CN113481318B - 检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学和黄瓜育种技术领域，特别是指检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物及其应用。本发明设计了可用于检测mlo基因该插入/缺失片段不同基因型的KASP引物和包含KASP引物的试剂盒。本发明提供的KASP引物或试剂盒可用于鉴定黄瓜中是否含有白粉病抗病基因mlo，区分抗白粉病和感白粉病的黄瓜。本发明提供的KASP引物及试剂盒，相比现有技术可以在黄瓜苗期快速、准确、高通量的进行白粉病抗性鉴定，大大降低了苗期人工接种和田间抗性鉴定的工作量，其应用可提高黄瓜育种效率、加快育种进程，节约成本。所述的KASP引物及试剂盒可应用于黄瓜种质资源、各类亲本、杂交种等材料的鉴定。

Description

检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，特别是指检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物及其应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科一年生攀援状草本植物，原产印度，是国际上第三大蔬菜作物，也是我国主要栽培蔬菜之一。黄瓜白粉病是一种广泛发生的世界性病害，对黄瓜生产造成了难以估量的损失。黄瓜白粉病是由专性寄生菌(Podosphaeraxanthii)引起的真菌病害，发病期贯穿整个黄瓜生育期，在植株生长中后期发病尤为严重，主要危害茎和叶片组织，会导致植株叶片枯黄、果实生长缓慢，植株早衰，严重影响黄瓜品质和产量。实际生产过程中，通过田间施药防治白粉病，不仅造成农药残留，危及食品安全，还会造成环境的污染。因此，培育抗病的黄瓜品种是解决白粉病危害的最佳方法。然而黄瓜白粉病的田间鉴定受环境及病原的影响，鉴定结果往往不够准确，常规抗病育种效率低下。如何快速、准确地获得抗白粉病鉴定结果并应用于黄瓜育种实践中是目前需要迫切解决的问题。
近年来随着现代分子生物技术的发展，为植物育种提供了新的思维，加快了育种进程。分子标记技术的出现为黄瓜白粉病抗病鉴定工作提供了一条新的途径。分子标记技术是对目标性状在DNA水平上的选择，具有不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果准确可靠等优点。目前，常用的分子标记类型有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、CAPS等，并已经广泛应用于黄瓜育种中，但是这些标记又具有一定的局限性：操作繁琐、实验要求高、检测效率低，不适用大样品、高通量的检测。SNP标记作为第3代分子标记，目前被公认是极具应用前景的分子标记技术，基于SNP标记开发的竞争性等位基因特异PCR(KompetitiveAllele Specific PCR，KASP)技术具有高通量、省时、便捷等优点，其特点是基于引物末端碱基的特异匹配对SNP分型，可在广泛的基因组DNA样品中对SNP位点进行精准的双等位基因判断，具有高度稳定性与准确性，成为SNP基因分型的主流。
国内外学者对于黄瓜白粉病抗病机理以及抗病基因定位等已经进行了很多研究，黄瓜白粉病抗性一般被认为是隐性基因控制，He等使用WI 2757和True Lemon构建的F2:3群体对黄瓜白粉病抗病基因进行定位，发现在第5连锁群上存在两个主效QTL(pm5.1和pm5.2)。Wang等对PI 197088中的白粉病抗性进行了QTL定位研究，共检测到4个QTL(pm1.1、pm2.1、pm5.1和pm6.1)，其中pm5.1为主效QTL。Nie等对黄瓜白粉病抗性的主效QTL pm5.1进行了精细定位，认为mlo即为pm5.1的候选基因，并通过对抗感亲本间mlo基因序列分析发现，该基因第11个外显子上存在1449bp片段的插入/缺失，造成蛋白功能的改变，从而形成了白粉病抗性表型，在抗病亲本中含有该片段的插入，感病亲本中则缺失了该片段。
发明内容
本发明的目的提供一种检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物及其应用，可用于鉴定黄瓜白粉病抗病基因mlo及黄瓜中是否含有mlo基因，区分含有mlo基因的抗白粉病的黄瓜和含有突变的Mlo基因的感白粉病的黄瓜，区分含有mlo基因的纯合抗病黄瓜(mlo/mlo)、含有Mlo基因的纯合感病黄瓜(Mlo/Mlo)和同时含有Mlo和mlo的杂合感病黄瓜(Mlo/mlo)，进而选育出含有mlo基因的抗白粉病的黄瓜品种。
本发明的整体技术构思是：
检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物，所述KASP引物序列包含：
反向引物mlo-R1：5’-ATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’，其序列如SEQ No.1；
反向引物mlo-R2：5’-TCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’，其序列如SEQ No.2；
所述反向引物mlo-R1和反向引物mlo-R2分别与不同的标签序列相连接。
合成所述的反向引物mlo-R1时，在其5’端加上序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’的标签序列A，其序列如SEQ No.6；合成所述的反向引物mlo-R2时，在其5’端加上序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’的标签序列B，其序列如SEQ No.7。
所述的KASP引物序列为：
反向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’，其序列如SEQ No.3；
反向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’，其序列如SEQ No.4；
所述的KASP引物中还包括：
正向引物：5’-CATTCAACTTTGCCTCTTTTGTATA-3’，其序列如SEQ No.5。
用于检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的试剂盒，包括所述的KASP引物。
用于检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的试剂盒，其中还包括：
标签序列A：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其序列如SEQ No.6；
标签序列B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，其序列如SEQ No.7；
所述标签序列A和标签序列B，分别与不同的荧光基团相连接，标签序列A与FAM荧光基因相连接，标签序列B与HEX荧光基因相连接；所述两种标签序列的互补序列均与BHQ淬灭基因相连接。
检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或用于检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的试剂盒在如下a-e至少一种中的应用：
a、鉴定黄瓜白粉病抗病基因mlo；
b、鉴定黄瓜中是否含有黄瓜白粉病抗病基因mlo；
c、鉴定或区分抗白粉病的黄瓜和感白粉病的黄瓜；
d、区分含有mlo基因的纯合抗白粉病黄瓜(mlo/mlo)、含有突变基因Mlo的纯合感白粉病黄瓜(Mlo/Mlo)和同时含有Mlo基因和mlo基因的杂合感白粉病黄瓜(Mlo/mlo)；
e、黄瓜抗白粉病育种。
鉴定黄瓜中是否含有白粉病抗病基因mlo的应用，是利用检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或用于检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的试剂盒扩增待检测的黄瓜样品，检测和分析扩增产物。
区分抗白粉病的黄瓜和感白粉病的黄瓜的应用，是利用检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或用于检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的试剂盒扩增待检测的黄瓜样品，检测和分析扩增产物。
区分含有mlo基因的纯合抗白粉病黄瓜(mlo/mlo)、含有突变基因Mlo的纯合感白粉病黄瓜(Mlo/Mlo)和同时含有Mlo基因和mlo基因的杂合感白粉病黄瓜(Mlo/mlo)的应用，是利用检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或用于检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的试剂盒扩增待检测的黄瓜样品，检测和分析扩增产物。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
本发明所提供的KASP引物及试剂盒，当黄瓜植株在苗期时，仅使用少量叶片组织即可快速、准确、高通量的完成对黄瓜白粉病抗病基因mlo的检测，大大降低苗期人工接种和田间抗病性鉴定的工作量。本发明提供的KASP引物及试剂盒可应用于黄瓜种植资源、各类亲本和杂交种等材料的鉴定，其应用可以提高黄瓜抗白粉病育种效率、加快育种进程、节约成本。
附图说明
图1为检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物的分型结果。
图中横坐标和纵坐标数值均表示荧光信号值，其中纵坐标表示FAM荧光信号值，横坐标表示HEX荧光信号值；图中靠近纵轴的黑色倒三角所表示的为纯合抗白粉病材料TMG1的扩增信号；图中处于中间位置的黑色菱形所表示的为杂合的感白粉病材料TMG1-9930-F1的扩增信号；图中靠近横轴的三角所表示的为纯合的感白粉病材料9930的扩增信号；靠近原点的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
图2为利用检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或试剂盒鉴定抗白粉病和感白粉病的黄瓜材料的分型结果。
图中横坐标和纵坐标数值均表示荧光信号值，其中纵坐标表示FAM荧光信号值，横坐标表示HEX荧光信号值；图中靠近纵轴的黑色倒三角所表示的为纯合抗白粉病的黄瓜材料的扩增信号；图中处于中间位置的黑色菱形所表示的为杂合的感白粉病的黄瓜材料的扩增信号；图中靠近横轴的三角所表示的为纯合的感白粉病的黄瓜材料的扩增信号；靠近原点的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本发明的说明书所做出的等效手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试剂(武汉市景肽生物科技有限公司)等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下列实施例中所用的黄瓜材料：TMG1(含有mlo基因的纯合抗白粉病材料)、9930(含有Mlo基因的纯合感白粉病材料)和TMG1-9930-F1(同时含有Mlo基因和mlo基因的杂合感白粉病材料)，社会公众可向河北省农林科学院经济作物研究所生物技术室索取，以重复本实验。
KASP基因分型方法操作简单，只需要将特异的KASP Primer mix和通用的KASPMaster mix加入到含有DNA样本的PCR反应孔中，进行PCR扩增，最终结果采用荧光检测仪进行PCR产物分析即可。
本发明基于KASP技术，提供了可检测mlo基因的KASP引物，结合条件严格的Touchdown PCR方法，可在高通量分子标记检测平台上鉴定mlo基因。
具体的，申请人基于前人研究，黄瓜对白粉病的抗性是由隐性基因控制，抗白粉病和感白粉病在候选基因mlo的第11个外显子上存在一个1449bp片段的插入/缺失突变。针对该突变进行大量实验，筛选确定了检测mlo基因插入/缺失突变的一条通用的正向引物和两条特异的反向引物。
具体实施方案中，针对SNP位点设计的KASP引物需要包括两条特异性正向引物(或反向引物)和一条通用的反向引物(或正向引物)，其本质是在同一个扩增体系中同时进行了两个PCR反应。
例如，本申请提供的检测mlo基因的KASP引物包括反向引物mlo-R1：5’-ATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’和反向引物mlo-R2：5’-TCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’，两条反向引物分别对应mlo基因第11外显子上的插入和缺失突变，在两个反向引物的5’端分别连接上不同的标签序列，如标签序列A：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，和标签序列B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
例如，本申请提供的反向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’，和反向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’。其中下划线所示序列为添加的标签序列A，波浪线所示为标签序列B。
例如，本申请提供的检测mlo基因的KASP引物还包括正向引物：5’-CATTCAACTTTGCCTCTTTTGTATA-3’。含有插入了1449bp片段的抗病亲本的扩增产物为88bp，缺失了该片段的感病亲本的扩增产物为185bp。
进一步地，在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒还包含荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，其中，荧光探针A的序列与标签序列A的序列相同，为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，在其5’末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列与标签序列B相同，为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，在其5’末端连接1个荧光基团HEX。淬灭探针A的序列与标签序列A的序列互补，为5’-CTTCCACTGGTTCAAGTACGA-3’，其序列如SEQ No.8；淬灭探针B的序列与标签序列B互补，为5’-CTTCCAGCCTCAGTTGCCTAA-3’，其序列如SEQ No.9；同时在淬灭探针A和淬灭探针B的3’末端均连接上淬灭基因BHA。
例如，上述的荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B可来自武汉市景肽生物科技有限公司的PARMS(PRO2.0)试剂盒。
本申请所提供的检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或用于检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的试剂盒，可用于鉴定黄瓜中是否含有mlo基因，同时又可以区分含有mlo基因的纯合抗白粉病的黄瓜(mlo/mlo)、含有突变基因Mlo的纯合感白粉病的黄瓜(Mlo/Mlo)和同时含有Mlo基因和mlo基因的杂合感白粉病的黄瓜(Mlo/mlo)。
在具体实施方案中，本申请提供了鉴定黄瓜中是否含有mlo基因的方法，包括利用本申请提供的KASP引物扩增待鉴定的黄瓜样品的DNA，检测、分析扩增产物。
在具体实施方案中，本申请提供的KASP：例如，反向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTC ATGCTATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’，和反向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’，及正向引物：5’-CATTCAACTTTGCCTCTTTTGTATA-3’。PCR扩增后，若反应中只检测到FAM荧光信号，则认定待检测的黄瓜样品中含有mlo基因；若只检测到HEX荧光信号，则认定黄瓜样品中含有突变的Mlo基因；若同时检测到FAM荧光信号和HEX荧光信号，则认定黄瓜样品中同时含有Mlo基因和mlo基因。
在具体实施方案中，所述的待检测的黄瓜样品可以是黄瓜植株的叶片、根、茎、花、果实和种子中的任意一种的DNA。
在另一个具体实施方案中，本申请提供了区分抗白粉病和感白粉病的黄瓜，及含有mlo基因的纯合抗白粉病的黄瓜(mlo/mlo)、含有突变基因Mlo的纯合感白粉病的黄瓜(Mlo/Mlo)和同时含有Mlo基因和mlo基因的杂合感白粉病的黄瓜(Mlo/mlo)的应用，包括利用本申请提供的KASP引物扩增待鉴定的黄瓜样品的DNA，检测、分析扩增产物。
在具体实施方案中，本申请提供的KASP：例如，反向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTC ATGCTATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT 3，和反向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’，及正向引物：5’-CATTCAACTTTGCCTCTTTTGTATA-3’。PCR扩增后，若反应中只检测到FAM荧光信号，则认定待检测的黄瓜样品为抗白粉病的黄瓜；若只检测到HEX信号，或同时检测到HEX荧光信号和FAM荧光信号，则认定待检测的黄瓜样品为感白粉病的黄瓜。
在具体实施方案中，本申请提供的KASP：例如，反向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTC ATGCTATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’，和反向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’，及正向引物：5’-CATTCAACTTTGCCTCTTTTGTATA-3’。PCR扩增后，若反应中只检测到FAM荧光信号，则认定待检测的黄瓜样品为含有mlo基因的纯合抗白粉病的黄瓜样品；若只检测HEX荧光信号，则认定待检测的黄瓜样品为含有突变基因Mlo的纯合感白粉病的黄瓜，扩增若同时检测到FAM和HEX信号，则认定黄瓜样品为同时含有Mlo基因和mlo基因的杂合感白粉病的黄瓜。
在具体实施方案中，所述的待检测的黄瓜样品可以是黄瓜植株的叶片、根、茎、花、果实和种子中的任意一种的DNA。
以下实施例仅用于说明而非限制本发明范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW，Molecularcloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。
实施例1
KASP标记的开发
比较分析了抗白粉病亲本与感白粉病亲本的mlo基因DNA序列，发现该基因第11个外显子上存在1449bp片段的插入/缺失，造成蛋白功能的改变，从而形成了白粉病抗性表型，在抗病亲本中含有该片段的插入，感病亲本中则缺失了该片段。
根据上述插入/缺失片段，设计了适用于KASP技术两条特异性反向引物：
反向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’；
反向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’；
其中下划线所示序列为添加的标签序列A，波浪线所示为标签序列B；
一条通用正向引物：
正向引物：5’-CATTCAACTTTGCCTCTTTTGTATA-3’。
引物测试结果如图1。
实施例2
本实施例中使用的材料为抗白粉病黄瓜材料TMG1，感白粉病黄瓜材料9930，和将两者作为亲本杂交制备的TMG1-9930-F1杂合感白粉病材料。采集植株叶片组织用于基因组DNA提取。
按照Plant DNA Isolation Kit(成都福际生物技术有限公司)试剂盒说明要求提取上述材料叶片中的基因组DNA，并将所提取的DNA溶液的浓度稀释至50-100ng/μl，于-20℃保存。
按照KASP-PARMS试剂盒(武汉市景肽生物科技有限公司)要求配置PCR反应体系，反应总体积为10μl，包括：2X PARMS PCR Mix：5μl；DNA提取液(50-100ng/μl)：1μl；特异引物1：0.15μl(10pmol/μl)；特异引物2：0.15μl(10pmol/μl)；通用引物：0.4μl(10pmol/μl)；以及ddH2O：3.3μl。设置三个技术重复。
PCR反应程序为：94℃：15分钟；94℃：20秒，65℃(每循环下降0.8℃)：1分钟，10个循环；94℃：20秒，57℃：1分钟，28个循环。PCR反应使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System进行。
实施例3
使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System自带的软件对PCR产物进行基因分型和数据分析，其中设定纵坐标数值表示FAM荧光信号值，横坐标数值表示HEX荧光信号值。
基因分型结果见图1。其中靠近纵轴的黑色倒三角表示为仅能检测到FAM信号的纯合抗白粉病材料TMG1的扩增结果；处于中间位置的黑色菱形表示为能同时检测到FAM和HEX荧光信号的杂合感病材料TMG1-9930-F1的扩增结果；图中靠近横轴的黑色三角表示为仅能检测到HEX信号的纯合感病材料9930的扩增结果；靠近原点的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增结果，HEX和FAM信号均不明显。纯合抗白粉病材料的基因型和纯合感白粉病材料的基因型各自的荧光扩增信号分别与原点连线，所形成的夹角越接近直角表明分型效果越好。
结果表明，所述KASP引物对黄瓜抗白粉病材料TMG1的扩增信号按预期靠近纵轴，对感白粉病材料9930的扩增信号按预期靠近横轴，对TMG1-9930-F1的扩增信号按预期处于中间位置。
三种基因型可以明显被区分和聚类，设计的KASP引物可以使用。
实施例4
利用所述检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或试剂盒鉴定和区分抗白粉病和感白粉病的黄瓜
本实施例中使用的材料为抗白粉病黄瓜材料TMG1，感白粉病黄瓜材料9930，和将两者作为亲本杂交制备的TMG1-9930-F1杂合感白粉病材料。同时广泛搜集黄瓜种质资源225份(具体分型结果见表1)。采集上述黄瓜植株叶片组织用于基因组DNA提取。
采用实施例2中所述方法，分别提取225份黄瓜材料的基因组DNA作为PCR扩增模板；使用所述检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或试剂盒进行PCR扩增；使用AppliedBiosystems 7500Real-Time PCR System进行PCR反应；使用Applied Biosystems7500Real-Time PCR System自带的软件对PCR产物进行基因分型和数据分析，其中设定纵坐标数值表示FAM荧光信号值，横坐标数值表示HEX荧光信号值。
检测分型结果显示，检测带型同图2中靠近纵轴的黑色倒三角的单株数为83(仅检测到FAM荧光信号，为含有mlo基因的纯合抗白粉病的黄瓜材料，基因型为mlo/mlo)；检测带型同图2中间位置的菱形的单株数为76(同时能检测到FAM和HEX信号，为同时含有Mlo基因和mlo基因杂合感白粉病的黄瓜材料，基因型为Mlo/mlo)；检测带型同图2中靠近横轴的三角的单株数为66个(仅检测到HEX荧光信号，为含有突变基因Mlo的纯合感白粉病的黄瓜材料，基因型为Mlo/Mlo)；检测带型同图2中靠近原点的黑色圆点表示阴性对照(未添加DNA样品)的扩增信号。
上述结果表明，本申请提供的检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物或试剂盒可以对抗白粉病和感白粉病的黄瓜实现准确、快速、高通量的鉴定。
表1鉴定抗白粉病和感白粉病黄瓜的分型结果。
Figure BDA0003204821500000101
Figure BDA0003204821500000111
Figure BDA0003204821500000121
Figure BDA0003204821500000131
Figure BDA0003204821500000141
Figure BDA0003204821500000151
Figure BDA0003204821500000161
Figure BDA0003204821500000171
Figure BDA0003204821500000181
序列表
<110> 河北省农林科学院经济作物研究所
<120> 检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 1
attccataaa atcaacaata ataacat 27
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 2
tcaggaagag aataagttgt ggac 24
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 3
gaaggtgacc aagttcatgc tattccataa aatcaacaat aataacat 48
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 4
gaaggtcgga gtcaacggat ttcaggaaga gaataagttg tggac 45
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 5
cattcaactt tgcctctttt gtata 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 8
cttccactgg ttcaagtacg a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> An Artificial Sequence
<400> 9
cttccagcct cagttgccta a 21

Claims (6)

1.检测黄瓜白粉病抗病基因mlo的KASP引物，其特征在于所述的KASP引物序列包含：
反向引物mlo-R1：5’-ATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’；
反向引物mlo-R2：5’-TCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC- 3’；
所述反向引物mlo-R1和反向引物mlo-R2分别与不同的标签序列相连接，在合成KASP引物时，所述反向引物mlo-R1的5’端加上标签序列A，标签序列A为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT- 3’；所述反向引物mlo-R2的5’端加上标签序列B，标签序列B为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT- 3’，所述KASP引物序列为：
反向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCATAAAATCAACAATAATAACAT-3’；
反向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAGGAAGAGAATAAGTTGTGGAC-3’；
正向引物：5’-CATTCAACTTTGCCTCTTTTGTATA-3’。
2.用于鉴定黄瓜白粉病抗病基因mlo的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的KASP引物，其中标签序列A 和标签序列B，分别与不同的荧光基团相连接，标签序列A与FAM荧光基因相连接，标签序列B与HEX荧光基因相连接；
所述两种标签序列的互补序列均与BHQ 淬灭基因相连接。
3.根据权利要求1所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定黄瓜白粉病抗病基因mlo中的应用。
4.根据权利要求1所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒在区分纯合的抗白粉病的黄瓜mlo/mlo、纯合的感白粉病的黄瓜Mlo/Mlo和杂合的感白粉病的黄瓜Mlo/mlo中的应用。
5.根据权利要求1所述的KASP引物或权利要求2所述的试剂盒在利用mlo 基因在黄瓜抗白粉病育种中的应用。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的应用，其特征在于是利用所述的KASP引物或试剂盒扩增待检测的黄瓜样品，检测和分析扩增产物。
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