones puntuales. El procedimiento requiere poco ADN por muestra. Uno o una combinacion de los metodos anteriores se puede utilizar en un programa de cultivo de seleccion tfpico a base de marcadores.

Actualmente, el metodo mas preferido para conseguir la amplificacion de fragmentos de nucleotidos que abarcan una region polimorfica del genoma de la planta emplea la reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR") (Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 51:263 273 (1986)), utilizando pares de cebadores que implican un cebador directo y un cebador inverso que son capaces de hibridarse a las secuencias proximales que definen un polimorfismo en su forma de doble cadena.

Basicamente, el metodo de la amplificacion por PCR implica el uso de un cebador o un par de cebadores que comprenden dos secuencias cortas de cebadores de oligonucleotidos que flanquean el segmento de ADN a amplificar o las secuencias de adaptador ligadas a dicho segmento de aDn. Ciclos repetidos de calentamiento y desnaturalizacion del ADN son seguidos por la reasociacion de los cebadores a sus secuencias complementarias a bajas temperaturas, y la extension de los cebadores hibridados con ADN polimerasa. Los cebadores se hibridan a cadenas opuestas de las secuencias diana de ADN. La hibridacion se refiere a la reasociacion de cadenas de ADN complementarias, en donde complementarias se refiere a la secuencia de los nucleotidos de modo que los nucleotidos de una cadena se pueden unir con los nucleotidos en la cadena opuesta para formar estructuras de doble cadena. Los cebadores estan orientados de manera que la smtesis de ADN por parte de la polimerasa procede bidireccionalmente a traves de la secuencia de nucleotidos entre los cebadores. Este procedimiento duplica efectivamente la cantidad de ese segmento de ADN en un ciclo. Debido a que los productos de PCR son complementarios a, y son capaces de unirse a, los cebadores, cada ciclo sucesivo duplica la cantidad de ADN

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sintetizado en el ciclo anterior. El resultado de este procedimiento es la acumulacion exponencial de un fragmento diana espedfico, que es aproximadamente 2 <n>, en donde n es el numero de ciclos.

A traves de la amplificacion por PCR se hacen millones de copias del segmento de ADN flanqueadas por los cebadores. Las diferencias en el numero de secuencias o inserciones o deleciones repetidas, que se encuentran entre los cebadores flanqueantes en diferentes alelos se reflejan en las variaciones de longitud de los fragmentos de ADN amplificados. Estas variaciones pueden ser detectadas, por ejemplo, mediante la separacion electroforetica de los fragmentos de ADN amplificados en geles o mediante el uso de un secuenciador capilar. Mediante el analisis del gel o perfil, se puede determinar si la planta contiene el alelo deseado en un estado homocigotico o heterocigotico o si el alelo deseado o no deseado esta ausente del genoma de la planta.

Variaciones de secuencia entre diferentes alelos que no conducen a una variacion de la longitud, tales como SNPs se pueden determinar (genotipar) mediante una amplia gama de metodos de genotipado que podnan basarse en la hibridacion, en enzimas, o por otros metodos post-amplificacion basados en las propiedades ffsicas del ADN, asf como por secuenciacion.

Se pueden emplear metodos alternativos para amplificar fragmentos, tales como la "Reaccion en Cadena de la Ligasa" ("LCR") (Barany, Proc Natl Acad Sci (U.S.A.) 88:189 193 (1991)), el cual utiliza dos pares de sondas de oligonucleotidos para amplificar exponencialmente una diana espedfica. Las secuencias de cada par de oligonucleotidos se seleccionan para permitir que el par se hibride con secuencias colindantes de la misma cadena de la diana. Una hibridacion de este tipo forma un sustrato para una ligasa dependiente del molde. Al igual que con la PCR, los productos resultantes de este modo sirven como molde en ciclos posteriores y se obtiene una amplificacion exponencial de la secuencia deseada.

La LCR se puede realizar con oligonucleotidos que tienen las secuencias proximales y distales de la misma cadena de un sitio polimorfico. En una realizacion, cualquier oligonucleotido se disenara para incluir el sitio polimorfico real del polimorfismo. En una realizacion de este tipo, se seleccionan las condiciones de reaccion de modo que los oligonucleotidos pueden ligarse juntos, solo si la molecula diana contiene o carece del nucleotido espedfico que es complementario al sitio polimorfico presente en el oligonucleotido. Alternativamente, los oligonucleotidos pueden seleccionarse de manera que no incluyen el sitio polimorfico (vease, Segev, Solicitud PCT WO 90/01069).

Un metodo adicional que, alternativamente, se puede emplear es el “Ensayo de Ligadura de Oligonucleotidos" (“OLA") (Landegren et al, Science 241:1077 1080 (1988}). El protocolo OLA utiliza dos oligonucleotidos que estan disenados para ser capaces de hibridarse a tope con las secuencias de una sola cadena de una diana. OLA, al igual que LCR, es particularmente adecuado para la deteccion de mutaciones puntuales. A diferencia de LCR, sin embargo, OLA resulta en una amplificacion "lineal" en lugar de exponencial de la secuencia diana.

Todavfa otro metodo que, alternativamente, se puede emplear es el "Ensayo Invasor" que utiliza una etiqueta de endonucleasa espedfica para la estructura (FEN) para escindir un complejo tridimensional formado por la hibridacion de oligonucleotidos solapantes espedficos de alelo con el ADN diana que contiene un sitio de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP). La reasociacion del oligonucleotido complementario al alelo SNP en la molecula diana desencadena la escision del oligonucleotido por cleavasa, una FEN termoestable. La escision se puede detectar mediante varios enfoques diferentes. Lo mas comunmente, el producto de escision desencadena una reaccion de escision secundaria en una casete de transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (FRET) para liberar una senal fluorescente. Alternativamente, la escision puede ser detectada directamente mediante el uso de sondas de polarizacion de fluorescencia (FP), o por espectrometna de masas. La reaccion de escision invasiva es altamente espedfica, tiene una baja tasa de fracaso, y puede detectar cantidades zeptomolares de ADN diana. Mientras que el ensayo se ha utilizado tradicionalmente para interrogar a un SNP en una muestra por cada reaccion, se han sometido a ensayo nuevos enfoques basados en chip o perlas para hacer este ensayo eficiente y preciso adaptable a la multiplexacion y genotipado de SNP de alto rendimiento.

Nickerson et al. han descrito un ensayo de deteccion de acidos nucleicos que combina atributos de PCR y OLA (Nickerson et al., Proc Natl Acad Sci (U.S.A.) 87:8923 8927 (1990)). En este metodo, se utiliza la PcR para conseguir la amplificacion exponencial del ADN diana, que se detecta despues utilizando OLA.

Tambien se conocen esquemas basados en el ligamiento de dos (o mas) oligonucleotidos en presencia de un acido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleotido" resultante, amplificando con ello el di-oljgonucleotido (Wu et al, Genomics 4:560 569 (1989)), y puede ser facilmente adaptado a los propositos de la presente invencion.

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Un marcador molecular puede ser por tanto un fragmento de ADN amplificado por PCR, p. ej., un marcador de SSR o un marcador RAPD. La presencia o ausencia de un fragmento de ADN amplificado puede ser indicativa de la presencia o ausencia del propio rasgo o de un alelo particular del rasgo. Cuando se utilizan marcadores de SSR, una diferencia en la longitud de un fragmento de ADN amplificado puede ser indicativa de la presencia de un alelo particuIar de un rasgo y, por lo tanto, permite distinguir entre diferentes alelos de un rasgo.

Marcadores de repeticiones de secuencia sencilla (SSR) se utilizan para identificar alelos relevantes para la invencion en las plantas parentales y/o los ancestros de las mismas, asf como en las plantas de la progenie resultantes de un cruce de dichas plantas parentales. Repeticiones de secuencia sencilla son secuencias cortas de ADN repetidas y estan presentes en los genomas de todos los eucariotas y consisten en varias a mas de cien repeticiones de un motivo de nucleotidos dado. Dado que el numero de repeticiones presentes en una localizacion particular en el genoma a menudo difiere entre las plantas, las SSRs se pueden analizar para determinar la ausencia o presencia de alelos espedficos.

Los marcadores SNP se utilizan para identificar alelos relevantes para la invencion en las plantas parentales y/o los antecesores de los mismos, asf como en plantas de la progenie que resultan de un cruce de dichas plantas parentales.

Analisis de marcadores se pueden hacer pronto en el desarrollo de la planta utilizando muestras de ADN extrafdas de tejido foliar de plantas muy jovenes o de semillas. Esto permite identificar las plantas con un deseable maquillaje genetico en el ciclo de cultivo y descartar las plantas que no contengan los alelos relevantes de la invencion deseados, antes de la polinizacion, reduciendo asf el tamano de la poblacion de cultivo y la reduccion de los requisitos de fenotipado.

Ademas, mediante el uso de marcadores moleculares, se puede hacer una distincion entre las plantas homocigotas que portan dos copias del alelo relevante de la invencion deseado en loci relevantes de la invencion y plantas heterocigotas que portan una sola copia y plantas que no contienen copia alguna del o de los alelos favorables.

Los marcadores moleculares pueden utilizarse en la seleccion asistida por marcadores y/o cualquier otro metodo en el que se rastrean las plantas que tienen o no tienen el rasgo “sin semillas". Los marcadores pueden ser tanto marcadores trans como cis. Un marcador trans indica un polimorfismo resultante de introgresion de ADN exogeno (donante) en un genoma de una planta receptora, polimorfismo que esta enlazado en cis con el genoma del receptor, es decir, esta enlazado con el alelo opuesto. Por lo tanto, los marcadores cis estan enlazados con el alelo de interes, mientras que los marcadores trans estan enlazados con el alelo opuesto (del receptor).

Para determinar la utilidad de la lmea endogamica y su potencial para contribuir geneticamente a la progenie hnbrida se realiza un cruce de ensayo con otra lmea endogamica, y la progenie resultante se evalua fenotfpicamente. Rasgos que pueden registrarse comunmente implican rasgos que se relacionan con la forma del fruto y caractensticas del fruto como el fruto puntiagudo o no puntiagudo, picante o no picante, rojo, amarillo o naranja. Caractensticas de la planta tales como la longitud de entrenudos, el poder de desarrollo y las ramificaciones tambien se consideran junto con las resistencias del virus espedfico tales como TMV (virus del mosaico del tabaco) y TSWV (virus del bronceado del tomate).

Para el genotipado o el mapeo de asociacion el ADN se extrae de material vegetal adecuado tal como, por ejemplo, tejido de la hoja. En particular, se recogen masas de hojas de una pluralidad de plantas. Las muestras de ADN se genotipan utilizando una pluralidad de SSRs polimorficas, SNPs o cualquier otro tipo de marcador adecuado que cubra la totalidad del genoma de pimiento.

El analisis conjunto de los datos genotfpicos y fenotfpicos se puede realizar utilizando un software estandar. EJEMPLOS

Los siguientes Ejemplos proporcionan realizaciones ilustrativas. A la vista de la presente descripcion y del nivel general de habilidad en la tecnica, los expertos apreciaran que los siguientes Ejemplos pretenden ser solamente ilustrativos y que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance de la materia reivindicada en esta memoria.

Ejemplo 1: Aislamiento de una lmea de Pimiento Sin Semillas

1.1 Crecimiento y Condiciones de Cultivo: Los SLPs de la presente invencion se cultivaron en Netiv HaHasara y Zofar (Israel) durante dos campanas de cultivo, es decir, la primavera y el verano de 2006; y el otono y el invierno de 2006-2007. Como en la mayona de las plantas, especialmente los pimientos, las caractensticas descritas estan relacionadas con el crecimiento, las estaciones y las condiciones, se puede suponer que, bajo otras condiciones, las

5 caractensticas de la planta sf pueden diferir. Se presenta el siguiente ejemplo:

Condiciones de Netiv HaHasara: invernadero cubierto de plastico sin calefaccion, cubierto por una red de sombra (40%, a partir de mayo); suelo arenoso; siembra en febrero de 2006; 2,500 plantas por cada 1.000 m2; cana de soporte lateral de estilo espanol; no desmochado de frutos y plantas, como en la practica comercial aceptada.

Condiciones de Zofar: Invernadero sin calefaccion al tiempo que se utilizaban redes dobles, una red blanca (MALLA 10 25, 20% de sombra) a lo largo de la temporada y redes negras, 40% de sombra durante los primeros 40 dfas, y los

dos ultimos meses de la temporada de desarrollo (es decir, febrero y marzo), suelo arenoso; siembra en julio de 2006; 3.500 plantas por cada 1.000 m2; cana de soporte lateral de estilo espanol; no desmochado de frutos y plantas, como en la practica comercial aceptada.

1.2 Informacion de la seleccion: La seleccion de una de esas plantas sin semilla es como se muestra en el esquema 15 siguiente:

imagen1

La fuente de P1 y P2 son semillas F2 de variedades comerciales cultivadas en el campo L3. La poblacion de P2 (la parcela L3-188) se dividio por la esterilidad. P1 y P2 fueron seleccionados de acuerdo a sus fuertes plantas y bastante buena calidad. P1 se hizo a partir de semillas de una planta fertil, N° 4, en la parcela "L3-161" y P2 es una 20 masa de las semillas de muchas plantas fertiles en la parcela L3-188. Ambos eran de tipo pimiento rojo. El hnbrido "B5-F1-217-b" fue hecho por estas 2 plantas, en donde P1 era el parental masculino y P2 era el femenino. El hnbrido fue cultivado (15 plantas) en el campo PC en la parcela 122, y las semillas F2 se obtuvieron de todas las plantas. Estas semillas F2 se sembraron en el campo L5 en la parcela 155. Esta poblacion se dividio por la esterilidad. Entre muchas otras plantas esteriles, la planta numero 1 se distinguio por su capacidad de dar pequenos frutos sin 25 semillas a lo largo de la planta. La planta se multiplico vegetativamente y la progenie se cultivo en la temporada de otono-invierno. En esta temporada el rendimiento de estas plantas era muy similar a la de primavera-verano

1.3 Caractensticas de la Planta y el Fruto: Los experimentos proporcionan frutos y plantas (Veanse las fotograffas 1 y 2), que se definen por lo siguiente: frutos sin semillas caracterizados por (i) sin semilla; (ii) Pigmentado de rojo en maduro y pigmentado verde oscuro en frutos pre-maduros (inmaduros); (iii) forma tipo conica, es decir, entre 30 campana y conica clasica; (iv) tamano entre aproximadamente 2 y 4 cm de largo por aproximadamente 3 a 4 cm de diametro; y (v) sabor muy dulce (Brix aproximadamente 8 a aproximadamente 11°). La planta sin semillas se caracteriza por caractensticas seleccionadas de un grupo que comprende, entre otros, (i) excelente fructificacion en todas las estaciones; (ii) planta fuerte y resistente; (iii) muchas ramas laterales, ramificaciones de las ramas, debil

dominancia apical; (iii) tendencia a dar dos frutos por nudo en aproximadamente el 20% de los nudos; (iv) tamano y forma bastante uniformes; (v) intervalos cortos entre nudos, aprox. de 10 cm de largo; (vi), la produccion de frutos comienza a partir de los primeros nudos y progresa a lo largo de la longitud de las ramas, de manera similar a las plantas no esteriles; y (vii) la flor tiene pequenas anteras sin polen.

5 Ejemplo 2: Genetica del rasgo “sin semillas"

Para demostrar que el rasgo “sin semillas”, descubierto en el tipo de pimiento “one-bite”, es un rasgo independiente controlado por un determinante genetico y, por lo tanto, que se puede transmitir geneticamente a muchos diferentes tipos de pimiento, se demuestra que el rasgo estara presente en la progenie de las poblaciones realizadas por el cruce de la planta sin semillas con otras plantas de tipo pimiento.

10 2.1 Historia del Cultivo: En primavera de 2007, la variedad SLP 255-1 se cruzo con 8 variedades de diferentes tipos;

Blocky, Kapya y Conic. Los tnbridos se cultivaron en otono/invierno 2007-2008 y semillas F2 fueron recolectadas de 10 plantas F1.

Nombre del Hibrido Descripcion Nombre masculino Nombre femenino

1

AR07-F1-56-b Hfbrido 255-1 x Kapya NJ06-F3-385-4 (Kapya) ARO6-F3-255-1

2

ARO7-F1-87-B Hfbrido 255-1 x Kapya NA06-F3-14-4 (Kapya) AR06-F3-255-1

3

AR07-F1-166-b Hfbrido 255-1 x Conic NJ06-F3-378-1 (conic) AR06-F3-255-1

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AR07-F1-171-X Hfbrido 255-1 x Blocky AV05-F1-7158-TT (Blocky) AR06-F3-255-1

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AR07-F1-172-X Hfbrido 255-1 x Blocky AV05-F1-7181-TT (Blocky) AR06-F3-255-1

Ejemplo 3: Recuperacion del rasgo “sin semillas"de los hforidos

15 3.1 Diseno experimental: Las 5 tnbridos depositados se cultivaron a partir de muestras de la semilla depositada, 10

plantas individuales para cada uno (50 plantas en total). Semillas F2 de las plantas individuales se obtuvieron

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mediante auto-polinizacion. Las semillas F2 fueron recolectadas de las plantas y se mantuvieron separadas. Se sembraron 55 semillas F2 de cada planta F1 (2.750 semillas en total, 550 semillas por familia tnbrida). El objetivo era conseguir 100-130 plantas F2 esteriles de cada familia tnbrida depositada (~25% de 550). El ensayo fue disenado para que cada progenie F2 fuera trasplantada por separado. Ademas, como control, semillas F2 del tnbrido original, donde el rasgo SLP fue descubierto en la progenie, tambien se sembraron 600 semillas de 3 plantas F1, 200 semillas de cada una. Las plantas F2 son entonces analizadas en cuanto a la expresion de un rasgo esteril masculino (MS) y el rasgo del pimiento sin semillas (SLP). Ambos rasgos se segregan por separado, sin embargo, el rasgo MS es necesario para tener al rasgo SLP fenotipicamente expresado. Mientras que en la lmea femenina (lmea SLP) el rasgo MS es homogeneo recesivo, en el tnbrido F1 es heterogeneo (las lmeas masculinas son todos fertiles masculinas homogeneas).

Como seguridad, semillas adicionales se sembraron una semana despues. Este ciclo de siembra incluia las familias sembradas en el primer ciclo (en caso de que la germinacion sea insuficiente) y familias F2 de otros tnbridos para enriquecer la variacion potencial.

Alrededor de 1 a 2 meses despues, las plantulas se trasplantan a macetas y siguen creciendo en el vivero. El cribado y la seleccion de plantas esteriles sin semillas se realizan por simple observacion de las flores. Despues de distinguir las plantas esteriles, que se plantan en invernaderos (red blanca de malla 50 para evitar la polinizacion cruzada por parte de insectos) a una densidad de 2,500 plantas/1.000 m2. El fenotipado partenocarpico se hace 2 semanas mas tarde.

3.2 Resultados: El rasgo de esterilidad masculina (MS), que esta comprendido en las semillas F2, se expresa con una tasa media de 27% (no lejos de la tasa teorica del 25% que se espera para un rasgo recesivo monogenico). El rasgo SLP solo se puede expresar fenotfpicamente en un fondo MS. La tasa media de las plantas que expresan el rasgo SLP en una poblacion de plantas MS es 23%, aunque el rasgo SLP no depende de las condiciones ambientales, el grado de expresion puede ser influenciado por el fondo gentico de la lmea masculina. Se extiende de 6% (tnbrido original) hasta 36% en el tnbrido AR07-F1-56-b hecho por el cruce de la planta SLP (AR06-F3-255-1) con la lmea Kapya. En todos los ensayos basados en las lmeas depositadas el rasgo SLP se pudo recuperar de forma coherente. Los datos indican que el rasgo SLP es un rasgo complejo con al menos 2 componentes geneticos primarios involucrados.

En todas las plantas de SLP, el 100% de los frutos eran sin semilla, y de todos estos frutos el 100% fueron sin semilla (no fueron fertilizados ovulos para convertirse en portadores de semillas). En el control fertil negativo solamente muy de vez en cuando se descubrio en algunos frutos individuales en una planta que eran sin semillas; sin embargo, esto es el resultado de efectos climaticos o la polinizacion irregular, pero no es un fenomeno genetico.

Depositos:

Las siguientes muestras de semillas de lmeas de Capsicum annuum se depositaron ante NClMB1 Aberdeen AB21 9YA, Escocia, Reino Unido el 26 de mayo de 2008, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest:

Designacion de la lmea de semillas de Capsicum annuum

Datos de deposito Acceso N°

AR07-F1-56-b

26 de mayo de 2008 NCIMB 41558

AR07-F1-87-b

26 de mayo de 2008 NCIMB 41559

AR07-F1-166-b

26 de mayo de 2008 NCIMB 41560

AR07-F1-171-X

26 de mayo de 2008 NCIMB 41561

AR07-F1-172-X

26 de mayo de 2008 NCIMB41562

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Lista de referencias

Sjut V, Bangerth F (1982) "Induced parthenocarpy: a way of changing the levels of endogenous hormones in tomato fruits (Lycopersicon esculentum Mill.): 1. Extractable hormones." Plant Growth Regul 1: 243-251

Kim IS, Okubo H, Fujieda K. 1992. "Endogenous levels of IAA in relation to parthenocarpy in cucumber (Cucumis sativus L.)." Scientia Horticulturae 52: 1-8.

Beyer EM, Quebedeaux B. 1974. "Parthenocarpy in cucumber: mechanism of action of auxin transport inhibitors."Journal of the American Society for Horticultural Science 99: 385-390.

Heuvelink and Korner "Parthenocarpic Fruit Growth Reduces Yield Fluctuation and Blossom-end Rot in Sweet Pepper", Annals of Botany. 88(1):69-74, (2001)

Rieger, R. et al, A "Glossary of Genetics and Cytogenetics, Classical and Molecular Book Microbes Human", George Allen & Uhwin Ltd.; Springer-Verlag, London; Berlin, Reino Unido; Alemania: 1968. 3a ed. (rev.), 507 pp

International Convention for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV treaty), de 2 Dic. de 1961, Revisado en Ginebra el 10 Nov. de 1972, el 23 Oct.de 1978 y el 19 Mar. de 1991

Poehlman & Sleper (1995) "Breeding Field Crops", 4a Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376,

Daskaloff S. 1972. Male sterile pepper (C. annuum L.) mutants and their utilization in heterosis breeding. Eucarpia, Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum. (Torino, Italia), pp. 205-210.

Peterson, 1958 "Cytoplasmically inherited male-sterility in Capsicum." Am. Nat. 92:111-119.

Michelmore, R. W., Para, I., y Kasseri, R. V. (1991). "Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations." Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 9828-9832

Mullis et al., "Specific enzymatic amplification of DNA in-vitro the polymerase chain reaction." Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-274 (1986)

Barany, "Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase" Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 88:189 193 (1991)

Landegren et al., "A ligase-mediated gene detection technique" Science 241:1077 1080 (1988)

Nickerson et al., "Automated DNA diagnostics using an ELISA-based oligonucleotide ligation assay" Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 87:8923-8927 (1990)

Wu et al., "The ligation amplification reaction (LAR) - amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation." Genomics 4:560-569 (1989)

Solicitud PCT WO 90/01069

Claims (8)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una planta de pimiento h^brida esteril masculina, que desarrolla frutos sin semillas comestibles, de aspecto normal por toda la planta, en donde dichos frutos sin semillas se caracterizan por ser al menos 95% sin semillas, en donde el rasgo "sin semillas" es controlado por un determinante genetico y es independiente del proceso de polinizacion y fecundacion, es independiente del tratamiento con hormonas vegetales inductoras de partenocarpia, incluyendo auxinas, giberelinas y citoquinas, inhibidores del transporte de auxina, u otros y/u otros factores exogenos inductores de partenocarpia y/o agentes inductores de partenocarpia administrados exogenamente tales como sustancias reguladoras del crecimiento, ya sean naturales o sinteticas, o extractos vegetales tales como, por ejemplo, extracto de polen muerto, y tambien es independiente de condiciones climaticas externas y en donde dicho rasgo “sin semillas” se puede obtener a partir de una planta de pimiento seleccionada del grupo que consiste en Capsicum annuum AR07-F1-56-b; Capsicum annuum AR07-F1-87-b; Capsicum annuum AR07-F1-166-b; Capsicum annuum AR07-F1-171-X; y Capsicum annuum AR07-F1-172-X, desarrollada a partir de semillas depositadas ante la NCIMB, Aberdeen AB21 9YA, Escocia, Reino Unido el 26 de mayo de 2008, bajo el numero de acceso NCIMB 41558, NClMB 41559, NCIMB 41560, NCIMB 41561 y NCIMB 41562, respectivamente.
2. 2. Una planta de pimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la fructificacion se inicia en los primeros nudos de una rama y progresa a lo largo de la longitud de la rama entera.
3. 3. Una planta de pimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dichos frutos sin semillas estan pigmentados de rojo en la fase madura y estan pigmentados de verde oscuro en la fase pre-madura (inmadura).
4. 4. Una planta de pimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dichos frutos sin semillas en la madurez tienen un sabor muy dulce con un Brix entre aproximadamente 7° y aproximadamente 14°, particularmente entre aproximadamente 7,5° y aproximadamente 12°, particularmente entre aproximadamente 8° y aproximadamente 11°.
5. 5. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha planta desarrolla frutos de pimiento seleccionados del grupo que consiste en un pimiento dulce incluyendo un pimiento de tipo dolce, un pimiento campana, un pimiento rectangular grande, un pimiento conico, un pimiento largo conico y un pimiento de tipo blocky.
6. 6. Un metodo de producir frutos de pimiento sin semillas, como un producto alimenticio, que comprende las etapas de

   i) proporcionar una planta de pimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;

   ii) multiplicar/propagar dicha planta de pimiento;

   iii) permitir que la planta desarrolle frutos de pimiento sin semillas; y

   iv) recolectar dichos frutos de pimiento;

   en el que la etapa de multiplicacion/propagacion ii) se realiza mediante propagacion vegetativa.
7. 7. Uso de la semilla depositada bajo el numero de acceso NCIMB 41558, NClMB 41559, NCIMB 41560, NCIMB 41561 y NCIMB 41562, para la produccion de frutos de pimiento partenocarpicos.
8. 8. Uso de un fruto sin semillas desarrollado a partir de una planta de pimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como producto fresco, como producto cortado fresco o para el procesamiento tal como, por ejemplo, el enlatado.