CN110117592A - 一种基于rpa快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法。本发明提供的引物对由序列表的序列1和序列2所示的两条引物组成。本发明还建立了水稻恶苗病菌藤仓镰孢的快速检测方法。本发明中所设计的引物可以有效扩增靶基因,特异性和灵敏性更高,可用于由水稻恶苗病菌藤仓镰孢的快速检测,精准防控该病害的发生与流行。

Description

一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法
技术领域
本发明涉及植物保护领域,具体涉及一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法。
背景技术
水稻恶苗病(rice bakanae disease)是严重影响水稻生长发育的真菌病害之一,通过带菌种子进行传播,病稻草也是其主要初侵染源。在我国分布广泛,其发生严重时可致使水稻减产50%以上。其发病症状主要表现为叶鞘叶片狭长,叶色呈现淡黄色,发病植株徒长,相较健康植株细高,而根系发育不良,根长变短且有倒生根,根毛少。水稻种子萌发后,病菌从芽鞘、根与根冠等部位侵染秧苗致病。病株上产生的恶苗病菌的分生孢子可从伤口侵入秧苗,引起发病。水稻开花时,病菌的分生孢子传染到健康的小穗上,最终形成带菌种子。在机械脱粒时,病种子的分生孢子会污染其他无病种子,致使其带菌,再次引起病菌的扩散。因而,水稻的全生长季都可能感染恶苗病菌,引起发病。
近年来,水稻恶苗病在我国的发病率逐渐上升,发病面积愈来愈大,严重影响我国水稻生产。水稻恶苗病菌的有性态为藤仓赤霉复合种(Gibberella fujikuroi speciescomplex,GFC)。目前研究表明,水稻恶苗病主要由层出镰孢(F.proliferatum)、拟轮枝镰孢(F.verticillioides)、藤仓镰孢(F.fujikuroi)和F.andiyazi导致的。其中层出镰孢、拟轮枝镰孢、藤仓镰孢为藤仓赤霉的复合种(GFC)。GFC复合种至少由10个不同交配群(A-J)组成,拟轮枝镰孢属于交配群A,藤仓镰孢属于交配群C,层出镰孢属于交配群D。GFC复合种种内成员形态特征非常相似,难以区分,藤仓镰孢与层出镰孢的一些基因序列也非常相似。藤仓镰孢是水稻恶苗病的主要病原菌,致病力最强,分布最广。
目前应用的水稻恶苗病病原菌的检测方法包括传统的鉴定方法和基于PCR的分子生物学技术。但这些技术检测结果准确度偏低,检测所需时间较长,或依赖于精密的仪器设备等。因此,建立便捷、特异、高效的水稻恶苗病菌藤仓镰孢的检测方法迫在眉睫。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)技术是高效、特异的核酸等温扩增技术。该技术由多种酶和蛋白参与,仅需设计2条特异性引物,在20分钟内即可实现核酸指数扩增的新技术,具有反应灵敏、操作简便的特点。RPA技术自开发以来,已被应用于生命科学等多个领域,为农业生产上的病害鉴定与检测也提供了更高效的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法。
本发明首先保护引物对,由引物F和引物R组成;
所述引物F为如下(a1)或(a2):
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子;
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子;
所述引物R为如下(a3)或(a4):
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子;
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
所述引物F根据编码链设计;所述引物R根据互补链设计。
所述引物对的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢;
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢的试剂盒;
(b3)检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢;
(b4)制备用于检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢的试剂盒。
本发明还保护所述引物对的应用,为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢;
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢的试剂盒;
(b3)检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢;
(b4)制备用于检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物对的试剂盒;所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2):
(c1)鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢;
(c2)检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法,包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢的方法,包括如下步骤:
(1)提取待测病菌的总DNA;
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板,采用所述引物对进行重组酶聚合酶扩增,如果PCR扩增产物中含有184bp±5bp的DNA片段、待测病菌为或候选为藤仓镰孢,如果PCR扩增产物中不含有184bp±5bp的DNA片段、待测病菌为或候选为非藤仓镰孢。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢的方法,包括如下步骤:
检测待测病菌的总DNA中是否含有特异DNA片段,如果含有特异DNA片段、待测病菌为或候选为藤仓镰孢,如果不含有特异DNA片段、待测病菌为或候选为非藤仓镰孢;
所述特异DNA片段为藤仓镰孢的总DNA中所述的引物对的靶序列。
本发明还保护一种检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢的方法,包括如下步骤:
(1)提取待测生物样本的总DNA;
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板,采用所述引物对进行重组酶聚合酶扩增,如果PCR扩增产物中含有184bp±5bp的DNA片段、待测生物样本中含有或疑似含有藤仓镰孢,如果PCR扩增产物中不含有184bp±5bp的DNA片段、待测生物样本中不含有或疑似不含有藤仓镰孢。
本发明还保护一种检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢的方法,包括如下步骤:
检测待测样本的总DNA中是否含有特异DNA片段,如果含有特异DNA片段、待测生物样本中含有或疑似含有藤仓镰孢,如果不含有特异DNA片段、待测生物样本中不含有或疑似不含有藤仓镰孢;
所述特异DNA片段为藤仓镰孢的总DNA中所述引物对的靶序列。
以上任一所述重组酶聚合酶扩增的方法具体可为如下所示:
(1)向1.5ml离心管中依次加入ddH2O 12.2μL、干粉溶解缓冲液(Rehydrationbuffer)29.5μL、引物F溶液、引物R溶液各2.4μL、模板DNA溶液1μL。
引物F溶液中引物F的浓度为10μmol/L,引物R溶液中引物R的浓度为10μmol/L。
(2)将(1)配置的再水合溶液转移至冻干Basic反应微球中,吹打混匀直到整个微球重悬,加入2.5μL 280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀,得到反应体系。将反应体系置于39℃的金属浴上反应20min。
以上任一所述184bp±5bp的DNA片段具体可为184bp的DNA片段。
以上任一所述待测病菌具体可为藤仓镰孢(F.fujikuroi)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、稻曲菌(Ustilaginoidea virens)、稻瘟菌(Magnaportheoryzae)、禾谷镰孢(F.graminearum)和木贼镰孢(F.equiseti)。
以上任一所述待测生物样本具体可为生物组织,更具体可为水稻或小麦组织。
以上任一所述藤仓镰孢为水稻恶苗病菌。
本发明提供了一对用于检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的特异引物,并建立了水稻恶苗病菌藤仓镰孢的快速检测方法。本发明中所设计的引物可以有效扩增靶基因,特异性和灵敏性更高,可用于由水稻恶苗病菌藤仓镰孢的快速检测,精准防控该病害的发生与流行。
附图说明
图1为利用特异引物对对水稻恶苗病菌藤仓镰孢进行特异性筛查的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为分子量标记(marker)DL2000,1-8依次对应藤仓镰孢(F.fujikuroi)相关材料、立枯丝核菌(R.solani)相关材料、稻曲菌(U.virens)相关材料、稻瘟菌(M.oryzae)相关材料、健康水稻叶片相关材料、禾谷镰孢(F.graminearum)和木贼镰孢(F.equiseti)相关材料及阴性对照的扩增产物。
图2利用特异引物对对水稻恶苗病菌藤仓镰孢进行灵敏度筛查的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为分子量标记(marker)DL2000,1-7依次对应10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6个稀释度DNA以及阴性对照的扩增产物。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
水稻恶苗病菌藤仓镰孢(具体为藤仓镰孢YC3菌株)记载于文献:陈子豪.藤仓镰孢菌对多菌灵抗药性分子机制及检测方法研究[D].2014.;公众可以从中国农业大学获得。
水稻纹枯病立枯丝核菌(具体为立枯丝核菌C30)记载于文献:几丁质识别受体与Xa21的嵌合基因对水稻真菌病害的抗性研究[D].2013.;公众可以从中国农业大学获得。
稻曲菌(具体为稻曲菌UV-8b)记载于文献:郑大伟.稻曲病菌基因敲除体系的建立及HOG1基因在稻曲病菌和禾谷镰刀菌中功能验证[D].2015.;公众可以从中国农业大学获得。
稻瘟菌及其分离方法记载于文献:杨军,薛芳,王海凤,et al.水稻稻瘟病菌单孢分离技术及常见问题分析[J].山东农业科学,2017(02):138-141.;公众可以从中国农业大学获得。
小麦赤霉病菌禾谷镰孢(具体为菌株PH-1)记载于文献:郑大伟.稻曲病菌基因敲除体系的建立及HOG1基因在稻曲病菌和禾谷镰刀菌中功能验证[D].2015.;公众可以从中国农业大学获得。
小麦木贼镰孢(具体为菌株y-35-1)记载于文献:魏荐郦.四川省小麦赤霉病与玉米茎腐病相互关系的研究[D].2015.;公众可以从中国农业大学获得。
健康水稻叶片记载于文献:张莉.华南早籼型水稻保持系的筛选与分子标记分析[D].广西大学,2018.;公众可以从中国农业大学获得。
实施例1、水稻恶苗病菌藤仓镰孢的RPA检测核苷酸引物组合筛选
一、引物设计
1.进行大量序列分析、比对获得了用于检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的6条引物(如表1所示)。
表1用于检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的RPA引物序列
引物名称 引物序列(5'-3')
F1 CCATTCAACACATACATCCGCCACCTCACT
F2 CAACACATACATCCGCCACCTCACTGAACAAGAC
F3 ACATACATCCGCCACCTCACTGAACAAGAC
R1 CTAGGAGATGGTCGCTTAGAGTAGGTAGATCAAGG
R2 TTCGTTGGATCGTATCTGTAGCCGAGGATTGGT
R3 CTAGGAGATGGTCGCTTAGAGTAGGTAGATCAAGG
2.将步骤1设计的6条引物组合成3对引物组合(如表2所示)。
表2 RPA引物组合及产物大小
编号 引物组合 产物大小(bp)
T1 F1R1 193
T2 F2R2 152
T3 F3R3 184
二、最佳引物组合的筛选
1.将水稻恶苗病菌藤仓镰孢接种至PDA平板上,25℃黑暗培养7天,用无菌接种针刮取菌丝至无菌离心管,CTAB法提取菌丝DNA。
2.以步骤1得到的菌丝DNA为模板,采用表2所示的3种引物组合分别进行RPA反应。
RPA反应体系的配置方法如下:
(1)配置再水合溶液
向1.5ml离心管中依次加入ddH2O 12.2μL、干粉溶解缓冲液(Rehydrationbuffer)29.5μL、上游引物溶液、下游引物溶液各2.4μL、模板DNA溶液1μL。
上游引物溶液中上游引物的浓度为10μmol/L,
下游引物溶液中下游引物的浓度为10μmol/L。
模板DNA溶液中,DNA的浓度为86.19ng/μL。
(2)将(1)配置的再水合溶液转移至冻干Basic反应微球中,吹打混匀直到整个微球重悬,加入2.5μL 280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀,得到反应体系。
上述反应中使用的试剂均来自Basic试剂盒(英国TwistDx),试剂用量参照Basic试剂盒说明书。
将反应体系置于39℃的金属浴上反应20min。
同时设置采用健康水稻叶片的总DNA代替水稻恶苗病菌藤仓镰孢菌丝DNA的阴性对照。
3.完成步骤2后,将50μL反应产物与等体积的(Tri饱和酚:氯仿=1:1,体积比)混合,12000rpm室温离心10min,取离心后的上清产物5μL于2%琼脂糖凝胶电泳26min,在凝胶成像系统上观察结果。
引物对(F3和R3)的扩增条带最为清晰特异,无杂带,扩增条带大小为184bp,为检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的最佳PRA引物组合。其余引物对扩增效果较差,条带不够清晰且非特异性杂带较多。
基于上述结果,得到用于水稻恶苗病菌藤仓镰孢的RPA检测的特异引物对,由引物F和引物R组成;
F:5'-ACATACATCCGCCACCTCACTGAACAAGAC-3'(序列1);
R:5'-CTAGGAGATGGTCGCTTAGAGTAGGTAGATCAAGG-3'(序列2)。
实施例2、特异性
供试菌株:水稻恶苗病菌藤仓镰孢、水稻纹枯病立枯丝核菌、稻曲菌、稻瘟菌、小麦赤霉病菌禾谷镰孢和小麦木贼镰孢。
1.将供试菌株接种至PDA平板上,25℃黑暗培养7天,用无菌接种针刮取菌丝至无菌离心管,CTAB法提取菌丝DNA。
2.提取健康水稻叶片的总DNA。
3.取步骤1和2获得的DNA样本,以所述DNA样本为模板,采用引物F和引物R组成的引物对进行RPA反应(反应方法见实施例1中第二部分的步骤2和3)。设置采用ddH20作为模板的阴性对照组。
结果如图1所示。结果表明,只有水稻恶苗病菌藤仓镰孢对应的RPA扩增产物含有1条大小为184bp的目的条带,其他菌株、健康水稻叶片和阴性对照均无条带,由此证明本发明设计的RPA引物对具有高度特异性。
实施例3、灵敏度
1.将水稻恶苗病菌藤仓镰孢接种至PDA平板上,25℃黑暗培养7天,用无菌接种针刮取菌丝至无菌离心管,CTAB法提取菌丝DNA(DNA浓度为861.9ng/μL)。
2.将步骤1得到的菌丝DNA以10倍梯度逐级稀释,分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6个稀释度,得到浓度为86.19ng/μL、8.619ng/μL、8.619×10-1ng/μL、8.619×10-2ng/μL、8.619×10-3ng/μL和8.619×10-4ng/μL的DNA溶液。
3.以步骤2进行不同梯度稀释的DNA样本为模板,采用引物F和引物R组成的引物对进行RPA反应(反应方法见实施例1中第二部分的步骤2和3)。
设置采用ddH20作为模板的阴性对照组。
结果如图2所示。
结果表明,本方法的灵敏度浓度为8.619×10-1ng/μL。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acatacatcc gccacctcac tgaacaagac 30
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaggagatg gtcgcttaga gtaggtagat caagg 35

Claims (8)

1.引物对,由引物F和引物R组成;
所述引物F为如下(a1)或(a2):
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子;
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子;
所述引物R为如下(a3)或(a4):
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子;
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述的引物对的应用,为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):
(b1)鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢;
(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢的试剂盒;
(b3)检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢;
(b4)制备用于检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢的试剂盒。
3.含有权利要求1所述引物对的试剂盒;所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2):
(c1)鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢;
(c2)检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法,包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢的方法,包括如下步骤:
(1)提取待测病菌的总DNA;
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板,采用权利要求1所述的引物对进行重组酶聚合酶扩增,如果PCR扩增产物中含有184bp±5bp的DNA片段、待测病菌为或候选为藤仓镰孢,如果PCR扩增产物中不含有184bp±5bp的DNA片段、待测病菌为或候选为非藤仓镰孢。
6.一种鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢的方法,包括如下步骤:
检测待测病菌的总DNA中是否含有特异DNA片段,如果含有特异DNA片段、待测病菌为或候选为藤仓镰孢,如果不含有特异DNA片段、待测病菌为或候选为非藤仓镰孢;
所述特异DNA片段为藤仓镰孢的总DNA中权利要求1所述的引物对的靶序列。
7.一种检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢的方法,包括如下步骤:
(1)提取待测生物样本的总DNA;
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板,采用权利要求1所述的引物对进行重组酶聚合酶扩增,如果PCR扩增产物中含有184bp±5bp的DNA片段、待测生物样本中含有或疑似含有藤仓镰孢,如果PCR扩增产物中不含有184bp±5bp的DNA片段、待测生物样本中不含有或疑似不含有藤仓镰孢。
8.一种检测待测生物样本中是否含有藤仓镰孢的方法,包括如下步骤:
检测待测样本的总DNA中是否含有特异DNA片段,如果含有特异DNA片段、待测生物样本中含有或疑似含有藤仓镰孢,如果不含有特异DNA片段、待测生物样本中不含有或疑似不含有藤仓镰孢;
所述特异DNA片段为藤仓镰孢的总DNA中权利要求1所述引物对的靶序列。
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