CN105505925A - 一种与甘蓝型油菜含油量qtl紧密连锁的分子标记 - Google Patents
一种与甘蓝型油菜含油量qtl紧密连锁的分子标记 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于油菜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与甘蓝型油菜含油量QTL紧密连锁的分子标记。本发明筛选得到可以单独使用或/和组合使用的新的含油量QTL紧密连锁的分子标记OilA5，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：5或6所示。构建得到检测分子标记OilA5的引物对OilA5-A、OilA5-G，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1-4所述。本发明的分子标记可在甘蓝型油菜含油量性状改良中的分子标记辅助选择以及在含油量性状位点精细定位和图位克隆中应用。
Description
技术领域
本发明属于油菜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与甘蓝型油菜含油量QTL紧密连锁的分子标记，该分子标记或其组合可用于甘蓝型油菜含油量性状改良中的标记辅助选择以及在含油量性状位点精细定位和图位克隆中应用。
背景技术
油菜作为世界上最重要的油料作物之一，每年能够产生大约两千六百万吨的植物油，约占植物油生产总量的15％。油菜生产以收获油菜籽后榨成油为主要目的，提高其产油量是油菜生产的最终目标。油菜产油量取决于两个因素：菜籽产量及菜籽含油量。与过去几十年中产量的较快速度增长相比，我国油菜新品种含油量却提高较少。因此，通过提高菜籽含油量来实现产油量的提高是油菜育种的主要目标。虽然三酰甘油(油脂的主要储存形式)的合成途径已经很清楚，但是对于油料作物，包括油菜含油量变异的遗传及分子机制，我们仍缺乏深入的了解。
关于含油量的遗传研究，前人已经定位到很多相关的QTL(QuantitativeTraitLoci)。由于群体材料、群体种植环境等各不相同，所以定位的QTL也存在差异。Delourme等(2006)利用两个DoubleHaploid(DH)群体定位了24个和含油量有关的QTLs，分别可解释表型变异的4.6％-14.3％，只有一个QTL在两群体A3连锁群上能同时检测到。Wang等(2013)利用含油量差异极大的两个材料构建的DH群体在8个环境中定位到24个与含油量有关的QTLs，分别可解释表型变异的3.6％-11.7％；通过整合前人定位的含油量QTLs，发现存在47个QTLs与含油量有关。另外，Jiang等(2014)利用TNDH群体在15个环境中定位了41个和含油量有关的QTLs，分别可解释表型变异的1.6％-24.5％；通过整合前人定位的含油量QTLs，发现存在46个QTLs与含油量有关。
综上所述，油菜含油量是由多基因控制的复杂数量性状，表现出环境和材料特异性。在油菜中至少存在46个控制含油量的QTLs，这些QTLs遍布在甘蓝型油菜的19条染色体上。通过不同连锁群体的QTL定位，发掘新的控制含油量的QTLs对于解析含油量的遗传变异是十分必要。在此基础上开发紧密连锁的分子标记能加速油菜含油量性状的改良进程。
发明内容
本发明的目的是发掘油菜含油量新的QTL及开发紧密连锁的共显性分子标记，并将其用于油菜高含油量性状的选育。这些分子标记可应用于甘蓝型油菜含油量性状改良中的分子标记辅助选择以及在含油量性状QTL精细定位和图位克隆中的应用，从而加速油菜含油量性状的改良进程，提高油菜育种的准确性和选择效率。
本发明是通过以下方案实现的。
a)以甘蓝型油菜品种中双11号(中国农业部主管，全国农作物品种审定委员会审定，国审油2008030；2013年测定的含油量为51.4％)与低含油量品系甲A254(2013年测定的含油量45.3％，该材料的来源参见：中国发明专利授权；专利权人：华中农业大学；专利号ZL2009102734352；发明名称：甘蓝型油菜高油酸分子标记及制备方法与应用；公开号CN101824472A；公开日2010.09.08)杂交，得到F1；
b)由杂种F1的花蕾通过小孢子培养获得分离的DH系群体；
c)对DH系群体的每一个株系进行分子标记分析，并对每个株系的基因型进行描述；具体方法：分离DH群体每一个株系的基因组DNA，采用SSR(简单序列重复)、InDel(插入缺失)和SNP(单核苷酸多态性)引物进行PCR扩增，获得每个株系的基因型；
d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记信息构建甘蓝型油菜遗传连锁图。遗传连锁图的构建采用MAPMAKER3.0(Lincoln等,1992)软件进行；
e)测定DH群体每个系成熟种子的含油量数值；
f)将DH群体每个株系的含油量与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，QTL检测采用MapQTL6(VanOoijen2009)软件中的MQM作图法进行，以2.5为LOD阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点。
g)在A5连锁群上存在一个新的QTL位点，SNP标记OilA5-A和OilA5-G处于QTL峰值处。这2个分子标记或其组合可作为与A5含油量QTL紧密连锁的分子标记。
在上述方法中，所用SNP引物对的核苷酸序列如下所示：
引物对OilA5-A(在序列表中的命名分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2)：
正向引物5'-ATGCGAAGTGTAAAGAAGATTATGAA-3'，即，SEQIDNO：1，
反向引物5'-TACGCTTCAGTCTTCACGAATCAC-3'。即，SEQIDNO：2；
引物对OilA5-G(在序列表中的命名分别为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4)：
正向引物5'-CGTGGAAGTTATGCGTCTTCTTATTC-3'，即，SEQIDNO：3，
反向引物5'-GATGCAACAAGTTGTGCAGGTAACCA-3'。即，SEQIDNO：4。
其中，引物对OilA5-A(即本发明的分子标记第一组)和OilA5-G(即本发明的分子标记第二组)分别用于扩增如序列表SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示核苷酸序列。这2对引物的扩增产物可作为一对共显性分子标记OilA5在油菜标记辅助选择中应用，能够区分(筛选)甘蓝型油菜含油量A5新位点高含油量与低含油量材料。
本发明筛选的两个分子标记既可以单独使用，也可以组合使用，使现有的含油量性状筛选效率大大提高。
本发明的积极效果：
本发明成功得到与前人不同的油菜含油量新的QTL及其位点特异性标记。该QTL与之前报道的QTLs相比，效应较大，可解释表型变异的20％，能提高1.8％的含油量，运用该QTL位点特异性标记可鉴别含油量新QTL，从而可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点。利用本发明制备的分子标记可进行油菜含油量性状的分子标记辅助选择，可以明显减少育种工作量，缩短育种年限，加快油菜育种的进程。
附图说明
序列表中SEQIDNO：1是本发明筛选的引物对OilA5-A的正向引物序列；
序列表中SEQIDNO：2是是本发明筛选的引物对OilA5-A的反向引物序列；
序列表中SEQIDNO：3是本发明筛选的引物对OilA5-G的正向引物序列；
序列表中SEQIDNO：4是本发明筛选的引物对OilA5-G的反向引物序列；
序列表中SEQIDNO：5是本发明筛选的引物对OilA5-A扩增的分子标记的核苷酸序列，序列长度为344bp；
序列表中SEQIDNO：6是本发明筛选的引物对OilA5-G扩增的分子标记的核苷酸序列，序列长度为348bp。
图1：是本发明的技术流程图。
图2：是本发明引物对OilA5-A和OilA5-G在甘蓝型油菜高含油量品种中双11号和低含油量品系甲A254的基因组DNA中的扩增结果。OilA5-A和OilA5-G引物对的PCR扩增产物是在1％的琼脂糖凝胶上电泳分离的图片。
图3：本发明DH群体A5连锁群上含油量QTL的定位结果。附图标记说明：图3中的A图为QTL
扫描的LOD值；图3中的B图为A5染色体的局部遗传连锁图，上排数字表示遗传距离(cM)，
下排为构建遗传连锁图所用的分子标记；图3中的C图为QTL的基本信息，图中R2：QTL能够解释的表型变异比例；其中A：加性效应；CI:QTL的置信区间。
图4：是本发明筛选的分子标记的核苷酸序列，序列长度为348bp。其中在该序列的第1-24位斜体加下划线的碱基是引物序列，在该序列的319-344位斜体加下划线的碱基是引物序列。
图5：是本发明筛选的分子标记的核苷酸序列，序列长度为344bp。其中在该序列的第1-26位斜体加下划线的碱基是引物序列，在该序列的323-348位斜体加下划线的碱基是引物序列。
具体实施方式
实施例1
1、甘蓝型油菜含油量定位群体的构建及田间试验
在本实施例中，以甘蓝型油菜品种中双11号(中国农业部主管，全国农作物品种审定委员会审定，文号：国审油2008030；2013年测定的含油量为51.4％)作母本，以低含油量的甘蓝型油菜品系甲A254(2013年测定的含油量45.3％，该材料的来源参见：中国发明专利授权；专利权人：华中农业大学；专利号ZL2009102734352；发明名称：甘蓝型油菜高油酸分子标记及制备方法与应用；公开号CN101824472A；公开日2010.09.08)作父本杂交得到F1，利用F1植株的花粉经小孢子培养(小孢子培养方法参见文献，余凤群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)：165-168)得到由149个株系组成的双单倍体(简称DH)群体。
将上步所得的DH系和其亲本(中双11号，甲A254)于2012-2013种植在武汉华中农业大学油菜试验田。田间试验采取完全随机区组设计，三次重复，每一个系种二行，每行11-12个单株，株距平均24cm左右，行间距30cm。2013年5月份从田间收割回成熟的试验材料，从自由授粉的单株上脱下种子，清理掉杂质和不饱满的种子，至少放置4周以上，在空气中自然干燥。含油量采用FossNIRSystems5000近红外仪测定(近红外模型参见文献，甘莉等，NIRS定量分析油菜种子含油量、蛋白质含量数学模型的创建，中国农业科学，2003，36(12):1609-1613)，每个株系取5个单株，算取平均值为其含油量值，用％表示(相关数据见表1)。
2、DH群体遗传连锁图的构建和含油量QTL分析
分离DH群体149个系以及双亲的基因组DNA(提取方法见李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)，选取在两个亲本间具有扩增多态性的SSR、InDel和SNP引物进行PCR扩增(所述的引物及其PCR扩增方法为本领域的公知方法)。SSR和InDel引物扩增产物在6％(100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离、银染、显影(方法见Sanguinetti等，1994)；SNP引物扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳分离，获得每个株系基因型和群体的分子标记多态性数据，将获得的群体基因型数据构建甘蓝型油菜遗传连锁图。遗传连锁图的构建采用MAPMAKER3.0(Lincoln等,1992)软件进行，连锁群划分的参数设置为LOD值为9.0，最大距离为30cM，每一个连锁群的确定利用order,try和ripple等命令，二个位点间的遗传距离的计算采用“Kosambi”参数。
将DH群体每个株系的含油量数据与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，QTL检测采用MapQTL6(VanOoijen2009)软件中的MQM作图法进行，以2.5为LOD阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点。QTL的置信区间的确定以在峰值所在的LOD-1所包含的峰值二端所对应在遗传连锁图上的位置。
DH群体QTL检测结果显示在A5连锁群上存在一个QTL且并未被报道，该QTL可解释含油量表型变异的20％，来自中双11号的等位基因能对含油量增加1.8％(加性效应0.9，见图3)。
3、甘蓝型油菜A5染色体含油量QTL位点特异性标记的应用
引物对OilA5-A在高含油量亲本中双11号的基因组DNA中扩增出344bp的目标片段，而在低含油量亲本甲A254的基因组DNA中无任何扩增产物，因此该扩增片段可作为甘蓝型油菜高含油量性状的显性分子标记。引物对OilA5-G正好相反，在低含油量亲本甲A254的基因组DNA中扩增出348bp的目标片段，而在高含油量亲本中双11号的基因组DNA中无任何扩增产物(见图2)。两个引物对OilA5-A和OilA5-G扩增片段组合(即同时使用)可作为甘蓝型油菜高含油量性状的共显性标记OilA5且定位在A5含油量QTL的峰值处(见图3)。
表1：亲本及DH群体2013年含油量数据
表1说明：1)数值后的大写字母指在t测验下亲本间在0.01水平下的差异显著性。
表2：DH群体的等位基因标记含油量效应
表2说明：1)大写字母是指在t测验下0.01水平下的差异显著性
表3：本发明设计的引物对的编号及其核苷酸序列
利用OilA5-A、OilA5-G对149个DH系的基因型进行分析，其中92个DH系存在OilA5-A标记基因型且和亲本中双11号带纹一致，携带A5染色体高含油量等位位点，其含油量平均值为48.2％±1.9％；57个DH系存在OilA5-G标记基因型且和亲本甲A254带纹一致，携带A5染色体低含油量等位位点，其含油量平均值为46.3％±1.8％。两组材料间含油量存在显著差别(表2)。
以上的结果说明本发明筛选的引物对OilA5-A和OilA5-G的扩增片段可作为与A5含油量QTL紧密连锁的分子标记，用于含油量的分子标记辅助选择，并且应用这些标记对含油量基因型的选择也是非常准确的。
主要参考文献：
(1)甘莉等，NIRS定量分析油菜种子含油量、蛋白质含量数学模型的创建，中国农业科学，2003，36(12):1609-1613；
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(4)中国发明专利公开说明书；华中农业大学：专利号ZL2009102734352；发明名称：甘蓝型油菜高油酸分子标记及制备方法与应用；公开号CN101824472A；公开日2010.09.08，中国国家知识产权局；
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Claims (6)
1.一种单独使用或/和组合使用的甘蓝型油菜高含油量的共显性分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：5或/和SEQIDNO：6所示。
2.一种扩增高含油量甘蓝型油菜共显性分子标记的引物对OilA5-A，其核苷酸序列如下所示：
正向引物：ATGCGAAGTGTAAAGAAGATTATGAA，
反向引物：TACGCTTCAGTCTTCACGAATCAC。
3.一种扩增高含油量甘蓝型油菜共显性分子标记的引物对OilA5-G，其核苷酸序列如下所示：
正向引物：CGTGGAAGTTATGCGTCTTCTTATTC，
反向引物：GATGCAACAAGTTGTGCAGGTAACCA。
4.一种筛选与甘蓝型油菜含油量QTL紧密连锁的分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)以甘蓝型油菜品种中双11号为母本与低含油量品系甲A254为父本杂交，得到F1；
b)由杂种F1的花蕾通过小孢子培养获得分离的DH系群体；
c)对DH系群体的每一个株系进行分子标记分析，分离DH群体每一个株系的基因组DNA，采用SSR、InDel及SNP引物进行PCR扩增，获得每个株系基因型；
d)用获得的分子标记信息构建甘蓝型油菜遗传连锁图；
e)测定DH群体每个株系成熟种子的含油量数值；
f)将DH群体每个株系的含油量与甘蓝型油菜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，从而确定和A5染色体上新的含油量QTL连锁的SNP分子标记OilA5；
g)根据SEQIDNO：1，SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的引物进行PCR扩增，得到能够区分甘蓝型油菜高含油量与低含油量的共显性分子标记OilA5。
5.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜含油量性状标记辅助选择中的应用。
6.权利要求2或3所述的引物对在甘蓝型油菜含油量性状标记辅助选择、精细定位和图位克隆中的应用。
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