CN106702017A

CN106702017A - 用于检测黄瓜果实表皮细胞结构的snp标记方法

Info

Publication number: CN106702017A
Application number: CN201710145415.1A
Authority: CN
Inventors: 张圣平; 顾兴芳; 苗晗; 张松; 王烨
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-13
Filing date: 2017-03-13
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2037-03-13
Also published as: CN106702017B

Abstract

本发明“用于检测黄瓜果实表皮细胞结构的SNP标记方法”，涉及生物技术辅助育种领域。用于检测黄瓜果实表皮细胞结构的SNP标记方法，其中所述标记引物的核苷酸序列为：dcaps—RsaI—F:GGGAACAATATTATTTTTGGAGTA/dcaps—RsaI—R:TGATTCCTATTACCTTCAACCTCA；以黄瓜基因组DNA为模板，以上述引物为前后引物进行PCR扩增，获得一个158bp的片段，该片段第26个碱基为SNP20114537A/C。片段如Seq ID No.1所示，则果实为栅栏状表皮细胞；片段如Seq ID No.2所示，则果实为扁平状表皮细胞；采用本发明获得的SNP标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断其果实表皮细胞结构为栅栏状还是扁平状，该标记具有高效、限制少的优点，提高了选育果实具有栅栏状表皮细胞的加工型黄瓜材料和具有扁平状表皮细胞的鲜食型黄瓜材料的效率，缩短了育种周期。

Description

用于检测黄瓜果实表皮细胞结构的SNP标记方法

技术领域

本发明涉及生物技术辅助育种技术领域，特别涉及一种用于检测黄瓜果实表皮细胞结构的的SNP标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，因其风味清香、口感脆爽，深受各国消费者的喜爱。随着消费水平的提高，人们对黄瓜品质的重视程度与日俱增。品质育种已成为黄瓜育种的重点之一。黄瓜果实品质包括鲜食品质和加工品质。鲜食品质要求黄瓜果实表皮薄、肉质脆，清香味浓、口感好；加工品质要求表皮致密、肉质较厚、干物质含量高。因此，研究黄瓜果实表皮细胞结构的分子标记，对于选育符合鲜食和加工的黄瓜新品种具有重要意义。

黄瓜果实表皮细胞指黄瓜果实最外层的一层细胞，表皮细胞能减少果实水分散失，保护果实免受物理伤害，位于表皮上的气孔能调节果实与外界气体的交换。不同结构形状的表皮细胞对于果实所起的作用存在差异，栅栏状的表皮细胞结构能更好的保护果实免受物理伤害，减少水分散失，同时使果实皮质紧密，能够提升加工品质；扁平状的表皮细胞结构在保护果实免受物理伤害、减少水分散失以及使皮质紧密方面的效果相对较差。

目前，在黄瓜上与果实相关的性状(比如，瓜长、把长、刺瘤、棱、纹等)研究较多，而对于黄瓜果实表皮细胞结构的研究极少，仅见一篇报道。1987年，国外学者Fanourakis以具有栅栏状表皮细胞结构的加工型黄瓜和具有扁平状表皮细胞结构的鲜食性黄瓜为材料，进行了果实栅栏状表皮细胞基因Pe的遗传分析，结果表明，杂交后代F₁的果实表皮细胞呈栅栏状排列，F₂群体出现了栅栏状结构和扁平状结构的分离，分离比符合栅栏状：扁平状＝3:1。结论认为，黄瓜果实栅栏状表皮细胞结构是由一个单基因(Pe)控制的，其中栅栏状对扁平状为显性，且该基因与果色一致基因u、果瘤基因Tu、无光泽基因D有连锁关系。截止目前，尚未见与Pe基因连锁的SNP分子标记的报道。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的SNP标记，并提供了该标记在筛选果实具有栅栏状结构表皮细胞的加工黄瓜种质资源上的应用。

一种用于检测黄瓜果实表皮细胞结构的SNP标记的引物，其特征在于：其核苷酸序列如下：

dcaps—RsaI—F:GGGAACAATATTATTTTTGGAGTA

dcaps—RsaI—R:TGATTCCTATTACCTTCAACCTCA

所述引物扩增的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.1所示，序列的26位碱基为A，经RsaI酶切后得到158bp片段；

所述引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带核苷酸序列如Seq ID No.2所示，序列的26位碱基为C，经RsaI酶切后得到134bp片段。

一种筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜种质资源的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品基因组DNA；

(2)以所述待测样品基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增片段进行测序或RsaI酶切；

如果测序结果如Seq ID No.1所示，果实表皮细胞结构为栅栏状，如果测序结果如Seq ID No.2所示，果实表皮细胞结构为扁平状；

如果酶切后片段为158bp，则果实表皮细胞结构为栅栏状；如果酶切后片段为134bp，则果实表皮细胞结构为扁平状。

优选地，所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/μl DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。

优选地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

优选地，所述方法中，RsaI酶切的体系为：PCR产物3μl，内切酶0.2μl，NEBcutsmart buffer1μl，双蒸水5.8μl，酶切温度为37℃，酶切时间为2h。

一种用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，包括粉状或溶液状态的核苷酸序列如下的引物：

dcaps—RsaI—F:GGGAACAATATTATTTTTGGAGTA

dcaps—RsaI—R:TGATTCCTATTACCTTCAACCTCA。

所述试剂盒还包括RsaI酶。

上述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括将所述引物包装为试剂盒的一部分的步骤。

进一步地，还包括组装PCR反应和/或电泳所需的试剂。

本发明通过利用WI2757,Wis.SMR18以及其F1(WI2757果实表皮细胞结构为扁平状，Wis.SMR18和F1的果实表皮细胞结构为栅栏状)构建的两个均为60株的回交群体进行验证，结果表明SNP20114537验证的正确率分别为93.33％和100％。

本试验不仅为黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育果实具有栅栏状表皮细胞结构的加工黄瓜新品种提供了高效的途径。

本发明基于SNP标记提供用于辅助筛选具有特定结构表皮细胞加工黄瓜新品种的方法，该方法中，采用所述SNP20114537特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行测序及酶切。

本发明基于上述引物，请求保护包含所述引物的试剂盒及其制备方法，任何基于商业目的的生产、制造和/或销售所述试剂盒的行为均属于本发明请求保护的范围。所述行为指，组装试剂盒的试剂中包括所述引物，或在标有辅助选育果实具有栅栏状表皮细胞结构的黄瓜品种资源的试剂包装中装有所述的引物。进一步地，组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。

通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行表皮细胞结构鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。

附图说明

图1.采用本发明所述的SNP20114537的特异性引物验证回交群体的黄瓜材料获得的基因片段对比图，Pe代表栅栏状结构，Fe代表扁平状结构；

图2.Dcaps-RsaI标记在BC1P1和BC1P2中的验证结果。1表示栅栏状结构；2表示扁平状结构。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。

生物材料的来源和记载出处

本研究所用的试验材料为黄瓜纯合自交系WI2757和Wis.SMR18。以WI2757为母本，Wis.SMR18为父本杂交，获得F1，自交获得F2群体。

本研究所用的验证群体是利用两亲本杂交获得的F1与两亲本回交构建的均包含60株的回交群体BC₁P₁、BC₁P₂。

WI2757(P₁)：欧洲温室型黄瓜雌性系，生长偏弱，侧枝发达。连续座果多，瓜长10厘米左右，表面多刺，无苦味，果实表皮细胞为扁平状，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《Hortscience》第33卷第6期第1050-1052页上发表的文章《Independenceof the mj nematode resistance gene from 17gene loci in cucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

Wis.SMR18(P₂)：美加工型黄瓜自交系，生长势强，侧枝较发达。瓜长15厘米左右，表面稀刺，果肉致密、硬度大，果实表皮细胞结构为栅栏状，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《Hortscience》第33卷第6期第1050-1052页上发表的文章《Independence of the mj nematode resistance gene from 17gene loci incucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

Dcaps-RsaI标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用dcaps finder软件和primer3.0软件设计，并在上海生工公司合成。

主要试剂

PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix；酶切使用NebEngland Biolabs的限制性内切酶Rsa I；凝胶电泳使用康润公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京诺赛基因组研究有限公司进行。

实施例1.用于检测黄瓜果实表皮细胞结构基因的SNP标记SNP20114537的获得

在前期研究中我们利用7个SSR标记和5个Indel标记，将果实表皮细胞结构基因Pe定位在5号染色体上标记SSR14611和Indelpe12之间，该区段的物理距离227.5kb。基于以上结果，我们开展了本研究。

步骤1.SNP的获得

结合黄瓜基因组序列的数据和两亲本重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，分析定位该区域内的SNP，找到SNP20114537(A-C)，发现该SNP在材料WI2757(扁平状)基因组中，该位点碱基为A；在材料Wis.SMR18(栅栏状)基因组中，该碱基为C。

步骤2.SNP20114537在F₂群体中的连锁分析

根据SNP20114537的物理位置，结合黄瓜基因组序列数据，利用primer 3.0软件设计引物，使扩增片段包含该SNP，用该引物在226个F₂单株中扩增包含该SNP的片段，将PCR产物测序，将每个单株的SNP与表型相比较，分析该SNP在F₂群体中的连锁情况。

PCR反应体系为：总反应体系10μL,3μL DNA(5.0ng·μL^-1)，正向和反向引物(50ng·μL^-1)各1μL，5μL GoGreen Master Mix(Promega公司产品)。

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃forever。

结果表明，226个F₂单株中，所有该位点碱基为AA(纯合)或AC(杂合)的单株果实表皮细胞结构均为扁平状，所有该位点碱基为CC(纯合)的单株果实表皮细胞结构均为栅栏状，SNP20114537与表皮细胞结构基因存在共分离。以上结果表明该SNP与表皮细胞结构基因存在联锁关系。

实施例2.基于SNP20114537设计dcaps标记

本发明基于实施例1中获得的与表皮细胞结构基因紧密连锁的SNP标记SNP20114537,开发与表皮细胞结构连锁的dcaps标记(命名为dcaps-RsaI)。其中正向和反向引物分别为：

dcaps—RsaI—F:GGGAACAATATTATTTTTGGAGTA

dcaps—RsaI—R:TGATTCCTATTACCTTCAACCTCA

由于实施例1中所得SNP的关系(SNP＝A/C)，当碱基C存在时，形成内切酶RsaI的识别序列(GT↓AC，↓为酶切位点)，扩增片段可以被内切酶RsaI切开；当碱基A存在时，不能形成内切酶识别序列，扩增片段无法被内切酶RsaI切开。

通过上述引物(dcaps—RsaI—F/dcaps—RsaI—R)对双亲材料进行PCR扩增，并结合内切酶RsaI对扩增片段进行酶切，获得特异性条带，其中在材料WI2757(扁平状)中，获得一个134bp的条带，在材料Wis.SMR18(栅栏状)中，获得一个158bp的条带。

具体操作方法：

步骤1.DNA提取和PCR扩增

取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及F₁、BC₁P₁、BC₁P₂群体各单株的基因组DNA。

Dcaps标记PCR反应体系为：总反应体系10μL,3μL DNA(5.0ng·μL^-1)，正向和反向引物(50ng·μL^-1)各1μL，5μL GoGreen Master Mix(Promega公司产品)。

步骤2.RsaI完全酶切PCR产物

酶切体系为：PCR产物3μl，内切酶0.2μl，NEB cutsmart buffer1μl，双蒸水5.8μl。酶切温度为37℃，酶切时间为2h。

扩增产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h5min，电泳后银染显色，统计带型。

步骤3.结果判定

方法一：不经过酶切，将PCR产物直接测序。WI2757(扁平状)所得序列在第26位碱基为C；Wis.SMR18(栅栏状)所得序列在26位碱基为A；F₁所得序列该位置有两种碱基，A和C同时存在。

方法二：经过内切酶完全酶切，酶切产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。WI2757(扁平状)得到一个为134bp的片段，条带带型记为a；Wis.SMR18(栅栏状)得到一个158bp的片段条带带型记为b；F1中两个条带同时检测到，条带带型记为h。

实施例3.Dcaps—RsaI在两个回交群体中的应用

步骤1.黄瓜果实表皮细胞结构鉴定

本试验以黄瓜高代自交系WI2757(表皮细胞扁平状排列)和Wis.SMR18(表皮细胞栅栏状排列)为母本和父本，自交获得F₁，F₁与亲本回交获得两个回交群体BC₁P₁、BC₁P₂，两个群体均为60株。2015年春季，在中国农业科学院蔬菜花卉研究所顺义基地大棚种植亲本材料，F₁和两回交群体，于盛瓜期摘商品瓜，制作果实横切面临时切片，利用光学显微镜在100倍放大倍数下进行表皮细胞结构鉴定。分两种结构，分别为栅栏状结构和扁平状结构。

步骤2.分子标记分析

用实施例2根据SNP20114537设计的dcaps标记对两亲本材料，F₁以及两个回交群体进行分析，以确定该SNP用于分子标记辅助选择的准确性。

验证采用实施例2中中的PCR扩增、酶切和结果分析方法。

步骤3.结果分析

参照实施例2步骤3方法一，在回交群体BC₁P₁中，果实栅栏状表皮细胞结构植株有29株，28株田间调查结果与标记分析结果一致(结果一致该位点碱基为A，不一致该位点碱基为C)；果实扁平状表皮细胞结构植株有31株，28株田间调查结果与标记分析结果一致(结果一致该位点碱基为C，不一致该位点碱基为A)，总共56株田间调查结果与分子分析结果一致，准确率为93.3％。在回交群体BC₁P₂中，60株均为栅栏状表皮细胞结构，所有单株田间调查结果与分子标记分析结果均一致(34株该位点碱基为A，26株该位点碱基为A-C杂合)，准确率为100％。

参照实施例2步骤3方法二，在回交群体BC₁P₁中，果实栅栏状表皮细胞结构植株有29株，28株田间调查结果与标记分析结果一致(结果一致带型为h，不一致带型为a)；果实扁平状表皮细胞结构植株有31株，28株田间调查结果与标记分析结果一致(结果一致带型为a，不一致带型为h)，总共56株田间调查结果与标记分析结果一致，准确率为93.3％。在回交群体BC₁P₂中，60株均为栅栏状表皮细胞结构，所有单株田间调查结果与标记分析结果均一致(34株带型为b，26株带型为h)，准确率为100％。

两种方法的到结果相比较，发现两者结果完全吻合，充分说明SNP20114537在两个回交群体中验证准确率分别为93.3％和100％。

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的SNP标记及其应用

<130> P141080/SCH

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 158

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>与黄瓜（Cucumis sativus L.）果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的片段及SNP

<400> 1

GGGAACAATATTATTTTTGGAGTAATGTTTTACCATTGAAAGAACCCCATTCCAACTAGT 60

TCACAATATTGTGGGGACAATGGATCAAATACAAATGACTTGTTTTTCTTCTACTGCTTG 120

GCCGGATTAATGCATGAGGTTGAAGGTAATAGGAATCA 158

<210> 2

<211> 158

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>与黄瓜（Cucumis sativus L.）果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的片段及SNP标记

<400> GGGAACAATATTATTTTTGGAGTACTGTTTTACCATTGAAAGAACCCCATTCCAACTAGTTCACAATATTGTGGGGACAATGGATCAAATACAAATGACTTGTTTTTCTTCTACTGCTTGGCCGGATTAATGCATGAGGTTGAAGGTAATAGGAATCA

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> dcaps—RsaI—F

<400> 3

GGGAACAATATTATTTTTGGAGTA

24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> dcaps—RsaI—R

<400> 4

TGATTCCTATTACCTTCAACCTCA

24

Claims

1.一种用于检测黄瓜果实表皮细胞结构的SNP标记的引物，其特征在于：其核苷酸序列如下：

dcaps—RsaI—F:GGGAACAATATTATTTTTGGAGTA

dcaps—RsaI—R:TGATTCCTATTACCTTCAACCTCA

所述引物扩增的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带核苷酸序列如SeqID No.1所示，序列的26位碱基为A，经RsaI酶切后得到158bp片段；

所述引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带核苷酸序列如SeqID No.2所示，序列的26位碱基为C，经RsaI酶切后得到134bp片段。

2.一种筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜种质资源的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品基因组DNA；

(3)对PCR扩增片段进行测序或RsaI酶切；

如果测序结果如Seq ID No.1所示，果实表皮细胞结构为栅栏状，如果测序结果如SeqID No.2所示，果实表皮细胞结构为扁平状；

3.根据权利要求2所述的方法，所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/μl DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。

4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

5.根据权利要求2所述的方法，RsaI酶切的体系为：PCR产物3μl，内切酶0.2μl，NEBcutsmartbuffer1μl，双蒸水5.8μl，酶切温度为37℃，酶切时间为2h。

6.一种用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，包括粉状或溶液状态的核苷酸序列如下的引物：

dcaps—RsaI—F:GGGAACAATATTATTTTTGGAGTA

dcaps—RsaI—R:TGATTCCTATTACCTTCAACCTCA。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包括RsaI酶。

8.权利要求6或7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的引物包装为试剂盒的一部分的步骤。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括组装PCR反应和/或电泳所需的试剂。