CN112458200A

CN112458200A - 与黄瓜果刺基座大小基因紧密连锁的InDel分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112458200A
Application number: CN202110042450.7A
Authority: CN
Inventors: 杨森; 杨路明; 刘斌; 赵丽君; 王月玲; 张敏娟; 豆峻岭; 刘东明; 侯娟
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2041-01-13
Also published as: CN112458200B

Abstract

本发明提供了一种与黄瓜果刺基座大小基因紧密连锁的InDel分子标记，命名为InDel‑SBS1分子标记，位于5号染色体20290735～20294659碱基位置，缺失核苷酸序列为4895 bp，缺失序列如SEQ ID NO.7所示。通过KASP技术，所述InDel‑SBS1分子标记可采用四条特异性引物检测得到。利用本发明的InDel‑SBS1分子标记，可以获得黄瓜果刺基座大小性状的相关基因SBS，能在黄瓜植株生长的任意阶段检测育种群体是否含有这一基因，建立快速、高效、简便的分子标记育种体系，节约大量的时间和成本，对改善黄瓜果实的外在品质具有重要的意义。

Description

与黄瓜果刺基座大小基因紧密连锁的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及一种与黄瓜果刺基座大小基因紧密连锁的InDel分子标记及其应用。

背景技术

黄瓜是葫芦科甜瓜属一年生草本植物，在全世界范围内广泛种植，是我国设施栽培的主要蔬菜种类之一。黄瓜植株叶片、茎、雄花、卷须等器官表面密集覆盖着大量的表皮毛。叶片及茎表皮毛能够增强植株表皮的保护作用，提高植株对强光、紫外线、食草昆虫的防护能力。黄瓜果刺（Cucumis sativus L.Spine）是密集分布在果实表面的多细胞表皮毛，由上部针状刺和下部多细胞球状基座共同组成，其密度及大小决定了果实的光滑程度，是影响黄瓜商品价值的重要外观品质之一。目前我国市场流通黄瓜主要有三种类型，分别是北方密刺大刺黄瓜，南方稀刺大刺黄瓜和引自欧洲的小刺水果黄瓜。小刺水果黄瓜果刺基座极小，果实表面表现为光滑。相对于大刺黄瓜果实，小刺黄瓜果实易于清洗、包装、储运，且表面农药残留少。另外，由于世界各地人们消费习惯的不同，人们对黄瓜果刺大小的喜好不同。在综合考虑抗病性、丰产性等各项性状的同时，选育果刺大小等外观品质符合市场需求的品种也一直是黄瓜主要育种目标。

迄今，有关黄瓜果刺发育的研究主要集中在果刺多少方面，且已鉴定到的果刺多少调控基因大都影响黄瓜植株叶片等其他器官表皮毛的发育，从而影响植株的抗性。目前，特异性调控黄瓜果刺发育的基因还未见报道。另外，有关黄瓜果刺基座发育的分子调控的研究刚刚起步，尚缺少相应的参考依据。2018年狄胜强等对果刺基座大小性状进行遗传分析，证实该性状是由多基因控制的数量性状。但尚未有果刺基座大小基因（Spine Base Size，简称“SBS”）被精细定位，与果刺基座大小基因SBS紧密连锁的InDel标记尚未见报道。

由于还未有黄瓜果刺基座大小基因SBS的定位的报道，所以，目前，鉴定黄瓜果刺大小还需要育种者待黄瓜结实后对果刺基座形态的观察进行筛选，造成育种者不能从苗期进行选择，且不能对果刺性状进行精确的基因改良。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种与黄瓜果刺基座大小基因紧密连锁的InDel分子标记、鉴定方法及应用，以解决上述问题。

本发明提供的一个技术方案为：一种与黄瓜果刺基座大小基因紧密连锁的InDel分子标记，命名为InDel-SBS1，该InDel-SBS1位于5号染色体20290735～20294659碱基位置，缺失核苷酸序列为4895 bp，缺失序列如SEQ ID NO.7所示。

所述InDel-SBS1分子标记具有序列表SEQ ID NO.8所示的 71 个核苷酸序列，以及序列表SEQ ID NO.9所示的 69 个核苷酸序列。其中SEQ ID NO.8中的核苷酸序列与大果刺基座基因共分离，SEQ ID NO.9中的核苷酸序列与小果刺基座基因共分离。所以，该与基因SBS紧密连锁的InDel-SBS1分子标记可以快速、简便、高通量地应用于黄瓜果刺大小的检测和筛选，还能够在苗期进行分子标记辅助选择，实现黄瓜小果刺高品质黄瓜新品种的快速选育。

上述InDel-SBS1分子标记由以下任一特异性引物对进行PCR扩增获得：

正向引物1：5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTATATTCATCTAAATGTCTTAGTTGAAAAATTG-3’（SEQ ID NO.5 + SEQ ID NO.1），其中第1～21碱基是检测接头序列；和反向引物1：5’-TAAAAAACAAGAAAGAAAAGTAAAGAAACATCG-3’（SEQ ID NO.3）；或

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTATATTCATCTAAATGTCTTAGTTGAAAAATTC-3’ （SEQ ID NO.6 + SEQ ID NO.2），其中第1～21碱基是检测接头序列；和反向引物2：5’-ATGTGTTTAGGTA AAACGAAAAACAAAGTGA-3’ （SEQ ID NO.4）。

本发明还提供一种用于检测上述InDel-SBS1分子标记的特异性引物对，分别为：

正向引物1：SEQ ID NO.5 + SEQ ID NO.1，其中第1～21碱基是检测接头序列；和反向引物1：SEQ ID NO.3；或

正向引物2：SEQ ID NO.6 + SEQ ID NO.2，其中第1～21碱基是检测接头序列；和反向引物2：SEQ ID NO.4。

本发明还提供一种用于检测与黄瓜果刺基座大小共分离的上述InDel-SBS1分子标记的引物组合物，含有四条特异性引物，分别为：两条末端碱基不同的等位基因正向引物SEQ ID NO.5+NO.1和SEQ ID NO.6+NO.2，以及两条不同的反向引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4，其中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6分别为两条正向引物的接头序列。

本发明还提供一种用于检测黄瓜果刺基座大小的特异性引物对的试剂盒，含有SEQ ID NO.5 +NO.1和SEQ ID NO.3；或SEQ ID NO.6+NO.2和SEQ ID NO.4。

本发明还提供一种用于检测黄瓜果刺基座大小的引物组合物的试剂盒，含有SEQID NO.5 +NO.1，SEQ ID NO.6+NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

本发明还提供一种上述特异性引物对或上述引物组合物在黄瓜果刺基座大小鉴定中的应用。

本发明还提供一种上述InDel-SBS1分子标记或上述特异性引物对或上述引物组合物在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供一种上述InDel-SBS1分子标记或上述特异性引物对或上述引物组合物在黄瓜种质资源改良中的应用。

本发明还提供一种鉴定黄瓜果刺基座大小的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测黄瓜的基因组DNA；

（2）以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用上述引物组合物进行KASP反应；

（3）通过KSAP系统的PHAstar荧光扫描仪和Kraken数据管理分析系统对PCR扩增产物进行分型检测，并以图表的形式呈现出来；图表分为X、Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起；图表中靠近X、Y轴的是纯合基因型，靠近对角线位置的是杂合基因型。具体地，图表中靠近X、Y轴的纯合基因型分别表示为GG和CC，靠近对角线位置的杂合基因型表示为CG；其中，CC组合型为候选的具有小果刺基座的性状的黄瓜；其他情况待测黄瓜为候选的具有大果刺基座性状的黄瓜。

其中，KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）指的是竞争性等位基因特异性PCR，是当前InDel分析鉴定的主流方法之一。KASP利用荧光探针并基于引物末端碱基的特异匹配进而检测InDels，可以对基因组特定位点上的InDels进行快速精准的鉴定。

黄瓜果刺基座大小基因SBS只调控黄瓜果刺大小，并不影响黄瓜植株叶片、茎等其他器官的表皮毛的发育。因此，利用本发明提供的与该基因SBS紧密连锁的InDel-SBS1分子标记可以获得黄瓜果刺基座大小性状的相关基因SBS。InDel-SBS1标记稳定性高、特异性强、可靠性好的特点，利用KASP技术，能在黄瓜植株生长的任意阶段就可鉴定育种群体是否含有这一基因，可以实现在苗期进行果刺基座大小的鉴定，进而缩短不同果刺大小性状的育种周期，加快育种进程，从而建立快速、高效、简便的分子标记育种体系，节约大量的时间和成本，对改善黄瓜果实的外在品质具有重要的意义。

附图说明

图1为黄瓜材料的照片图；其中，该图中的图A为大果刺黄瓜材料L-SB的照片图，图B为小果刺黄瓜材料S-SB的照片图，图C为图A标记部分的放大照片图，图D为图B标记部分的放大照片图。

图2是图1所示的黄瓜材料开花当天子房表面果刺基座形态图；其中，图E为L-SB开花当天子房表面果刺基座形态，图F为S-SB开花当天子房表面果刺基座形态。

图3为InDel-SBS1分子标记在F2群体中的验证结果，图中所示，蓝色点区域代表纯合大果刺基座基因型（GG），红色点区域代表纯合小果刺基座基因型（CC）；绿色点区域代表杂合硬刺基因型（CG）。

图4是InDel-SBS1分子标记对不同黄瓜果刺基座大小品种的筛选效果图。

序列表中：

SEQ ID NO.1为用于检测黄瓜果刺基座大小的一个正向引物的DNA序列；

SEQ ID NO.2为用于检测黄瓜果刺基座大小的另一个正向引物的DNA序列；

SEQ ID NO.3为SEQ ID NO.1对应的反向引物的DNA序列；

SEQ ID NO.4为SEQ ID NO.2对应的反向引物的DNA序列；

SEQ ID NO.5为SEQ ID NO.1的检测接头DNA序列；

SEQ ID NO.6为SEQ ID NO.2的检测接头DNA序列；

SEQ ID NO.7为与黄瓜果刺基座大小相关的InDel-SBS1分子标记DNA序列；

SEQ ID NO.8为与黄瓜大果刺基座基因共分离的DNA序列；

SEQ ID NO.9为与黄瓜小果刺基座基因共分离的DNA序列。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。下列实施例中未特别指明具体条件的实验方法，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。实施例中的试剂耗材等，如无特殊标注，均可从商业途径购买得到。

生物材料

小果刺基座黄瓜材料S-SB和大果刺基座黄瓜材料L-SB，如图1和图2所示，是由本实验室培育获得的一对除果刺基座大小不同外，其它性状完全一致的近等基因系（nearisogenic lines，NIL）。

试剂与耗材

KSAP反应所需的试剂，如2×KASP V4.0 Mastermix等。

实施例1 F2代遗传分离群体的构建

小果刺基座黄瓜材料S-SB和大果刺黄瓜材料L-SB配制杂交组合，F₁群体单株全部表现为大果刺基座性状。F₁代自交产生F₂代群体，共1040株个体，鉴定单株表型，其中大果刺基座单株784株，小果刺基座单株256株，经卡方检验验证其符合3:1的分离比例，确定该群体中黄瓜小果刺基座性状是单基因控制的隐性性状，并且，命名小果刺基座基因为sbs-1，大果刺基座基因为SBS-1。

实施例2 黄瓜全基因组重测序

采用群体分离分析法（BSA）从F₂分离群体中分别随机挑选大基座和小基座个体各30株，建立小果刺基座黄瓜（sbs1 sbs1）和大果刺基座黄瓜（SBS1_）的基因混池。并将混池送至北京百迈克生物科技有限公司进行全基因组重测序。将筛选获得的纯合SNP标记与果刺基座大小性状进行关联分析，将控制黄瓜小果刺基座的小果刺基座基因sbs-1定位到5号染色体，从而获得InDel-SBS1分子标记，该InDel-SBS1分子标记位于5号染色体20290735～20294659碱基位置，缺失核苷酸序列为4895 bp，缺失序列如SEQ ID NO.7所示。

所述InDel-SBS1分子标记具有序列表SEQ ID NO.8所示的 71 个核苷酸序列，以及序列表SEQ ID NO.9所示的 69 个核苷酸序列。其中SEQ ID NO.8中的核苷酸序列与大果刺基座基因共分离，SEQ ID NO.9中的核苷酸序列与小果刺基座基因共分离。

实施例3 KASP技术用于黄瓜果刺基座大小的基因分型

准备：两条末端碱基不同的等位基因正向引物与两条不同的反向引物构成的引物混合溶液（primer Mix），两条正向引物5’端分别连有不同的检测接头序列；混有2个荧光基团FAM、HEX的反应混合物（Master Mix）；DNA模板。

KSAP反应体系：DNA模板 3 μL，2×Master mix 5 μL，primer mix 0.14 μL，用H₂O补足总反应体积10 μL。

KSAP反应程序：94℃热启动激活15 min；94℃ 20 sec，51℃～55℃ 60 sec，每个循环降0.6℃，10个循环；94℃ 20 sec，55℃ 60 sec，26个循环。

PCR反应I：变性模板与引物混合溶液中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测接头序列；

PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；

PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测序列随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。

本实施例涉及的黄瓜果刺大小基因SBS紧密连锁的标记InDel-SBS1引物分别为：

正向引物1：SEQ ID NO.5 + SEQ ID NO.1，其中第1～21碱基是检测接头序列；

正向引物2：SEQ ID NO.6 + SEQ ID NO.2，其中第1～21碱基是检测接头序列；

反向引物1：SEQ ID NO.3；

反向引物2：SEQ ID NO.4。

在F2代群体验证结果如图2所示。

图2分为X、Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起呈现相同的颜色。靠近X、Y轴的是纯合基因型，分别用蓝点和红点表示；靠近对角线位置的是杂合基因型，用绿点表示。大果刺基座型的黄瓜表示为G，显示为靠近X轴的位置的蓝点；小果刺基座型的黄瓜表示为C，显示为靠近Y轴的位置的红点。

从图2的群体分型结果显示：大果刺基座型的个体显示为聚团在靠近X轴的位置的蓝点，属于纯合基因型GG；或显示为靠近对角线的位置的绿点，属于杂合基因型GC。小果刺基座型的个体都显示为聚团在靠近Y轴的位置的红点，属于纯合基因型CC。由此证明：本发明提供的InDel-SBS1分子标记与黄瓜果刺基座大小的性状紧密连锁，能够利用本实施例提供的四条引物组合物对待测黄瓜品种或品系进行检测。

实施例4 共分离SNP标记在自然群体中的验证

选取田间52份果刺基座大小不同的两叶一心时期的黄瓜材料，包括L-SB、S-SB、25份欧洲温室型黄瓜种质和25份东亚型黄瓜种质。其中25份东亚型黄瓜种质拥有大果刺基座，25份欧洲温室型黄瓜种质都是小果刺基座材料。对InDel-SBS分子标记进行验证，结果如图3所示。

从图3所示的自然群体分型结果显示：大果刺基座型的东亚型黄瓜种质都聚团在靠近X轴的位置，显示蓝点，属于纯合基因型GG；小果刺基座型的欧洲温室型黄瓜种质个体都聚团在靠近Y轴的位置，显示红点，属于纯合基因型CC。由此进一步证明：本发明实施例提供的InDel-SBS1分子标记与黄瓜果刺基座大小的性状紧密连锁，该InDel-SBS1标记稳定性高、特异性强、可靠性好的特点，可以在苗期进行黄瓜品种或品系果刺基座大小的快速鉴定，实现在苗期进行分子标记辅助选择，能够快速黄瓜小果刺高品质黄瓜新品种的选育，进而缩短不同果刺大小性状的育种周期，加快育种进程。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110>河南农业大学

<120>与黄瓜果刺基座大小基因SBS紧密连锁的分子标记及其应用

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<212> DNA

<213> 黄瓜

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<212> DNA

<213> 黄瓜

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taaacacat 69

Claims

1.一种与黄瓜果刺基座大小基因紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于，它位于5号染色体20290735～20294659碱基位置，缺失核苷酸序列为4895 bp，缺失序列如SEQ IDNO.7所示。

2.根据权利要求1所述的InDel分子标记，其特征在于，它具有与大果刺基座基因共分离的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，以及与小果刺基座基因共分离的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求1或2所述的InDel分子标记，其特征在于，由以下任一特异性引物对进行PCR扩增获得：

正向引物1：5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTATATTCATCTAA ATGTCTTAGTTGAAAAATTG-3’，其中第1～21碱基是检测接头序列；和反向引物1：5’-TAAAAAACAAGAAAGAAAAGTAAAGAAACATCG-3’；或

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTATATTCATCTA AATGTCTTAGTTGAAAAATTC-3’，其中第1～21碱基是检测接头序列；和反向引物2：5’-ATGTGTTTAGGTAAAACGAAAAACAAAGTGA-3’。

4.一种用于检测权利要求1～3任一项所述的InDel-SBS1分子标记的特异性引物对，其特征在于，分别为：

正向引物1：5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTATATTCATCTAA ATGTCTTAGTTGAAAAATTG-3’，其中第1～21碱基是检测接头序列；和反向引物1：5’-TAAAAAACAAGAAAGAAAAGTAAAGAAACATCG- 3’；或

5.一种用于检测黄瓜果刺基座大小共分离的InDel-SBS1分子标记的引物组合物，其特征在于，含有四条特异性引物，分别为：

正向引物1：5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTTATATTCATCTAA ATGTCTTAGTTGAAAAATTG-3’，其中第1～21碱基是检测接头序列；

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTATATTCATCTA AATGTCTTAGTTGAAAAATTC-3’，其中第1～21碱基是检测接头序列；

反向引物1：5’-TAAAAAACAAGAAAGAAAAGTAAAGAAACATCG- 3’；和

反向引物2：5’-ATGTGTTTAGGTA AAACGAAAAACAAAGTGA-3’。

6.一种含有权利要求4所述的特异性引物对或含有权利要求5所述的引物组合物的试剂盒。

7.一种权利要求4所述的特异性引物或权利要求5所述的引物组合物在黄瓜果刺基座大小鉴定中的应用。

8.一种权利要求1～3任一项所述的InDel-SBS1分子标记或权利要求4所述的特异性引物或权利要求5所述的引物组合物在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。

9.一种权利要求1～3任一项所述的InDel-SBS1分子标记或权利要求4所述的特异性引物或权利要求5所述的引物组合物在黄瓜种质资源改良中的应用。

10.一种鉴定黄瓜果刺基座大小的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测黄瓜的基因组DNA；

（2）以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求5所述的引物组合物进行KASP反应；

（3）通过KSAP系统的PHAstar荧光扫描仪和Kraken数据管理分析系统对PCR扩增产物进行分型检测，并以图表的形式呈现出来；图表分为X、Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起；图表中靠近X、Y轴的是纯合基因型，靠近对角线位置的是杂合基因型。