CN111961751B - 检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物及其应用 - Google Patents

检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学和番茄育种技术领域，特别是指检测番茄根结线虫抗性基因Mi‑1.2基因分型的KASP引物及其应用。基因Mi‑1.2在第9173碱基的位置存在一处SNP位点，该SNP位点碱基的突变导致Mi‑1.2基因对番茄根结线虫抗性的改变。本发明基于该SNP位点开发设计了一组可用于检测番茄根结线虫抗性基因Mi‑1.2基因分型的KASP引物和包含该KASP引物的试剂盒。本发明中的KASP引物和试剂盒可用于鉴定番茄中是否含有番茄根结线虫的抗性基因Mi‑1.2，区分含有Mi‑1.2基因的抗根结线虫的番茄和不含有Mi‑1.2基因的感根结线虫的番茄。本发明相比现有技术可对番茄植株在苗期快速、准确、高通量的进行番茄根结线虫抗性鉴定，降低苗期人工接种和田间抗虫性鉴定的工作量。

Description

检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和作物育种技术领域，特别是指检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物及其应用。
背景技术
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是茄科番茄属的一种一年生或多年生草本植物，起源于南美洲，是一种世界性的蔬菜作物，也是我国的主要栽培蔬菜之一。随着番茄栽培面积的扩大、栽培方式的多样化和连作障碍等影响，番茄病虫害也在不断加剧。根结线虫(Meloidogyne spp.)是危害番茄的重要病原物之一，它种类繁多，分布广泛，危害严重，侵染的寄主范围广，传播途径多。随着保护地蔬菜生产的增加，由于复种和重茬严重，作为土传病害的根结线虫危害日趋严重。
番茄是对根结线虫最敏感的作物之一，番茄抗根结线虫育种已成为番茄育种工作的重要目标之一，随着番茄育种技术的不断进步，番茄已经由传统育种转向现代分子标记辅助的育种研究，分子标记辅助选择是对目标性状在DNA水平上的选择，不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果准确可靠。目前国际植物新品种保护联盟(UPOV)在BMT分子测试指南中，已将构建DNA分子标记的方法确定为SSR(Simple sequence repeats)和SNP(Single nucleotide polymorphism)标记。SNP标记作为第3代分子标记，目前被公认是极具应用前景的分子标记技术，基于SNP标记开发了许多稳定、高效的SNP分型技术如基因芯片、竞争性等位基因特异PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)标记，已成功替代传统的SNP电泳分析，其中KASP技术具有高通量、省时、便捷的特点，其特点是基于引物末端碱基的特异匹配对SNP分型，可在广泛的基因组DNA样品中对SNP位点进行精准的双等位基因判断，具有高度稳定性与准确性，成为SNP基因分型的主流。其主要特征是引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3’端为等位基因变异碱基，5’端添加通用荧光接头序列，通用的下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。
目前，已知有9个番茄抗根结线虫的基因，分别是：Mi-1、Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-7、Mi-8和Mi-9。其中Mi-1基因控制的是显性单基因抗性，定位于第六号染色体上，其抗性具有广谱性。Mi-1基因又分为Mi-1.1和Mi-1.2两个基因簇，而Mi-1.2正是番茄能产生抗线虫作用的有效基因。Mi-1.2基因被广泛应用于番茄抗根结线虫育种中。因此利用KASP技术快速准确地鉴定抗番茄根结线虫的基因Mi-1等可以大幅度提高新品种的选育效率，缩短育种年限。
KASP技术(竞争性等位基因特异性PCR)是目前国际上主流的基因分型方法之一，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP和特定位点上的InDel进行精准的双等位基因判断。引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3’端为等位基因变异碱基，5’端添加通用荧光接头序列，下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。
KASP的特异性引物通常采用24bp-26bp，会有更高的特异性，对比常规酶切电泳准确率高；只需常规PCR扩增，所需时间短；无需昂贵的双色标记探针，灵活性超强；最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增；快速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。
其主要操作步骤如下：
1、含有SNP位点的等位基因-1和-2作为模板；
2、针对等位基因SNP位点设计特异性引物：两个正向引物和一个通用反向引物；
3、两条正向引物5’端分别连有特异性的检测引物序列，可与荧光标记结合；
4、提取待测样品的基因组DNA为模板；
5、PCR扩增，对扩增产物进行荧光信号扫描，数据分析。
KASP技术具有灵活、便宜、准确的特点，已被广泛应用于各个领域。目前，还未发现应用于番茄黄化曲叶病毒病检测上的KASP标记。
申请人未在国内专利数据库中检索到与本申请相关主题的专利文献。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物及其应用，可用于鉴定番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2及番茄中是否含有番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2，区分含有Mi-1.2的抗根结线虫的番茄和不含有Mi-1.2的感根结线虫的番茄，区分纯合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/Mi-1.2)、纯合的感根结线虫的番茄(mi-1.2/mi-1.2)和杂合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/mi-1.2)，进而选育出含有Mi-1.2基因的抗根结线虫的番茄品种。
本发明的整体技术构思是：
检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物，所述KASP引物序列包含：
正向引物Mi-1.2-F1：5’-CTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，其序列如SEQ No.1；
正向引物Mi-1.2-F2：5’-CTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’，其序列如SEQ No.2；
所述正向引物Mi-1.2-F1和正向引物Mi-1.2-F2分别与不同的标签序列相连接。
用于检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的试剂盒，包含所述的KASP引物。
KASP引物或试剂盒在鉴定番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2中的应用。
KASP引物或试剂盒在鉴定番茄中是否含有番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2中的应用。
KASP引物或试剂盒在鉴定或区分含有Mi-1.2基因的抗根结线虫的番茄和不含有Mi-1.2基因的感根结线虫的番茄中的应用。
KASP引物或试剂盒在区分纯合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/Mi-1.2)、纯合的感根结线虫的番茄(mi-1.2/mi-1.2)和杂合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/mi-1.2)中的应用。
KASP引物或试剂盒在Mi-1.2基因在番茄抗根结线虫育种中的应用。
本发明的具体技术构思还有：
合成所述正向引物Mi-1.2-F1时，在其5’端加上序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’的标签序列A，其序列如SEQ No.6；合成所述正向引物Mi-1.2-F2时，在其5’端加上序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’的标签序列B，其序列如SEQNo.7。
所述的KASP引物序列为：
正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，其序列如SEQ No.3；
正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’，其序列如SEQ No.4。
所述KASP引物中还包括：
反向引物：5’-ACTATTCCTATGCTATGTTGTTTGC-3’，其序列如SEQ No.5。
试剂盒其中还包含：
标签序列A：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其序列如SEQ No.6；
标签序列B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，其序列如SEQ No.7；
所述两种标签序列分别与不同的荧光基团相连接，所述两种标签序列的互补序列均与BHQ淬灭基因相连接，标签序列A与FAM荧光基因相连接，标签序列B与HEX荧光基因相连接。
KASP引物或试剂盒在鉴定番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2中的应用，KASP引物或试剂盒在鉴定番茄中是否含有番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2中的应用，KASP引物或试剂盒在鉴定或区分含有Mi-1.2基因的抗根结线虫的番茄和不含有Mi-1.2基因的感根结线虫的番茄中的应用，KASP引物或试剂盒在区分纯合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/Mi-1.2)、纯合的感根结线虫的番茄(mi-1.2/mi-1.2)和杂合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/mi-1.2)中的应用是利用所述的KASP引物或所述的试剂盒扩增待检测的番茄样品，检测和分析扩增产物。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
利用本申请提供的KASP引物及试剂盒，相比现有技术可对番茄植株在苗期快速、准确、高通量的进行番茄根结线虫抗性鉴定，大大降低苗期人工接种和田间抗虫性鉴定的工作量，其应用可提高育种效率、节约育种成本、加快育种进程。所述KASP引物及试剂盒可应用于番茄种植资源、各类亲本、杂交种等材料的鉴定。
附图说明
图1为番茄抗根结线虫基因Mi-1.2标记的分型结果。
图中横坐标和纵坐标数值均表示荧光信号值，其中横坐标表示HEX荧光信号值，纵坐标表示FAM荧光信号值；I处圆点为纯合的抗番茄根结线虫材料P808-1的扩增信号；II处圆点为杂合的抗番茄根结线虫材料P808-1-P802-1-F1的扩增信号；III处圆点为感番茄根结线虫材料P802-1的扩增信号；靠近原点的IV处的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
图2为鉴定抗根结线虫的番茄和感根结线虫的番茄的分型结果。
图中横坐标和纵坐标数值均表示荧光信号值，其中横坐标表示HEX荧光信号值，纵坐标表示FAM荧光信号值；I处圆点为纯合的抗根结线虫的番茄材料的扩增信号；II处圆点为杂合的抗根结线虫的番茄材料的扩增信号；III处圆点为感根结线虫的番茄材料的扩增信号；靠近原点的IV处的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本发明的说明书所做出的等效手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试剂(武汉市景肽生物科技有限公司)等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的番茄材料：番茄抗根结线虫材料P808-1、番茄感根结线虫材料P802-1和杂合的番茄抗根结线虫材料P808-1-P802-1-F1，社会公众可向河北省农林科学院经济作物研究所生物技术室索取以重复本实验。
KASP基因分型方法操作简单，只需要将特异的KASP Primer mix和通用的KASPMaster mix加入到含有DNA样本的PCR反应孔中，进行PCR扩增，最终结果采用荧光检测仪进行PCR产物分析即可。
本发明基于KASP技术，提供了可用于高通量鉴定番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物，包括两条特异性扩增引物和一条通用引物，结合应用条件严格的Touchdown PCR方法，建立了应用高通量分子标记检测平台鉴定番茄根结线虫抗性基因的方法。
具体地，申请人基于前人研究，即番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2在第9173碱基的位置存在一处SNP位点。经申请人验证，该处SNP位点满足KASP标记开发的要求(基因型在9173bp不同；邻近无其他SNP位点，位于非SNP密集区域；避免连续AT、GC含量高等序列复杂区域)。针对番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2第9173位(T/C)SNP位点进行大量实验，筛选确定了两条特异性正向引物和一条通用反向引物。
具体实施方案中，针对SNP位点碱基的不同需要设计不同的正向或反向引物，例如，本申请提供的正向引物为两条，包括正向引物Mi-1.2-F1：5’-CTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，和正向引物Mi-1.2-F2：5’-CTTGCATACGGAT AATACAGATGC-3’，两者仅3’端最后一个碱基不同，即对应的SNP位点；同时在两个正向引物的5’端分别与不同的标签序列相连接，如标签序列A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，和标签序列B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
例如，本申请提供的正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’。其中下划线所示序列即为添加的标签序列。
具体实施方案中，KASP技术要求PCR扩增产物长度在80bp-150bp之间为宜，在此前提下序列可变。例如，本申请所提供的反向引物为：5’-ACTATTCCTATGCTATGTTGTTTGC-3’，扩增产物长度为123bp。
进一步地，在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒还包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，其中，荧光探针A的序列与标签序列A的序列相同，为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，在其5’末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列与标签序列B相同，为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，在其5’末端连接1个荧光基团HEX。淬灭探针A的序列与标签序列A的序列互补，为5’-CTTCCACTGGTTCAAGTACGA-3’，其序列如SEQ No.8；淬灭探针B的序列与标签序列B互补，为5’-CTTCCAGCCTCAGTTGCCTAA-3’，其序列如SEQ No.9；同时，在淬灭探针A和淬灭探针B的3’末端均连接上淬灭基因BHA。
例如，上述的荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B可来自武汉市景肽生物科技有限公司的PARMS(PRO2.0)试剂盒。
本申请所提供的检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物或用于检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的试剂盒，可用于鉴定番茄中是否含有根结线虫的抗性基因Mi-1.2，同时作为共显性标记又可用于区分纯合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/Mi-1.2)、纯合的感根结线虫的番茄(mi-1.2/mi-1.2)和杂合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/mi-1.2)，准确鉴定Mi-1.2的基因型进而指导番茄育种和番茄根结线虫的防控等工作。
在具体实施方案中，本申请提供鉴定番茄中是否含有番茄根结线虫的抗性基因Mi-1.2的方法，其包括利用本申请提供的KASP引物扩增待鉴定的番茄样品的DNA，并检测、分析扩增产物。
在具体实施方案中，本申请提供的KASP引物：例如，正向引物1：5’-GAAGGTGACCAA GTTCATGCTCTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’，及反向引物：5’-ACTATTCCTATGCTATGTTGTTTGC-3’。扩增若只检测到FAM荧光信号，或同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号，则认定待鉴定的番茄样品中含有番茄根结线虫的抗性基因Mi-1.2；扩增若只检测到HEX荧光信号，则认定待鉴定的番茄样品中不含番茄根结线虫的抗性基因Mi-1.2。
在具体实施方案中，本申请提供的KASP引物：例如，向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGT TCATGCTCTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’，及反向引物：5’-ACTATTCCTATGCTATGTTGTTTGC-3’。扩增若只检测到FAM荧光信号，则认定待检测的番茄样品含有纯合的抗番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2；扩增若同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号，则认定待检测的番茄样品含有杂合的番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2；扩增若只检测到HEX荧光信号，则认定待鉴定的番茄样品不含番茄根结线虫的抗性基因Mi-1.2。
在具体实施方案中，所述的待鉴定的番茄样品可取自番茄植株的叶片、根、茎、花、果实和种子中的任一种。
在另一具体实施方案中，本申请提供了区分含有Mi-1.2基因的抗根结线虫的番茄和不含有Mi-1.2基因的感根结线虫的番茄，及区分纯合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/Mi-1.2)、纯合的感根结线虫的番茄(mi-1.2/mi-1.2)和杂合的抗根结线虫的番茄(Mi-1.2/mi-1.2)的应用，其包括利用本申请提供的KASP引物或试剂盒扩增待鉴定的番茄样品的DNA，并检测、分析扩增产物。
在具体实施方案中，本申请提供的KASP引物：例如，向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGT TCATGCTCTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’，及反向引物：5’-ACTATTCCTATGCTATGTTGTTTGC-3’。扩增若只检测到FAM荧光信号，或同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号，则认定待鉴定的番茄样品为抗根结线虫的番茄；扩增若只检测到HEX荧光信号，则认定待鉴定的番茄样品为感根结线虫的番茄。
在具体实施方案中，本申请提供的KASP引物：例如，正向引物1：5’-GAAGGTGACCAA GTTCATGCTCTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，和正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’，及反向引物：5’-ACTATTCCTATGCTATGTTGTTTGC-3’。扩增若只检测到FAM荧光信号，则认定待检测的番茄样品为纯合的抗根结线虫的番茄；扩增若同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号，则认定待检测的番茄样品为杂合的抗根结线虫的番茄；扩增若只检测到HEX荧光信号，则认定待鉴定的番茄样品为感根结线虫的番茄。
在具体实施方案中，所述的待鉴定的番茄样品可取自番茄植株的叶片、根、茎、花、果实和种子中的任一种。
以下实施例仅用于说明而非限制本发明范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW，Molecularcloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。
实施例1
KASP标记的开发
比较分析Mi-1.2的抗病和感病两个等位基因的序列，将Mi-1.2抗病的等位基因命名为Mi-1.2/Mi-1.2，Mi-1.2感病的等位基因命名为mi-1.2/mi-1.2；并发现二者在第9173bp的位置存在一处SNP位点。该处SNP位点满足KASP标记开发的要求：基因型在9173bp不同；邻近无其他SNP位点，位于非SNP密集区域；避免连续AT、GC含量高等序列复杂区域。
因此在第9173位T/C位点作为唯一选择目标；此位点处Mi-1.2/Mi-1.2的基因型为T，mi-1.2/mi-1.2的基因型为C。
根据上述SNP位点设计KASP引物，引物序列为：
第9173位T/C：
正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’；
正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’；
其中下划线所示序列为添加的标签序列；
反向引物：5’-ACTATTCCTATGCTATGTTGTTTGC-3’。
引物测试结果如图1。
实施例2
分子标记的扩增
本实施例中使用材料为申请人所选育的高世代纯合抗根结线虫材料P808-1(Mi-1.2/Mi-1.2)，感根结线虫材料P802-1(mi-1.2/mi-1.2)这些材料田间鉴定分别表现为抗病和感病(以下同)，和将两者作为亲本杂交制备的P808-1-P802-1-F1杂合的抗根结线虫材料(Mi-1.2/mi-1.2)。采集植株的叶片组织用于基因组DNA提取。
按照Plant DNA Isolation Kit(成都福际生物技术有限公司)试剂盒说明要求提取上述材料叶片中的基因组DNA，并将所提取的DNA溶液的浓度稀释至50-100ng/μl，于-20℃保存。
按照KASP-PARMS试剂盒(武汉市景肽生物科技有限公司)要求配置PCR反应体系，反应总体积为10μl，包括：2X PARMS PCR Mix：5μl；DNA提取液(50-100ng/μl)：1μl；正向引物1：0.15μl(10pmol/μl)；正向引物2：0.15μl(10pmol/μl)；反向引物：0.4μl(10pmol/μl)；以及ddH2O：3.3μl。设置三个技术重复。
PCR反应程序为：94℃：15分钟；94℃：20秒，65℃(每循环下降0.8℃)：1分钟，10个循环；94℃：20秒，57℃：1分钟，28个循环。PCR反应使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System进行。
实施例3
扩增产物的检测和分析
使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System自带的软件对PCR产物进行基因分型和数据分析，其中设定纵坐标数值表示FAM荧光信号值，横坐标数值表示HEX荧光信号值。
基因分型结果见图1。其中I处圆点为抗根结线虫材料P808-1的扩增信号，仅检测到FAM荧光信号；II处圆点为杂合抗根结线虫材料P808-1-P802-1-F1的扩增信号，同时检测到FAM荧光和HEX荧光；III处圆点为感根结线虫材料P802-1的扩增信号，仅检测到HEX荧光信号；靠近原点的IV处的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。两种纯合基因型的扩增信号，即纯合抗根结线虫(Mi-1.2/Mi-1.2)和纯合感根结线虫(mi-1.2/mi-1.2)的扩增信号分别与原点连线，所形成的夹角越接近于直角说明分型效果越好。
结果表明，所述KASP引物对P808-1的扩增信号按预期靠近纵轴，对P802-1的扩增信号按预期靠近横轴，对P808-1-P802-1-F1的扩增信号按预期处于中间位置，
三种基因型可以明显被区分和聚类，该组引物可以使用，设计成功。
实施例4
利用所述Mi-1.2基因KASP引物或试剂盒鉴定和区分抗根结线虫的番茄和感根结线虫的番茄
本实施例中使用材料为申请人所选育的高世代纯合抗根结线虫材料P808-1，感根结线虫材料P802-1，和将两者作为亲本杂交制备的P808-1-P802-1-F1杂合抗根结线虫材料。广泛搜集番茄种植资源220份(具体分型结果见表1)，采集植株的叶片组织用于基因组DNA提取。
采用实施例2中所述的方法，分别提取220份材料的基因组DNA样本作为PCR扩增模板；使用所述KASP引物进行PCR扩增；使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCRSystem进行PCR反应；使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System自带的软件对PCR产物进行基因分型和数据分析，其中设定纵坐标数值表示FAM荧光信号值，横坐标数值表示HEX荧光信号值。
检测分型结果显示，检测带型同图2中I的单株数为75(仅检测到FAM荧光信号，为纯合的抗根结线虫材料，基因型为Mi-1.2/Mi-1.2)、检测带型同图2中II的单株数为81(同时检测到FAM和HEX荧光信号，为杂合的抗根结线虫材料，基因型为Mi-1.2/mi-1.2)、检测带型同图2中III的单株数为64(仅检测到HEX荧光信号，为感根结线虫材料，基因型为mi-1.2/mi-1.2)、检测带型同图2中IV靠近原点处的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
上述结果表明，所设计的引物对抗根结线虫的番茄和感根结线虫的番茄均能够准确的进行鉴定。
表1鉴定抗番茄根结线虫番茄材料的分型结果
Figure BDA0002681170750000111
Figure BDA0002681170750000121
Figure BDA0002681170750000131
/>
Figure BDA0002681170750000141
/>
Figure BDA0002681170750000151
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Figure BDA0002681170750000161
/>
Figure BDA0002681170750000171
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Figure BDA0002681170750000181
/>
Figure BDA0002681170750000191
/>
序列表
<110> 河北省农林科学院经济作物研究所
<120> 检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物及其应用
<130> none
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 1
cttgcatacg gataatacag atgt 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 2
cttgcatacg gataatacag atgc 24
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 3
gaaggtgacc aagttcatgc tcttgcatac ggataataca gatgt 45
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 4
gaaggtcgga gtcaacggat tcttgcatac ggataataca gatgc 45
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 5
actattccta tgctatgttg tttgc 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 8
cttccactgg ttcaagtacg a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> an Artificial Sequence
<400> 9
cttccagcct cagttgccta a 21

Claims (8)

1.检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的KASP引物，其特征在于所述KASP引物序列包含：
正向引物Mi-1.2-F1：5’-CTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，其序列如SEQNo.1；
正向引物Mi-1.2-F2：5’-CTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’，其序列如SEQNo.2；
所述正向引物Mi-1.2-F1和正向引物Mi-1.2-F2分别与不同的标签序列相连接；合成所述正向引物Mi-1.2-F1时，在其5’端加上序列为：5’-GAAG GTGACCAAGTTCATGCT-3’的标签序列A，其序列如SEQ No.6；合成所述正向引物Mi-1.2-F2时，在其5’端加上序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’的标签序列B，其序列如SEQ No.7；所述两种标签序列分别与不同的荧光基团相连接，所述两种标签序列的互补序列均与BHQ淬灭基因相连接，标签序列A与FAM荧光基因相连接，标签序列B与HEX荧光基因相连接；
所述的KASP引物序列为：
正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTGCATACGGATAATACAGATGT-3’，其序列如SEQNo.3；
正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGCATACGGATAATACAGATGC-3’，其序列如SEQNo.4；
反向引物：5’-ACTATTCCTATGCTATGTTGTTTGC-3’，其序列如SEQ No.5。
2.用于检测番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的KASP引物。
3.根据权利要求1所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2中的应用。
4.根据权利要求1所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定番茄中是否含有番茄根结线虫抗性基因Mi-1.2中的应用。
5.根据权利要求1所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定或区分含有Mi-1.2基因的抗根结线虫的番茄和不含有Mi-1.2基因的感根结线虫的番茄中的应用。
6.根据权利要求1所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒在区分纯合的抗根结线虫的番茄Mi-1.2/Mi-1.2、纯合的感根结线虫的番茄mi-1.2/mi-1.2和杂合的抗根结线虫的番茄Mi-1.2/mi-1.2中的应用。
7.根据权利要求1所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒在Mi-1.2基因在番茄抗根结线虫育种中的应用。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的应用，其特征在于利用所述的KASP引物或所述的试剂盒扩增待检测的番茄样品，检测和分析扩增产物。
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