CN115976248B - 一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及林木分子辅助育种技术领域，尤其为一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒，可对不同杨属派系种间与进化过程中相对保守性基因EXPA1的克隆，比对分析派系间的序列变异规律，并通过派系间的序列特征分析，筛选得到胡杨派特异分子标记，以及用于区分杨属五大派系树种间的特有鉴别胡杨派树种的方法及鉴定试剂盒，利用本方案试剂盒及鉴别方法，可以鉴定胡杨派树种(特异扩增条带为456bp)，可以用于杨属间派系的鉴定、亲缘关系分析及进化路程分析等，并为杨树的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持，还可有效鉴定五莲杨不属于胡杨派树种，具有高灵敏性、特异性以及直观、简洁、准确等优点。
Description
技术领域
本发明涉及林木分子辅助育种技术领域，具体为一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒。
背景技术
杨树指杨柳科(Salicaceae)杨树(Populus L.)的所有树种的统称，是以无性繁殖为主、雌雄异株的落叶乔木。尹春英(2004)和栾鹖慧(2011)介绍到杨树适应范围广泛，遍及北美洲、亚洲、欧洲，有较强的适应性和抗逆性。杨树种类繁多，目前世界约有品种超过100种，我国杨树资源丰富，国内约有60种，且特有种多，西北、西南、华北及东北地区均有分布。
王战等(1984)根据形态特性、生物学属性及地理空间所处位置的不同，将杨属分为五大派：黑杨派(Sect.Aigeiros Duby)、白杨派(Sect.Lence Duby)、胡杨派(Sect.Turanga Bge)、青杨派(Sect.Tacamahaca Spach)和大叶杨派(Sect.LeucoidesSpach)。
胡杨是杨树中最古老的物种，距今大约有300～600万年的历史，胡杨因其耐高温和耐盐碱等特性而显著区别其他杨树。作为干旱大陆性气候条件下的树种，其喜光、抗热、同时耐大气干旱、抗盐碱、耐风沙。胡杨派仅有胡杨(P.euphratica)和灰胡杨(P.pruinosaSchrenk)两个种，主要分布于中亚和西亚，在我国西北地区的新疆、青海、内蒙古、甘肃、宁夏等地也有生长，但由于近几年生态环境的恶化和人为破坏干扰，胡杨林面积日益缩减。
CAIRUS(2008)研究发现不同地区间杨树引种频繁，杨树的栽培育种研究兴盛不衰，产生了数量众多的人工杂种，这些引种、人工杂种又与乡土树种之间发生了程度不一的杂交渐渗，无形之中改变着彼此的遗传结构，这使杨树各派的系统发育关系认定又增变数。在品种改良上，常常利用同种植物的不同种源地植株杂交或通过相近物种间的杂交获得遗传改良植株，系统学研究则通过形态性状或分子数据探索物种间的亲缘关系，为种质资源利用提供科学依据。
胡杨分子标记研究集中于特异引物开发、遗传多样性检测和系统进化等方面，Fay等(1999)利用AFLP对西班牙唯一的胡杨居群进行了遗传多样性检测，没有发现差异条带，推测这一居群在起源上属同一克隆；Bruelheide等(2004)对新疆策勒县胡杨也进行了AFLP分析；Saito等(2002)用RAPD标记研究了新疆胡杨居群遗传多样性：塔里木河流域的胡杨居群遗传多样性较高，但地理距离与遗传距离相关性不显著，而地形对遗传变异起较大作用，天山北部居群具有一条特有带且单独聚为一类，推测因天山山脉阻碍基因流而导致胡杨遗传隔离和分化；生光等(2008)也利用RAPD进行了研究:塔里木盆地和吐鲁番盆地胡杨种群相比准噶尔盆地种群遗传关系更近，进而推测新疆胡杨通过2个途径传入，由于对新疆特殊地理环境的生态适应造成遗传分化。Rotenberg等(2000)对分布于以色列的3个胡杨群体进行了同工酶分析，从12种酶系统检测到20个位点，其中13个位点具有多态性，表明胡杨基因资源遗传多样性丰富。Satio等(2003)运用RAPD标记技术对中国西北地区胡杨遗传多样性进行了研究，证明胡杨RAPD多态性(49.2％)低于同工酶多态性(59.3％)。张玲等(2012)利用12对SSR引物对中国新疆灰叶胡9个天然群体的135个样品进行遗传多样性研究，结果表明灰叶胡杨群体内遗传多样性较高，具有丰富的遗传变异。这些遗传多样性的研究为胡杨种质资源的保护提供了理论基础。
物种在进化过程中，需要适应各种不同的环境，因此抗逆性基因在物种进化过程中占据重要的地位。基因作为遗传信息的载体，保留了很多进化的痕迹，同一基因在不同物种中的序列差异可以作为分类鉴定的分子标记，具有信息量大、能够稳定遗传等优点。扩展蛋白是一组细胞外蛋白，可直接改变植物细胞壁的机械特性，导致膨胀驱动的细胞延伸。Chase(2020)基于系统发育分析，包括Schipper(2002)、Carey(2007)和Cosgrove(2017)在单子叶植物、松树(Pinus radiata、P.taeda)、蕨类植物(Regnellidium diphyllum、Marsilea quadrifolia)和苔藓(Physcomitrella patens)中发现的扩展蛋白序列表明，三个植物的扩展蛋白在亚科水平上很早就出现并开始多样化。结合以往的研究结果中变形虫(Proteus)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)中也发现了密切相关的“扩展蛋白样”序列，这表明植物扩展蛋白是一个复杂的多基因家族，与Yi(2002)研究认为扩展蛋白属于古老的进化起源基因相一致。本研究拟通过对不同杨树的抗逆性基因Pt EXP1的克隆，分析其序列位点差异，了解该基因在不同种属间的变异规律，并通过种属间序列特征分析，筛选胡杨派特异性分子标记，以期用于区分胡杨派的鉴定、亲缘关系分析及进化路径分析等，并为杨树的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持。
综上所述，本发明提供一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒来解决存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒，以解决现有杨树植物派系分类不清楚及其他分类技术方法复杂性等问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种特有鉴定胡杨派树种的方法，步骤如下：
步骤1，杨属基因组DNA扩展蛋白1即为EXPA1基因同源片段引物设计：利用毛果杨EXPA1基因DNA全长序列中820bp～885bp的片段引物对1；
步骤2，五大派杨树基因组DNA同源EXPA1基因片段序列获得：提取五大派代表性物种DNA，利用序列表中的引物对1对以上模板进行PCR扩增；其次，将这5大派代表性物种的EXPA1基因片段进行克隆测序；
步骤3，胡杨派特有引物对获得：将获得的五大派代表性物种的基因组DNA同源性EXPA1基因片段序列比对，挑选胡杨派在比对序列中特有部分，作为胡杨派物种区别其他四大派物种的特有片段，设计引物，即为引物对2；
步骤4，验证特异引物对2的准确性：将收集的五大派杨树共计21个样本使用胡杨派专用试剂盒进行验证，结果显示，胡杨派的5个样本在扩增结果中均有456bp特异条带出现，而其他四大派树种的样本中均没有此条带产生；
步骤5，鉴定五莲杨不属于胡杨派的物种：分别提取五莲杨雌株、雄株DNA，利用胡杨专用试剂盒进行鉴别，结果显示，五莲杨雌雄两样本中均无456bp特异条带产生，说明五莲杨雌株、雄株均不属于胡杨派的植物；
所述五大派杨树分别为胡杨派、白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派；
所述选取的五大派代表性树种分别为：胡杨派的胡杨、白杨派的鲁毛50、黑杨派的欧美杨107(Populus×euramericana Neva)、青杨派的小叶杨和大叶杨派的大叶杨。
作为本发明优选的方案，所述的毛果杨基因组DNA EXPA1基因的片段序列位于第二个和第三个外显子之间，利用DNAMAN软件设计引物对，使其扩增产物在820bp～885bp。
作为本发明优选的方案，所述的五种杨树基因组DNA EXPA1基因同源片段序列获得包括PCR产物胶回收、纯化连接克隆载体即为pMD18-T vector、转化大肠杆菌后阳性筛选和质粒提取后基因测序。
作为本发明优选的方案，所述胡杨派与其他派系差异较大片段的区别在于部分作为引物对的上游引物，下游引物在382bp处。
作为本发明优选的方案，所述胡杨派与其他四个派系特有片段包括5'-GCATTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAA-3'48bp片段。
作为本发明优选的方案，所述的PCR扩增体系为：引物对列表中的引物对浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq即为Ex Taq Version 2.0plusdye)，0.4μl DNA模板，无菌水补至15μl。
作为本发明优选的方案，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。
一种特有鉴定胡杨派树种的试剂盒，利用以上方法可形成能够鉴定胡杨派树种的试剂盒，其试剂盒包括能够区别其他四大派的引物对2，PCR扩增体系和PCR扩增条件。
作为本发明优选的方案，所述PCR扩增体系为引物对列表中的引物对2浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq即为Ex Taq Version 2.0 plusdye，0.4μlDNA模板，无菌水补至15μl，其中PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。
作为本发明优选的方案，所述引物对1的片段大小为820bp～885bp，其中引物对1包括PtA1F和PtA1R，其中PtA1F的引物序列为5'-CCCAACAACAACCTTTATGG-3'，PtA1R的引物序列为5'-CAACCAGAACAGCGTTTGAC-3'；
所述引物对2的片段大小为456bp，其中引物对2包括PtA2F和PtA2R，其中PtA2F的引物序列为5'-TTCCAATAGTTCTCACTCCA-3'，PtA2R的引物序列为5'-CTCATGCTCATCCAACCAGT-3'；
具体的序列5引物对PtA1F/PtA1R对基因EXPA1片段进行扩增的序列为胡杨派：
CCCAACAACAACCTTTATGGCCCCAAAGCAATAGCTCTCTGAAGCCATGAAAATACACTCGAGATGTTGACAAAAGAACACCATGATAACTGCGAAAAACACCTATTTTTGGTTGGTCTTTATCTCTTTTGTCAACCAATTTTCTACCTTTGAATTCTTGTTGTGATCCAAAAATGTGTTAACTGAAGTCACCAAACAGTTATGCACGAACTGATGTTATTAAGAGATGTCGGTGGTTTAGGTATACCTCAACAGCTTTCTCTTGTGTCCATTTACCACGGGACCGTTTATGACCACCTTCGGTGATTTGTTTTTACTCTTATATCCCTGCTTTAGTACATTAAAAACGCCAATGCACCCTTGCCCTATTAGTTTCTACGCTTGCATTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAACCCTCCTGCAGAAAAGTGGATAGCCGCATCTTACTACAGCACTATTTCTGAGTGGATCGGGAGTATTTTAGTGGGAAAATCAAAACATTTAGTCAAACACCAAAACCCAAAAATCACACTTCCCAAAAACTTAAGACTTCCATGTTTATGTTTTTTATTTAATGCCTAGGTTAGGCTTCCTGTTGTCCTTGACTGCTCTTTTTGTAAATTTGTTTCATTGTCGCAATTACGGAAGTGTCCTAACGGCATTGAACTACTATGCAGAGTACCATGCCGCAAGAGGGGAGGCATAAGGTTCACAATAAACGGATTCCGTTACTTCAACTTGGTGTTGATCAGCAACGTGGCGGGTGCAGGGGATATAGTGCAGGTGAGCGTGAAGGGTTCAAAGACTGGTTGGATGAGCATGAGCCGTAACTGGGGCCAAAACTGGCAGTCAAACGCTGTTCTGGTTG；
具体的序列6引物对PtA2F/PtA2R对基因EXPA1片段进行扩增的序列为胡杨派'1'：
TTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAACCCTCCTGCAGAAAAGTGGATAGCCGCATCTTACTACAGCACTATTTCTGAGTGGATCGGGAGTATTTTAGTGGGAAAATCAAAACATTTAGTCAAACACCAAAACCCAAAAATCACACTTCCCAAAAACTTAAGACTTCCATGTTTATGTTTTTTATTTAATGCCTAGGTTAGGCTTCCTGTTGTCCTTGACTGCTCTTTTTGTAAATTTGTTTCATTGTCGCAATTACGGAAGTGTCCTAACGGCATTGAACTACTATGCAGAGTACCATGCCGCAAGAGGGGAGGCATAAGGTTCACAATAAACGGATTCCGTTACTTCAACTTGGTGTTGATCAGCAACGTGGCGGGTGCAGGGGATATAGTGCAGGTGAGCGTGAAGGGTTCAAAGACTGGTTGGATGAGCATGAG。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明中，通过对不同杨树派系种间与进化过程中相对保守性基因EXPA1的克隆，比对分析派系间的序列变异规律，并通过派系间的序列特征分析，筛选得到胡杨派特异分子标记，以及用于区分杨属五大派系树种间的特有鉴别胡杨派树种的方法及鉴定试剂盒，利用本方案试剂盒及鉴别方法，可以鉴定胡杨派树种(特异扩增条带为456bp)，可以用于杨属间派系的鉴定、亲缘关系分析及进化路程分析等，并为杨树的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持，还可有效鉴定五莲杨(P.Wulianensis)不属于胡杨派树种，具有高灵敏性、特异性以及直观、简洁、准确等优点。
附图说明
图1为利用引物对1(PtA1F/PtA1R)对五大派代表的5个杨树基因组DNA进行的PCR扩增结果示意图；泳道1-6依次为M,DL2,000 DNA Marker、P.euphratica'1'、P.tomentosa'Lumao 50'、P.nigra'9'、P.simonii'17'、P.lasiocarpa；
图2为五大派5个杨树EXPA1基因片段序列比对结果；
图3为引物对2PtA2F/PtA2R对杨树五大派21个样本的PCR扩增结果，泳道1-5胡杨派样本分别为P.euphratica'1'、P.euphratica'2'、P.euphratica'4'、P.euphratica'6'、P.euphratica'7'；泳道6-10白杨派样本分别为P.tomentosa'Lumao 50'、P.tomentosa'TC1521'、P.hopeiensis、P.tomentosa'Zhong 27'、P.alba×P.glandulosa；11-13泳道黑杨派样本分别为P.nigra'9'、P.nigra'2025'、Populus×eurame ricana Neva；14-19泳道青杨派样本分别为P.simonii'17'、P.simonii'54'、P.simonii'60'、P.simonii'70'、P.simonii'77'、P.trichoc arpa；泳道20-21大叶杨派样本分别为P.lasiocarpa'1'、P.lasiocarpa'2'；泳道22为水空白对照；
图4为利用本方案试剂盒初步鉴定五莲杨在五大派中的分类地位，泳道1-2分别为五莲杨雌株和雄株，泳道4为P.euphratica'1'阳性对照，泳道5水空白对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例，仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述,给出了本发明的若干实施例,但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例,相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
需要说明的是，当元件被称为“固设于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件,当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件,本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同,本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明,本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例，请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：
一种鉴别胡杨派树种的方法，其方法包括以下步骤：
(1)杨树基因组DNA扩展蛋白1(EXPA1)基因同源片段引物设计：利用毛果杨(P.trichocarpa)EXPA1基因DNA全长序列设计详见序列表1中820bp～885bp的区段引物对1(PtA1F/PtA1R)；
(2)五大派杨树基因组DNA同源EXPA1基因片段序列获得：提取杨属五大派代表杨树DNA，利用序列表中的引物对PtA1F/PtA1R对以上模板进行PCR扩增；其次，将这5个杨树区段EXPA1基因片段进行克隆测序；
(3)胡杨派特有引物对获得：将获得的五大派代表性物种的基因组DNA同源性EXPA1基因片段序列比对，挑选胡杨派在比对序列中特有插入序列(48bp)作为胡杨派区别其他四大派的特有片段，设计引物对见序列表中引物对2(PtA2F/PtA2R)；
(4)验证特有鉴定胡杨派试剂盒的准确性：将收集的五大派杨树共计21个样本使用本专利试剂盒进行验证，结果显示，胡杨派的5个样本在扩增结果中均有456bp特异条带出现，而其他四大派杨树均没有此条带产生；
(5)初步鉴定五莲杨不属于胡杨派的分属地位：分别提取五莲杨雌株、雄株DNA，利用引物对2进行PCR扩增，电泳结果显示，两样本均无456bp特异条带产生，说明五莲杨不属于胡杨派树种；
所述杨树五大派分别为胡杨派、白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派；
所述选取的五大派杨树代表树种分别为：胡杨派的胡杨‘1’，白杨派的‘鲁毛50’(P.tomentosa'Lumao 50')，黑杨派的欧美杨107(Populus×euramericana Neva)，青杨派的小叶杨(P.simonii)，大叶杨派的大叶杨(P.lasiocarpa)。
作为一种优选的实施方案，选取的毛果杨EXPA1基因的的基因组DNA片段序列位于第二个和第三个外显子之间，利用DNAMAN软件设计引物对，使其扩增产物在820bp～885bp。
作为一种优选的实施方案，五种杨树基因组DNA EXPA1基因同源片段序列获得包括PCR产物胶回收、纯化，连接克隆载体(pMD18-T vector)，转化大肠杆菌(E.coli)后阳性筛选，质粒提取后基因测序。
作为一种优选的实施方案，胡杨派与其他派系差异较大片段在于图1中标记框中部分，本专利选择该部分作为引物对的上游引物PtA2F，下游引物PtA2R在382bp处。
作为一种优选的实施方案，胡杨派与其他派系特有片段包括5'-GCATTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAA-3'48bp片段。
作为一种优选的实施方案，所述的PCR扩增体系为：引物对列表中的引物对浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plusdye)，0.4μl DNA模板，无菌水补至15μl。
作为一种优选的实施方案，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。
作为一种优选的实施方案，利用以上方法可形成能够鉴定胡杨派树种的试剂盒，其试剂盒包括能够区别其他四大派引物对PtA2F/PtA2R，PCR扩增体系和PCR扩增条件。
作为一种优选的实施方案，所述的PCR扩增体系为：引物对列表中的引物对浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plusdye)，0.4μl DNA模板，无菌水补至15μl。
作为一种优选的实施方案，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min；
具体的：
1)EXPA1基因同源片段序列比较分析：从杨属五大派分别随机挑选1个样本(胡杨派的胡杨‘1’，白杨派的‘鲁毛50’，黑杨派的欧美杨107，青杨派的小叶杨，大叶杨派的大叶杨)作为实验材料，采用CTAB法分别提取基因组DNA，以序列表中引物对1PtA1F/PtA1R进行EXPA1基因同源片段扩增。其中PCR扩增体系包括：引物浓度均为10pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)，0.4μl DNA模板，无菌水补至15μl。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min，附图1显示，所有样本条带均在850bp左右，不同派系间的同源片段大小相似，但在1.5％琼脂糖凝胶电泳中分辨不出具体核苷酸位点区别；
2)基因组DNA EXPA1基因同源片段克隆：将上述5种杨树PCR扩增电泳条带相应的进行切割、胶回收纯化，连接克隆载体(pMD18-T vector)，转化大肠杆菌后阳性筛选，质粒提取后基因测序，最后进行基因序列比对分析。其中采用试剂盒将PCR产物进行纯化回收；
3)杨树五大派EXPA1基因片段同源性比对分析：将上述反馈得到的测序结果利用DNAMAN软件进行比对分析，附图2结果显示在序列的前端和后端具有高度保守序列，主要差异分布在中间片段，这表现出存在较好的种间特异性；
4)胡杨派特异性分子标记引物的筛选：上述结果显示，种间EXPA1基因片段序列具有种属特异性。分析胡杨派在附图2标记框架区段特有并含有48bp插入片段(GCATTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAA)，在此设计正向引物PtA2F以及下游382bp处设计反向引物PtA2R；
PtA2F:5'-TTCCAATAGTTCTCACTCCA-3'(引物对2上游引物)；
PtA2R:5'-CTCATGCTCATCCAACCAGT-3'(引物对2下游引物)；
引物对2PtA2F/PtA2R的靶向序列为序列表5中第400bp～856bp核苷酸片段(456bp)；
以上形成此专利的鉴定胡杨派特有试剂盒，其中包括引物对2PtA2F/PtA2R和PCR扩增体系及反应条件；
序列表1
序列5引物对PtA1F/PtA1R对基因EXPA1片段进行扩增的序列(胡杨派P.euphratica)：
CCCAACAACAACCTTTATGGCCCCAAAGCAATAGCTCTCTGAAGCCATGAAAATACACTCGAGATGTTGACAAAAGAACACCATGATAACTGCGAAAAACACCTATTTTTGGTTGGTCTTTATCTCTTTTGTCAACCAATTTTCTACCTTTGAATTCTTGTTGTGATCCAAAAATGTGTTAACTGAAGTCACCAAACAGTTATGCACGAACTGATGTTATTAAGAGATGTCGGTGGTTTAGGTATACCTCAACAGCTTTCTCTTGTGTCCATTTACCACGGGACCGTTTATGACCACCTTCGGTGATTTGTTTTTACTCTTATATCCCTGCTTTAGTACATTAAAAACGCCAATGCACCCTTGCCCTATTAGTTTCTACGCTTGCATTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAACCCTCCTGCAGAAAAGTGGATAGCCGCATCTTACTACAGCACTATTTCTGAGTGGATCGGGAGTATTTTAGTGGGAAAATCAAAACATTTAGTCAAACACCAAAACCCAAAAATCACACTTCCCAAAAACTTAAGACTTCCATGTTTATGTTTTTTATTTAATGCCTAGGTTAGGCTTCCTGTTGTCCTTGACTGCTCTTTTTGTAAATTTGTTTCATTGTCGCAATTACGGAAGTGTCCTAACGGCATTGAACTACTATGCAGAGTACCATGCCGCAAGAGGGGAGGCATAAGGTTCACAATAAACGGATTCCGTTACTTCAACTTGGTGTTGATCAGCAACGTGGCGGGTGCAGGGGATATAGTGCAGGTGAGCGTGAAGGGTTCAAAGACTGGTTGGATGAGCATGAGCCGTAACTGGGGCCAAAACTGGCAGTCAAACGCTGTTCTGGTTG；
序列6引物对PtA2F/PtA2R对基因EXPA1片段进行扩增的序列为胡杨派'1'：
TTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAACCCTCCTGCAGAAAAGTGGATAGCCGCATCTTACTACAGCACTATTTCTGAGTGGATCGGGAGTATTTTAGTGGGAAAATCAAAACATTTAGTCAAACACCAAAACCCAAAAATCACACTTCCCAAAAACTTAAGACTTCCATGTTTATGTTTTTTATTTAATGCCTAGGTTAGGCTTCCTGTTGTCCTTGACTGCTCTTTTTGTAAATTTGTTTCATTGTCGCAATTACGGAAGTGTCCTAACGGCATTGAACTACTATGCAGAGTACCATGCCGCAAGAGGGGAGGCATAAGGTTCACAATAAACGGATTCCGTTACTTCAACTTGGTGTTGATCAGCAACGTGGCGGGTGCAGGGGATATAGTGCAGGTGAGCGTGAAGGGTTCAAAGACTGGTTGGATGAGCATGAG。
下面将结合实施例进一步说明本方案的有效及有益效果。
实施例1
首先，提取收集到的五大派杨树资源DNA，其中资源包括胡杨派P.euphratica'1'、P.euphratica'2'、P.euphratica'4'、P.euphratica'6'、P.euphratica'7'五种；白杨派P.tomentosa'Lumao 50'、P.tomentosa'TC1521'、P.hopeiensis、P.tomentosa'Zhong 27'、P.alba×P.glandulosa五种；黑杨派P.nigra'9'、P.nigra'2025'、Populus×euramericanaNeva三种；青杨派P.simonii'17'、P.simonii'54'、P.simonii'60'、P.simonii'70'、P.simonii'77'、P.trichocarpa六种；大叶杨派杨P.lasiocarpa'1'、P.lasiocarpa'2'两种。其中，DNA提取采用CTAB法(Doyle等，Phytochemistry Bulletin.(1987)，1-15)；
其次，利用鉴定胡杨派特有试剂盒对以上DNA样本进行检测；
对检测产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，如附图3所示，只有泳道1-5胡杨派出现456bp特异条带，白杨派泳道6-10、泳道11-13黑杨派、泳道14-19青杨派、泳道20-21大叶杨派和泳道22水对照均无条带产生。
实施例2
利用特有鉴定胡杨派基因分子标记试剂盒对五莲杨雌株、雄株进行是否属于胡杨派属类地位的鉴定；
从山东省林草种质资源中心五莲杨种质资源汇集区(36°37′N,117°90′E)采集五莲杨雌株、雄株叶片各2-3个作为DNA样本材料。利用CTAB法对以上两种材料进行DNA提取，制备PCR扩增使用的模板；
利用上述提供的试剂盒，同样利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带如附图4所示，泳道1、2分别为五莲杨雌株、雄株在456bp处均无特异条带，泳道3为胡杨阳性对照，有明显条带出现，4泳道水空白对照没有条带出现。根据本专利提供的试剂盒及方法，初步鉴定五莲杨雌株、雄株均不属于胡杨派树种。
综上所述，应用本方案的形成方法和技术方案具备以下成效：
1.本方案利用最低成本形成了将别胡杨派植物的方法，相对于AFLP、SSR等分子标记方法，其利用一次性反应就能够将结果以最为直观的方式进行展示出来，本发明利用了最简单的原理，解决最广泛的问题。
2.由于杨树物种间的严格异交性质和广泛的种间杂交，使得产生众多的野生近缘物种，而且很多物种的种内个体的形态变异幅度大，与物种之间形态变化存在重叠，使得传统形态分类很难鉴别，需要大量的标本和实物观察才能区别物种，这样对于一种经济植物的广泛利用是十分不利的，使用在进化过程中具有保守性基因为鉴别依据，不受形态学性状的干扰，同时技术流程简便，因此其应用于杨树的物种鉴别具有很大的实践意义，它的应用不仅有助于科研工作者快速地鉴别野生杨树资源，加快实验进度，而且对杨树起源进化的研究也起到促进作用；同时有利于保护区、林业相关基层工作人员进行优良天然杨树种质资源的鉴别和珍稀濒危种质资源的保护。
利用本方案提供的辅助鉴定胡杨派植物试剂盒，对材料的年龄、组织、部位等没有过多的要求，只需要样本的DNA作为模板就可实现鉴定结果，此过程通过一种特有鉴定胡杨派树种的方法，包含以下步骤：选择五大派代表性树种进行基因EXPA1基因组DNA同源片段PCR扩增、切胶回收纯化、克隆鉴定及质粒提取测序，将得到的5条基因EXPA1片段序列使用DNAMAN比对分析，发现胡杨派的树种具有特异片段(48bp)插入，跨越该区域设计上游引物为本发明专利试剂盒引物对2的前端引物，下游引物在382bp保守区域，全长共有456bp，与PCR反应体系和条件组成了本发明专利的可使用的试剂盒。采用该试剂盒，可将胡杨派中的5个种从白杨派(5个样本)、黑杨派(3个样本)、青杨派(6个样本)及大叶杨派(2个样本)共计21样本中区分开来。同时，使用本发明专利的试剂盒在鉴定五莲杨雌株、雄株时，没有特异条带产生，说明五莲杨不属于胡杨派的树种，本方案提供的用于鉴定胡杨派树种的方法及使用试剂盒，可用于杨属间派系间物种的鉴定、亲缘关系分析及进化路程分析等，并为杨属植物的分子标记辅助育种和品种遗传改良工作提供理论基础和技术支持。具有高灵敏性、特异性以及操作简单、准确快速等特点。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种特有鉴定胡杨派树种的方法，步骤如下：
步骤1，杨属基因组DNA扩展蛋白1即为EXPA1基因，其同源片段引物设计如下：选取毛果杨EXPA1基因DNA全长序列中820bp～885bp的片段设计引物对1，所述引物对1为PtA1F和PtA1R，所述PtA1F的引物序列为5'-CCCAACAACAACCTTTATGG-3'，所述PtA1R的引物序列为5'-CAACCAGAACAGCGTTTGAC-3'；
步骤2，获得五大派杨树基因组DNA同源EXPA1基因片段序列：提取五大派杨树代表性树种DNA，利用所述引物对1对所述EXPA1基因片段进行PCR扩增；其次，将这五大派杨树代表性树种的EXPA1基因片段进行克隆测序；所述五大派杨树分别为胡杨派、白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派；
选取的五大派杨树代表性树种分别为：胡杨派的胡杨、白杨派的‘鲁毛50’、黑杨派的欧美杨107、青杨派的小叶杨和大叶杨派的大叶杨；
步骤3，获得胡杨派特异引物对：将获得的五大派杨树代表性树种的基因组DNA同源性EXPA1基因片段进行序列比对，挑选胡杨派在比对序列中区别其他四大派物种的特有片段，所述特有片段为5'- GCATTCCAATAGTTCTCACTCCACATTTTGGTGTATGCAAAAAAAAAA-3'的48 bp片段；设计引物对2，所述引物对2为PtA2F和PtA2R，所述PtA2F的引物序列为5'-TTCCAATAGTTCTCACTCCA-3'，所述PtA2R的引物序列为5'-CTCATGCTCATCCAACCAGT-3'；
步骤4，验证所述引物对2的准确性：将收集的五大派杨树代表性树种共计21个样本使用胡杨派专用试剂盒进行验证，结果显示，胡杨派的5个样本在扩增结果中均有456bp特异条带出现，而白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派树种的样本中均没有所述特异条带产生；
步骤5，鉴定五莲杨不属于胡杨派的树种：分别提取五莲杨雌株、雄株DNA，利用胡杨专用试剂盒进行鉴别，结果显示，五莲杨雌雄两样本中均无456bp特异条带产生，说明五莲杨雌株、雄株均不属于胡杨派的植物；
所述胡杨派专用试剂盒包含所述引物对2。
2.根据权利要求1所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述的毛果杨基因组DNA EXPA1基因的片段位于第二个和第三个外显子之间，利用DNAMAN软件设计引物对。
3.根据权利要求1所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，获得所述五大派杨树代表性树种的DNA EXPA1基因同源片段序列包括PCR产物胶回收纯化，连接克隆载体pMD18-T vector，转化大肠杆菌后进行阳性筛选，以及质粒提取后进行基因测序。
4. 根据权利要求1至3任意一项所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，PCR扩增体系为：引物对列表中的引物对浓度均为10 pmol/μl，上下游引物各取用0.3μl，7.5μl Premix Taq 即为Ex Taq Version 2.0 plus dye ，0.4μl DNA模板，无菌水补至15μl。
5.根据权利要求4的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。
6.根据权利要求1所述的一种特有鉴定胡杨派树种的方法，其特征在于，所述引物对2扩增产物片段为456bp；
引物对 PtA1F/ PtA1R对胡杨派P. euphratica的EXPA1基因片段进行扩增的序列如SEQ ID NO.5所示；
引物对 PtA2F/ PtA2R对胡杨派'1'的EXPA1基因片段进行扩增的序列如 SEQ ID NO.6所示。
7.一种特有鉴定胡杨派树种的试剂盒，其特征在于，利用如权利要求1所述的方法形成能够鉴定胡杨派树种的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对2， PCR扩增体系和PCR扩增条件，所述引物对2用于区别胡杨派和其他杨属四大派，所述其他杨属四大派为白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派。
8. 根据权利要求7所述的一种特有鉴定胡杨派树种的试剂盒，其特征在于，PCR扩增体系为所述引物对2浓度均为10 pmol/μl，上下游引物各取用0.3 μl，7.5 μl Premix Taq 即为Ex Taq Version 2.0 plus dye，0.4μlDNA模板，无菌水补至15μl，PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40～60sec，35个循环，然后72℃充分延伸7min。
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