CN105524999B - 一种与棉花海岛棉纤维长度连锁的分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL‑C13‑1和qFL‑C22‑1连锁的分子标记，qFL‑C13‑1和qFL‑C22‑1分别位于染色体C13和C22上。与qFL‑C13‑1紧密连锁的分子标记为CGR5242100，与qFL‑C22‑1连锁的分子标记为NAU2977150。利用本发明这些与棉花纤维长度QTL/主效基因位点连锁的SSR标记进行辅助选择可提高棉花纤维长度育种效率。

Description

一种与棉花海岛棉纤维长度连锁的分子标记
技术领域
本发明涉及棉花分子育种技术领域，具体涉及到一种与棉花海岛棉纤维长度连锁的分子标记及其应用。
背景技术
棉花是世界上重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原料，棉花在我国国民经济中占具重要地位。随着纺织工业的快速发展和人民生活水平的不断提高，对棉花纤维品质的要求也越来越高。纤维品质的育种已成为我国棉花育种的主要目标之一。纤维长度是纤维品质性状的一项重要指标，培育纤维较长的品种是纺高档纱和出高档棉织品的要求之一，也是实现棉花机械化采收的一个重要要求。
海岛棉纤维品质优良，但适应性差，产量低，而陆地棉产量高，适应性广，但品质差(Percy et al.,2006)。因此挖掘海岛棉的优异纤维品质基因，把海岛棉优异纤维品质基因转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉纤维品质和产量同步改良具有重要的意义。
采用传统的育种方法，每一世代的纤维品质选择都需等到棉花吐絮后收取棉花轧花后进行纤维品质检测后才能决定，而且纤维品质性状受环境影响较大，使得表型选择准确性差、周期长、效率低，导致品质育种进展缓慢。棉花的纤维品质性状属于多基因控制的数量性状。主要纤维品质性状与产量性状之间存在显著或不显著负相关(潘家驹，等，1998)，给棉花纤维品质与产量的同步改良带来了难度。
分子生物学以及数量性状基因位点作图方法的发展为棉纤维品质改良提供了有效手段。借助分子标记对目标性状的基因型直接进行选择，而不必考虑作物生长时期和发育条件，可在早期进行选择，又能减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的相互干扰，有利于快速垒集目标基因，加速回交育种进程，克服不利性状连锁，极大地缩短了育种时间。在海岛棉纤维品质性状的基因挖掘方面，利用不同的陆海杂种群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL检测(如Jiang et al.1998；Paterson etal.2003；Mei et al.2004；Lin et al.2005；杨鑫雷等，2009,2015；He et al.2007；Lacapeet al.2005,2010；Yu et al.2013)，取得了很大研究进展，为纤维品质性状的分子标记辅助选择打下了良好的基础，但QTLs或与之连锁的分子标记已应用于分子标记辅助选择育种中的不多。
前人研究中多数是利用分离群体(如F2、BC1)，遗传背景复杂，或只在单个环境下检测得到的结果，因此缺乏可靠性和稳定性，多环境稳定的QTL少，且有些研究最初的目的只是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上没有考虑和育种材料相结合，还很难应用到育种中。染色体片段代换系(又叫导入系，或渐渗系)，基因组中只含有少数供体亲本的染色体片段，大部分遗传背景与受体亲本一致，减少了遗传背景的干扰，是QTL检测和研究的理想材料。本发明是利用染色体片段代换系筛选出多环境稳定的QTLs及其连锁的标记，通过标记辅助选择，得到纤维长度得到提高的单株系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：为了克服传统育种中表型选择准确性差、效率低、周期长、成本高等许多缺点，解决纤维品质育种进展缓慢的问题，本发明提供一种来自纤维高优质材料海岛棉海1与棉花纤维长度QTL/主效基因连锁的分子标记，即：通过筛选来自纤维高优质材料海岛棉海1中与纤维长度QTL/主效基因连锁的SSR分子标记，进行DNA水平上的早期标记辅助选择，提高育种效率。
本发明的提供的技术方案是：一种与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-1和qFL-C22-1连锁的分子标记，qFL-C13-1和qFL-C22-1分别位于染色体C13和C22上，与qFL-C13-1紧密连锁的标记为CGR5242100；与qFL-C22-1连锁的标记为NAU2977150，其中，分子标记CGR5242100的特异性引物CGR5242其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为100bp；分子标记NAU2977150的特异性引物NAU2977其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为150bp，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度具体如下：
本发明还提供一种陆地棉纤维长度辅助育种方法及利用上述与棉花纤维长度QTL/主效基因位点连锁的分子标记在棉花辅助育种以提高棉花纤维长度中的应用。
一种陆地棉纤维长度辅助育种方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取苗期单株DNA；
(2)使用与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-1和qFL-C22-1连锁的分子标记，分别为CGR5242100和NAU2977150，对群体单株的基因型进行分子检测，并以陆地棉中棉所45和海岛棉海1基因型作为对照；
(3)对检测结果进行分析；
(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维长度得到提高的单株；
其中，所述与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-1和qFL-C22-1连锁的分子标记的特异性引物分别为CGR5242和NAU2977，CGR5242引物其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为100bp；NAU2977其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为150b。
上述方法中，步骤(1)苗期单株提取DNA；以陆地棉品种或品系(如鲁棉研28、中棉所60)为受体亲本，海岛棉海1为供体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种为受体亲本杂交高代回交获得的染色体片段代换系及其衍生品系，或者其染色体片段代换系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用CTAB法(Paterson et al.1993)提取分离群体单株DNA；
根据本发明的与陆地棉纤维长度辅助育种方法，使用SSR标记CGR5242100和NAU2977150在与海岛棉海1等有关的育种群体中对纤维长度性状进行分子标记选择，可提高陆地棉的纤维长度。该方法所用的分子标记CGR5242100和NAU2977150分别与棉花纤维长度性状的2个QTLs：qFL-C13-1和qFL-C22-1(FL是纤维长度的英文单词fiber length的缩写；QTL的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如：qFL-C13-1表示在第13条染色体上控制纤维长度的第1个QTL)紧密连锁。这2个纤维长度性状的QTLs：qFL-C13-1和qFL-C22-1分别位于染色体C13和C22上，都来源于海岛棉海1，对棉花纤维长度的贡献率分别为3.71-7.14％和3.69-5.60％，加性效应分别为0.61-0.88cm和0.53-0.68cm。
本发明不仅有助于筛选长纤维材料，为今后海岛棉海1杂交、回交后代及其衍生品系的纤维长度性状育种利用提供了极大的便利，同时也为QTL的精细定位及基因克隆奠定基础。通过这些分子标记选择可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种，加速棉花纤维品质的育种进程。
使用本发明可以在棉花苗期预测纤维长度的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选纤维长度长的株系用于棉花纤维品质育种，提高选择的准确性和效率。
本发明所述与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-1和qFL-C22-1连锁的分子标记是通过以下方法按照下列步骤获得的：
(1)以海岛棉海1为供体亲本、以中棉所45为受体亲本，通过杂交高代回交，连续自交，构建了一套中棉所45为遗传背景的染色体片段代换系，共116个BC4F1家系(杨泽茂等，2009)。经过连续自交，2009年获得2328个BC4F3单株。按家系随机挑选332个BC4F3单株2010年种成BC4F3:4株行，混收BC4F3:4株行种子，2011年种成两个环境的BC4F3:5株系(安阳和新疆)，混收BC4F3:5株系种子，2014年种成两个环境的BC4F3:6株系(周口和新疆)。测定每个环境中群体的纤维品质；
(2)对(1)中332个代换系及其亲本提取DNA，按照CTAB方法(Paterson etal.1993)提取DNA；
(3)本发明人以中棉所36×海1BC1F1群体为作图群体，构建了一个SSR高密度分子遗传连锁图谱(Shi et al.2015)，从该图谱上每隔大约5-10cM选择一个SSR标记，共筛选出覆盖棉花全部26条染色体的520个标记位点，并用其对上述(2)332个染色体片段代换系材料DNA进行基因型检测，以中棉所45和海1基因型作为对照；
(4)采用QTL IciMapping V4.0软件(http://www.isbreeding.net/software/)，利用七个环境(2009年安阳，2010安阳，2011年安阳和新疆，2014年周口和新疆)的纤维长度性状的表型数据和基因型数据进行纤维长度性状的多环境QTL定位分析，获得多环境稳定的纤维长度性状QTLs，其中有2个QTLs在四个环境中表现稳定，是新发现的，这2个QTL为qFL-C13-1和qFL-C22-1，分别位于染色体C13和CC22上，增效基因都来源于海岛棉海1，对棉花纤维长度的贡献率分别为3.71-7.14％和3.69-5.60％，加性效应分别为0.61-0.88cm和0.53-0.68cm；与这2个纤维长度性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CGR5242100和NAU2977150。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种提高陆地棉纤维长度性状的分子标记选择方法，使用分子标记CGR5242100和NAU2977150在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高纤维长度0.61-0.88cm和0.53-0.68cm。
使用本发明中的分子标记可以在棉花苗期进行选择，提高纤维长度性状的选择效率。本发明不但有助于解决我国棉花纤维品质育种进展缓慢的问题，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，大大加快我国高优质纤维新品种的培育进程。
附图说明
图1为本发明与纤维长度有关的2个QTLs在分子标记连锁图谱的位置。
qFL-C13-1和qFL-C22-1分别位于染色体C13和C22上。
FL是纤维长度的英文单词fiber length的缩写。
QTL的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如：qFL-C13-1表示在第13条染色体上控制纤维长度的第1个QTL。
具体实施方式
下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1筛选分子标记
(1)染色体片段代换系的构建及表型数据的获得
本发明人以海岛棉海1为供体亲本、以中棉所45为受体亲本，通过杂交高代回交，连续自交，构建了一套中棉所45为遗传背景的染色体片段代换系，2007年获得116个BC4F1家系(杨泽茂等，2009)。供体亲本海1(Hai1)是带有显性无腺体基因的纤维高优质的海岛棉栽培种，而中棉所45(国审棉2003002)是中国农业科学院棉花研究所培育的具有高产抗倒伏、耐黄萎病特性中熟品种。。
2009年种植116个BC4F3家系，中棉所45作为对照，行长5m，株距25cm。每个家系1行约20株，共2328株，按单株收取自然铃，测定纤维品质，纤维样送中国农业部纤维品质检验监督测试中心以HVI1000测定纤维的上半部平均长度(简称长度)、整齐度、马克隆值、伸长率和断裂比强度。2010年按照每个家系选择2-4株的原则，共选择332个BC4F3单株在河南安阳种成BC4F3:4株行，行长5m，行宽80cm，株距25cm，按照行区混收种子。2011年设置两个环境(安阳和新疆)的试验，种植成BC4F3:5株系，田间种植采用地膜覆盖的方式播种，安阳单行区两重复种植，行长5m，行宽80cm，株距25cm，新疆2行区两重复种植，行长3m，行距按新疆当地宽窄行设置，株距为10cm，按照小区混收种子。2014年设置三环境(周口、库尔勒和阿克苏)的试验，种植成BC4F3:6株系，周口单行区两重复种植，行长5m，行宽100cm，株距30cm，库尔勒和阿克苏2行区两重复种植，行长3m，行距按新疆当地宽窄行设置，株距为10cm。2010-2011年和2014年，按照小区测定纤维品质。共获得了七个环境的纤维品质的数据(表1)。
表1 七个环境中染色体片段代换系纤维长度统计分析及中棉所45纤维长度的平均值表现
AY：河南的安阳；KEL：新疆的库尔勒；ZK：河南的周口；AKS：新疆的阿克苏
(2)DNA提取
按照CTAB方法(Paterson et al.1993)提取332个染色体片段代换系DNA及双亲DNA。
(3)分子基因型检测
从本发明人以中棉所36×海1BC1F1群体构建的高密度分子遗传连锁图谱(Shi etal.2015)上，每隔大约10cM选择一个SSR标记，共选择覆盖棉花全部26条染色体的520个标记位点(表2)，并用其对上述(2)332个染色体片段代换系材料及其双亲DNA进行基因型检测。
引物由上海生工和北京三博公司合成。SSR扩增反应体系为10μ1，其中10×Buffer1.0μ1，10mM dNTPs 0.50μ1，Taq DNA聚合酶(5U/μ1)0.10μ1，正向引物(10μM)0.50μ1，反向引物(10μM)0.50μ1，模板DNA(30ng/μ1)1.0μ1，超纯水6.40μ1。SSR扩增反应程序：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环。94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min。扩增反应在BIO-RAD公司PTC-200及BIOMETRA公司TGRADIENT上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照张军(2000)的方法进行凝胶银染，记录结果。
表2 从分子连锁图谱上选择的SSR标记
(4)纤维长度的QTL定位
利用332个染色体片段代换系群体七个环境(2009年安阳，2010安阳，2011年安阳和库尔勒，2014年周口、库尔勒和阿克苏)的纤维长度性状的数据和分子基因型数据，采用QTL IciMapping V4.0软件(http://www.isbreeding.net/software/)进行QTL定位分析，检测到多环境稳定的QTLs，其中有2个纤维长度的QTLs是新发现的。这2个QTLs中qFL-C13-1均能在2010年安阳、2011年安阳、2011年库尔勒和2014年库尔勒四个环境中被检测到，qFL-C22-1能够在2010年安阳、2011年安阳、2011年库尔勒和2014年周口四个环境中被检测到，具体结果见表3。
表3 四个环境都能检测到的2个纤维长度的QTLs
QTL 环境 染色体 染色体位置(cM) 最近标记 LOD值 加性效应 贡献率(％)
FL-C13-1 2010AY 13 164.2 CGR5242 2.74 0.61 3.71
FL-C13-1 2011AY 13 164.2 CGR5242 5.36 0.88 7.14
FL-C13-1 2011KEL 13 164.2 CGR5242 4.37 0.75 5.88
FL-C13-1 2014KEL 13 164.2 CGR5242 3.26 0.68 4.40
FL-C22-1 2010AY 22 142.7 NAU2977 4.08 0.68 5.49
FL-C22-1 2011AY 22 142.7 NAU2977 2.71 0.58 3.69
FL-C22-1 2011KEL 22 142.7 NAU2977 4.16 0.67 5.60
FL-C22-1 2014ZK 22 142.7 NAU2977 3.50 0.53 4.73
AY:安阳；KEL：库尔勒；ZK：周口
这2个纤维长度性状的qFL-C13-1和qFL-C22-1，分别位于染色体C13和C22上(图1)，加性效应都为正，增效基因都来源于海岛棉海1，对棉花纤维长度的贡献率分别为3.71-7.14％和3.69-5.60％，加性效应分别为0.61-0.88cm和0.53-0.68cm；与这2个纤维长度性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CGR5242100和NAU2977150。
其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
引物对 正向引物序列 反向引物序列 扩增片断大小(bp)
CGR5242 CCCTATCAATGAGGAGAACTTA GCAGTCAAGATCACAAGCCA 100
NAU2977 ATTATACATGGGCCATATTCAC TAAATTGGATAACCAAGCCACT 150
实施例2陆地棉纤维长度性状提高的分子标记选择方法
使用实施例1获得的分子标记CGR5242100和NAU2977150在与海岛棉海1等有关的育种群体中进行分子标记选择，包括以下步骤：
(1)DNA提取：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系(如鲁棉研28、中棉所60)为受体亲本，进行杂交、回交、自交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种(如鲁棉研28、中棉所60)为受体亲本杂交高代回交获得的染色体片段代换系及其衍生品系，或者其染色体片段代换系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用CTAB法(Paterson et al.1993)提取分离群体单株DNA；
(2)使用分子标记CGR5242100和NAU2977150对上述(1)群体单株的基因型进行分子标记检测，以海1和中棉所45基因型作为对照；
(3)对检测结果进行分析；
(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的纤维长度可能得到不同程度的提高(表4)。
表4 分子标记选择的陆地棉中棉所36与海1回交5代自交5代的株系纤维长度的表现
材料编号 CGR5242<sub>100</sub> NAU2977<sub>150</sub> 平均纤维长度(mm)
ZL004 + 30.52
ZL007 + 30.26
ZL140 + 30.85
ZL292 + 30.22
ZL307 + 31.6
ZL325 + 31.78
ZL331 + 30.13
ZL364 + 30.11
ZL374 + 32.78
ZL404 + 30.76
CK(中棉所36) 29.64
“+”表示能检测到标记的特征带
通过本发明可获得纤维长度得到提高的陆地棉品种(系)，可加速棉花纤维品质的育种进程。
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120>一种与棉花海岛棉纤维长度连锁的分子标记
<160> 4
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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GCAGTCAAGATCACAAGCCA 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：人工合成的序列
<400> 4
TAAATTGGATAACCAAGCCACT 22

Claims (3)

1.一种与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-1和qFL-C22-1连锁的分子标记在棉花育种中的应用，其特征在于：qFL-C13-1和qFL-C22-1分别位于染色体C13和C22上，与qFL-C13-1紧密连锁的标记为 CGR5242100；与qFL-C22-1连锁的标记为 NAU2977150，其中，分子标记CGR5242100的特异性引物CGR5242其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQID NO.2所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为100bp；分子标记NAU2977150的特异性引物NAU2977其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为150bp；
其中，所述的应用是指提高棉花纤维长度中的应用。
2.一种陆地棉纤维长度辅助育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）提取苗期单株DNA；
（2）使用与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-1和qFL-C22-1连锁的分子标记，分别为CGR5242100和NAU2977150，对群体单株的基因型进行分子检测，并以陆地棉中棉所45和海岛棉海1基因型作为对照；
（3）对检测结果进行分析；
（4）选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得纤维长度得到提高的单株；
其中，所述与棉花纤维长度QTL/主效基因位点qFL-C13-1和qFL-C22-1连锁的分子标记的特异性引物分别为CGR5242和NAU2977，CGR5242引物其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为100bp；NAU2977引物其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示，用该引物扩增出的特异标记，条带分子量为150b。
3.根据权利要求2所述的的方法，其特征在于：步骤（1）中提取DNA：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系为受体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种为受体亲本杂交高代回交获得的染色体片段代换系及其衍生品系，或者其染色体片段代换系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期提取分离群体单株DNA。
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