CN104313018B - 黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其应用 - Google Patents
黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104313018B CN104313018B CN201410510396.4A CN201410510396A CN104313018B CN 104313018 B CN104313018 B CN 104313018B CN 201410510396 A CN201410510396 A CN 201410510396A CN 104313018 B CN104313018 B CN 104313018B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cucumber
- thorniness
- gene
- indel
- fruits
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title claims abstract description 64
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 title claims abstract description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 244000299906 Cucumis sativus var. sativus Species 0.000 title 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims abstract description 63
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 4
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 4
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 3
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 3
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 3
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 208000026686 chromosomal inheritance Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000010413 gardening Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229940023569 palmate Drugs 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明“黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。本发明公开了与黄瓜果实多刺基因ns连锁的Indel标记，其特征在于：Indelns24‑F/Indelns24‑R：TTTGAATGGCAGAAGAGAGT/TCCCTCTTTATTTGTGAACC。所述Indel标记扩增的与黄瓜果实多刺基因ns连锁的特征条带为216bp，核苷酸序列如Seq ID No.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜果实少刺基因Ns连锁的特征条带为219bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示；采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实多刺材料的筛选，具有高效、限制少的优点，为选育多刺黄瓜提高了选择效率，缩短了育种周期。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术辅助育种领域，特别涉及一种黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，因其风味清香、口感脆爽、营养丰富，深受各国消费者的喜爱。作为重要的果菜类蔬菜，果实品质一直是黄瓜育种研究的重点。黄瓜果实品质包括外观品质和内在品质。通常说的品质性状主要指商品性即外观品质，包括瓜色、瓜长、果刺多少、果刺颜色、果瘤大小、果色均匀度、光泽度、果棱、果实表面黄色条纹等。果刺多少作为黄瓜重要的商品性状之一，对商品销售影响很大。一般来讲，国内市场上需求密刺黄瓜，目前生产上主推的品种绝大多数为密刺。研究黄瓜果刺多少的遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的新品种具有重要意义。
关于控制黄瓜果刺的相关基因，已报道的有五个基因，分别为s、s-2、s-3、ss和ns。前人对于果刺多少的遗传规律进行了多项研究。1984年Fanourakis首次报道了控制黄瓜果实多刺的基因(ns)，少刺Ns对多刺ns为显性。随后Fanourakis和Simon的研究也表明，黄瓜果实少刺对多刺为显性，且与小刺基因(ss)存在连锁关系。对于黄瓜果实多刺基因的分子标记研究较少。苗晗等将果刺多少作为数量性状来研究，在6号染色体(Chr.6)上检测到主效QTL位点，并将主效QTL定位在了Chr.6上SSR14652-SSR20680内。可见，到目前为止，与质量性状基因ns紧密连锁的Indel标记尚未见报道。
发明内容
本发明基于上述领域的空白，提供了与黄瓜果实多刺基因ns连锁的Indel标记，并提供了其在选择黄瓜果刺多少种质资源上的应用。
本发明的技术方案如下：
一种与黄瓜果实多刺基因ns连锁的Indel标记，其特征在于：其引物的核苷酸序列如下：Indelns-24-F/Indelns-24-R：
TTTGAATGGCAGAAGAGAGT/TCCCTCTTTATTTGTGAACC；
所述引物扩增的与黄瓜果实多刺基因ns连锁的特征条带为216bp，核苷酸序列如Seq ID No.1所示；
所述引物扩增的与黄瓜果实少刺基因Ns连锁的特征条带为219bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
所述Indel标记在筛选具有果实多刺基因ns的黄瓜种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用上述Indel标记的引物对待选黄瓜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增；
(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测；
(3)从检测结果中筛选出现与黄瓜果实多刺基因ns连锁的Indel标记特征条带一致的材料。
所述PCR反应体系为：0.75ng/ul DNA模板，正向和反向引物各5ng/ul，0.5μL/ulGoGreen Master Mix，其余为双蒸水。
所述PCR扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒；35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
所述凝胶电泳检测是指将所述PCR扩增产物上样用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在150V恒功率下进行电泳分离，再经银染显色，最后进行条带统计。
本发明以现有已知品种黄瓜果实多刺自交系WI 2757和少刺自交系Wis.SMR18为亲本构建F1、F2群体，对果实多刺基因ns进行了遗传规律分析。以F2群体为作图材料，利用BSA法和Indel技术，实现ns基因的染色体遗传定位，并获得紧密连锁的Indel标记Indelns-24，与ns的遗传距离为1.1cM。所述Indel标记引扩增的与黄瓜果实多刺基因ns连锁的特征条带为216bp，核苷酸序列如Seq ID No.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜果实少刺基因Ns连锁的特征条带为219bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
通过利用96份核心种质材料对本发明所述的Indel标记进行验证，结果证明该标记在这些材料中用于分子标记辅助选择的正确率为69.8％。
本发明不仅为黄瓜果实多刺基因ns的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育果实多刺黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明基于开发的Indel标记提供用于辅助筛选具有果实多刺基因的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用Indelns-24标记扩增待测品种的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条216bp条带，这种为含黄瓜果实多刺基因ns的隐型纯合材料；另一种是216bp条带和219bp条带都出现，这种是含黄瓜果实多刺基因ns的显性杂合材料，第三种是仅仅出现219bp条带，这种是不含黄瓜果实多刺基因ns的显性纯和材料。选出第一种条带对应的材料，去掉第二种和第三种情况对应的材料。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果实多刺基因的筛选，具有效率高、限制少、较准确的优点。
附图说明
图1.是Indel标记Indelns-24在黄瓜亲本材料WI 2757(P1，果实多刺)，Wis.SMR18(P2，果实少刺)，F1世代单株及F2群体随机单株的部分电泳检测结果。
图2.是Indel标记Indelns-24验证96份不同遗传背景的黄瓜核心种质材料的部分电泳检测结果。
具体实施方式
下面用来详细说明本发明技术方案的具体实施方式用于进一步解释本发明，而不是限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
生物材料的来源和记载出处
WI 2757是欧洲温室型黄瓜雌性系，生长势中等，叶片中等偏小，果皮绿色，果实多刺，白色果刺，无果瘤。为现有已知品种，在Xiaoming He等人于2013年8月在《Theor ApplGenet》第8期发表的文章《QTL mapping of powdery mildew resistance in WI2757cucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
Wis.SMR18是美国加工类型黄瓜自交系，生长势强等，叶片掌状，果皮深绿和白色相间，黑色果刺，果实少刺。为现有已知品种，在Christopher S.Cramer和Todd C.Wehner于1999年在《Euphytica》第110卷、第99–108页发表的文章《Little heterosis for yieldand yield components in hybrids of six ucumber inbreds》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
96份核心种质材料是本所构建的包含120份材料的核心种质的一部分，是从3318份黄瓜资源里面筛选出来的，均为现有已知品种。在2011年6月，吕婧发表的中国农业科学院硕士学位论文《黄瓜种质资源群体结构分析与核心种质集筛选》第三章“核心种质资源的构建”部分里面有介绍，是从3318份黄瓜资源里面筛选了120份作为核心种质。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
主要试剂
Indel引物是本实验室基于115份核心种质重测序的基因组信息、利用primer 3.0软件开发而来。重测序的基因组信息详见Qi等在《Nature Genetics》杂志2013年发表的论文《A genomic variation map provides insights into the genetic basis ofcucumber domestication and diversity》。
SSR引物来自国际黄瓜基因组计划(CUGI)，共2112对(Ren et al.，2009)。详细结果可以参见Ren等在PloS One2009年第4期在线发表的文章《An inteGrated Genetic andCytoenetic map of the cucumber Genome》。
PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix；
凝胶电泳使用盈信阳光公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。
实施例1.与黄瓜果实多刺基因ns连锁的Indel标记的筛选
步骤1.黄瓜果刺多少性状鉴定
试验于2013年春季和秋季在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验基地进行，以WI2757(P1)和Wis.SMR18(P2)为父母本进行正反交、自交，获得F1、F1’、F2群体。秋季利用实验大棚种植P1、P2和F1、F1’各30株，三次重复，随机区组排列。种植F2群体182株。株距25cm，行距55cm，按常规田间管理。在开花结果期，调查群体各单株上商品瓜(开花后7～10d)的果刺多少。计算分离比，使用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，使用SAS8.0对结果进行卡方测验。
结果显示：无论正反交后代F1果刺均表现为少刺；在F2群体中，少刺与多刺植株的分离比例为136:46，经卡方测验符合3:1。由此可知，多刺性状是由1对核基因控制的，少刺(Ns)对多刺(ns)为显性。
步骤2.DNA提取和Indel分析
取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。
PCR反应体系为:总反应体系10μL,3μL DNA(2.5ng·μL-1)，正向和反向引物(50ng·μL-1)各1μL，5μL GoGreen Master Mix(Promega公司产品)。
引物使用黄瓜全基因测序开发的Indel引物。
PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸
30s，35个循环；72℃保温5min，16℃forever。
扩增产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h，电泳后银染显色，统计带型。
步骤3.初步定位的SSR分子标记筛选、数据统计及连锁图构建
主要包括4步：(1)筛选在父母本间表现多态的分子标记；(2)在F2群体中选取果实多刺、少刺单株的DNA各7个，根据BSA法构建果实多刺和少刺2个基因池，用基因池筛选多态性引物；(3)利用获得的多态性引物分析F2群体各单株基因型；(4)利用JoinMap 4.0软件进行连锁图的绘制。
共显性标记的统计方法：与母本(WI 2757)一致的带型记为a，与父本(Wis.SMR18)一致的带型记为b，杂合的带型记为h。
显性标记的统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b；若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为c，未扩增出的或模糊不清的记为u。
结果显示：
用2112对SSR引物对P1(WI 2757)和P2(Wis.SMR18)进行筛选，其中在两个亲本间表现多态的引物有282对，多态率13.4％。
结合BSA法建池，进一步筛选得到了8个SSR多态性标记。
利用筛选出的多态性标记对WI 2757×Wis.SMR18组合的F2群体进行分析，结合调查性状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。结果8个标记和ns被定位在同一连锁群上(LOD＝10)。
将本发明得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱(Ren et al.，2009；Miao etal，2011)比较，发现本连锁群与第2染色体上共有7个共有标记，据此将ns基因定位在第2染色体上。
步骤4.ns连锁群分子标记加密及本发明所述Indel标记的确定
针对初定位的染色体区段，利用本实验室之前重测序的数据寻找Indel位点，利用primer 3.0软件在这些Indel位点上设计引物，对连锁群进行分析加密标记。在目标区段共设计了40对Indel标记，用双亲筛选出有多态性的有3对标记，多态率7.5％。。加上之前在此区域设计的SSR类型的有多态性的引物，上群体后得到一个总长度为26.3cM包含15个标记的连锁群，获得与果实多刺基因ns连锁距离为1.1cM的Indel标记Indelns-24。
步骤5.PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序
(1)目的片段的回收
采用煮沸法。具体操作为：先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100μL超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95℃水浴锅(或PCR仪)中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行PCR扩增，剩余产物置-20℃保存备用。
(2)目的片段的纯化
用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜放置，1,2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。
(3)目的片段与载体的连接
反应体系为10μL：PMD18-T Vector1.0μL；Ligation bufferⅠ5.0μL；目的片段4.0μL。
在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16℃连接约1h，过夜也不影响连接效率。
(4)连接产物的转化
1)取出感受态细胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；
2)感受态(50μL)+5μL SolutionA+4μL SolutionB+46μL预冷去离子水；
3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105μL，再加入5μL的目的DNA，轻旋混匀；
4)42℃水浴热激90s，注意不要晃动离心管；
5)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3～5min；
6)加入500μL LB液体培养基。在37℃，150rpm摇床上预培养1h；
7)将菌液涂布到含有100μg·mL-1Amp、25μg·mL-1IPTG和40μg·mL-1X-GAL的LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；
8)倒置平板，37℃培养12～16h。
(5)重组质粒的蓝白斑筛选
经37℃培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养。
(6)菌落PCR的检测
吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μL PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。
(7)克隆后载体的测序与分析
取3个阳性克隆菌液在甘油(330μL甘油中加入1000μL菌液)中各保存两份，一份-20℃保藏，一份送去测序。
其中Indel标记引物Indel-24扩增出的与黄瓜果实多刺基因ns连锁的片段的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；与黄瓜果实少刺基因Ns连锁的片段的核苷酸序列如Seq IDNo.2所示。
实施例2.本发明所述Indel标记的验证
利用实施例1获得的与ns基因连锁的Indel标记Indelns-24在96份不同遗传背景的黄瓜核心种质材料中进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证程序采用与实施例1中的步骤2中描述的PCR扩增和检测方法来进行。
采用现有已知的96份不同遗传背景的黄瓜种质材料中重复验证本发明所述的Indel标记，结果表明共有67份材料的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算正确率为69.8％，部分材料的PAGE胶电泳检测结果见图2。
Claims (6)
1.一种与黄瓜果实多刺基因ns连锁的Indel标记，其特征在于：其扩增引物的核苷酸序列如下：Indelns-24-F/Indelns-24-R：
TTTGAATGGCAGAAGAGAGT/TCCCTCTTTATTTGTGAACC；
在含有黄瓜果实多刺基因ns的显性纯合黄瓜材料中，所述Indel标记的特征条带为一条216bp的条带，核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
2.一种与黄瓜果实少刺基因Ns连锁的片段，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
3.一种筛选具有果实多刺基因ns的黄瓜种质资源的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用权利要求1所述的Indel标记的的扩增引物对待选黄瓜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增；
(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测；
(3)从检测结果中筛选出出现权利要求1所述的Indel标记的特征条带的材料。
4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR反应体系为：0.75ng/μl DNA模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。
5.根据权利要求3所述的方法，所述PCR扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒；35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。
6.根据权利要求3-5任一所述的方法：所述凝胶电泳检测是指将所述PCR扩增产物上样用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在150V恒功率下进行电泳分离，再经银染显色，最后进行条带统计。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410510396.4A CN104313018B (zh) | 2014-09-24 | 2014-09-28 | 黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其应用 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410494192.6 | 2014-09-24 | ||
| CN2014104941926 | 2014-09-24 | ||
| CN201410494192 | 2014-09-24 | ||
| CN201410510396.4A CN104313018B (zh) | 2014-09-24 | 2014-09-28 | 黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104313018A CN104313018A (zh) | 2015-01-28 |
| CN104313018B true CN104313018B (zh) | 2017-04-05 |
Family
ID=52368332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410510396.4A Expired - Fee Related CN104313018B (zh) | 2014-09-24 | 2014-09-28 | 黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104313018B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104805216B (zh) * | 2015-05-21 | 2017-07-11 | 山东农业大学 | 一种快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记、鉴定方法及应用 |
| CN105420235B (zh) * | 2015-12-17 | 2018-01-02 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的Indel标记及其应用 |
| CN107400721B (zh) * | 2017-09-12 | 2021-01-26 | 扬州大学 | 与黄瓜黄白色果皮紧密连锁的两个InDel标记及应用 |
| CN109762920B (zh) * | 2019-01-28 | 2022-04-08 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记及其应用 |
| CN110205396B (zh) * | 2019-04-18 | 2023-04-11 | 南京农业大学 | 一种与黄瓜果实不规则条纹性状紧密连锁的snp标记及其应用 |
| CN116064911B (zh) * | 2022-11-10 | 2024-07-23 | 上海农林职业技术学院 | 与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用 |
-
2014
- 2014-09-28 CN CN201410510396.4A patent/CN104313018B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104313018A (zh) | 2015-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104313018B (zh) | 黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其应用 | |
| CN103740711B (zh) | 黄瓜黄色果肉基因yf连锁的Indel标记及其应用 | |
| Etminan et al. | Applicability of CAAT box-derived polymorphism (CBDP) markers for analysis of genetic diversity in durum wheat | |
| CN109762920B (zh) | 黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记及其应用 | |
| CN105506149A (zh) | 西瓜果实糖分积累基因stp1连锁snp位点及caps标记 | |
| CN104498486B (zh) | 黄瓜抗白粉病基因pm‑h的Indel标记及其应用 | |
| CN105441457B (zh) | 一种与低氮条件下水稻千粒重相关的qtl分子标记方法 | |
| CN105256031B (zh) | 利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物 | |
| CN102154471A (zh) | 水稻籽粒长度主效qtl位点的分子标记方法 | |
| CN108239674A (zh) | 甘蓝型油菜高油酸qtl及与其紧密连锁的分子标记 | |
| CN109929945A (zh) | 甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF2604引物及其应用 | |
| CN103993073B (zh) | 青花菜品种台绿1号杂交种的快速鉴定方法 | |
| CN107674922A (zh) | 黄瓜抗黄瓜花叶病毒病基因cmv的InDel标记及其应用 | |
| CN107881256A (zh) | 用于鉴定桃果实苦仁/甜仁性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用 | |
| CN104004749B (zh) | 黄瓜黑色果刺基因b连锁的ssr标记引物及其应用 | |
| CN105296472B (zh) | 砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记及其筛选方法 | |
| CN106498048A (zh) | 一种与大豆结瘤数相关的qtl、snp分子标记及应用 | |
| CN109280665A (zh) | 黑麦分子特异性标记引物、使用方法及其应用 | |
| CN103725785B (zh) | 柚木无性系指纹图谱的构建方法及其应用 | |
| Kubo et al. | Classification of “nabana”(Brassica rapa) cultivars and landraces based on simple sequence repeat markers | |
| CN104313017B (zh) | 黄瓜抗番木瓜环斑病毒病基因prsv的Indel标记及其应用 | |
| Gheorghe et al. | Genetic diversity of some Romanian grapevine cultivars as revealed by microsatellite markers | |
| CN105462971B (zh) | 水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记及其专用引物 | |
| CN105087757A (zh) | 鉴定大豆百粒重高低的分子标记及其应用 | |
| CN102827837B (zh) | 黄瓜嫩果白色果皮基因w连锁的SSR标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170405 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |