CN104726450B - 与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了2个与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用。所述分子标记含有SEQ？ID？NO.1所示核苷酸序列，命名为P52-11-21；或者含有SEQ？ID？NO.2所示核苷酸序列，命名为P52-11-41。所述分子标记与根腐疫病特异抗性基因紧密连锁，遗传距离分别为1.5cM和1.1cM，可直接用于辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于辣椒抗根腐疫病育种实践中，同时为克隆辣椒根腐疫病特异抗性基因及其功能研究奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及分子标记，特别是涉及2个与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeon.）引起的一种毁灭性土传病害（Leonian,1922），在世界范围内广泛传播。广东地区由于高温高湿气候条件的影响，辣椒疫病尤为严重，辣椒生产经常损失惨重。
辣椒疫病根据病原菌侵染部位的不同表现为根腐、果腐、茎枯和叶枯等不同病症（Ristaino,1990），并且多项研究结果认为，根腐、果腐、茎枯和叶枯疫病抗性的遗传机理并不相同（Barksdaleetal.,1984;Syetal.,2005）。辣椒根腐疫病的发生通常直接导致植株不可逆死亡，对辣椒生产的损害最为严重，国内外学者研究结果表明根腐疫病的抗性遗传机制从广义上可分为2种类型，分别为数量抗性和特异抗性。数量抗性表现为多基因控制，目前多项研究结果鉴定并定位的主效根腐疫病抗性基因位于辣椒第5号染色体上（Quirinetal.,2005;Truongetal.,2013）；特异抗性为单基因控制，表现为对某种特异菌株具有完全抗性（Monroy-BarbosaandBosland,2008），目前为止，国内外还未见根腐疫病特异抗性基因定位的报道。
CM334是国际公认的抗性水平最高的抗辣椒疫病材料，已在辣椒抗病研究和育种中广泛应用。对基因（QTL）的鉴定及定位是利用分子标记辅助选择育种的前提。目前，只有辣椒第5号染色体上的主效抗性QTL位点紧密连锁标记开发比较成熟，并能应用于育种实践中。由于辣椒疫病病症表现多样，辣椒疫霉菌又存在生理小种分化，要培育一个对所有疫霉菌都具有抗性的辣椒品种几乎不可能，而考虑到其特异抗性的特点，针对当地优势疫霉菌株鉴定抗性基因位点并开发紧密连锁分子标记，有助于加快抗性品种的选育进程。
发明内容
本发明的一个目的在于提供2个与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记。
本发明的另一个目的在于提供用于扩增与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记的引物对。
本发明的另一个目的在于提供所述与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记的应用。
本发明所采取的技术方案是：
与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记，定位于辣椒第10号染色体上，分别位于辣椒根腐疫病特异抗性基因两侧，命名为P52-11-21和P52-11-41。
所述分子标记P52-11-21包含SEQIDNO.1所示核苷酸序列；所述分子标记P52-11-41包含SEQIDNO.2所示核苷酸序列。
用于扩增上述与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记的引物对。
用于扩增分子标记P52-11-21的引物序列如下所示：
F1：5’-CAATCCAAACAAGTCCTAAG-3’(SEQIDNO.3)；
R1：5’-GGTGCAATTGAAAATCTAAG-3’（SEQIDNO.4）；
用于扩增分子标记P52-11-41的引物序列如下所示：
F2：5’-TTGATGAGATGGGAAGTAAA-3’(SEQIDNO.5)；
R2：5’-CACCAACAATAATAGAACTACA-3’(SEQIDNO.6)。
分子标记P52-11-21和P52-11-41在辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种或者辣椒根腐疫病特异抗性基因定位中的应用。
一种辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种的方法，该方法包括：以CM334或其衍生品种为对象，用特异性引物PCR扩增待检测植株DNA，如果扩增产物中存在所述分子标记P52-11-21和/或分子标记P52-11-41，则表示该植株中存在辣椒根腐疫病特异抗性基因。
本发明的有益效果是：
本发明提供了与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记P52-11-21与P52-11-41，所述分子标记与根腐疫病特异抗性基因紧密连锁，遗传距离分别为1.5cM和1.1cM，可直接用于辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于辣椒育种实践中，同时为克隆辣椒根腐疫病特异抗性基因及其功能研究奠定了良好的基础。
附图说明
1、图1为抗性基因关联区域：横坐标表示染色体位置，纵坐标表示Δ(SNP_index)的值；红线表示所有Δ(SNP_index)拟合后的结果；蓝色虚线标记Δ(SNP_index)的阈值，拟合后的Δ(SNP_index)越强，表示关联性越强；
2、图2为标记P52-11-21的PCR扩增结果：P1、P2分别为抗病亲本CM334和感病亲本10399的扩增带型，主带分别为长127bp和139bp；BR和BS分别为抗病混池和感病混池的扩增带型；BC1F1群体随机扩增表示在BC1F1群体中随机挑选的10株抗病或感病单株的PCR扩增结果，扩增出长139bp主带的为感病单株，同时扩增出127bp和139bp主带的为杂合抗病单株；
3、图3为标记P52-11-41的PCR扩增结果：P1、P2分别为抗病亲本CM334和感病亲本10399的扩增带型，主带分别为长147bp和141bp；BR和BS分别为抗病混池和感病混池的扩增带型；BC1F1群体随机扩增表示在BC1F1群体中随机挑选的10株抗病或感病单株的PCR扩增结果，扩增出长141bp主带的为感病单株，同时扩增出147bp和141bp主带的为杂合抗病单株；
4、图4为抗性基因的遗传连锁图谱：左边数值代表遗传距离（单位：cM），右边标示SSR分子标记，均位于辣椒第10号染色体，根腐疫病抗性基因PhR定位于标记P52-11-21和P52-11-41之间。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳、酶切、转化等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW，JanssenK,ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
一、遗传群体的构建及遗传分析
1、供试材料
植物材料：国际公认辣椒抗疫病材料CM334和高世代纯合感病材料10399，均由美国新墨西哥州立大学辣椒遗传育种专家PaulW.Bosland教授赠予。CM334和10399杂交（正反交）获得F1，F1自交得F2，回交得BC1F1，用作遗传分析和定位群体。
菌种材料：辣椒疫霉菌株Byl4，从广州钟落潭实验基地发病辣椒植株上分离获得，分离方法参照李智军等（2007）。接种前按郑小波等（1990）叙述的方法配制游动孢子接种液。
2、表型鉴定
待鉴定材料种植于55mm×55mm×70mm穴孔中，于无疫霉菌污染的温室中正常管理生长至4-6片真叶时转移到人工气候箱，于接种前12小时浇透水。采用灌根法接种，接种浓度为104个游动孢子/ml，于距植株根际1～2cm处用注射器小心注入5ml游动孢子的悬浮液，黑暗保湿24小时后正常管理。接种后待感病对照10399开始发病时进行调查，此后每天调查一次，待感病对照全部发病萎焉时（接种后约10天）停止调查。表型评价参照Monroy-BarbosaandBosland（2008），没有出现病症的植株为抗病株，出现病症的植株为感病株。
3、遗传分析
抗病亲本CM334和感病亲本10399各种植32株作为对照。接种后第3天，感病亲本10399开始发病，接种后第11天全部枯萎死亡，而32株抗病亲本均未感病。F1代和反交F1代群体的各48株幼苗在接种第11天没有表现出任何病症，表现为抗病，表明CM334的抗疫病性状属于细胞核遗传而非细胞质遗传。157株F2代分离群体中有115株幼苗表现抗病，42株表现感病，抗、感分离比符合3:1（X2 3:1=0.26，P=0.61）；BC1(F1×P1)群体中154株幼苗均表现抗病，BC1(F1×P2)群体中75株幼苗表现抗病，83株表现感病，抗、感分离比符合1:1（X2 1:1=0.41，P=0.52），分析结果表明CM334抗根腐疫病性状由一个单显性基因控制。
二、辣椒根腐疫病抗性基因定位
1、抗病DNA混池和感病DNA混池的建立
于无疫霉菌污染的温室中种植BC1F1群体436株，每穴孔1株，正常管理生长至4-6片真叶时转移到人工气候箱接种鉴定表型，筛选出极端抗病植株和极端感病植株各50株，以常规CTAB法提取各单株DNA，用Thermonanodrop2000检测DNA浓度并用1%琼脂糖电泳检测DNA纯度及完整性，检测合格后分别将50个抗病单株和感病单株DNA等量混合成终浓度为40ng/μl的抗病DNA混池和感病DNA混池。
2、SLAF-seq结合BSA分析方法定位抗性基因
本研究前期委托北京百迈客生物科技有限公司利用其自主研发的SLAF-seq技术进行简化基因组测序（Sunetal.,2013），并结合集群分离分析方法（BSA）对辣椒根腐疫病抗性基因进行定位，在辣椒第10号染色体末端定位到1个关联区域，大小约为16.0Mb，并在该区域内检测到SNP关联标记139个（见图1）。
3、抗性基因精细定位
为将抗性基因进一步精细定位，在CM334辣椒基因组数据库（http://peppergenome.snu.ac.kr/download.php）下载关联区域基因组序列，设计SSR引物197对，筛选出10个SSR标记同时在抗、感亲本和抗病池、感病池间表现为多态，用筛选出来的10个多态标记检测636株BC1F1定位群体的基因型，结合表型调查，分别利用MAPMAKER/EXP3.0软件进行分析和Mapchart2.0软件构建遗传图谱将抗病基因定位在标记P52-11-21与P52-11-41之间，与两侧标记的遗传距离分别为1.5cM和1.1cM（图4）。
三、分子标记扩增片段的回收、克隆及测序
将分子标记扩增片段从聚丙烯酰胺凝胶上切下，置于离心管中，用枪头捣碎，加入超纯水冲洗三遍，然后加入10ul超纯水95℃水浴15min，快速离心取上清液。以回收上清液为模板、相应标记引物进行PCR扩增，50μLPCR反应体系为：回收上清液（含DNA）5ul，10×TaqDNApolymerasebuffer5μL，25mMMgCl23μL，引物(10μM）各1.2μL，2.5mMdNTP4μL，5U/μLTaq酶0.4μL，ddH2O补足至50μL，扩增程序为：94℃5min；30cycles：94℃30s；55℃30s；72℃30s；72℃5min。各吸取20μLPCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外光仪下切下目标片段放入1.5ml的离心管中，参照DNAGelExtractionKit（北京全式金公司）说明操作回收DNA，将回收后的PCR产物与pMD19-TSimplevector(Takara公司)进行连接，采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，从涂布有Amp(100μg·ml-1)、X-gal(20μg·ml-1)和IPTG(40μg·ml-1)的LB平板挑选含有重组子的白色菌落，以pMD19-TSimple载体上的RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)和M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)为引物，验证阳性克隆。25μLPCR反应体系为10×TaqDNApolymerasebuffer2.5μL，25mMMgCl21.5μL，引物RV-M和M13-47(10μM）各0.5μL，2.5mMdNTP2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，大肠杆菌单菌落为模板，ddH2O补足至25μL。PCR反应条件为：94℃5min；30cycles:94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃延伸5min，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。挑取阳性克隆子送上海生工进行序列测定。测序结果显示，分子标记P52-11-21的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，分子标记P52-11-41的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110>广东省农业科学院蔬菜研究所；广东科农蔬菜种业有限公司
<120>与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用
<130>
<160>6
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>127
<212>DNA
<213>CapsicumannuumL.
<400>1
caatccaaacaagtcctaagatgtgattaggtgaaatgtgtagatatctttattattatt60
attattattattttgcgttttaattatattattactttgttgtttatcttagattttcaa120
ttgcacc127
<210>2
<211>147
<212>DNA
<213>CapsicumannuumL.
<400>2
ttgatgagatgggaagtaaatataaaaaagaataaatacgttctcatatatatatatata60
taaaattcaaccaaagtctaatgtaatagtagataaagttgattctaattaacatgacat120
tcttgtgtagttctattattgttggtg147
<210>3
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>6
caccaacaataatagaactaca22
Claims (5)
1.与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记，定位于辣椒第10号染色体上，分别位于辣椒根腐疫病特异抗性基因两侧，命名为P52-11-21和P52-11-41；
其特征在于：所述分子标记P52-11-21为SEQIDNO.1所示核苷酸序列；所述分子标记P52-11-41为SEQIDNO.2所示核苷酸序列。
2.用于扩增权利要求1所述与辣椒根腐疫病特异抗性基因紧密连锁的分子标记的引物对。
3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：用于扩增分子标记P52-11-21的引物序列如下所示：
F1：5’-CAATCCAAACAAGTCCTAAG-3’；
R1：5’-GGTGCAATTGAAAATCTAAG-3’；
用于扩增分子标记P52-11-41的引物序列如下所示：
F2：5’-TTGATGAGATGGGAAGTAAA-3’；
R2：5’-CACCAACAATAATAGAACTACA-3’。
4.权利要求1所述的分子标记在辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种或者辣椒根腐疫病特异抗性基因定位中的应用。
5.一种辣椒抗根腐疫病分子标记辅助育种的方法，该方法包括：以CM334或其衍生品种为对象，用权利要求2或3所述引物PCR扩增待检测植株DNA，如果扩增产物中存在分子标记P52-11-21和/或分子标记P52-11-41，则表示该植株中存在辣椒根腐疫病特异抗性基因。
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