CN116144827B - 一种与棉花纤维长度qtl紧密连锁的kasp分子标记和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与棉花纤维长度QTL紧密连锁的KASP分子标记组合和应用，属于棉花育种技术领域。包括以下(1)‑(3)中至少一项所述的KASP分子标记组合：(1)与棉花纤维长度QTL中FL5区间紧密连锁的四个KASP分子标记；(2)与棉花纤维长度QTL中FL3区间紧密连锁的四个KASP分子标记；(3)与棉花纤维长度QTL中FL2区间紧密连锁的四个KASP分子标记。本发明能够实现多个纤维长度QTL的聚合鉴定，可以大幅度提高棉花品种的纤维长度，有助于棉花纤维长度分子标记辅助选择育种，促进棉花纤维长度改良。
Description
技术领域
本发明涉及棉花育种技术领域，特别是涉及一种与棉花纤维长度QTL紧密连锁的KASP分子标记和应用。
背景技术
棉花是世界上重要的经济作物，其纤维是纺织工业重要的原材料。目前所应用的棉花栽培种主要是亚洲棉、海岛棉和陆地棉等。陆地棉原产于中美洲，具有适应性好、产量高、纤维长和品质优秀的特点。棉花的经济价值主要是用于制成各种各样的织布品，是世界上最主要的农作物之一。而棉花纤维长度的改善对提高棉花的经济价值有重要作用。
棉花的纤维长度性状属于数量性状，受多基因的控制。QTL作图是一种分析复杂数量性状遗传基础的有效工具，主要包括连锁分析和关联分析两种方法。连锁分析主要基于由遗传差异大的双亲构建的群体，具有很高的作图能力，但双亲群体缺乏遗传多样性和大量重组事件。关联分析主要基于通过广泛收集种质资源而获得的种质资源群体，该群体具有丰富的遗传变异和表型变异，可以检测到大量的QTL。目前已经在棉花中定位到了大量的与纤维长度有关的QTL，但是如何将这些纤维长度的QTL运用到棉花精准分子育种是个问题。
利用多亲本杂交群体可以将亲本拥有的纤维长度的QTL聚合到重组单株。聚合纤维长度QTL的重组单株可以用于育种。利用分子标记可以鉴定筛选单个纤维长度QTL的单株的存在与否，以及聚合多个纤维长度QTL的单株。
发明内容
本发明的目的是提供一种与棉花纤维长度QTL紧密连锁的KASP分子标记和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的KASP分子标记能够实现多个纤维长度QTL的聚合鉴定，可以大幅度提高棉花品种的纤维长度，为棉花植株优良品种的筛选提供了有力保障。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种与棉花纤维长度QTL紧密连锁的KASP分子标记组合，包括以下(1)-(3)中至少一项所述的KASP分子标记组合：
(1)与棉花纤维长度QTL中FL5区间紧密连锁的KASP分子标记KASP-G41、KASP-G42、KASP-G43和KASP-G44；
(2)与棉花纤维长度QTL中FL3区间紧密连锁的KASP分子标记KASP-G21、KASP-G22、KASP-G23和KASP-G24；
(3)与棉花纤维长度QTL中FL2区间紧密连锁的KASP分子标记KASP-G31、KASP-G32、KASP-G33和KASP-G34；
所述KASP-G41的SNP位点的物理位置为A07染色体的88,396,617bp，为C/T突变；
所述KASP-G42的SNP位点的物理位置为A07染色体的88,437,416bp，为A/G突变；
所述KASP-G43的SNP位点的物理位置为A07染色体的88,459,489bp，为C/T突变；
所述KASP-G44的SNP位点的物理位置为A07染色体的88,469,638bp，为C/T突变；
所述KASP-G21的SNP位点的物理位置为A09染色体的61,894,952bp，为C/G突变；
所述KASP-G22的SNP位点的物理位置为A09染色体的61,890,951bp，为C/G突变；
所述KASP-G23的SNP位点的物理位置为A09染色体的61,976,868bp，为C/T突变；
所述KASP-G24的SNP位点的物理位置为A09染色体的62,027,231bp，为C/G突变；
所述KASP-G31的SNP位点的物理位置为D11染色体的24,669,170bp，为G/T突变；
所述KASP-G32的SNP位点的物理位置为D11染色体的24,671,829bp，为C/G突变；
所述KASP-G33的SNP位点的物理位置为D11染色体的24,676,672bp，为C/T突变；
所述KASP-G34的SNP位点的物理位置为D11染色体的24,567,513bp，为A/G突变。
本发明还提供一种与棉花纤维长度QTL中FL5区间紧密连锁的KASP引物对组合，所述KASP引物对组合包括如下表所示引物：
本发明还提供一种与棉花纤维长度QTL中FL3区间紧密连锁的KASP引物对组合，所述KASP引物对组合包括如下表所示引物：
本发明还提供一种与棉花纤维长度QTL中FL2区间紧密连锁的KASP引物对组合，所述KASP引物对组合包括如下表所示引物：
本发明还提供一种利用单个棉花纤维长度QTL分子标记鉴定棉花纤维长度性状的方法，包括以下步骤，
S1.利用所述的KASP引物对组合对待测棉花材料进行KASP分子标记基因型分型检测；
S2.当能够读取到以下(1)-(3)任一项所述的扩增信号时，将所述待测棉花材料鉴定为棉花长纤维性状植株：
(1)当采用所述的KASP引物对组合时，所述KASP-G41、所述KASP-G42、所述KASP-G43和所述KASP-G44均检测到引物类型为X的扩增信号；
(2)当采用所述的KASP引物对组合时，所述KASP-G21、所述KASP-G22、所述KASP-G23和所述KASP-G24均检测到引物类型为Y的扩增信号；
(3)当采用所述的KASP引物对组合时，所述KASP-G31、所述KASP-G32、所述KASP-G33和所述KASP-G34均检测到引物类型为X的扩增信号。
本发明还提供一种利用多个棉花纤维长度QTL分子标记鉴定棉花纤维长度性状的方法，包括以下步骤，
(1)利用所述的KASP引物对组合对待测棉花材料进行KASP分子标记基因型分型检测；
(2)当能够读取到以下所示的扩增信号时，将所述待测棉花材料鉴定为棉花长纤维性状植株：所述KASP-G41、所述KASP-G42、所述KASP-G43和所述KASP-G44均检测到引物类型为X的扩增信号，所述KASP-G21、所述KASP-G22、所述KASP-G23和所述KASP-G24均检测到引物类型为Y的扩增信号，并且所述KASP-G31、所述KASP-G32、所述KASP-G33和所述KASP-G34均检测到引物类型为X的扩增信号。
本发明还提供一种鉴定棉花纤维长度性状的试剂盒，包含至少一项所述的引物对组合。
本发明还提供一种制备鉴定棉花纤维长度性状的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种在棉花育种中的应用。
进一步的，所述应用为鉴定棉花纤维长度性状。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明有助于棉花纤维长度分子标记辅助选择育种，促进棉花纤维长度改良。
(2)利用本发明的KASP分子标记对FC群体(4133Bt/M-8124-1159//鲁棉研28号/冀棉20///大铃棉69号/中棉所12//中棉所41/乌干达3号杂交的分离群体)、YZ群体(中AR40772/鲁原343//苏远7235/苏优6070///苏远04-3/苏优6003//宿棉9108/J02-508杂交的分离群体)和FY群体(4133Bt/M-8124-1159//鲁棉研28号/冀棉20///大铃棉69号/中棉所12//中棉所41/乌干达3号////中AR40772/鲁原343//苏远7235/苏优6070///苏远04-3/苏优6003//宿棉9108/J02-508杂交的分离群体)进行单个纤维长度QTL的分子标记辅助筛选，可以筛选出长纤维纯合等位基因型的材料和短纤维纯合等位基因型的材料，并且长纤维纯合等位基因型材料的平均纤维长度比短纤维纯合等位基因型材料的平均纤维长度要显著长0.5-1.4mm。说明利用本发明的KASP分子标记能够筛选出纤维更长的材料。
(3)利用本发明的KASP分子标记对FC群体、YZ群体和FY群体进行多个纤维长度QTL的分子聚合筛选，可以筛选出聚合三个纤维长度QTL的材料，并且含有三个纤维长度QTL长纤维纯合等位基因型材料的平均纤维长度比含有三个纤维长度QTL短纤维纯合等位基因型材料的平均纤维长度长3.1mm。说明本发明的KASP分子标记能够实现多个纤维长度QTL的聚合鉴定，可以大幅度提高棉花品种的纤维长度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为F2分离群体和F2:3家系的纤维长度性状频率分布，A为：F2分离群体，B为：F2:3家系；
图2为棉花纤维长度QTL中FL5区间紧密连锁的KASP分子标记的连锁不平衡结构域；
图3为棉花纤维长度QTL中FL2区间紧密连锁的KASP分子标记的连锁不平衡结构域；
图4为棉花纤维长度QTL中FL3区间紧密连锁的KASP分子标记的连锁不平衡结构域。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语说明：
本发明所指的FL5，位于A07染色体，物理位置为88,391,473bp到88,557,465bp；
本发明所指的FL3，位于A09染色体，物理位置为61,835,562bp到62,123,785bp；
本发明所指的FL2，位于D11染色体，物理位置为24,509,312bp到24,800,082bp。
实施例1
一种棉花纤维长度QTL紧密连锁的KASP分子标记开发和应用，具体包括以下步骤：
(1)构建(4133Bt/M-8124-1159//鲁棉研28号/冀棉20///大铃棉69号/中棉所12//中棉所41/乌干达3号)杂交的分离群体简称FC群体、(中AR40772/鲁原343//苏远7235/苏优6070///苏远04-3/苏优6003//宿棉9108/J02-508)杂交的分离群体简称YZ群体和(4133Bt/M-8124-1159//鲁棉研28号/冀棉20///大铃棉69号/中棉所12//中棉所41/乌干达3号////中AR40772/鲁原343//苏远7235/苏优6070///苏远04-3/苏优6003//宿棉9108/J02-508)杂交的分离群体简称FY群体，对F2分离群体和F2:3家系进行纤维长度检测，如图1所示。
(2)发明人研究团队前期通过全基因组关联分析(GWAS)检测到与纤维长度性状显著关联的3个QTL区间(He,S.,Sun,G.,Geng,X.et al.The genomic basis of geographicdifferentiation and fiber improvement in cultivated cotton.Nature Genetics,2021,53,:916–924.)，并根据图2、图3和图4所示的QTL区间中显著关联的SNP所在的连锁不平衡结构域确定了上述3个QTL区间在染色体上的物理位置区间。
(3)根据SNP在染色体上的物理位置信息，选择步骤(2)中的3个QTL物理位置区间的SNP开发KASP分子标记。根据SNP在染色体上的物理位置，从参考基因组(陆地棉参考基因组版本：G.hirsutum.genome.CRI.TM-1)中提取SNP所在染色体的物理位置的前30bp序列和后29bp序列，组合形成包含SNP在内的共60bp的序列。对60bp序列进行筛选，去掉含有缺失碱基的序列、含有4个以上不确定碱基的序列、5X以下覆盖率的序列和含有1到5个碱基的重复序列数大于等于4的序列。将筛选完毕的60bp序列进行KASP分子标记引物设计。
(4)进一步将步骤(3)中设计得到KASP分子标记引物进行筛选，每个纤维长度QTL物理位置区间中均匀的选取10个KASP分子标记，使用SNP已知的亲本材料对开发的KASP分子标记进行基因型分型效果检测。每个纤维长度QTL物理位置区间中筛选得到4个区分基因型效果好的KASP分子标记，从而获得本发明的与棉花纤维长度QTL紧密连锁的KSAP分子标记，上述KASP分子标记的引物序列、SNP信息如表1所示：
表1KASP分子标记的引物序列、SNP信息
(5)利用上述KASP分子标记，可以实现对单个或多个棉花纤维长度QTL的分子标记辅助选择，对单个棉花纤维长度QTL的分子标记辅助选择的方法为：使用步骤(4)中筛选得到的棉花纤维长度QTL中的FL5区间的4个KSAP分子标记，对步骤(1)中构建的群体材料进行KASP分子标记基因型分型检测，选择同时含有4个KASP分子标记的长纤维纯合等位基因型的材料，其选择方法为采用引物中标记荧光基团的方式进行鉴定，其中gaaggtgaccaagttcatgct对应FAM荧光，gaaggtcggagtcaacggatt对应VIC荧光。单个棉花纤维长度QTL的分子标记辅助选择效果如表2所示：
表2单个棉花纤维长度QTL的分子标记辅助选择效果
对多个棉花纤维长度QTL的分子标记辅助选择的方法是：使用步骤(4)中筛选得到的棉花纤维长度QTL中的FL5区间的4个KSAP分子标记、FL3区间的4个KASP分子标记和FL2区间的4个KASP分子标记，对步骤(1)中构建的群体材料进行KASP分子标记基因型分型检测，选择同时含有12个KASP分子标记的长纤维纯合等位基因型的材料，其选择方法为采用引物中标记荧光基团的方式进行鉴定，其中gaaggtgaccaagttcatgct对应FAM荧光，gaaggtcggagtcaacggatt对应VIC荧光，多个棉花纤维长度QTL的分子标记辅助选择效果如表3所示：
表3多个棉花纤维长度QTL的分子标记辅助选择效果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种与棉花纤维长度QTL紧密连锁的KASP分子标记组合，其特征在于，所述分子标记为与棉花纤维长度QTL中FL5区间紧密连锁的KASP分子标记KASP-G41、KASP-G42、KASP-G43和KASP-G44；
所述KASP-G41是由核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的引物合成的DNA片段；
所述KASP-G42是由核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的引物合成的DNA片段；
所述KASP-G43是由核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示的引物合成的DNA片段；
所述KASP-G44是由核苷酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的引物合成的DNA片段；
所述KASP-G41的SNP位点的物理位置为A07染色体的88,396,617bp，为C/T突变；
所述KASP-G42的SNP位点的物理位置为A07染色体的88,437,416bp，为A/G突变；
所述KASP-G43的SNP位点的物理位置为A07染色体的88,459,489bp，为C/T突变；
所述KASP-G44的SNP位点的物理位置为A07染色体的88,469,638bp，为C/T突变。
2.一种与棉花纤维长度QTL中FL5区间紧密连锁的KASP引物对组合，其特征在于，所述KASP引物对组合包括如下表所示引物：
。
3.一种利用单个棉花纤维长度QTL分子标记鉴定棉花纤维长度性状的方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1.利用如权利要求2所述的KASP引物对组合对待测棉花材料进行KASP分子标记基因型分型检测；
S2.当能够读取到以下所述的扩增信号时，将所述待测棉花材料鉴定为棉花长纤维性状植株：
当采用所述KASP引物对组合时，所述KASP-G41、所述KASP-G42、所述KASP-G43和所述KASP-G44均检测到引物类型为X的扩增信号。
4.一种鉴定棉花纤维长度性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物对组合。
5.一种如权利要求2所述的KASP引物对组合在制备鉴定棉花纤维长度性状的试剂盒中的应用。
6.一种如权利要求1所述的KASP分子标记组合、权利要求2所述的KASP引物对组合或权利要求4所述的试剂盒在鉴定棉花纤维长度性状的棉花育种中的应用。
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