CN108239674A - 甘蓝型油菜高油酸qtl及与其紧密连锁的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于油菜分子标记制备技术领域，具体涉及甘蓝型油菜高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记。本发明筛选得到新的油酸含量QTL紧密连锁的分子标记BnA129，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3和/或4所示。构建得到检测分子标记OLEA9的引物BnA129，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和2所述。本发明的数量性状位点OLEA9及分子标记可在甘蓝型油菜高油酸性状改良中的分子标记辅助选择以及在油酸性状位点精细定位和图位克隆中应用。

Description

甘蓝型油菜高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记

技术领域

本发明属于油菜分子标记筛选技术领域，具体涉及甘蓝型油菜高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记。本发明的油酸QTL及与之紧密连锁的分子标记可用于甘蓝型油菜油酸性状改良，以及在油酸性状位点精细定位和图位克隆中应用。

背景技术

油菜是世界上最重要的油料作物之一，植物油的食用和加工特性及品质主要取决于种子脂肪酸组分。低芥酸油菜中主要脂肪酸包括三种不饱和脂肪酸，即油酸，亚油酸和亚麻酸。这三种脂肪酸的比例对菜籽油的品质影响很大。油酸是一种十八碳单不饱和脂肪酸。高油酸品种在加工、存储和煎炸过程中不易被氧化，加工过程中不产生不健康的反式脂肪酸，降低了患心血管疾病的风险，并且可以降低胆固醇。高油酸菜籽油可用于生产优质生物柴油，是重要的可再生性能源原料。因此，低芥酸的基础上进一步的品质改良的重要目标是要提高油菜种子中油酸含量。

前人研究定位了油菜控制脂肪酸合成的QTL。鉴定到了一些控制脂肪酸成分变异的主效基因(Hu et al 2006；Zhao et al 2008；Yan et al 2011；Zhao et al 2012；Yanget al 2012)。前人的研究普遍认为，油酸含量受2对主基因控制，遗传方式为加性模式，其中位于N5连锁群的主效QTL被认为是FAD2基因，其它大部分位点主要分布在1、2、3、5、6、8、11、13和 18连锁群上。Hu等(2006)从两个双低甘蓝型油菜构建的DH群体中分别定位了两个油酸和两个亚油酸的QTL，前者位于N1和N5连锁群上，并且在N5上的主效QTL区域开发了本FAD2 基因的等位特异标记，而亚油酸QTL则定位在N4和N14上，同样将开发的FAD3标记定位到主效QTL的置信区间内。Zhao等(2008)在利用两个双高甘蓝型油菜品种构建的DH群体中，对各种脂肪酸组分QTL进行了全基因扫描，在四个地点中发现各种脂肪酸含量QTL 1-8个，对油酸的QTL定位中，分别在N18、N2和N8发现7个QTL共解释59％的表型变异，其中位于N18上的主效QTL解释变异24％，然而未在N5和N15上发现相同的QTL，认为存在不同于N5和N15的新位点。控制脂肪酸合成的分子机制是非常复杂的，不同的遗传材料，甚至不同的定位方法都可能导致不一样的定位结果。

综上所述，油菜油酸含量是由多基因控制的复杂数量性状，控制油酸的基因除了一个主基因FAD2外，还有微效多基因的影响。目前见诸报道的生产上用到的控制油酸含量的基因基本上是FAD2基因，对其他控制油酸含量的QTL变异的遗传基础还不清楚。因此，利用不同材料开展油酸含量变异的遗传分析和QTL定位，发掘新油酸QTL，对于高油酸性状的改良十分必要，在此基础上开发紧密连锁的分子标记将能加速油菜高油酸育种的进程。

发明内容

本发明包括鉴定出了一个新的控制油菜种子中油酸含量的数量性状遗传位点(QTL)，并在此基础上开发了与其紧密连锁的共显性分子标记。新发现的QTL可用于油菜高油酸性状的改良。新开发的分子标记可用于甘蓝型油菜油酸性状改良中的分子标记辅助选择，以及在油酸性状QTL精细定位和图位克隆。本发明可为油菜高油酸育种提供新资源，并加快油菜油酸性状的改良进程，从而提高油菜育种的准确性和选择效率。

本发明是通过以下方案实现的：

申请人通过筛选和杂交育种得到一个甘蓝型油菜新的高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记，通过如下步骤制备得到：

a)以甘蓝型油菜品系ZP1作父本(甘蓝型油菜品系ZP1的油酸含量为67.68％,甘蓝型油菜ZP1,Brassica napus L.ZP1的种子已于2017年11月10日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：P201722)与甘蓝型油菜品系甲A254作母本(油酸含量72.296％，中国发明专利，专利号为ZL 2009102734352；公开号CN101824472A) 杂交，得到杂种F1；

b)种植杂种F1，取植株的花蕾通过小孢子培养(余凤群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)：165-168)获得定位用DH(加倍单倍体)群体；

c)提取分离DH群体每一个株系的基因组DNA，采用SSR(简单序列重复)和InDel(插入缺失)标记引物进行PCR扩增，获得每个株系的基因型；

d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记信息构建甘蓝型油菜遗传连锁图(遗传连锁图的构建采用MAPMAKER 3.0(Lincoln等,1992)软件进行)；

e)测定DH群体每个系成熟种子的油酸含量，以其所占总脂肪酸含量的百分比(％)表示；

f)将DH群体每个株系的油酸含量与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL 分析(QTL检测采用WinQTLcart 2.5(Wang et al，2012)软件中的CIM作图法进行)，以2.5 为LOD阈值，将大于2.5界定为一个QTL位点；

g)上述分析步骤在A5连锁群和A9连锁群鉴定到两个稳定的QTL，其中在A9连锁群上 QTL位点OLEA9是一个新发现的QTL；

h)选择仅含A9位点油酸含量为63.79％的常规品种华双5号做父本与母本ZP1配制杂交组合F1；

i)利用二代测序技术(Wei L et al,2013)对步骤h)的亲本ZP1和华双5号进行重测序确定其基因型，以甘蓝型油菜参考基因组序列为参照，找出两亲本间在QTL区段内存在的序列差异，得到InDel类型的DNA标记。发现InDel标记BnA129处于A9连锁群QTL置信区间内。该标记可作为与A9位点QTL紧密连锁的分子标记，其序列如下所示：

正向引物：5'-CGATTAAAGGCTTGGTTTCG-3'(与序列表SEQ ID NO：1序列相同)

反向引物：5'-CCGTTCTGCTTCAAATCTCC-3'(与序列表SEQ ID NO：2序列相同)

以该引物扩增，得到如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。该引物可作为共显性分子标记在油菜标记辅助选择中应用，能够区分(筛选)甘蓝型油菜A9位点高油酸与低油酸材料。

本发明的积极效果：

(1)本发明中发现的位于甘蓝型油菜A9连锁群上控制种子中油酸含量的QTL位点，是一个不同于现有报道中控制油酸含量的新的位点。将该位点引入到现有的普通油菜品种，可以提高油酸含量3-5％，有助于解决现有高油酸育种中基因资源单一的问题。

(2)本发明开发了针对上述位点的特异分子标记。该标记能够有效地用于在油菜生长发育早期鉴定高油酸基因型，可以克服传统育种方法中仅仅依靠表型选择需要收获成熟种子、以及种子发育中受环境条件影响，从而影响鉴定准确性的问题。

(3)利用本发明制备的分子标记(或称分子标记引物)可进行油菜油酸性状的分子标记辅助选择(例如中作为精细定位和图位克隆中的应用)，以及用于该QTL对应基因的克隆，可以明显减少育种工作量，缩短育种年限，加快油菜育种和分离基因的进程。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明筛选的引物组合BnA129的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明筛选的引物组合BnA129的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明筛选的分子标记引物对A基因型扩增产物的核苷酸序列，序列长度为100bp；

序列表中SEQ ID NO：4是本发明筛选的分子标记引物对B基因型扩增产物的核苷酸序列，序列长度为109bp。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是本发明引物组合BnA129在甘蓝型油菜高油酸品系ZP1和低油酸品系华双5号的基因组 DNA中的扩增结果，PCR扩增产物是在6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的图片。附图标记说明，图2中：A基因型代表P1高油酸品系ZP1，B基因型代表P2低油酸品系华双5号。

图3：本发明在DH群体A9连锁群上油酸QTL的定位结果。附图标记说明：图3中的1、2、3分别代表2011-2012年、2012-2013年、2013-2014年三个自然生产年(甘蓝型油菜为跨年作物)扫描的结果，分别用红绿蓝三色线表示，QTL扫描的LOD值阈值为2.5(以蓝色线标明)；横坐标为A9染色体的局部遗传连锁图，上排数字表示遗传距离(cM)，下排为构建遗传连锁图所用的分子标记；QTL的基本信息中R²：QTL能够解释的表型变异比例；其中Additive为加性效应；CI为QTL的置信区间，纵坐标为LOD值。

图4：利用引物组合BnA129在甘蓝型油菜高油酸品系ZP1和低油酸品系华双5号的基因组DNA 的扩增序列片段的比对，附图标记说明：图中P1代表高油酸品系ZP1，代表序列表中SEQ ID NO：3所示的序列；P2代表低油酸品系华双5号，代表序列表中SEQ ID NO：4所示的序列。三角形表示在序列的第79-87处存在一个InDel突变，下划线处为设计的引物位置，分别位于第1-20位和90-109位碱基所示的序列。

具体实施方式

实施例1：利用DH群体定位新的油酸QTL

1、甘蓝型油菜DH定位群体的构建及田间试验

以甘蓝型油菜品系ZP1(油酸含量为67.68％,甘蓝型油菜ZP1,Brassica napusL.ZP1,于 2017年11月10日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：P201722)作母本，以甘蓝型油菜品系甲A254作父本(油酸含量72.296％，专利号ZL 2009102734352；公开号CN101824472A)杂交得到F1，种植F1，取F1植株的花粉经小孢子培养 (小孢子培养方法参见文献，余凤群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)：165-168)得到由150个株系组成的双单倍体(简称DH) 群体。

将以上所得的DH系和其亲本(ZP1，甲A254)于2011-2014连续三年种植在湖北武汉华中农业大学油菜试验田。田间试验采取完全随机区组设计，三次重复，每行10-12个单株，株距平均24cm左右，行间距30cm。每年5月份从田间收割回成熟的试验材料，从自交授粉的单株上脱下种子，清理掉杂质和不饱满的种子，至少放置4周以上，在空气中自然干燥以待测量。

油酸是油菜脂肪酸的一种，其含量多少以其占油菜脂肪酸的比例表示。确定油菜油酸含量必须测定油菜种子中脂肪酸的含量。本发明中脂肪酸测定采用气相色谱测定。包括将种子中脂肪酸进行甲酯化，然后按标准的气相色谱法进行定量(Thies W.(1971)Rapidand simple analysis of fatty acid composition of individual rapecotyledons.1.Gas and paper chromatographic techniques.Z.Pflanzenzücht.65：181-202.)。其中种子样品制备方法是：每个单株随机选取 30粒左右饱满种子磨碎后倒入10ml玻璃试管中，加入1ml乙醚石油醚(体积比1:1)，然后加入等体积0.5mol/L甲醇氢氧化钾溶液进行反应，静止30分钟以上。最后加入蒸馏水定容至10ml，取上层溶液到进样瓶中进样测定。

脂肪酸成分的分离及定量测定用气相色谱法。所用的气相色谱仪为安捷伦HP7890A。测试条件包括：进样量1ul，分流比设置为1:45，检测器温度为250℃，进样室温度为280℃，载气为N₂，流速30mL/min，尾吹为40mL/min，H₂速度为30mL/min，空气流速为300mL/min，炉温设置为持续升温，180℃保持2min，然后10℃/min升至220℃保持7min。脂肪酸成分由各脂肪酸气化后的出峰时间和标准脂肪酸出峰时间对比确定，用峰面积百分比表示脂肪酸含量，主要考虑7种脂肪酸，即：棕榈酸，硬脂酸，油酸，亚油酸，亚麻酸，花生烯酸，芥酸。每个株系取3个单株，取平均值为其油酸含量值，用％表示。

2、DH群体遗传连锁图的构建和QTL分析

分离DH群体150个系以及双亲的基因组DNA(提取方法见李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)，选取在两个亲本间具有扩增多态性的SSR、InDel和SNP引物进行PCR扩增(Cheng XM,Xu JS,Xia S,Gu JX,Yang Y,FuJ,Qian XJ,Zhang SC,Wu JS,Liu KD.(2009)Development and genetic mapping ofmicrosatellite markers from genome survey sequences in Brassica napus.TheorAppl Genet 118:1121–1131)。SSR和InDel 引物扩增产物在常规6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离、银染、显影(方法见Sanguinetti等， 1994)；SNP引物扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳分离，获得每个株系基因型和群体的分子标记多态性数据，将获得的群体基因型数据构建甘蓝型油菜遗传连锁图(遗传连锁图的构建采用MAPMAKER 3.0(Lincoln等,1992)软件进行)，连锁群划分的参数设置为LOD值为2.5，最大距离为30cM，每一个连锁群的确定利用order,try和ripple等命令，二个位点间的遗传距离的计算采用“Kosambi”参数。

将DH群体每个株系的脂肪酸含量数据与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和 QTL分析，QTL检测采用WinQTLcart 2.5软件中的CIM方法进行，以2.5为LOD阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点。QTL置信区间的确定采用QTL峰值处LOD-1所对应的的区间来确定。对 DH群体的QTL定位检测到2个主要的QTL，分别位于A5和A9连锁群。位于A5连锁群上的QTL是以前报道的FAD2基因位点(Yang et al,2012)。而A9连锁群上的OLEA9QTL是本发明鉴定到的一个新的位点，可解释油酸表型变异的5.7-11.2％，来自ZP1的等位基因可增加油酸含量3-5％。

实施例2：利用F2群体验证新的油酸QTL

1.F2群体构建

为了进一步确认上述结果，申请人选取不含A5位点的两个亲本ZP1为母本和常规品种华双5号(中国农业部全国农作物新品种审定委员会2004年审定的国家级甘蓝型油菜新品种 (审定编号：国审油2004006)，已在中国大面积推广、种植)杂交得到F1，通过F1自交得到F2群体，通过F2群体验证OLEA9的效应及稳定性。在F2的一个包含170单株的亚群中，油酸含量呈双峰分布，且峰值附近的该标记进行分析表明三种不同基因型间有明显的表型差异。

2.F2群体双亲重测序及InDel标记的开发

申请人对双亲ZP1和华双5号进行全基因组重测序，并以甘蓝型油菜参考基因组(http://brassicadb.org/brad/)进行序列比对。在此基础上找出两亲本间在QTL区段内存在的序列差异开发出InDel标记。

从上述甘蓝型油菜双亲(ZP1和华双5号)幼嫩叶片中提取高质量的总DNA(提取方法采用CTAB法，参照李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523介绍的方法)，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计 (型号：Pharmacia Biotech,GeneQuant II)检测DNA浓度。用Qubit进行DNA定量，文库构建使用Truseq DNA LT sample preparation kit，测序是在华大基因科技股份有限公司的Illumina HiSeq X-Ten测序平台商完成的，测序片段大小为PE150。数据分析及标记开发过程主要在实验室服务器，利用linux操作系统来完成。具体流程：(1)建库，利用bowtie2 软件，将参考基因组进行建库处理；(2)将测序数据对比生成sam文件；(3)将sam文件转化为二进制的bam文件，并对其进行sort排序；(4)对排序完成的bam文件处理，产生索引文件，(5)利用samtools工具寻找所有存在的符合条件的的插入/缺失位点；(6)结合IGV可视化软件，在QTL目标区段内寻找合适的InDel位点；(7)利用Primer3完成引物设计。InDel 程序见表1。

实施例3：甘蓝型油菜A9染色体油酸含量QTL位点特异性标记的应用

从开发出的InDel标记中选择在峰值附近的标记BnA129(核苷酸序列见表2)进行效应检验。该标记引物在高油酸含量亲本ZP1的基因组DNA中扩增出100bp的目标片段，而在低油酸含量亲本华双5号的基因组DNA中扩增出109bp的目标片段(见图2)，两者之间有9bp的InDel差异，因此该扩增片段可作为甘蓝型油菜高油酸含量性状的共显性分子标记。

利用BnA129对170个F2单株的基因型进行分析，其中42个单株是A基因型且和亲本ZP1带纹一致，携带A9染色体高油酸位点等位位点，其油酸含量平均值为67.47±1.76％；51个单株是B基因型且和亲本华双5号带纹一致，携带A9染色体低油酸含量等位位点，其油酸含量平均值为64.43±1.46％。两组材料间油酸含量存在显著差别(表3)。

表1实施例3中的Indel程序

表2本发明设计的引物及其核苷酸序列

表3F2群体的等位基因标记油酸效应

以上的结果说明，本发明采用不同的遗传材料进行QTL定位，鉴定到一个新的控制油菜种子中油酸含量的QTL OLEA9，该位点来自ZP1的等位基因可以提高油酸含量3-5％。同时，本发明开发出与A9位点QTL紧密连锁的分子标记BnA129。该标记用于油酸的分子标记辅助选择，可以在油菜生长发育早期准确选择到高油酸基因型。

主要参考文献

(1)李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994,13(5)：521-523.

(2)余凤群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)： 165-168.

(3)中国发明专利说明书；专利权人：华中农业大学；专利号：ZL 2009102734352；发明名称：甘蓝型油菜高油酸分子标记及制备方法与应用；公开号CN101824472A；公开日2010.09.08；中国国家知识产权局.

(4)Hu XY，Sullivan-Gilbert M，Gupta M，Thompson S.(2006)Mapping of theloci controlling oleic and linolenic acid contents and development of fad2andfad3allele-specific markers in canola(Brassica napus L.).Theor Appl Genet113(3)：497-507.

(5)Lincoln et al.(1993)Constructing genetic linkage maps withMAPMAKER/EXP Version 3.0:a tutorial and reference manual.Whitehead InstituteTechnical Report.Whitehead Institute,Cambridge.

(6)Sanguinetti et al.(1994)Rapid silver staining and recovery of PCRproducts separated on polyacrylamide gels.Biotechniques 17(5):914-921.

(7)Thies W.(1971)Rapid and simple analysis of fatty acid compositionof individual rape cotyledons.1. Gas and paper chromatographictechniques.Z.Pflanzenzücht.65：181-202.

(8)Wang S,C.J.Basten,and Z.-B.Zeng(2012).Windows QTL Cartographer2.5.Department of Statistics, North Carolina State University,Raleigh,NC.

(9)Yang Q,Fan C,Guo Z,Qin J,Wu J,Li Q,Fu T,Zhou Y(2012)Identificationof FAD2and FAD3genes in Brassica napus genome and development of allele-specific markers for high oleic and low linolenic acid contents. TAGTheoretical and Applied Genetics:1-15.

(10)Zhao JY，Dimov Z，Becker HC，Ecke W，Mollers C.(2008)Mapping QTLcontrolling fatty acid composition in a doubled haploid rapeseed populationsegregating for oil content.Molecular breeding 21(1)：115-125。

(11)Cheng XM,Xu JS,Xia S,Gu JX,Yang Y,Fu J,Qian XJ,Zhang SC,Wu JS,LiuKD.(2009)Development and genetic mapping of microsatellite markers fromgenome survey sequences in Brassica napus.Theor Appl Genet 118:1121–1131

(12)Wei L,Xiao M,Hayward A,Fu D.(2013)Applications and challenges ofnext-generation sequencing in Brassica species.Planta 238(6):1005-24。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 甘蓝型油菜高油酸QTL及与其紧密连锁的分子标记

<141> 2017-06-24

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 1

ccgttctgct tcaaatctcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 2

cgattaaagg cttggtttcg 20

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(100)

<400> 3

cgattaaagg cttggtttcg tctcggcaat ggatgtcgcg ttttcgagct tacagagacg 60

atacggcagc gttttcggcc ggagatttga agcagaacgg 100

<210> 4

<211> 109

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(109)

<400> 4

cgattaaagg cttggtttcg tctcggcaat ggatgtcgcg ttttcgagct tacagagacg 60

atatggcggc gttttcagaa catttcgccg gagatttgaa gcagaacgg 109

Claims (8)

1.一个控制甘蓝型油菜中油酸含量的QTL位点OLEA9紧密连锁的共显性分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3或/和SEQ ID NO：4所示。

2.扩增如权利要求1所述的共显性分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：CCGTTCTGCTTCAAATCTCC，

反向引物：CGATTAAAGGCTTGGTTTCG。

3.一种筛选与甘蓝型油菜油酸含量QTL紧密连锁的分子标记的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

a)以甘蓝型油菜品系ZP1与甘蓝型油菜品系甲A254杂交，得到杂种F1；

b)将杂种F1的花蕾通过小孢子培养获得分离的DH系群体；

c)分离DH系群体每一个株系的基因组DNA，采用SSR、InDel引物进行PCR扩增，获得每个株系的基因型，对DH系群体的每一个株系进行分子标记分析，并对每个株系的基因型进行描述；

d)用获得的分子标记信息构建甘蓝型油菜遗传连锁图；

e)测定DH群体中每个系成熟种子的油酸含量；

f)将DH群体每个株系的油酸含量与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，以2.5为LOD阈值，将大于2.5界定为一个QTL位点；

g)在A5连锁群和A9连锁群中鉴定筛选出到两个稳定的QTL，其中在A9连锁群上QTL位点的QTL为OLEA9；

h)选择仅含A9位点油酸含量为63.79％的双低品种华双5号为父本与母本ZP1配制杂交组合得到杂种F1；

i)利用二代测序技术对步骤h)配制组合所用亲本ZP1和华双5号进行重新测序确定其基因型，以甘蓝型油菜参考基因组序列为参照，找出两亲本间在QTL区段内存在的序列差异，得到插入缺失(InDel)的DNA标记引物BnA129；确定InDel标记引物BnA129处于A9QTL置信区间内；以该标记作为与A9位点QTL紧密连锁的分子标记引物，该分子标记引物的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5'-CGATTAAAGGCTTGGTTTCG-3'；

反向引物：5'-CCGTTCTGCTTCAAATCTCC-3'。

4.一个在甘蓝型油菜中控制油酸含量的QTL位点OLEA9标记在甘蓝型油菜和白菜型油菜育种中的应用，其特征在于，将该位点OLEA9标记导入低芥酸油菜品种中，得到油酸含量提高3％-5％的品种。

5.权利要求2所述的分子标记的引物对在甘蓝型油菜油酸含量性状标记辅助选择中的应用。

6.权利要求4所述应用，其特征包括在甘蓝型油菜精细定位和图位克隆中的应用。

7.权利要求2所述的分子标记的引物对在甘蓝型油菜油酸含量性状标记辅助选择中作为精细定位和图位克隆中的应用。

8.权利要求3所述的方法在甘蓝型油菜油酸含量性状标记辅助选择中作为精细定位和图位克隆中的应用。