CN108315471A

CN108315471A - 鉴定根肿病菌4号生理小种的特异基因、特异性引物、含有所述引物的试剂盒及其应用

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Publication number: CN108315471A
Application number: CN201810366659.7A
Authority: CN
Inventors: 杨辉; 郑静; 付寅冬; 黄云; 张煜辉; 易春霖
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CN108315471B

Abstract

本发明提供基因PBRA003268在检测根肿病菌4号生理小种中的应用，所述基因的序列如SEQ No.1所示。本发明还提供根肿病菌4号生理小种的检测方法，包括以待测样品的DNA为模板，用特异引物进行PCR扩增；通过扩增产物判断检测样品是否含有根肿病菌4号生理小种。本发明还提供检测根肿病菌4号生理小种的基因类型的特异基因及方法。本发明的检测方法可以直接对感病植物组织总DNA进行PCR鉴定，具有操作简化、所需材料少的特点，能够适用于不同地区、不同侵染时期的植物组织的根肿菌生理小种鉴定，还实现了区分4号生理小种的不同基因类型的快速检测，通过应用于田间动态变化监测，为抗病品种的合理布局提供指导依据。

Description

鉴定根肿病菌4号生理小种的特异基因、特异性引物、含有所述引物的试剂盒及其应用

【技术领域】

本发明涉及分子生物学领域。具体涉及用于检测根肿病菌4号生理小种的特异基因和用于检测根肿病菌4号生理小种基因类型的特异基因及其应用。

【背景技术】

根肿病是制约十字花科作物生产的一种世界性病害。它由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)引起，主要危害植株的根部，使其根部细胞发生畸形变化，挤压维管束，影响对水分和养分的吸收，从而使植株地上部分萎蔫或死亡，严重影响十字花科作物产量。其寄主范围包括十字花科330个属，3700 个种的植物。目前世界范围内已经有80个国家或地区报道有根肿病发生，在我国28个省均有分布，特别在西南，东北和华中地区尤为严重，并呈现加速蔓延的态势，造成极大危害。

由于根肿菌在土壤中存活时间长，传统农业防治很难奏效，化学防治易对环境造成污染，栽培抗病品种则是一种较为有效的防治手段，是从根本上解决根肿病危害的途径。但由于根肿菌存在明显的小种分化，所推广的抗病品种必须结合当地生理小种种类及组成；此外，在抗病品种的应用中，由于病原菌与宿主的相互作用，相互选择，使得一些本来抗病的品种经多年种植，抗性也会减弱甚至丧失。因此，根肿菌生理小种的鉴定以及田间变化的动态监测是根肿病抗病品种合理应用的基础。

根肿菌生理小种鉴定一直以来都是依据病原菌与鉴别寄主之间的互作结果，通过症状进行判别，其中Williams鉴别系统(4个鉴别寄主)和ECD(Europeanclubrootdifferentialhost)鉴别系统(15个鉴别寄主)应用最为广泛。当前，已有许多科研工作者利用这两种体系对世界范围内各个地区的小种进行鉴定。2008 年，沈向群首次用Williams鉴别系统对吉林、辽宁、四川和山东这四个省大白菜产区的15个菌系，丁云花(2013)对云南，重庆，湖北，山东，陕西，四川，上海，辽宁18个菌系进行鉴定，均表明中国目前的优势生理小种为4号。近年湖北，湖南，东北，安徽，西藏，云南也陆续对各个省进行了较为细致的小种鉴定(卢桂香etal.2013；彭沙莎etal.2013；赵杨etal.2013；方春华etal.2014；刘峰etal.2013)，各省的鉴定结果(除了湖南)都指出4号小种为我国的优势小种。

但这两种鉴别系统亦存在缺陷，例如利用鉴别寄主鉴定生理小种费时费力；结果易受根肿菌休眠孢子成熟程度和活力的影响；症状的形成需要较长时间，在此期间，根肿菌的侵染和扩展易受温度和湿度等环境因素的影响；田间根肿样品多为复合群体，也会影响与鉴别寄主之间互作的结果。基于此，建立对根肿菌生理小种鉴定的一种准确、方便、快速的分子方法，尤其是优势小种4号的鉴定，对我国根肿病的防治具有重要意义。据报道，目前仅发现基因Cr811可以将5号与3号和8号生理小种区分(Zhangetal.2015)，一个RAPD分子标记存在于1号生理小种(Soméetal.1996)。但用于根肿菌生理小种分子鉴定的特异基因极少，其分子鉴别体系极不完善，针对4号生理小种的分子鉴定目前还未有报道。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术对于根肿病菌(P.brassicae)生理小种4号难以鉴别、现有技术的鉴定方法中存在周期长且结果易受环境因素影响、鉴别寄主不易扩繁等问题，提供了根肿病菌生理小种4号的分子鉴定方法，并将其应用于根肿病菌4号生理小种，从而建立一种高效、快速、准确判断根肿菌4号生理小种的鉴定方法。

进一步的，发明人还发现，通过现有的Willams鉴别系统鉴定的同一4号生理小种具有典型的基因差异，该基因差异与地理分布存在关联。因此，本发明的另一个目的是提供根肿菌4号生理小种不同基因型的检测手段，包括用于检测的基因和检测方法，并考察检测结果与地理分布的关系。

为了实现上述目的，本发明提供基因PBRA003268在检测根肿病菌(P. brassicae)4号生理小种中的应用，所述基因的序列如SEQNo.1所示。

与此对应的，本发明还提供用于检测根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种的特异性引物对，所述引物包括：

PBRA003268-F：GAATAGGAAACCCGCCCTGT

PBRA003268-R：CGTGATCGTACCAAGACGCA。

基于上述特异基因和特异性引物对，本发明还提供根肿病菌(P.brassicae)4 号生理小种的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)待检测样品的制备

通过CTAB法提取待检测样品的DNA，得到含有待检测样品DNA的溶液；

(2)PCR扩增

以步骤(1)的DNA为模板，用权利要求2的特异引物对PBRA003268-F 和PBRA003268-R进行PCR扩增；

(3)凝胶电泳结果判断

对步骤(2)的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当扩增产物大小为 248bp时表明检测样品中的DNA中具有根据权利要求1所述的基因 PBRA003268，判断该检测样品含有根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种。

在本发明中，上部检测步骤(1)中，待检测样品是提纯的根肿菌休眠孢子，或待检测植株的根瘤。

当待检测样品是植株的根瘤时：取根瘤部分于流水下冲洗干净，切碎，用 75体积％酒精消毒5分钟，蒸馏水冲洗3次，备用。

当待测样品是菌休眠孢子：取根瘤部分于流水下冲洗干净，切碎，75体积％酒精消毒5分钟，蒸馏水冲洗3次，加蒸馏水于搅拌机中搅成匀浆，8层灭菌纱布过滤，得到的滤液500rpm离心10min，去沉淀，上清液转入新离心管，3100rpm 离心10min，弃上清，向沉淀中加入无菌水，3100rpm离心10min，重复此步骤两次，得到休眠孢子沉淀冻存备用。

以上待检测样品均可采用常规CTAB法提取DNA：将得到待测样品置于研钵中，液氮速冻研磨至粉末，装入2mL离心管，加入1mL65℃预热的CTAB和 15μLβ-巯基乙醇，充分混匀，65℃水浴60min后10000rpm离心10min，小心吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，上下颠倒温和混匀，10000rpm 离心10min，重复此步骤1～2次；收集上清液至2mL离心管，迅速加入等体积的异丙醇，置于-20℃冰箱中冷冻30min以上，12000rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加1mL70％乙醇，12000rpm离心10min，弃上清；将空管再离心30s，去乙醇，晾干沉淀；无酒精味后加入50μLddH₂O。

根据上述检测方法，步骤(2)中，PCR反应体系为：总量为10～50μL，含有上下游引物各0.5～2μL，2×MasterMix聚合酶混合液5～25μL，ddH₂O3.5～19μL，根肿菌标准4号生理小种的DNA溶液阳性对照。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，53～55℃退火30s，72℃延伸1min，循环数25～30次，72℃延伸10min。

本发明还提供上述特异基因PBRA003268在白菜(Brassicarapekinensis)、萝卜(RaphanussativusL.)、青菜(Brassicachinensisvarchinensis)、油菜(BrassicanapusL.)、芥菜(Brassicajuncea(L.)Czern.etCoss.)、甘蓝(BrassicaoleraceaL)、花菜(BrassicaoleraceaL.var.botrytisL.)、苋菜(AmaranthustricolorL.)或小白菜(BrassicacampestrisL.ssp.ChinensisMakino(var.communisTsenetLee))中检测根肿菌4号生理小种的应用。

本发明还提供含有上述特异性引物对PBRA003268-F和PBRA003268-R的检测试剂盒。

作为一种优选的实施方式，所述试剂盒还包括2×MasterMix聚合酶混合液，根肿菌标准4号生理小种的DNA溶液阳性对照及ddH₂O。

进一步地，为了更好的进行抗根肿病品种的筛选及合理布局，了解当地根肿菌生理小种的类型并及时掌握其动态变化，本发明通过大量基因的筛选，获得了用于鉴定4号生理小种以及4号生理小种不同基因类型的特异基因，并致力于探索根肿菌生理小种的分子鉴定方法。

对此，本发明提供用于检测根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种的基因类型的特异基因，所述特异基因包括如SEQNo.1所示的基因PBRA003268、如SEQ No.2所示的基因Novel512和/或如SEQNo.3所示的基因Novel137。

对此对应地，本发明提供用于检测根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种的基因类型的特异性引物对，所述引物包括：

用于检测如SEQNo.1所示的PBRA003268的引物：

PBRA003268-F：GAATAGGAAACCCGCCCTGT

PBRA003268-R：CGTGATCGTACCAAGACGCA

用于检测如SEQNo.2所示的Novel512的引物：

Novel512-FGAGTGATGAGCCCGTACTGC

Novel512-RAGCTGAGGGGAATTCCTTGG

用于检测如SEQNo.3所示的Novel137的引物：

Novel137-FACGCTGGAACGCATAGAACA

Novel137-RCATACGGGTGGATACGGGTG。

基于以上特异基因和特异性引物对，本发明还提供根肿病菌(P.brassicae)4 号生理小种的基因类型的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)待检测样品的制备

(2)PCR扩增

以步骤(1)的DNA为模板，分别以权利要求8的三对引物对进行PCR扩增，得到三次PCR扩增结果；

(3)凝胶电泳结果判断

分别对步骤(2)的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR扩增产物大小为248bp和207bp时，表明检测样品中的根肿菌存在基因PBRA003268 和基因Novel512，判断检测对象是根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种，其基因类型为P4-1；当PCR扩增产物大小为248bp和469bp时，表明检测样品中的根肿菌存在基因PBRA003268和基因Novel137，判断检测对象是根肿病菌(P. brassicae)4号生理小种，基因类型为P4-2；当PCR扩增产物大小为248bp、207bp 和469bp时，表明检测样品中的根肿菌存在基因PBRA003268、基因Novel512和基因Novel137三个基因，判断检测对象是根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种，其基因类型为P4-3。

本发明还提供上述特异性基因和引物对在白菜(Brassicarapekinensis),萝卜(RaphanussativusL.),青菜(Brassicachinensisvarchinensis),油菜(BrassicanapusL.),芥菜(Brassicajuncea(L.)Czern.etCoss.),甘蓝(BrassicaoleraceaL),花菜(BrassicaoleraceaL.var.botrytisL.),苋菜(AmaranthustricolorL.),小白菜(BrassicacampestrisL.ssp.ChinensisMakino(var.communisTsenetLee))中检测根肿菌(P.brassicae)4号生理小种的应用。

以及，本发明还提供含有上述三对特异性引物对的检测试剂盒。

优选地，该试剂盒还包括PBRA003268-F和PBRA003268-R，Novel512-F和Novel512-R、Novel137-F和Novel137-R三个引物对，2×MasterMix聚合酶混合液，根肿菌标准4号生理小种的DNA溶液阳性对照及ddH₂O。

特别优选地，所述检测试剂盒中的反应体系为10μL，待测样品DNA浓度 100～200ng,上游引物(PBRA003268-F，Novel512-F，Novel137-F)共1μL、下游引物(PBRA003268-R，Novel512-R，Novel137-R)共1μL，2×MasterMix聚合酶混合液5μL，ddH₂O2.5μL。

所述特异性引物应用于根肿菌基因类型检测鉴定的反应条件优选为94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环25次，72℃延伸10min。不高于30个循环数是根肿菌生理小种鉴定的关键。

本发明还提供上述特异性基因和三对引物对在分析根肿菌4号生理小种的不同基因类型的地理分布中的应用。

本发明通过特异基因PBRA003268及基于该基因而设计的一对特异性引物实现了根肿病菌的检测，能够有效实现4号生理小种与其他生理小种的鉴别，具有高稳定性和高特异性的优势；

进一步，本发明还通过三个基因PBRA003268、Novel512和Novel137及基于此设计的三对特异性引物实现了根肿病菌4号生理小种基因类型的鉴定，有效实现P4-1、P4-2和P4-3共三种基因类型的快速鉴定，同样具有高稳定性和高特异性的优势。

本发明通过检测、分析和结果统计发现，基因PBRA003268存在于所有的4 号生理小种，因此可单独用于检测根肿菌(P.brassicae)4号生理小种。此外，大部分4号生理小种还具有基因Novel512(命名为P4-1)，小部分4号生理小种还具有基因Novel137(命名为P4-2)，极少数的4号生理小种同时具有Novel512 和Novel137这两个基因(命名为P4-3)。通过分析各检测样品在四川的分布发现， P4-1主要集中在成都平原及临近区域，P4-2集中于凉山、西昌和阿坝等高海拔地区，P4-3在四川省仅鉴定到一个分离物。由此可见，4号生理小种间存在特异的基因类型，这种不同的基因类型与四川的地理分布具有相关性。

通过本发明的检测方法和试剂盒可以直接对感病植物组织总DNA进行PCR 鉴定，现对于现有技术中必须先对样品进行前处理、收集根肿菌休眠孢子进行检测，本发明具有操作简化、所需材料少的特点，能够适用于不同地区、不同侵染时期的植物组织的根肿菌生理小种鉴定。

此外，利用本发明的检测方法鉴定根肿病菌4号生理小种耗时约5h，对比现有技术中利用鉴别寄主则需要40天的耗时，显著提高了检测效率；

此外，本发明还实现了区分4号生理小种的不同基因类型的快速检测，通过应用于田间动态变化监测，可以有针对性地应用抗病品种，并为抗病品种的合理布局提供指导依据。

【附图说明】

图1为实施例1中各样品的电泳结果；

图2为实施例2中各田间样品的电泳结果；

图3为实施例3的寄主植物的电泳结果；

图4不同循环数的PCR扩增结果对比。

【具体实施方式】

以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。

在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”为重量百分比，“：”为重量比，“份”为重量份。

本发明涉及以下试剂及仪器：核酸染料、琼脂糖、蛋白酶K购于上海生物工程有限公司；2×TaqMasterMix、DNAMarker2000天根生化科技有限公司；台式高速冷冻离心(Eppendorf,5424R,上海)、PCR扩增仪(Eppendorf)、电泳仪 (DYY-6C型，北京六一仪器厂)、凝胶成像仪(MniversalHoodⅡ,Bio-Rad)、超微量分光光度计(ThermoScientific,Nanodrop2000，美国)。

实施例1不同生理小种的分子鉴定

通过PBRA003268、Novel512和Novel137三个基因的序列分析，考虑引物 GC含量在45％-60％之间，上下游引物退火温度无太大差异的基础上，同时注重区别于寄主的同源序列，最终设计获得引物GC含量约为55％，退火温度在 52-56℃之间的三对引物，序列如下：

表1.引物序列

本实施例涉及以下PCR反应体系

表2.10μL反应体系如下：

25μL反应体系如下：

50μL反应体系如下：

上述反应体系的反应条件：

94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环25 次，72℃延伸10min。

其中，退火温度在53～55℃范围内都可以实现PCR的扩增，例如将退火温度设定为53℃、54℃、55℃。其中，循环次数在25～30次均可实现本发明的目的，例如将循环次数设为25次、26次、27次、28次、29次和30次。

选取本实验室依据现有技术已鉴定的根肿病菌2号生理小种、4号生理小种、 5号生理小种、7号生理小种、9号生理小种、10号生理小种和11号生理小种作为待测样品。

1、DNA提取

(1)肿根的DNA提取

将获得收集到的肿根于流水下冲洗干净，75％酒精消毒约5分钟，采用CTAB 法提取肿根DNA。具体步骤如下：将肿根切碎，置于研钵中，在液氮中研磨至粉末状，装入2mL离心管，加入1mL65℃预热的CTAB和15μLβ-巯基乙醇，充分混匀，65℃水浴60min后10000rpm离心10min，小心吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，上下颠倒温和混匀，10000rpm离心10min，重复此步骤1～2次；收集上清液至2mL离心管，迅速加入等体积的异丙醇，置于-20℃冰箱中冷冻30min以上，12000rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加 1mL70％乙醇，12000rpm离心10min，弃上清；将空管再离心30s，去乙醇，晾干沉淀；无酒精味后加入50μLddH₂O。

(2)根肿菌休眠孢子的DNA提取

根肿菌休眠孢子收集：将获得收集到的肿根于流水下冲洗干净，75％酒精消毒约5分钟，蒸馏水冲洗3次，加蒸馏水于搅拌机中搅成匀浆，8层灭菌纱布过滤，得到的滤液500rpm离心10min，去沉淀，上清液转入新离心管，3100rpm 离心10min，弃上清，向沉淀中加入无菌水，3100rpm离心10min，重复此步骤两次。得到休眠孢子沉淀冻存备用。

根肿菌休眠孢子DNA提取：采用CTAB法，将以上提取获得的休眠孢子置于研钵，在液氮中研磨至粉末状，装入2mL离心管，加入1mL65℃预热的CTAB 和15μLβ-巯基乙醇，充分混匀，65℃水浴60min后10000rpm离心10min，小心吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，上下颠倒温和混匀， 10000rpm离心10min，重复此步骤1～2次；收集上清液至2mL离心管，迅速加入等体积的异丙醇，置于-20℃冰箱中冷冻30min以上，12000rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加1mL70％乙醇，12000rpm离心10min，弃上清；将空管再离心30s，去乙醇，晾干沉淀；无酒精味后加入50μLddH₂O。

2、PCR扩增鉴定

分别利用PBRA003268-F、PBRA003268-R所示的第一对引物，Novel512-F、Novel512-R所示的第二对引物，Novel137-F、Novel137-R所示的第三对引物对各样品进行PCR扩增。

反应体系为10μL：待测样品DNA溶液0.5μL，上游引物0.5μL、下游引物 0.5μL，2×MasterMix聚合酶混合液5μL，ddH₂O3.5μL，其中DNA浓度100～200ng。反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环25次，72℃延伸10min。

所得PCR扩增产物分别通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。

表3实施例1所使用的根肿菌菌株

从图1可以看出，利用本发明所有引物对不同生理小种DNA进行PCR检测， ddH₂O为对照，7号生理小种(菌株LX,KD)，10号生理小种(菌株LZ)，5号生理小种(菌株JX)，2号生理小种(菌株HRB)，11号生理小种(菌株ES)和 9号生理小种(菌株NC)均不能扩增出相应目的条带；所有4号生理小种(包括菌株DY,SL,LJ,XC)均能产生引物对1(PBRA003268-F，PBRA003268-R) 所代表的目的片段248bp；其中菌株DY,SL,LJ能产生引物对1(PBRA003268-F， PBRA003268-R)和2(Novel512-F，Novel512-R)所对应的条带248bp和207bp，表明为4号生理小种的基因类型P4-1；菌株XC能扩增引物对1(PBRA003268-F， PBRA003268-R)和3(Novel137-F，Novel137-R)所对应的条带248bp和469bp，表明为4号生理小种的基因类型P4-2。所有引物扩增条带均明亮，无杂带干扰，表明引物特异性好，可将4号生理小种与其他测试的生理小种区分开。

实施例2田间样品休眠孢子的分子鉴定

从四川、重庆等15个不同地区采集未知根肿病发病材料作为待测样品，以 ddH₂O为空白对照检验本发明中的引物对的实用性，并以Willams鉴别系统的鉴定结果作为对比。

1、休眠孢子制备

将获得收集到的肿根于流水下冲洗干净，切碎，75％酒精消毒约5分钟，蒸馏水冲洗3次，加蒸馏水于搅拌机中搅成匀浆，8层灭菌纱布过滤，得到的滤液 500rpm离心10min，去沉淀，上清液转入新离心管，3100rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加入无菌水，3100rpm离心10min，重复此步骤两次。得到休眠孢子沉淀冻存备用。

表4.实施例2中的田间样品

2、休眠孢子DNA提取

采用CTAB法提取根肿病菌休眠孢子DNA。具体步骤如下：将得到的休眠孢子置于研钵中，在液氮中研磨至粉末状，装入2mL离心管，加入1mL65℃预热的CTAB和15μLβ-巯基乙醇，充分混匀，65℃水浴60min后10000rpm离心 10min，小心吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，上下颠倒温和混匀，10000rpm离心10min，重复此步骤1～2次；收集上清液至2mL离心管，迅速加入等体积的异丙醇，置于-20℃冰箱中冷冻30min以上，12000rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加1mL70％乙醇，12000rpm离心10min，弃上清；将空管再离心30s，去乙醇，晾干沉淀；无酒精味后加入50μLddH₂O。

3、引物实用性的验证

针对4号生理小种，提供的三对特异性引物就15个根肿菌田间样品DNA 进行PCR检测。由图2可知，样品3,6,8,12,14,15为非4号生理小种，样品1, 2,4,5,7,9,10,11,13能产生引物对1(PBRA003268-F，PBRA003268-R)所对应的条带248bp，为4号生理小种(P4)。其中，样品4,7,9,10,13能扩增出引物对1(PBRA003268-F，PBRA003268-R)和2(Novel512-F，Novel512-R)所对应的条带248bp和207bp，为P4-1；样品2,5,11能扩增出引物对1(PBRA003268-F，PBRA003268-R)和3(Novel137-F，Novel137-R)所对应的条带248bp和469bp，为P4-2；样品1能扩增出引物对1(PBRA003268-F， PBRA003268-R)，引物对2(Novel512-F，Novel512-R)和引物对3(Novel137-F， Novel137-R)所对应的条带248bp，207bp和469bp，为P4-3。

实施例3不同循环数的PCR鉴定结果分析

将实施例2中的15个不同地区田间样品作为实验材料，设置4个不同循环数，分别为25循环，30循环，33循环和40循环，以ddH₂O为空白对照，寻找最适的PCR循环数。

从图3可以看出，PCR扩增的循环数在25～30之间，只有4号生理小种的样品琼脂糖凝胶电泳时可以检测到的条带；循环数在30～33时非4号生理小种样品出现淡条带，但比4号生理小种对应菌株的条带浅；循环数在33～40间时，有的非4号小种对应的条带与4号生理小种对应条带基本一样。因此，选取25～30 作为PCR检测的最适循环数。

对照例1

选取9种常见的自然生长的十字花科寄主植物的根，包括白菜(Brassicarapekinensis)、萝卜(RaphanussativusL.)、青菜(Brassicachinensisvarchinensis)、油菜(BrassicanapusL.)、芥菜(Brassicajuncea(L.)Czern.etCoss.)、甘蓝(BrassicaoleraceaL)、花菜(BrassicaoleraceaL.var.botrytisL.)、苋菜(AmaranthustricolorL.)和小白菜(BrassicacampestrisL.ssp.ChinensisMakino(var.communisTsenet Lee)))，和4号生理小种菌株DY、XC，七号生理小种菌株LX分别混匀，以ddH₂O 为阴性对照，利用本发明提供的三对引物进行PCR扩增，得到如图4的检测结果。

图中，1～9为九种寄主根部提取的DNA分别与根肿病菌2/5/7/9/10/11号生理小种的混合DNA的混合物，11～19为九种寄主植物根部提取的DNA分别与4 号生理小种代表菌株DY(引物对1和2中使用)、XC(引物对3中使用)，10 为ddH₂O对照。由图4可知，生理小种2/5/7/9/10/11的混合DNA分别与九种不同寄主植物DNA混合之后经PCR扩增仍未出现条带，而4号生理小种的DNA (DY和XC菌株)与寄主DNA分别混匀后进行PCR出现了明亮切单一的条带，这表明了寄主的DNA不会对引物的特异性造成影响，因此可以将感染根肿病的植物组织直接用于分子鉴定，而不需要制备休眠孢子。

综上所述，本发明通过特异性引物实现了根肿病菌的检测，能够有效实现4 号生理小种与其他生理小种的鉴别，能够实现4号生理小种的基因类型检测，具有高稳定性和高特异性的优势；

进一步，本发明还通过三对特异性引物实现了根肿病菌4号生理小种基因类型的鉴定，有效实现P4-1、P4-2和P4-3共三种基因类型的快速鉴定，同样具有高稳定性和高特异性的优势，为进一步的抗病品种研究提供指导依据。

序列表

<120> 鉴定根肿病菌4号生理小种的特异基因、特异性引物、含有所述引物的试剂盒及其应用

<130> 18044

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 996

<212> DNA/RNA

<213> PBRA003268(人工合成)

<400> 1

atgatcacca agatcgtcgt tgttgccgtc gcgtgggcat tggcgacagc atccgggtcg 60

gggacgttgg agactatgaa ccagcgggtg gacatcagag gtattgacaa ggtcgaactg 120

ctacacgcac tctggcagaa taggaaaccc gccctgtact tctatggatc gggcgctcct 180

gcacccgcat tcgaccatgc gaaggccggg ggcgccgtgc tgcgccacat tgactacttc 240

gaaggtcgct gcatcaagac cgacttgtcc gggaatacgg cgaatgcgtg gttttacgat 300

cacgatacgg ggcccggtac gttccagcgc atcgtccaag agctccgtca gagcagttcg 360

gcggatgcgt cttggtacga tcacgatacg gggtccggta cgtcccagca catcgtccaa 420

gagctccgtc agagcagcag cgaccgcaag cccgcagtct gcttgccttg gggctgtctg 480

tactggtggt tctggtgaat gatcaccaag atcgtcgttg ttgccgtcgc gtgggcattg 540

gcgacagcat ccgggtcggg gacgttggag actatgaacc agcgggtgga catcagaggt 600

attgacaagg tcgaactgct acacgcactc tggcagaata ggaaacccgc cctgtacttc 660

tatggatcgg gcgctcctgc acccgcattc gaccatgcga aggccggggg cgccgtgctg 720

cgccacattg actacttcga aggtcgctgc atcaagaccg acttgtccgg gaatacggcg 780

aatgcgtggt tttacgatca cgatacgggg cccggtacgt tccagcgcat cgtccaagag 840

ctccgtcaga gcagttcggc ggatgcgtct tggtacgatc acgatacggg gtccggtacg 900

tcccagcaca tcgtccaaga gctccgtcag agcagcagcg accgcaagcc cgcagtctgc 960

ttgccttggg gctgtctgta ctggtggttc tggtga 996

<210> 3

<211> 411

<212> DNA/RNA

<213> Novel512(人工合成)

<400> 3

agaaacagaa cgcatatgat tacccatcat agcatggacg acacacgtat attagaatgc 60

cagaagcaac gcgaaacaga taccgagtga tgagcccgta ctgccagccg ttactgtacg 120

cgagcacatg gactggacga cattcagagc aggcaggcac cgatcggcat gtaggcaggg 180

agctggacga tgcccctgat tgggcggacc gccttccacc actggtccag tgcagtagcg 240

ggcacgacca attacaacca tcgacgtgac gccaaggaat tcccctcagc tggggggcag 300

gtcggctcga cgcggtcccg cctcgcctac gcataacgag tgctgcgttg cacgccctta 360

tgcttgacag gagacagcag gcgacgacag gcgtgtccgg agcagaacgt g 411

<210> 4

<211> 792

<212> DNA/RNA

<213> Novel137(人工合成)

<400> 4

ttccacccga aactcacccg agtttattgc ctacgacgtt gttgttttgc gctaagacag 60

gaacgcagaa acaacgcgtc attcaccgtt actggtttct gtagcgatcg gcgatttgtc 120

accaggttgc tagcgtcaga gcaattgcat tctggcttcg aacttgacgc tggaacgcat 180

agaacatgcc gggcaactct cgacagaata gggtagtttg gtgagtggtg gactggtggc 240

gcaacgtagg agcctgctaa tcaccgtcag tagttcgaat actgcgtcgg aggcttacgt 300

aggtgtgttg gtgtccgtta ttgcctttct gcagcttcac aggctgttcg tcagcagcac 360

tgcggcgtct cgctgaagac ctggtgggcc accaggtccc acaacgcggc ttctccaaat 420

agtgttctga gctcaggtgc agccccggac ttgcggactc cgcagacagc cgccgcccgg 480

tagacgaccg catggttggc ctatcgcagc aggctgcagt ccgcaggcag acaaaaatgg 540

actctcactc tgtatcgcgg gatgttgttg atggtgcggg cagccgagca ctgatttatt 600

gtacatggcg gcgcccaccc gtatccaccc gtatgccgta atgtttggcg cctacccgcc 660

cgtacccgcc cgtctcataa tttccgttac ccgaaccctg cccaaaccct acgggtacgg 720

gtgggtaagc gggtgggtac gggtacgggt acccgatgca atactctgct gcacgtgccc 780

attgctgttt ca 792

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物PBRA003268-F(人工合成)

<400> 2

gaataggaaa cccgccctgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物PBRA003268-R(人工合成)

<400> 5

cgtgatcgta ccaagacgca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物Novel512-F(人工合成)

<400> 7

gagtgatgag cccgtactgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物Novel512-R(人工合成)

<400> 6

agctgagggg aattccttgg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物Novel137-F(人工合成)

<400> 8

acgctggaac gcatagaaca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物Novel137-R(人工合成)

<400> 9

catacgggtg gatacgggtg 20

Claims

1.PBRA003268基因在检测根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种中的应用，所述基因的序列如SEQ No.1所示。

2.用于检测根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种的特异性引物对，所述引物包括：

PBRA003268-F：gaataggaaacccgccctgt

PBRA003268-R：cgtgatcgtaccaagacgca。

3.根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)待检测样品的制备

(2)PCR扩增

以步骤(1)的DNA为模板，用权利要求2的特异引物对PBRA003268-F和PBRA003268-R进行PCR扩增；

(3)凝胶电泳结果判断

对步骤(2)的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当扩增产物大小为248bp时表明检测样品中的DNA中具有根据权利要求1所述的基因PBRA003268，判断该检测样品含有根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(1)中，待检测样品是提纯的根肿菌休眠孢子，或待检测植株的根瘤。

5.权利要求1的特异基因PBRA003268在白菜(Brassica rape kinensis)、萝卜(Raphanus sativus L.)、青菜(Brassica chinensis var chinensis)、油菜(Brassicanapus L.)、芥菜(Brassicajuncea(L.)Czern.et Coss.)、甘蓝(Brassica oleracea L)、花菜(Brassica oleracea L.var.botrytis L.)、苋菜(Amaranthus tricolor L.)或小白菜(Brassica campestris L.ssp.Chinensis Makino(var.communis Tsen et Lee))中检测根肿菌4号生理小种的应用。

6.含有权利要求2所述的特异性引物对的检测试剂盒。

7.用于检测根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种的基因类型的特异基因，所述特异基因包括如SEQ No.1所示的基因PBRA003268、如SEQ No.2所示的基因Novel512和/或如SEQNo.3所示的基因Novel137。

8.用于检测根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种的基因类型的特异性引物对，所述引物包括：

用于检测如SEQ No.1所示的PBRA003268的引物：

PBRA003268-F：gaataggaaacccgccctgt

PBRA003268-R：cgtgatcgtaccaagacgca

用于检测如SEQ No.2所示的Novel512的引物：

Novel512-F；gagtgatgagcccgtactgc

Novel512-R：agctgaggggaattccttgg

用于检测如SEQ No.3所示的Novel137的引物：

Novel137-F：acgctggaacgcatagaaca

Novel137-R：catacgggtggatacgggtg。

9.根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种的基因类型的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)待检测样品的制备

(2)PCR扩增

(3)凝胶电泳结果判断

分别对步骤(2)的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR扩增产物大小为248bp和207bp时，表明检测样品中的根肿菌存在基因PBRA003268和基因Novel512，判断检测对象是根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种，其基因类型为P4-1；当PCR扩增产物大小为248bp和469bp时，表明检测样品中的根肿菌存在基因PBRA003268和基因Novel137，判断检测对象是根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种，基因类型为P4-2；当PCR扩增产物大小为248bp、207bp和469bp时，表明检测样品中的根肿菌存在基因PBRA003268、基因Novel512和基因Novel137三个基因，判断检测对象是根肿病菌(P.brassicae)4号生理小种，其基因类型为P4-3。

10.权利要求7的特异性基因和权利要求8所述的引物对在白菜(Brassica rapekinensis),萝卜(Raphanus sativus L.),青菜(Brassica chinensis var chinensis),油菜(Brassica napus L.),芥菜(Brassica juncea(L.)Czern.et Coss.),甘蓝(Brassicaoleracea L),花菜(Brassica oleracea L.var.botrytis L.),苋菜(Amaranthustricolor L.),小白菜(Brassica campestris L.ssp.Chinensis Makino(var.communisTsen et Lee))中检测根肿菌(P.brassicae)4号生理小种的应用。

11.含有权利要求8所述的特异性引物对的检测试剂盒。

12.权利要求7的特异性基因和权利要求8所述的引物对在分析根肿菌4号生理小种的不同基因类型的地理分布中的应用。