CN114292944A - 一种与辣椒疫病抗性连锁的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的132bp处，多态性为G/T。本发明方案利用所述分子标记，可以快速准确的检测辣椒的疫病抗性，可用于分子标记辅助选择育种，无需琼脂糖凝胶电泳，可快速、准确、高效、高通量的筛选抗性品种，加快辣椒抗疫病新品种的选育进程。

Description

一种与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农业分子生物学领域，具体涉及一种与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L.)是一种广泛种植的蔬菜。辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici Leonian)是一种病原真菌，最早在美国发现，可侵染辣椒的根、茎、叶、果，目前已在多个国家和地区的辣椒种植区传播，成为威胁辣椒生产的主要病害。疫霉菌可在土壤中长期存活，一旦传入辣椒种植区就难以根治。生产上常用的化学药剂不仅无法根治辣椒疫病，还会使病菌产生抗药性，增加疫病的防治难度。

相比化学药剂防治，培育辣椒抗疫病品种具有安全、环保等特点，在防治疫病方面具有突出优势。目前，相关技术已定位出多个与疫病抗性相关的数量性状基因座(QTL)。但是，辣椒疫病抗性的鉴定需要人为接种相应病菌，易受外界因素影响，测定数据可能出现偏差。目前，可用于辣椒抗疫病品种选育的分子标记较少，并且这些分子标记需要繁琐的凝胶电泳检测，自动化程度低通量小，大大的限制了抗疫病新品种的选育进程。因此，开发辣椒疫病连锁的SNP分子标记，可快速高通量的筛选抗病品种，加快新品种的选育进程，对减少辣椒疫病带来的产量损失具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记。

本发明还提出用于检测上述SNP分子标记的引物组。

本发明还提出一种试剂盒。

本发明还提出一种基因芯片。

本发明还提出上述SNP分子标记、引物组、试剂盒和/或基因芯片的应用。

本发明还提出上述SNP分子标记的检测方法。

根据本发明的第一方面实施方式的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列的132bp处，多态性为G/T。

根据本发明第二方面实施方式的用于扩增上述SNP分子标记的引物组，所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物序列包括Primer X和Primer Y。

在本发明的一些实施方式中，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

根据本发明的一些实施方式，所述SNP分子标记还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的通用引物序列。

在本发明的一些实施方式中，所述特异性引物分别连接FAM和HEX荧光接头序列。

在本发明的一些实施方式中，所述引物组在辣椒基因型检测中的应用。

根据本发明第三方面实施方式，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

根据本发明第四方面实施方式，提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括上述引物组。

根据本发明的第五方面实施方式，上述SNP分子标记、引物组、试剂盒或基因芯片的以下任一应用：

(1)在鉴定或辅助鉴定待测辣椒的辣椒疫病抗性中的应用；

(2)在制备鉴定或辅助鉴定待测辣椒的辣椒疫病抗性的产品中的应用；

(3)在选育具有高等辣椒疫病抗性的辣椒中的应用；

(4)在制备选育具有高等辣椒疫病抗性的辣椒的产品中的应用；

(5)在辣椒育种中的应用；

(6)在制备辣椒育种的产品中的应用。

根据本发明的第六方面实施方式，利用上述SNP分子标记检测辣椒疫病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、从辣椒中提取基因组DNA；

S2、对步骤S1中提取的基因组DNA进行所述SNP分子标记的多态性检测，根据检测结果判断待测辣椒材料的疫病抗性。

在本发明的一些实施方式中，只检测到引物Primer X所对应的碱基，判定测试的辣椒材料不具有疫病抗性或中等疫病抗性；若只检测到引物Primer Y所对应的碱基，判定测试的辣椒材料具有高等疫病抗性，如果同时检测到Primer X与Primer Y对应的荧光信号，则检测位点碱基为G:T，该测试材料为杂合基因型，表现为中等疫病抗性。

在本发明的一些实施方式中，优选地，步骤S1中，辣椒中提取基因组DNA采用简化CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)。

在本发明的一些实施方式中，优选地，步骤S2中，用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术对SNP分子标记进行检测。

一种辣椒育种方法，包括如下步骤：利用上述基因型的检测方法，选择具有高等辣椒疫病抗性的样品进行后续育种。

根据本发明实施方式的与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记，至少具有如下有益效果：结合KASP技术，利用与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记对辣椒样品进行检测，可以快速准确的检测辣椒的疫病抗性。本发明的分子标记可用于识别辣椒疫病抗性，利用分子标记辅助选择育种，无需琼脂糖凝胶电泳，可快速、准确、高效、高通量的筛选抗性品种，加快辣椒抗疫病新品种的选育进程。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的分子标记开发流程图；

图2为本发明实施例1中的Ca900002_K01分子标记的分型图；

图3为本发明实施例1中的分子标记Ca900002_K01在16份辣椒材料中分型结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例为：一种与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记，该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已发表文献中SSR标记信息，在SSR标记连锁区域进行SNP位点挖掘，通过序列对比分析得到SNP位点，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：

1引物设计

根据已发表文献中SSR标记ZL6726在参考基因组中的位置，比对重测序BAM文件，挖掘与该标记连锁的SNP位点，发现在zunla-1参考基因组5号染色体29100832位碱基存在G/T变异，利用BatchPrimer3引物设计网站对其进行引物设计。标记Ca900002_K01由3条引物组成，如表1所示，其中2条特异性引物的5’端分别连接FAM和HEX荧光接头序列。引物委托Invitrogen公司合成，1条通用引物。

分子标记Ca900002_K01核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

TTGAAAGTTAAAAAGAGTAACATTATTAGTAAATGACGTCTAACATTTTGGAATATGAATATCCCAAAATGGAAGAATGACATATACAATAGAGAGACGTATTAGTACTTCAAGGAATAAGTGTGTTAGTA[G/T]CTCCACTCTCCATCCATCAAGTTATTTTTCAACGTCACTATCCTAAATTATAATGTGGAGTTGCAGAAGAAAATAAGATAATCAA(SEQ ID NO.1)。

利用基于KASP反应原理及材料的单碱基差异设计的分子标记，可高通量的对辣椒材料进行疫病抗性检测。如果PCR产物只检测到Primer X对应的荧光信号，则检测位点碱基为G，该测试材料不具有疫病抗性或中等疫病抗性；如果只检测到Primer Y对应的荧光信号，则检测位点碱基为T，该测试材料具有高等疫病抗性；如果同时检测到Primer X与Primer Y对应的荧光信号，则检测位点碱基为G:T，该测试材料为杂合基因型，表现为中等疫病抗性。

表1标记信息

2样品检测

DNA提取：从辣椒叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法，包括以下步骤：

(1)取约30mg叶片至1.3mL 96孔板，并置于冻干机中，抽真空12h或以上；

(2)抽真空结束后，使用分珠器向每孔中加入两粒钢珠，并盖上硅胶膜，置于高通量研磨仪中研磨1min，研磨后置于深孔板离心机中瞬离，将磨碎组织离心到孔底；

(3)用移液工作站TECAN向每孔加CTAB提取液700μL，震荡混匀后置于65℃水浴锅中温浴约1-1.5h，每20min将1.3mL 96孔板取出于漩涡振荡器上振荡数次；

(4)温浴结束后取出1.3mL 96孔板，将其置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm离心10min；

(5)用移液工作站TECAN将每孔380μL上清转移到新的1.3mL 96孔板中，并加入等体积氯仿，颠倒混匀后静置2min，置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心10min；

(6)离心后，用移液工作站TECAN抽取上清液250μL至预先加好250μL异丙醇的0.8mL 96孔板中，漩涡振荡混匀，将其置于-20℃冰箱沉淀1h或以上；

(7)取出0.8mL 96孔板置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心15min；

(8)弃掉上清，用移液工作站TECAN向每孔中加入250μL 70％乙醇，漩涡振荡器上振荡数次，5000rpm，离心15min；

(9)弃掉上清，并置于65℃烘箱中30min将其烘干；

(10)每孔加200μL灭菌超纯水，置于室温过夜溶解备用。

KASP反应测试：KASP反应测试在Douglas Arraytape基因分型平台上进行，反应体系如表2所示，从表中可以看出，PCR扩增反应使用的扩增体系以0.8μL计为：样品DNA20ng-50ng烘干后加入100μM两条特异性引物各0.0013μL，100μM通用引物0.0033μL，2×KASPMaster Mix 0.3945μL，超纯水0.3996μL。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。反应完成后利用Arraytape扫描系统对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

表2 KASP检测的反应体系

	终浓度	体积
			100μM Primer C	0.42μM	0.0033μL
100μM Primer X	0.17μM	0.0013μL
			100μM Primer Y	0.17μM	0.0013μL
2×KASP Master Mix	1×	0.3945μL
			超纯水		0.3996μL
DNA(干燥)		20ng-50ng
			总体积		0.8μL

3标记分型数据

根据上述检测方法，用标记Ca900002_K01对已知基因型的泡椒、丘北辣椒、云泡椒3号、小米辣-1、小米辣-2等5份材料进行KASP反应验证，每份材料15个重复。

分型结果如图2所示，从图中可以看出，泡椒、云泡椒3号、小米辣-1在测试位点碱基为T，表明具有高等疫病抗性；丘北辣椒、小米辣-2在测试位点碱基为G，表明不具有疫病抗性或中等疫病抗性，检测结果与田间表型鉴定结果一致，结果表明，本发明方案提供的标记Ca900002_K01分型准确，可以准确检测辣椒的疫病抗性。

田间表型鉴定：上述各辣椒材料的抗性鉴定采用人工接种鉴定方法，每个材料3次重复，每重复30株，按照中华人民共和国农业行业标准《辣椒抗病性鉴定技术规程第1部分：辣椒抗疫病鉴定技术规程》(NYT 2060.1-2011)进行。

病情指数(DI)＝[∑(病级数值×该病级病株数)×100]/(病级最高值×调查株数)

抗病性划分标准，高等疫病抗性(HR)：病情指数≤10；抗病(R):10<病情指数≤30；中等疫病抗性(MR):30<病情指数≤50；感病(S)：病情指数>50。

4特异性和实用性检测

为检测本发明中标记Ca900002_K01的特异性及实用性，根据上述检测方法，将已知基因型的16份辣椒材料，进行KASP反应分型，每份材料10个重复。

标记分型结果如图3所示，其中6份材料在检测位点碱基为T(分型图中标为蓝色)，具有高等疫病抗性；1份材料在检测位点碱基为G:T(分型图中标为紫色)，表现为杂合型，具有中等疫病抗性；9份材料在检测位点碱基为G(分型图中标为红色)，不具有疫病抗性或中等疫病抗性，与田间表型鉴定结果一致。结果表明，标记Ca900002_K01分型准确，可快速高通量的筛选辣椒疫病抗性品种。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 华智生物技术有限公司

云南省农业科学院园艺作物研究所

<120> 一种与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 217

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgaaagtta aaaagagtaa cattattagt aaatgacgtc taacattttg gaatatgaat 60

atcccaaaat ggaagaatga catatacaat agagagacgt attagtactt caaggaataa 120

gtgtgttagt agctccactc tccatccatc aagttatttt tcaacgtcac tatcctaaat 180

tataatgtgg agttgcagaa gaaaataaga taatcaa 217

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttgatggat ggagagtgga gc 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acttgatgga tggagagtgg aga 23

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaagaatga catatacaat agagagacgt 30

Claims (10)

1.一种与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于如SEQID NO.1所示的核苷酸序列的132bp处，多态性为G/T。

2.用于扩增如权利要求1所述的与辣椒疫病抗性连锁的SNP分子标记的引物组。

3.如权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括特异性引物，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述特异性引物分别连接FAM和HEX荧光接头序列。

5.如权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括通用引物，所述通用引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2-5任一项所述的引物组。

7.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括如权利要求2-5任一项所述的引物组。

8.如权利要求1所述的SNP分子标记、权利要求2-5任一项所述的引物组、权利要求6所述的试剂盒或权利要求7所述的基因芯片的以下任一应用：

(1)在鉴定或辅助鉴定待测辣椒的辣椒疫病抗性中的应用；

(2)在制备鉴定或辅助鉴定待测辣椒的辣椒疫病抗性的产品中的应用；

(3)在选育具有高等辣椒疫病抗性的辣椒中的应用；

(4)在制备选育具有高等辣椒疫病抗性的辣椒的产品中的应用；

(5)在辣椒育种中的应用；

(6)在制备辣椒育种的产品中的应用。

9.利用如权利要求1所述的SNP分子标记检测辣椒疫病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、从辣椒中提取基因组DNA；

S2、对步骤S1中提取的基因组DNA进行所述SNP分子标记的多态性检测，根据检测结果判断待测辣椒材料的疫病抗性。

10.一种辣椒育种方法，其特征在于，包括如下步骤：根据如权利要求9所述方法，选择具有高等辣椒疫病抗性的样品进行后续育种。

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