CN115927699B - 一种鉴定抗疫病辣椒种质的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定抗疫病辣椒种质的分子标记及其应用，所述分子标记为SNPs分子标记组合，由PcRM07‑96、PcRM10‑233和PcRM12‑0.4组成，分别对应辣椒基因组的7号染色体96,534,770位置、10号染色体233,316,777位置和12号染色体494,846位置。利用本发明提供的分子标记及其扩增引物，结合特定的限制性内切酶处理，可在苗期快速、准确鉴定抗疫病辣椒种质，可用于辣椒抗疫病种质的分子标记辅助选择，提高育种选择效率，可准确高效的筛选出聚合不同抗源的抗疫病辣椒种质。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记检测技术，具体地说，涉及一种鉴定抗疫病辣椒种质的分子标记及其应用。
背景技术
辣椒疫病（Phytophthora blight）是由疫霉菌（Phytophthora capsici L.）侵染引起的一种土传性病害，自1918年在美国新墨西哥州被首次发现以来（Leonian, 1922），辣椒疫病就成为制约辣椒生产的一种毁灭性病害。中国是辣椒种植面积最大的国家，辣椒疫病在我国南北方地区均为害严重。虽然人们常采用化学方法控制辣椒疫病并在近年的相关研究中取得一定进展，但相比之下筛选和培育抗病品种是防控农作物病害更为经济、安全和有效的方法。
深入研究辣椒疫病抗源，是培育辣椒抗病新品种的基础。目前，国际上利用连锁作图（Linkage mapping）方法，找到一些抗性位点。但是，基于家系的连锁作图方法主要是依赖一个或少数几个亲本组合及其重组材料，在此基础上进行的分子标记辅助选择育种不能有效利用更多的抗性种质资源和更广泛的遗传多样性，因而具有一定的局限性。全基因组关联分析（genome-wide associated study，GWAS）以连锁不平衡（Linkagedisequilibrium，LD）为基础，通过对遗传变异数据与表型变异之间的关系进行统计分析，找到与目标性状相关联的染色体位点。该方法能检测同一座位上多个等位基因，利于充分发掘不同种质资源中的有益基因。
由于辣椒疫病抗性的遗传背景复杂，目前在辣椒疫病抗性遗传改良中可直接应用的分子标记还十分有限。5号染色体的疫病抗性位点在大多研究材料中都较为保守，所以目前报道的可有效用于分子标记辅助育种的标记多集中在5号染色体，存在抗源单一化问题。随着种植年限增长，单一抗源辣椒种质的抗病性会随着病原菌致病力的增强而下降甚至丧失。受育种材料限制，抗源单一化严重影响了抗性育种进度。不断挖掘新的抗源，是辣椒抗性遗传改良的重要基础，对辣椒抗病稳产具有重要意义。因疫病抗性常常是由多个基因控制的数量性状，除了一些抗性主效位点外，依靠单个分子标记鉴定的单一位点基因型不足以有效筛选出抗疫病种质。
本发明基于不同的辣椒种质利用关联分析找到不同的疫病抗性显著关联位点，分别开发分子标记，利用3个分子标记筛选同时带有3个抗性位点的种质，该方法能准确筛选出聚合不同抗源的抗疫病辣椒种质，对突破辣椒疫病抗源单一化育种瓶颈、创制抗性新种质具重大作用与意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定抗疫病辣椒种质的分子标记及其应用，基于关联分析鉴定的显著关联位点，利用分子标记组合实现对不同抗性位点的基因型选择，可准确高效的筛选出聚合不同抗源的辣椒抗疫病种质。
本发明通过下述技术方案来实现：鉴定抗疫病辣椒种质的分子标记，分子标记为SNPs分子标记组合，由PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4组成，分别含有辣椒基因组的7号染色体96,534,770位置多态性为G/T、10号染色体233,316,777位置多态性为C/T和12号染色体494,846位置多态性为A/G的核苷酸序列。
具体地，PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4分别针对3个SNPs位点，即辣椒基因组（C. annuum cv. CM334 v1.6）7号染色体96,534,770位置多态性为G/T的SNP，10号染色体233,316,777位置多态性为C/T的SNP和12号染色体494,846位置多态性为A/G的SNP。
所述鉴定抗疫病辣椒种质分子标记可以由如下引物两两组合扩增得到：
SEQ ID NO.1：TCTTAAATCTGCTGAAGTGACTGAG
SEQ ID NO.2：TGTTTGTTTTGGATGTGACATTTC
SEQ ID NO.3：TCCAAAATTACAAGGACGCGA
SEQ ID NO.4：GGTTGTTTGATTATGTTGTTGTGCT
SEQ ID NO.5：CGAGTGCATTGACGCTCCC
SEQ ID NO.6：TGGATGTCATCGTATTGAACTTTC
进一步地，本发明提供用于扩增所述的鉴定抗疫病辣椒种质的分子标记的引物对。
优选的，引物对具有如下核苷酸序列：
SEQ ID NO.1：TCTTAAATCTGCTGAAGTGACTGAG
SEQ ID NO.2：TGTTTGTTTTGGATGTGACATTTC
SEQ ID NO.3：TCCAAAATTACAAGGACGCGA
SEQ ID NO.4：GGTTGTTTGATTATGTTGTTGTGCT
SEQ ID NO.5：CGAGTGCATTGACGCTCCC
SEQ ID NO.6：TGGATGTCATCGTATTGAACTTTC
优选的，PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4标记的引物对分别为chr7-96.5-F1/chr7-96.5-R、chr10-233.3-F/chr10-233.3-R和chr12-0.49-F2C/chr12-0.49-R，分别具有SEQ ID NO:1~2、SEQ ID NO:3~4和SEQ ID NO:5~6所示的核苷酸序列。
利用本发明提供的分子标记，可以实现抗疫病辣椒种质的快速准确鉴定。因此，本发明还提供了所述的鉴定抗疫病辣椒种质的分子标记或其引物对在鉴定抗疫病辣椒种质及分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供了含有所述分子标记的引物对的检测试剂、基因芯片或含有所述检测试剂的试剂盒。
所述试剂盒还包含dNTPs、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、限制性内切酶和标准阳性模板中的一种或多种。
本发明还提供了一种分子标记鉴定辣椒抗疫病种质的方法，包括如下步骤：
1）提取待测辣椒的基因组DNA；
2）以待测辣椒的基因组DNA为模板，利用所述的引物对扩增PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4标记对应的SNPs位点，进行PCR扩增反应；
3）分析扩增产物的SNP位点，PcRM07-96位点碱基为GG的纯合基因型，PcRM10-233位点碱基为TT或CT基因型，且PcRM12-0.4位点碱基为GG或AG基因型，对应的辣椒种质为抗疫病种质。
本领域技术人员应该理解，分析SNP位点碱基类型的方法有很多，包括测序分析、等位基因特异性PCR分析、酶切产物多态性分析等。
优选地，步骤（3）中分析所述扩增产物的SNP位点为采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后，对酶切产物进行特征条带电泳检测，判断所述SNPs位点碱基类型。
更优选地，所述限制性内切酶为所述限制性内切酶分别为特异性识别AGCT的限制性内切酶AluI，特异性识别CCTCN7的限制性内切酶MnlI，和特异性识别TCGA的限制性内切酶TaqI。
本发明具备如下有益效果：
（1）本发明能够依据分子标记结果准确鉴定兼具7号、10号和12号染色体抗性位点的辣椒抗疫病种质，涉及的3个分子标记位点是在辣椒疫病抗性关联分析中与疫病抗性显著关联的单核苷酸多态性位点（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位点，适用范围广，效应显著；
（2）本发明提供的鉴定抗疫病辣椒的分子标记，能够在分子水平对辣椒的疫病抗性做出精准鉴定，能在苗期进行大批量种质材料的快速、准确鉴定，提高育种效率；
（3）本发明提供的鉴定抗疫病辣椒的分子标记，选择的是辣椒7号、10号和12号染色体的抗性位点，克服传统育种方法难以聚合多个抗性位点的缺陷，能有效避免抗源单一化问题，对打破抗源单一化育种瓶颈、创制抗性新种质具重要作用与意义。
附图说明
图1为实施例1中分子标记PcRM07-96的琼脂糖凝胶电泳结果；条带大小见图示；其中，M为DNA Marker，1-13为抗疫病辣椒种质，14-17为感病参照种质，18-48为待测种质；1，A087；2，A124；3，A145；4，A162；5，A185；6，B015；7，B018；8，B027；9，B125；10，B134；11，C014；12，WY089；13，WY119；14，B040；15，BJ10；16，A171；17，A012；18，A055；19，A057；20，A058；21，A064；22，A170；23，A175；24，A201；25，A207；26，A209；27，A220；28，A221；29，A227；30，A236；31，A263；32，B002；33，B020；34，B022；35，B094；36，B097；37，B111；38，B116；39，B130；40，B178；41，B182；42，B254；43，B311；44，B313；45，B321；46，B326；47，B328；48，B352。
图2为实施例1中分子标记PcRM10-233的琼脂糖凝胶电泳结果；条带大小见图示，其中90 bp和91 bp条带相近，在琼脂糖凝胶中重叠在一起；其中，M为DNA Marker，1-13为抗疫病辣椒种质，14-17为感病参照种质，18-48为待测种质；1，A087；2，A124；3，A145；4，A162；5，A185；6，B015；7，B018；8，B027；9，B125；10，B134；11，C014；12，WY089；13，WY119；14，B040；15，BJ10；16，A171；17，A012；18，A055；19，A057；20，A058；21，A064；22，A170；23，A175；24，A201；25，A207；26，A209；27，A220；28，A221；29，A227；30，A236；31，A263；32，B002；33，B020；34，B022；35，B094；36，B097；37，B111；38，B116；39，B130；40，B178；41，B182；42，B254；43，B311；44，B313；45，B321；46，B326；47，B328；48，B352。
图3为实施例1中分子标记PcRM12-0.4的琼脂糖凝胶电泳结果；条带大小见图示，其中294 bp和273 bp条带相近，在琼脂糖凝胶中重叠在一起；其中，M为DNA Marker，1-13为抗疫病辣椒种质，14-17为感病参照种质，18-48为待测种质；1，A087；2，A124；3，A145；4，A162；5，A185；6，B015；7，B018；8，B027；9，B125；10，B134；11，C014；12，WY089；13，WY119；14，B040；15，BJ10；16，A171；17，A012；18，A055；19，A057；20，A058；21，A064；22，A170；23，A175；24，A201；25，A207；26，A209；27，A220；28，A221；29，A227；30，A236；31，A263；32，B002；33，B020；34，B022；35，B094；36，B097；37，B111；38，B116；39，B130；40，B178；41，B182；42，B254；43，B311；44，B313；45，B321；46，B326；47，B328；48，B352。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW, Molecular Cloning: aLaboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1 辣椒抗疫病性分子标记的开发
1、待测辣椒种质的疫病抗性鉴定
将保存的菌株活化后于10% V8平板培养基（V8营养汁 100 mL，CaCO3 0.2 g，蒸馏水900 mL，琼脂20 g）上26℃~28℃暗培养7～9 d，加入少量无菌水于光照下培养，待在显微镜下能检测到大量孢子囊后，刮下菌丝和孢子囊于4℃放置30 min，室温放置2 h，用纱布过滤得到游动孢子悬浮液，将浓度调整为104个/mL，用灌根法接种6～8叶期辣椒幼苗，接种后保持土壤湿润，3~12 d后鉴定病情级别并计算病情指数，0 ≤ DI ≤ 10为高抗（HR），10 <DI ≤ 30为抗病（R），30 < DI ≤ 50为中抗（MR），50 < DI ≤ 70为感病（S），DI > 70为高感（HS）。
2、基于GBS-seq的辣椒疫病抗性关联分析
对220份辣椒种质通过测序进行基因分型（Genotyping-by-sequencing，GBS），用限制性内切酶EcoRI和NlaIII对基因组DNA进行酶切，给酶切片段加上带标签的测序接头后构建小片段文库，进行PE125双末端测序，经质量控制后共得到2,887,920个SNPs和InDel。使用gemma软件（v0.98.1）对220份辣椒的疫病抗性表型数据和基因型数据进行关联分析，得到显著关联的SNPs和InDels。
3、抗疫病分子标记开发
基于显著关联的SNPs中表型贡献率高于10%的SNPs，根据SNPs位点数尽可能少，适宜开发成酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）分子标记，且SNPs组合能准确筛选出抗疫病种质的标准，筛选出3个SNPs，即辣椒基因组（C.annuum cv. CM334 v1.6）7号染色体SNP 96,534,770、10号染色体SNP 233,316,777和12号染色体SNP 494,846，分别命名为PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4位点。当PcRM07-96位点基因型为G:G，PcRM10-233位点基因型为T:T或T:C，且PcRM12-0.4位点基因型为G:G或G:A时，筛选出辣椒种质13个：A087、A124、A145、A162、A185、B015、B018、B027、B125、B134、C014、WY089和WY119，均为疫病抗性种质，说明这3个SNPs可用于筛选疫病抗性种质。在这3个SNPs侧翼分别设计引物对chr7-96.5-F1和chr7-96.5-R，chr10-233.3-F和chr10-233.3-R以及chr12-0.49-F2C和chr12-0.49-R，分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。3个SNPs可分别被限制性内切酶AluI、MnlI和TaqI识别，从而开发成CAPS分子标记。
4、疫病抗性分子标记鉴定辣椒种质基因型
利用CTAB法提取辣椒种质A087、A124、A145、A162、A185、B015、B018、B027、B125、B134、C014、WY089和WY119，以及感病参照种质B040、BJ10、A171和A012的基因组DNA。以上述辣椒种质的基因组DNA为模板，利用引物对chr7-96.5-F1和chr7-96.5-R扩增上述种质PcRM07-96位点，用引物对chr10-233.3-F和chr10-233.3-R扩增上述种质PcRM10-233位点，引物对chr12-0.49-F2C和chr12-0.49-R扩增上述种质PcRM12-0.4位点。PCR扩增反应使用的反应体系为：5 μL 2×Taq Master Mix，0.2 μL 10 μM正向引物，0.2 μL 10 μM反向引物，100 ng/μL DNA模板0.5 μL，ddH2O 4.1 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸60 s，39个循环；72℃延伸5 min。PcRM07-96位点的PCR产物用限制性内切酶AluI酶切，PcRM10-233位点的PCR产物用限制性内切酶MnlI酶切，PcRM12-0.4位点的PCR产物用限制性内切酶TaqI酶切。酶切体系为PCR产物5 μL，CutSmart Buffer0.7 μL，限制性内切酶0.2 μL，ddH2O 4.1 μL，AluI和MnlI酶切体系在PCR仪中于37℃孵育4h，TaqI酶切体系在PCR仪中于65℃孵育4 h。采用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物酶切后条带大小，结果显示抗性种质A087、A124、A145、A162、A185、B015、B018、B027、B125、B134、C014、WY089和WY119的基因型都符合疫病抗性种质基因型，即引物对chr7-96.5-F1和chr7-96.5-R扩增的PCR产物经限制性内切酶AluI酶切后出现两条大小分别为343 bp和86 bp的特征条带且无429 bp条带（附图1），引物对chr10-233.3-F和chr10-233.3-R扩增的PCR产物经限制性内切酶MnlI酶切后具有一条大小为181 bp的特征条带（附图2），并且引物对chr12-0.49-F2C和chr12-0.49-R扩增的PCR产物经限制性内切酶TaqI酶切后具有一条大小为567 bp的特征条带（附图3）。感病参照种质B040、BJ10、A171和A012则不符合此基因型条件。说明本发明开发的分子标记可准确鉴定辣椒种质基因型，并筛选兼具三个抗性位点（PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4位点）的抗疫病辣椒种质。
实施例2 辣椒抗疫病分子标记的应用
另外选取35份辣椒种质（均不包括在实施例1的220份辣椒种质中），这35份辣椒种质分别为A055、A057、A058、A064、A170、A175、A201、A207、A209、A220、A221、A227、A236、A263、B002、B020、B022、B094、B097、B111、B116、B130、B178、B182、B254、B311、B313、B321、B326、B328、B352。利用CTAB法提取这35份辣椒种质的DNA。以上述辣椒种质的基因组DNA为模板，利用引物对chr7-96.5-F1和chr7-96.5-R扩增上述种质PcRM07-96位点，用引物对chr10-233.3-F和chr10-233.3-R扩增上述种质PcRM10-233位点，引物对chr12-0.49-F2C和chr12-0.49-R扩增上述种质PcRM12-0.4位点。PCR扩增反应使用的反应体系为：5 μL 2×Taq Master Mix，0.2 μL 10 μM正向引物，0.2 μL 10 μM反向引物，100 ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 4.1 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸60 s，39个循环；72℃延伸5 min。PcRM07-96位点的PCR产物用限制性内切酶AluI酶切，PcRM10-233位点的PCR产物用限制性内切酶MnlI酶切，PcRM12-0.4位点的PCR产物用限制性内切酶TaqI酶切。酶切体系为PCR产物5 μL，CutSmart Buffer 0.7 μL，限制性内切酶0.2 μL，ddH2O 4.1 μL，AluI和MnlI酶切体系在PCR仪中于37℃孵育4 h，TaqI酶切体系在PCR仪中于65℃孵育4 h。采用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物酶切后条带大小，结果显示种质B002、B111和B326的基因型符合疫病抗性种质基因型，即引物对chr7-96.5-F1和chr7-96.5-R扩增的PCR产物经限制性内切酶AluI酶切后出现两条大小分别为343 bp和86 bp的特征条带且无429 bp条带（附图1），引物对chr10-233.3-F和chr10-233.3-R扩增的PCR产物经限制性内切酶MnlI酶切后出现一条大小为181 bp的特征条带（附图2），且引物对chr12-0.49-F2C和chr12-0.49-R经限制性内切酶TaqI酶切后出现一条大小为567 bp的特征条带（附图3）。经疫病抗性鉴定（同实施例1步骤1），证实这3份辣椒种质均为抗疫病种质，说明利用本发明分子标记筛选疫病抗性种质准确率高达100%，说明利用本发明所述分子标记按上述方法检测，鉴定的抗疫病种质结果准确可靠，可大大提高辣椒抗疫病种质的选择效率，具有重要应用价值。
更优选地，在本发明提供的具体实施例中，所述PCR扩增反应的体系和程序，限制性内切酶的酶切反应体系和程序，以及酶切条带的判定如下：
PCR扩增反应使用的反应体系为：5 μL 2×Taq Master Mix，0.2 μL 10 μM正向引物，0.2 μL 10 μM反向引物，100 ng/μL DNA模板0.5 μL，ddH2O 4.1 μL。其中，2×TaqMaster Mix来自近岸蛋白质科技有限公司的商品化试剂盒E005-02B。
PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸60 s，39个循环；72℃延伸5 min。
限制性内切酶酶切体系为：PCR产物5 μL，CutSmart Buffer 0.7 μL，限制性内切酶0.2 μL，ddH2O 4.1 μL，AluI和MnlI酶切体系在PCR仪中于37℃孵育4 h，TaqI酶切体系在PCR仪中于65℃孵育4 h。限制性内切酶AluI、MnlI和TaqI分别来自New England Biolabs的商品化试剂盒R0137V、R0163V和R0149V。
采用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物酶切后条带大小：如果引物对chr7-96.5-F1/chr7-96.5-R扩增的PCR产物经限制性内切酶AluI酶切后出现两条大小分别为343bp和86 bp的特征条带且无429 bp条带，引物对chr10-233.3-F/chr10-233.3-R扩增的PCR产物经限制性内切酶MnlI酶切后具有一条大小为181 bp的特征条带，并且引物对chr12-0.49-F2C/chr12-0.49-R扩增的PCR产物经限制性内切酶TaqI酶切后具有一条大小为567bp的特征条带，则判定待测辣椒为抗疫病材料。
本领域技术人员应该知晓，PCR的扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序可以根据所用DNA聚合酶、限制性内切酶不同或其它需要调整其中各组分的体积和/或用量以及各反应的温度和时间，因此，本发明所述的PCR扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序的选择包括但不限于上述扩增体系和反应程序。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.用于鉴定抗疫病辣椒种质的分子标记的引物对，其特征在于，所述分子标记为SNPs分子标记组合，由PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4组成，分别含有辣椒基因组的7号染色体96,534,770位置多态性为G/T、10号染色体233,316,777位置多态性为C/T和12号染色体494,846位置多态性为A/G的核苷酸序列；
由C. annuum cv. CM334 v1.6辣椒基因组的7号染色体96,534,770位置多态性为G/T的SNP，10号染色体233,316,777位置多态性为C/T的SNP和12号染色体494,846位置多态性为A/G的SNP组成；
PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4标记的引物对分别为chr7-96.5-F1/chr7-96.5-R、chr10-233.3-F/chr10-233.3-R和chr12-0.49-F2C/chr12-0.49-R，分别具有SEQ ID NO:1~2、SEQ ID NO:3~4和SEQ ID NO:5~6所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述引物对的检测试剂、基因芯片或含有所述检测试剂的试剂盒。
3.权利要求1所述的引物对在鉴定抗疫病辣椒种质和分子标记辅助育种中的应用。
4.一种利用分子标记的引物对鉴定辣椒抗疫病种质的方法，其特征在于，所述分子标记为SNPs分子标记组合，由PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4组成，分别含有辣椒基因组的7号染色体96,534,770位置多态性为G/T、10号染色体233,316,777位置多态性为C/T和12号染色体494,846位置多态性为A/G的核苷酸序列,包括如下步骤：
1）提取待测辣椒的基因组DNA；
2）以待测辣椒的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对扩增PcRM07-96、PcRM10-233和PcRM12-0.4标记对应的SNPs位点，进行PCR扩增反应；
3）分析扩增产物的SNP位点，PcRM07-96位点碱基为GG的纯合基因型，PcRM10-233位点碱基为TT或CT基因型，且PcRM12-0.4位点碱基为GG或AG基因型，对应的辣椒种质为抗疫病种质。
5.根据权利要求4所述的一种分子标记鉴定辣椒抗疫病种质的方法，其特征在于，步骤3）中所述的分析所述扩增产物的SNP位点为采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后，对酶切产物进行特征条带的电泳检测，判断所述SNPs位点碱基类型。
6.根据权利要求5所述的一种分子标记鉴定辣椒抗疫病种质的方法，其特征在于，所述限制性内切酶分别为特异性识别AGCT的限制性内切酶AluI，特异性识别CCTCN7的限制性内切酶MnlI，和特异性识别TCGA的限制性内切酶TaqI。
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