CN109762920A - 黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术辅助育种领域，特别涉及黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记及其应用。用于检测黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记的引物，核苷酸序列为TCACCCTTACTCTAAAAAAGTA/GCTTTCAACGTGAAAAATGTG；所述引物扩增的与黄瓜果实多刺基因ns连锁的特征条带的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，序列的23位碱基为T；所述引物扩增的与黄瓜果实少刺基因Ns连锁的特征条带的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，序列的23位碱基为C。该标记可用在黄瓜候选材料的任何阶段判断其果实为多刺还是少刺，具有效率高、限制少、准确度高的优点。

Description

黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术辅助育种领域，特别涉及一种黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP 标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，因其风味清香、口感脆爽、营养丰富，深受各国消费者的喜爱。作为重要的果菜类蔬菜，果实品质一直是黄瓜育种研究的重点。黄瓜果实品质包括外观品质和内在品质。通常说的品质性状主要指商品性即外观品质，包括瓜色、瓜长、果刺多少、果刺颜色、果瘤大小、果色均匀度、光泽度、果棱、果实表面黄色条纹等。果刺多少作为黄瓜重要的商品性状之一，对商品销售影响很大。一般来讲，国内市场上需求密刺黄瓜，目前生产上主推的品种绝大多数为密刺。研究黄瓜果刺多少的遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的新品种具有重要意义。

关于控制黄瓜果刺的相关基因，已报道的有五个基因，分别为s、s-2、s-3、ss和ns。前人对于果刺多少的遗传规律进行了多项研究。1984年Fanourakis首次报道了控制黄瓜果实多刺的基因(ns)，少刺Ns对多刺ns为显性。随后Fanourakis和Simon的研究也表明，黄瓜果实少刺对多刺为显性，且与小刺基因(ss)存在连锁关系。Xie等将多刺性状作为质量性状来研究，定位在了Chr.2上nsIndel55-nsIndel39之间32.4kb的区间内，并预测到候选基因Csa2M264590。张圣平等开发了与黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的Indelns-24标记，但标记Indelns-24用于分子标记辅助选择的准确率低于80％。到目前为止，与质量性状基因ns紧密连锁的SNP标记尚未见报道。

发明内容

本发明基于上述领域的空白，提供了与黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记，并提供了其在选择黄瓜果刺多少种质资源上的应用。

本发明的技术方案如下：

用于检测黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记的引物，其特征在于：其核苷酸序列如下：

SNPns-01-F：5’-TCACCCTTACTCTAAAAAAGTA-3’；

SNPns-01-R：5’-GCTTTCAACGTGAAAAATGTG-3’；

所述引物扩增的与黄瓜果实多刺基因ns连锁的特征条带的核苷酸序列如Seq IDNo.1所示，序列的第23位碱基为T，经RsaI酶切后得到154bp片段；

所述引物扩增的与黄瓜果实少刺基因Ns连锁的特征条带的核苷酸序列如Seq IDNo.2所示，序列的第23位碱基为C，经RsaI酶切后得到133bp片段。

一种筛选具有果实多刺基因ns的黄瓜种质资源的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取待测样品基因组DNA；

(2)以所述待测样品基因组DNA为模板，以所述引物进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增片段进行测序或RsaI酶切；

如果测序结果如Seq ID No.1所示，则果实为多刺性状；如果测序结果如Seq IDNo.2所示，则果实为少刺性状；

如果酶切后片段为154bp，则果实为多刺性状；如果酶切后片段为133bp，则果实为少刺性状。

优选地，所述PCR扩增的反应体系为：15ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μLGo Green Master Mix，加双蒸水至10μL。

优选地，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

优选地，所述RsaI酶切的体系为：PCR产物3μl，RsaI酶0.2μl，NEB cutsmartbuffer 1μl，双蒸水5.8μl；酶切条件为：温度为37℃，酶切时间为2h。

用于筛选具有果实多刺性状的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于：包括粉状或溶液状态的所述引物。

优选地，所述试剂盒还包括RsaI酶。

优选地，所述试剂盒还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。

任一所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括合成所述引物并包装为试剂盒的一部分的步骤。

优选地，所述制备方法还包括组装PCR反应和/或电泳所需的试剂。

本发明根据黄瓜基因组序列的数据和黄瓜果实多刺自交系WI 2757和少刺自交系Wis.SMR18的重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，获得了与果刺多少性状相关的SNP标记SNP12797647(C/T)(SNPns01)，发现在材料WI2757(多刺)基因组中，该位点的碱基为T；在材料Wis.SMR18(少刺)基因组中，该位点的碱基为C。利用53份黄瓜核心种质材料对所述SNP标记进行验证，结果表明SNPns01标记用于分子标记辅助果实多刺性状选择的正确率为92.5％。本发明不仅为黄瓜果实多刺基因ns的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育果实多刺黄瓜新品种提供了高效的途径。

本发明基于开发的SNP标记提供用于辅助筛选具有果实多刺基因ns的黄瓜新品种的方法。该方法中，采用所述SNP标记的特异性引物SNPns-01-F/SNPns-01-R扩增待测材料的基因组DNA，然后对扩增产物进行测序鉴定或者RsaI酶切鉴定。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实多刺的筛选，具有高效、限制少、准确的优点。

附图说明

图1是利用本发明的SNP标记(SNPns01)检测黄瓜亲本材料WI 2757(P₁)，Wis.SMR18 (P₂)，F₁世代单株的电泳检测结果；泳道1-3分别是亲本材料WI 2757(P₁)，Wis.SMR18 (P₂)，F₁世代单株的检测结果；其中，P₁:WI 2757(果实多刺)得到一个154bp的片段，P₂: Wis.SMR18(果实少刺)得到一个133bp的片段，F₁代同时检测到154bp和133bp两个片段。

图2是利用黄瓜材料验证SNP标记(SNPns01)的电泳检测结果。其中，数字标记的泳道为53份核心种质材料的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。

生物材料的来源和记载出处

WI 2757(P₁)是欧洲温室型黄瓜雌性系，生长势中等，叶片中等偏小，果皮绿色，果实多刺，白色果刺，无果瘤。为现有已知品种，在Xiaoming He等人于2013年8月在《TheorAppl Genet》第8期发表的文章《QTL mapping of powdery mildew resistance in WI2757 cucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

Wis.SMR18(P₂)是美国加工类型黄瓜自交系，生长势强等，叶片掌状，果皮深绿和白色相间，黑色果刺，果实少刺。为现有已知品种，在Christopher S.Cramer和ToddC.Wehner 于1999年在《Euphytica》第110卷、第99–108页发表的文章《Little heterosisfor yield and yield components in hybrids of six ucumber inbreds》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

53份核心种质材料是本所构建的包含120份材料的核心种质的一部分，是从3318份黄瓜资源里面筛选出来的，均为现有已知品种。在2011年6月，吕婧发表的中国农业科学院硕士学位论文《黄瓜种质资源群体结构分析与核心种质集筛选》第三章“核心种质资源的构建”部分里面有介绍，是从3318份黄瓜资源里面筛选了120份作为核心种质。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

Dcaps-RsaI标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用dcaps finder软件和primer 3.0软件设计，并在北京生工公司合成。重测序的基因组信息详见Qi等在《Nature Genetics》杂志2013年发表的论文《Agenomic variation map providesinsights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity》。

主要试剂

PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix；酶切使用NebEngland Biolabs的限制性内切酶Rsa I；凝胶电泳使用康润公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至 6％后使用。测序在北京生工公司进行。

下述实施例中，未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或参考制造厂商说明书记载的方法。

实施例1.黄瓜果实多刺基因ns连锁的SNP标记的获得

在前期研究中我们利用5个Indel标记，将黄瓜果实多刺基因ns定位在2号染色体上标记nsIndel55和nsIndel39之间，该区段的物理距离32.4kb，并预测基因Csa2M264590。基于以上结果，我们开展了本研究。

SNP标记的获得

结合黄瓜基因组序列的数据和黄瓜材料WI 2757和Wis.SMR18的重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，分析定位该区域内的SNP，找到SNP12797647(C/T)(命名为SNPns01)，发现该SNP在材料WI2757(多刺)基因组中，该位点的碱基为T；在材料Wis.SMR18(少刺)基因组中，该位点的碱基为C。

基于SNP标记开发dcaps标记

基于获得的与果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记SNP12797647，开发与果实多刺基因ns连锁的dcaps标记(命名为dcaps-RsaI)。其中正向引物和反向引物分别为：

SNPns-01-F(dcaps－RsaI－F)：TCACCCTTACTCTAAAAAAGTA；

SNPns-01-R(dcaps－RsaI－R)：GCTTTCAACGTGAAAAATGTG。

由于上述所得SNP的关系(SNP＝C/T)，当碱基C存在时，形成限制性内切酶RsaI的识别序列(GT↓AC，↓为酶切位点)，扩增片段可以被内切酶RsaI切开；当碱基T存在时，不能形成限制性内切酶RsaI的识别序列，扩增片段无法被内切酶RsaI切开。

通过上述引物(SNPns-01-F/SNPns-01-R)对双亲材料WI 2757和Wis.SMR18进行PCR 扩增，并结合内切酶RsaI对扩增片段进行酶切，获得特异性条带。在材料WI2757(多刺)中，获得一个154bp的条带，在材料Wis.SMR18(少刺)中，获得一个133bp的条带。

具体操作方法：

步骤1.DNA提取和PCR扩增

取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本WI 2757(P₁) 和Wis.SMR18(P₂)以及F₁、BC₁P₁、BC₁P₂群体各单株的基因组DNA。

dcaps标记PCR反应体系为：总反应体系10μL，3μL DNA(5.0ng·μL^-1)，正向和反向引物SNPns-01-F/SNPns-01-R(50ng·μL^-1)各1μL，5μL GoGreen Master Mix(Promega公司产品)。

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃保存。

步骤2.RsaI完全酶切PCR产物

酶切体系为：PCR产物3μl，内切酶0.2μl，NEB cutsmart buffer 1μl，双蒸水5.8μl。酶切温度为37℃，酶切时间为2h。

步骤3.结果判定

方法一：跳过步骤2，不经过酶切，将PCR产物直接测序。WI2757(多刺)所得序列在第23位碱基为T；Wis.SMR18(少刺)所得序列在第23位碱基为C；F₁所得序列该位置有两种碱基，C和T同时存在。

方法二：经过内切酶RsaI完全酶切，酶切产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色，统计带型。

如图1所示，WI2757(多刺)得到一个154bp的片段，条带带型记为a；Wis.SMR18(少刺)得到一个133bp的片段，条带带型记为b；F1中两个条带同时检测到，条带带型记为h。

实施例2.黄瓜果实多刺基因ns侧翼标记的验证

利用本课题组保存的53份核心种质材料，对实施例1获得的与ns基因连锁的SNP标记 (SNPns01)进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证方法采用实施例1记载的步骤1～3。

PCR产物的酶切条带见图2。经和所选材料的田间表现型相比，本发明的SNP标记在53份材料中共有49份材料的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算，正确率为92.5％。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记及其应用

<130> P190030/SCH

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 154

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 与黄瓜果实多刺ns连锁的片段

<400> 1

tcacccttac tctaaaaaag tatttataaa attagtaaac agtctatcta tcaatcaaat 60

ttttctaaac gttaagtttg ttctgttgtg actattactc ataaaagcta ttgttgttaa 120

caattatcaa tgacacattt ttcacgttga aagc 154

<210> 2

<211> 154

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 与黄瓜果实少刺Ns连锁的片段

<400> 2

tcacccttac tctaaaaaag tacttataaa attagtaaac agtctatcta tcaatcaaat 60

ttttctaaac gttaagtttg ttctgttgtg actattactc ataaaagcta ttgttgttaa 120

caattatcaa tgacacattt ttcacgttga aagc 154

<210> 3

<211> 133

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 与黄瓜果实少刺Ns连锁的片段经RsaI酶切后产生的片段

<400> 3

acttataaaa ttagtaaaca gtctatctat caatcaaatt tttctaaacg ttaagtttgt 60

tctgttgtga ctattactca taaaagctat tgttgttaac aattatcaat gacacatttt 120

tcacgttgaa agc 133

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 用于检测黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记的正向引物SNPns-01-F

<400> 4

tcacccttac tctaaaaaag ta 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 用于检测黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记的反向引物SNPns-01-R

<400> 5

gctttcaacg tgaaaaatgt g 21

Claims (10)

1.用于检测黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记的引物，其特征在于：其核苷酸序列如下：

SNPns-01-F：5’-TCACCCTTACTCTAAAAAAGTA-3’；

SNPns-01-R：5’-GCTTTCAACGTGAAAAATGTG-3’；

所述引物扩增的与黄瓜果实多刺基因ns连锁的特征条带的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，序列的第23位碱基为T，经RsaI酶切后得到154bp片段；

所述引物扩增的与黄瓜果实少刺基因Ns连锁的特征条带的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，序列的第23位碱基为C，经RsaI酶切后得到133bp片段。

2.一种筛选具有果实多刺基因ns的黄瓜种质资源的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取待测样品基因组DNA；

(2)以所述待测样品基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增片段进行测序或RsaI酶切；

如果测序结果如Seq ID No.1所示，则果实为多刺性状；如果测序结果如Seq ID No.2所示，则果实为少刺性状；

如果酶切后片段为154bp，则果实为多刺性状；如果酶切后片段为133bp，则果实为少刺性状。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：15ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL GoGreen Master Mix，加双蒸水至10μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述RsaI酶切的体系为：PCR产物3μl，RsaI酶0.2μl，NEB cutsmart buffer 1μl，双蒸水5.8μl；酶切条件为：温度为37℃，酶切时间为2h。

6.用于筛选具有果实多刺性状的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于：包括粉状或溶液状态的权利要求1所述的引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括RsaI酶。

8.根据根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。

9.权利要求6-8任一所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括合成权利要求1所述的引物并包装为试剂盒的一部分的步骤。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：还包括组装PCR反应和/或电泳所需的试剂。