CN108559787B - 一种与棉花纤维长度有关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子育种技术领域，具体涉及一种来自海岛棉海1与纤维长度有关的分子标记及其应用。所述分子标记为CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀。本发明有助于克服现有育种技术对纤维长度鉴定存在的不足，能提高纤维长度的选择效率，加快优质新品种的培育进程。

Description

一种与棉花纤维长度有关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及棉花分子育种技术领域，具体涉及一种来自海岛棉海1与纤维长度有关的分子标记及其应用。

背景技术

棉花是世界上重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原料，棉花在我国国民经济中占具重要地位。随着纺织工业的快速发展和人民生活水平的不断提高，对棉花纤维品质的要求也越来越高。我国大面积种植的是陆地棉品种，棉花育种工作者在上世纪80年代前主要集中在产量的提高上，纤维品质的提高没有得到足够的重视，使得我国的棉花品种大多表现为产量高，品质差。进入90年代中后期，纤维品质的育种已成为棉花分子育种的一个重要目标。纤维长度是纤维品质性状的一项重要指标。

海岛棉具纤维品质具有长、强、细的特性，但产量低，而陆地棉产量高，适应性广，但品质差(Percy et al.,2006)。因此挖掘海岛棉的优异纤维品质基因，把海岛棉优异纤维品质基因转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉纤维品质的改良有着重要的意义。

采用传统的育种方法改良或提高陆地棉的纤维长度，首先要通过陆地棉和海岛棉等杂交，通过多代的回交，获得具有高强纤维基因渐渗的种质材料，与现有的陆地棉栽培品种杂交，通过多代的回交及自交选择，以打破纤维品质性状与产量性状间的负相关。每个世代需要足够大的选择群体，都要对纤维品质进行测定，而每一世代的选择都需等到棉花吐絮后收取棉花进行纤维品质检测后才能决定，这就导致了育种的群体要大，选择工作量大，成本较高且周期长。而且纤维品质性状受环境影响较大，使得育种进展缓慢。

由于传统育种的整个过程中的选择主要是表型选择，这对质量性状而言一般是有效的，但对纤维品质等这样的数量性状来说，则存在准确性差、效率低等许多缺点。要提高选择的效率，理想的方法应该是能够直接对基因型进行选择。

分子标记辅助选择是借助分子标记对目标性状的基因型直接进行选择，而不必考虑作物生长时期和发育条件，可在早期进行选择，又能减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的相互干扰，有利于快速垒集目标基因，加速回交育种进程，克服不利性状连锁，极大地缩短了育种时间，减少了群体种植规模。分子标记辅助选择对同步改良纤维品质和产量、多性状基因聚合、快速培育棉花新品种等具有无比优越性。现有技术对分子标记筛选做了大量的工作，利用不同的群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL(Quantitative trait loci,简写QTL)筛选，得到了大量的与纤维品质相关的QTL。在海岛棉纤维品质性状的基因挖掘方面，利用不同的陆海杂种群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL筛选，取得了很大研究进展。这些研究结果为纤维品质性状的分子标记辅助选择打下了良好的基础，有些QTL或与之连锁的分子标记已应用于分子标记辅助选择育种中。但是，前人的研究中多数是利用RILs、BC₁F₁等分离群体，遗传背景复杂，或只在单个环境下检测得到的结果，因此缺乏可靠性和稳定性，且有些研究最初的目的只是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上没有考虑和育种材料相结合，还很难应用到育种中。而染色体片段代换系在准确鉴定QTL方面具有优势。

发明内容

为了克服传统育种中表型选择准确性差、效率低、周期长、成本高等许多缺点，解决纤维长度育种进展缓慢的问题。本发明以陆地棉品种中棉所45(中45)为遗传背景渐渗有海岛棉海1染色体片段的优质代换系MBI7747为母本，与其轮回亲本中棉所45杂交，构建次级分离大群体F₂及其群体F_2:3，进行海岛棉纤维长度QTL定位，同时还可以直接培育用于育种的新品系。

本发明的目的是提供来自海岛棉海1与纤维长度有关的分子标记。

本发明的再一目的是提供一种陆地棉纤维长度辅助育种方法。

本发明的再一目的是提供上述来自海岛棉海1与纤维长度有关的分子标记的应用。

本发明提供的技术方案是：一种与海岛棉海1纤维长度有关的分子标记，所述分子标记为CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀。

其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：

①CGR6381₁₅₀

正向引物序列为GGCGCTACTTCATCACATCA，

反向引物序列为GTGCTGCATTGGATCCTTC，可扩增长度为150bp的海1的DNA片段；

②HAU0734₂₁₀

正向引物序列为TGGTCAAAACAACACAAACA，

反向引物序列为AGGAGATTTGGTGAGCTGAG，可扩增长度为210bp的海1的DNA片段；

③CGR5151₁₄₀

正向引物序列为CAAACCAGTTAAAGATCCTCCG，

反向引物序列为AAGGCTCCTGGTAGCACACA，可扩增长度为140bp的海1的DNA片段。

本发明还提供一种陆地棉纤维长度辅助育种方法，该方法包括以下步骤：

(1)DNA提取，使用与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的分子标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀对群体单株的基因型进行分子检测；

(2)对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维长度得到提高的陆地棉品种；

其中，所述与自海岛棉海1与纤维长度性状紧密连锁的分子标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：

①CGR6381₁₅₀

正向引物序列为GGCGCTACTTCATCACATCA，

反向引物序列为GTGCTGCATTGGATCCTTC，

扩增长度为150bp的海1的DNA片段；

②HAU0734₂₁₀

正向引物序列为TGGTCAAAACAACACAAACA，

反向引物序列为AGGAGATTTGGTGAGCTGAG，

扩增长度为210bp的海1的DNA片段；

③CGR5151₁₄₀

正向引物序列为CAAACCAGTTAAAGATCCTCCG，

反向引物序列为AAGGCTCCTGGTAGCACACA，

扩增长度为140bp的海1的DNA片段。

根据本发明陆地棉纤维长度辅助育种方法，使用SSR标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀在与海岛棉海1、MBI7747等有关的育种群体中对纤维长度性状进行分子标记选择，可提高陆地棉的纤维长度。该方法所用的分子标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀分别与纤维长度性状的3个QTLs：qFL-C7-1、qFL-C12-1和qFL-C12-2(FL是纤维长度的英文单词fiber length的缩写。QTL的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如：qFL-C12-1表示在第12条染色体(Chr12)上控制纤维长度的第1个QTL。)紧密连锁。这3个纤维长度性状的QTLs中，qFL-C7-1位于染色体Chr7上，qFL-C12-1和qFL-C12-2位于染色体Chr12上，增效基因都来源于海岛棉海1，对纤维长度的贡献率分别为6.23-6.28％、10.25-20.99％和9.66-11.25％，加性效应分别为0.5-0.60mm、0.74-1.14mm、和0.55-0.62mm。

本发明不仅有助于筛选纤维长的材料，为今后海岛棉海1杂交、回交后代及其衍生品系的纤维长度性状育种利用提供了极大的便利，同时也为基因克隆奠定了基础。

使用本发明可以在苗期预测纤维长度的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选纤维长的株系用于棉花纤维品质育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。通过这些与纤维长度性状的QTL紧密连锁的分子标记在与海岛棉海1等有关的育种群体中的分子标记选择，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，以克服现有技术存在的不足。

本发明与海岛棉海1相关的陆地棉纤维长度性状提高的分子标记选择方法，使用与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的SSR标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可分别提高陆地棉棉纤维长度0.50-0.60mm、0.74-1.14mm、和0.55-0.62mm。

通过这些分子标记选择可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种，加速棉花纤维品质的育种进程。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种提高陆地棉纤维长度性状的分子标记选择方法，使用分子标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀。在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高纤维长度0.50-0.60mm、0.74-1.14mm和0.55-0.62mm。

使用这些分子标记可以在棉花苗期进行选择，提高纤维长度性状的选择效率。本发明不但有助于解决我国棉花纤维品质育种进展缓慢的问题，而且有助于克服现有育种技术对纤维品质鉴定存在的成本高、时间长、稳定性低、准确性差、效率低等不足，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，大大加快我国高优质纤维新品种的培育与种子产业化进程。

具体实施方式

下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：筛选分子标记

(1)群体构建及数据的获得

以海岛棉海1为供体亲本、以中棉所45(中45)为轮回亲本，杂交回交并自交获得中棉所45×海1BC₄F_3：5染色体片段代换系，进行了多个环境的评价(马留军等，2013)，从中挑选一个优质含有少数渐渗片段的代换系MIBI7749作为母本，与轮回亲本中棉所45为父本杂交，构建次级分离大群体F₂。

2013年在安阳种植F₂分离大群体900株，行长8m，行宽80cm，株距25cm，对单株进行常规田间调查和纤维品质测定，测定纤维长度的单株604个。从中随机挑选82个和153个于2014年分别种植在安阳和库尔勒，为F_2：3株系。2014年田间种植采用地膜覆盖的方式播种，安阳单行区，行长5m，行宽80cm，株距25cm；新疆库尔勒2行区，行长3m，行距按新疆库尔勒当地宽窄行设置，株距为10cm。对株行进行田间农艺性状的调查及纤维长度等性状的测定，获得了2年3个群体的纤维长度的数据(表1)。

表1三个群体中纤维长度性状描述性统计分析

上表中，AY:安阳；XJ：新疆库尔勒。

(2)采用CTAB法(Paterson et al.1993)提取上述(1)中单株DNA。

(3)用本实验室以中棉所36×海1BC₁F₁群体构建的高密度分子遗传连锁图谱(Shiet al.2015)上的SSR标记，对双亲本(MIBI7749和中棉所45)进行多态性筛选，用多态性标记对F₂群体进行基因型检测。引物由上海生工和北京三博公司合成。SSR扩增反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1，10mM dNTPs 0.50μ1，正向引物(10μM)0.50μ1，反向引物(10μM)0.50μ1，模板DNA(30ng/μ1)1.0μ1，Taq DNA聚合酶(5U/μ1)0.10μ1。SSR扩增反应程序：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环。94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min。扩增反应在BIOMETRA公司TGRADIENT及BIO-RAD公司PTC-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照张军(2000)的方法进行凝胶银染，记录结果。

(4)纤维长度QTL定位

利用两年三个群体的纤维长度性状的表型数据和基因型数据，采用王健康的QTLIciMapping V4.1软件进行纤维长度性状的QTL定位分析，检测到在两个群体或三个群体中稳定的纤维长度性状的QTLs，其中有3个QTLs是新发现的。新发现的3个QTLs(qFL-C7-1、qFL-C12-1和qFL-C12-2)中，qFL-C12-2均能在2013年安阳、2014年安阳和2014年新疆三个群体中被检测到，qFL-C7-1和qFL-C12-1能够在2013年安阳和2014年新疆两个群体中被检测到，具体结果见表2。

表2两个或三个群体中都能检测到的3个纤维长度的QTLs

上表中：AY:安阳；XJ：新疆库尔勒。

这3个纤维长度性状的QTLs中，qFL-C7-1位于染色体Chr7上，qFL-C12-1和qFL-C12-2位于染色体Chr12上。加性效应都为正，增效基因都来源于海岛棉海1，对纤维长度的贡献率分别为6.23-6.28％、10.25-20.99％、和9.66-11.25％，加性效应分别为0.50-0.60、0.74-1.14和0.55-0.62。与qFL-C7-1紧密连锁的标记为CGR6381₁₅₀；与qFL-C12-1紧密连锁的标记为HAU0734₂₁₀；与qFL-C12-2紧密连锁的标记为CGR5151₁₄₀。

其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：

①CGR6381₁₅₀

正向引物序列为GGCGCTACTTCATCACATCA，

反向引物序列为GTGCTGCATTGGATCCTTC，可扩增长度为150bp的海1的DNA片段；

②HAU0734₂₁₀

正向引物序列为TGGTCAAAACAACACAAACA，

反向引物序列为AGGAGATTTGGTGAGCTGAG，可扩增长度为210bp的海1的DNA片段；

③CGR5151₁₄₀

正向引物序列为CAAACCAGTTAAAGATCCTCCG，

反向引物序列为AAGGCTCCTGGTAGCACACA，可扩增长度为140bp的海1的DNA片段。

实施例2：陆地棉纤维长度性状提高的分子标记选择方法

使用实施例1获得的分子标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀在与海岛棉海1等有关的育种群体中进行分子标记选择，包括以下步骤：

(1)DNA提取：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系(如中棉所60、鲁棉研28，新陆早50，冀08)为受体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种(如中棉所60、鲁棉研28，新陆早50，冀08)为受体亲本杂交高代回交获得的代换系及其衍生品系，或者代换系MBI7747与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用CTAB法(Paterson et al.1993)提取分离群体单株DNA；

(2)使用分子标CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀对上述(1)群体单株的基因型进行分子标记检测；

(3)对检测结果进行分析；

(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的纤维长度得到不同程度的提高。

通过本发明可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种(系)，加速棉花纤维品质的育种进程。

Claims (1)

1.一种陆地棉纤维长度辅助育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）DNA提取，使用与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的分子标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀对群体单株的基因型进行分子检测；

（2）对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维长度得到提高的陆地棉品种；

其中，所述与海岛棉海1纤维长度性状紧密连锁的分子标记CGR6381₁₅₀、HAU0734₂₁₀和CGR5151₁₄₀的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：

CGR6381₁₅₀

正向引物序列为 GGCGCTACTTCATCACATCA，

反向引物序列为 GTGCTGCATTGGATCCTTC，

扩增长度为150bp的海1的DNA片段；

HAU0734₂₁₀

正向引物序列为 TGGTCAAAACAACACAAACA，

反向引物序列为 AGGAGATTTGGTGAGCTGAG，

扩增长度为210bp的海1的DNA片段；

③CGR5151₁₄₀

正向引物序列为 CAAACCAGTTAAAGATCCTCCG，

反向引物序列为 AAGGCTCCTGGTAGCACACA，

扩增长度为140bp的海1的DNA片段。