CN103882142A - 一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法 - Google Patents

一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，包括如下步骤：（1）确定目标植物种类和目标基因，提取目标植物的总RNA，反转录为cDNA作为PCR的为模板，选择多个内参基因，设计特异性引物进行实时荧光定量PCR反应得到CT值；（2）将所述CT值数据通过geNorm、NormFinder、BestKeeper三种软件分析其适用性，用R软件的RankAggreg程序包，将每个处理里得到的四组适用性排序数据进行加权平均聚合，得到所述多个基因的最终适用性排序。本发明所述方法对于推动揭示植物生长发育、抗逆机理等基础性研究和培育速生、抗逆、丰产的植物新品种等应用型研究具有十分重要的意义。

Description

一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，特别是涉及一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法。
背景技术
内参基因，也被称作参照基因或者管家基因，是研究目的基因表达量变化的重要内源对照。内参基因表达量的不稳定和变化将导致需要研究的目的基因的表达量的偏差和波动，为了获得精确和可信度高的实验结果，鉴定和评价合适的内参基因是任何一个物种进行基因表达分析的关键前提条件。近几年随着测序技术的快速发展和测序成本的不断降低，科学家完成大量植物物种的全基因测序工作，在这些已获得基因组信息的植物物种内开展内参基因适用性的研究，成为从各方面深入研究该植物物种的基础。目前有许多植物物种需要对内参基因在不同组织、不同发育阶段、不同的环境处理条件下的适用性进行研究。
鉴定和评价内参基因的适用性，需要对其稳定性进行排序，技术操作基于实时性光定量PCR，目前应用最广泛的用于基因表达量分析的技术手之一，其具有较高的稳定性、特异性和可靠性。胡杨(Populus euphratica Oliv)生长在干旱盐碱和温差剧烈变化的极端沙漠环境中，被国际学术界越来越多的定性为进行木本植物抗逆研究的模式材料，本研究对胡杨在脱落酸、寒冷、脱水、干旱、短期盐、长期盐等六种逆境条件下的内参基因适用性进行鉴定和评价，以作为其它植物的参考。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种快速、准确地对植物内参基因进行鉴定和评价的方法，提供了可用于基因表达分析的合适内参基因。
一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，包括如下步骤：
（1）确定目标植物种类和目标基因，并目标植物其进行前处理，提取目标植物的总RNA，反转录为cDNA作为PCR的为模板，选择多个在其它物种中常用的并在转录组中表达较稳定的多个内参基因，所述内参基因的数量大于等于9，设计特异性引物，进行实时荧光定量PCR反应，得到CT值；
（2）将所述CT值数据通过geNorm、NormFinder、BestKeeper三种软件分析其适用性，然后用R软件的RankAggreg程序包，将每个处理里得到的四组适用性排序数据进行加权平均聚合，得到所述多个基因的最终适用性排序。
本发明所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其中所述目标植物为草本粮食作物或木本植物，所述前处理为环境胁迫处理，为脱落酸处理、寒冷处理、脱水处理、干旱处理、短期盐胁迫处理或长期盐胁迫处理中的一种或几种。
本发明所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其中所述目标植物为水稻、小麦、玉米、大豆、杨树、松树、柏树、杉木、苹果树、梨树、葡萄、橙子。
本发明所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其中所述目标植物为胡杨。
本发明所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其中所述步骤（1）具体为：确定目标植物为胡杨，对胡杨进行前处理，用CTAB法氯仿抽提提取胡杨叶片的总RNA，从拟南芥、水稻研究中找到常用来作为内参基因的基因，以及已有的胡杨的转录组数据中，共挑出16个候选的内参基因，分别为18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF-5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ，以及三个用于检测内参基因适用性的三个目标基因PePYL1、PeSCOF-1和PeSCL7，对每个所述目标基因用Primer6软件设计特异性引物，对16个候选内参基因进行实时荧光定量分析，20ul的反应体系含有10ulSuperReal PreMix Plus，1ul的sscDNA，对应约9ng的RNA，2ul的ROX reference Dye，上下游各0.3uM的引物，反应条件为95℃5min，95℃15s60℃60s共40个循环，然后温度由40℃到100℃升温，每个温度下记录荧光值来获得溶解曲线，其中重复数为3，得到CT值。
本发明所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其中所述前处理包括如下步骤：
在每年的四月份取来自新疆维吾尔族自治区的胡杨仔苗，四月上旬种植于直径60cm高50cm的圆盆内，每盆3-5棵，土壤以沙土为主，含有少量蛭石和花卉营养土，每周浇两次水，待小苗生长3-4个月，即七月初或月末，苗高60～80cm的时候进行环境胁迫处理，所述环境胁迫处理方法为以下方法中的一种或几种：
A、脱落酸处理：对胡杨小苗叶面喷洒200mM ABA溶液，溶液由ABA固体粉末配制而成，处理时间为12个小时，未喷洒ABA溶液的植株作为对照；
B、冷处理，将胡杨小苗连盆放在4-6℃的环境下，室温约25℃度下的植株作为对照，保持对照和处理的光照一致，处理时间12h；
C、脱水处理，从土壤中避免损伤根的前提下取出小苗，洗尽根部泥土直接裸露放置于湿度70%、温度25℃的环境下，正常生长的植株作为对照，处理时间12h；
D、干旱处理；通过浇水量控制相对土壤水分(RSMC)含量75%-10%，呈六个梯度，一直充分浇水的植株RSMC约75%-70%的作为对照，处理时间为一个月；
E、短期盐处理，将土壤中移出未伤根的胡杨苗洗尽根部泥土后水培于含有350mM NaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作为对照，每隔6h换一次水避免根部缺氧，处理时间12h；
F、长期盐胁迫，对长有胡杨苗的盆浇200mM NaCl水溶液2L，之后维持正常不含盐溶液的水25d；
其中，每种处理6个梯度，每个梯度三盆植物材料；在ABA、冷、脱水、短期盐胁迫处理1、3、6、9、12小时的时候，在长期盐胁迫5、10、15、20、25天的时候，干旱胁迫控制RSMC一个月后，取20-30片同一位置的叶子速冻于液氮中，然后再放置于-80℃保存材料。
本发明所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其中在提提取胡杨叶片的总RNA操作过程的最后一步用DNA酶消化，用Thermo NanoDrop2000测RNA的浓度，通过测OD260/OD280以及OD260/OD230两个值来检测RNA的纯度，用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA的质量，Agilent2100微流控芯片检测RNA是否降解，每个处理每个梯度取1.8μg的RNA逆转录为cDNA，将得到的cDNA稀释8-10倍，保持终浓度的一致。
本发明所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其中所述步骤（2）具体包括如下步骤：先将CT值的平均值对数转换后输入geNorm软件，通过M值的大小对16个基因的稳定性进行排序，将对数转换未经过平均的三组CT值输入NormFinder分析stab值，并根据stab值的由小到大对对16个基因的稳定性进行1-16的排序，BestKeeper通过CV值得出稳定性排名并通过r2算出关联性排名，将得到的四组排名用R软件的RankAggreg程序包进行加权平均聚合，得到16个基因的最终稳定性排序，其中需要使用的内参基因的数目由geNorm软件算出的PV值进行确定。
本发明所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其中16个候选的内参基因，18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF-5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32所示，三个用于检测内参基因适用性的三个目标基因PePYL1、PeSCOF-1和PeSCL7的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:38所示。
本发明快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法与现有技术不同之处在于：
本发明快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法简单易行，基于快速对基因表达量进行分析的实时荧光定量PCR技术，仅需要提取目标植物的总RNA，选择常用的多个内参基因进行实时荧光定量PCR反应，得到CT值，并通过geNorm、NormFinder、BestKeeper三种软件分析其适用性，然后用R软件的RankAggreg程序包，将每个处理里得到的四组适用性排序数据进行加权平均聚合，得到所述多个基因的最终适用性排序，对三种结果进行叠加和归一化处理，再用qBasePlus对实验体系和结论进行验证，能够快速而系统完整的得到可信的实验结果。比起传统的只用单一的一种分析方法，该方法的可信度高，结果更准确，应用性更强，本发明所述方法结果准确。另外，本研究建立了在六种环境胁迫处理条件下对胡杨内参基因的适用性进行鉴定和评价，可作为其它植物物种的参考，为今后植物内参基因适用性的研究奠定了基础。
本发明快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法可实现对任何一个已获得全基因组测序数据或EST数据的植物物种，包括草本主粮作物水稻、小麦、玉米、大豆等，或者木本植物杨树、松树、柏树、杉木等以及经济林木本植物果树类苹果树、梨树、葡萄内参基因的鉴定和评价，对于推动揭示植物生长发育、抗逆机理等基础性研究和培育速生、抗逆、丰产的植物新品种等应用型研究，都具有十分重要的意义。
下面结合附图对本发明的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明所述方法的流程示意图；
图2是本发明方法中16个内参基因PCR的特异性检测，两端为Marker；
图3是本发明方法中对所得到的CT值的离散性进行分析；
图4是本发明方法中通过geNorm算出的M值对16个基因在六种处理下的稳定进行排序，其中包括综合起来的数据Total；
图5是本发明方法中使用RankAggreg对得到的四组排名进行加权平均聚合，得到最终的排序结果；其中，笔直的黑色线是CE，有弯曲的黑色线代表Mean；
图6是本发明方法中选择鉴定出的最适合的或者最不适合的内参基因对PePYL1、PeSCOF-1、PeSCL7三个基因的表达量进行分析。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，包括如下步骤：
确定目标植物为胡杨，确定目标基因为PePYL1、PeSCOF-1、PeSCL7三个基因；
在每年的四月份取来自新疆维吾尔族自治区的胡杨仔苗，约四月初旬种植于直径约60cm高约50cm的圆盆内，每盆3-5棵，土壤以沙土为主，含有少量蛭石和花卉营养土，每周浇两次水，待小苗生长3-4个月，即七月初或月末，苗高约60～80cm的时候进行6种环境胁迫处理：脱落酸处理，对胡杨小苗叶面喷洒200mM ABA溶液，溶液由ABA固体粉末配制而成，处理时间为12个小时，未喷洒ABA溶液的植株作为对照；冷处理，将胡杨小苗连盆放在4-6℃的环境下，室温约25℃度下的植株作为对照，保持对照和处理的光照一致，处理时间12h；脱水处理，从土壤中避免损伤根的前提下取出小苗，洗尽根部泥土直接裸露放置于湿度70%、温度25℃的环境下，正常生长的植株作为对照，处理时间12h；干旱处理；通过浇水量控制相对土壤水分(RSMC)含量75%-10%，呈六个梯度，一直充分浇水的植株RSMC约75%-70%的作为对照，处理时间为一个月；短期盐处理，将土壤中移出未伤根的胡杨苗洗尽根部泥土后水培于含有350mM NaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作为对照，每隔6h换一次水避免根部缺氧，处理时间12h；长期盐胁迫，对长有胡杨苗的盆浇200mM NaCl水溶液2L，之后维持正常不含盐溶液的水25d。其中每种处理6个梯度，每个梯度三盆植物材料。在ABA、冷、脱水、短期盐胁迫处理1、3、6、9、12小时的时候，在长期盐胁迫5、10、15、20、25天的时候，干旱胁迫控制RSMC一个月后，取20-30片同一位置的叶子速冻于液氮中，然后再放置于-80℃保存材料。
取-80℃保存的材料在液氮条件下用研钵和杵研磨成粉末，并用CTAB法氯仿抽提提取胡杨叶片的总RNA，在操作过程的最后一步用DNA酶消化可能残留的DNA以免对实验结果产生干扰，并用Thermo NanoDrop2000测RNA的浓度，以及通过测OD260/OD280以及OD260/OD230两个值来检测RNA的纯度，用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA的质量，Agilent2100微流控芯片检测RNA是否降解，三种方法并用以获得高质量的RNA确保实验结果的准确性。每个处理每个梯度取1.8μg的RNA逆转录为cDNA，将得到的cDNA稀释8-10倍，保持终浓度的一致。
从拟南芥、水稻等研究中找到常用来作为内参基因的基因，以及已有的胡杨的转录组数据中，共挑出16个候选的内参基因，它们是：18S(18S核糖体RNA基因)、60S(60S核糖体蛋白)、Actin(肌动蛋白)、Cpn60β(60-KD伴侣蛋白β亚家族)、EF1α(延伸因子1α家族)、eIF-5A(真核翻译起始因子5A)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、GIIα(葡萄糖苷酶IIα亚家族)、HIS(组氨酸家族蛋白)、LIPL(类脂质运转蛋白)、LTP(脂质转移蛋白)、RA(羧化/加氧酶活化蛋白)、RP(核糖体L27e蛋白家族)、RPL17(核糖体蛋白L17)、TUB(微管蛋白)、UBQ(泛素蛋白家族)以及三个用于检测内参基因适用性的三个基因PePYL1(ABA受体蛋白1)、PeSCOF-1(锌指蛋白)、PeSCL7(植物特异性SC7转录因子)，对每个基因用Primer6软件设计特异性引物。对16个候选内参基因进行实时荧光定量分析(qRT-PCR)，20ul的反应体系含有10ul SuperRealPreMix Plus，1ul的sscDNA(对应约9ng的RNA)，2ul的ROX reference Dye，上下游各0.3uM的引物，反应条件为95℃5min，95℃15s60℃60s共40个循环，然后温度由40℃到100℃升温，每个温度下记录荧光值来获得溶解曲线，其中重复数为3。获得CT值，对得到的CT值进行离散性分析，分析结果如图3所示。16个内参基因PCR的特异性检测结果见图2，两端为Marker，片段大小如图2所示。16个候选的内参基因，18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF-5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32所示，三个用于检测内参基因适用性的三个目标基因PePYL1、PeSCOF-1和PeSCL7的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:33～SEQ ID NO:38所示。16个内参基因的信息如表1所示，按表1中的引物从上至下38个引物的序号分别为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:38。
表1.本发明中16个内参基因及三个目的基因的基因名、功能注释、引物序列、扩增长度、PCR效率
Figure BDA0000488184770000061
Figure BDA0000488184770000071
将得到的阈值(CT值)数据通过geNorm、NormFinder、BestKeeper三种软件进行表达量的稳定性分析，其中先将CT值的平均值对数转换后输入geNorm软件，通过M值的大小对16个基因的稳定性进行排序（结果如图4所示），M值越小，基因表达稳定性越好，排名越靠前。将对数转换未经过平均的三组CT值输入NormFinder分析stab值，并根据stab值的由小到大对对16个基因的稳定性进行1-16的排序（结果如表2所示）。BestKeeper能通过CV值得出稳定性排名并通过r2算出关联性排名（结果如表3所示）。将得到的四组排名用R软件的RankAggreg程序包进行加权平均聚合，得到16个基因的最终稳定性排序（结果如图5所示）。
表2用NormFinder软件对16个内参基因在六种逆境条件的适用性进行排序
Figure BDA0000488184770000072
Figure BDA0000488184770000081
表3用BestKeeper软件的CV值和r2值对16个内参基因在六种逆境条件的适用性进行排序
Figure BDA0000488184770000082
用鉴定出的排名靠前和靠后的单内参基因（鉴定结果见表4），以及排名靠前的内参基因的组合来对PePYL1、PeSCOF-1、PeSCL7三个基因进行表达量的分析，将得到的表达量的差异进行比较，实验表明使用排名靠前的内参基因比排名靠后的能得到更准确的结果。
表4鉴定和评价出的最适用（TR，Top-ranked reference gene）和最不适用（LR，Low-ranked reference gene）的内参基因
上述结果表明，通过选择不同的内参基因用于定量分析将会对实验结果产生巨大影响，本发明中鉴定出的合适内参基因的方法，提供了一种可用于指导植物基因表达量分析的技术。利用此方法将促进胡杨这一重要树种的抗逆机理的研究和培育抗逆林木树种的应用研究，同时该方法可用于任何一种已获得全基因组数据或EST数据信息的植物材料内参基因的鉴定和评价，不仅包括草本主粮作物水稻、小麦、玉米、大豆等，也包括造林木本植物诸如杨树、松树、柏树、杉木或者经济林木本植物如果树类苹果树、梨树、葡萄、橙子等内参基因的鉴定，对于推动木本植物的基础理论研究，揭示抗逆机理、生长发育等机制以及新品种培育具有重要意义。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Figure IDA0000488184860000011
Figure IDA0000488184860000031
Figure IDA0000488184860000041
Figure IDA0000488184860000051
Figure IDA0000488184860000061
Figure IDA0000488184860000071
Figure IDA0000488184860000081
Figure IDA0000488184860000111

Claims (9)

1.一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）确定目标植物种类和目标基因，并目标植物其进行前处理，提取目标植物的总RNA，反转录为cDNA作为PCR的为模板，选择多个在其它物种中常用的并在转录组中表达较稳定的多个内参基因，所述内参基因的数量大于等于9，设计特异性引物，进行实时荧光定量PCR反应，得到CT值；
（2）将所述CT值数据通过geNorm、NormFinder、BestKeeper三种软件分析其适用性，然后用R软件的RankAggreg程序包，将每个处理里得到的四组适用性排序数据进行加权平均聚合，得到所述多个基因的最终适用性排序。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：所述目标植物为草本粮食作物或木本植物，所述前处理为环境胁迫处理，为脱落酸处理、寒冷处理、脱水处理、干旱处理、短期盐胁迫处理或长期盐胁迫处理中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：所述目标植物为水稻、小麦、玉米、大豆、杨树、松树、柏树、杉木、苹果树、梨树、葡萄、橙子。
4.根据权利要求3所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：所述目标植物为胡杨。
5.根据权利要求1所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：所述步骤（1）具体为：确定目标植物为胡杨，对胡杨进行前处理，用CTAB法氯仿抽提提取胡杨叶片的总RNA，从拟南芥、水稻研究中找到常用来作为内参基因的基因，以及已有的胡杨的转录组数据中，共挑出16个候选的内参基因，分别为18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF-5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ，以及三个用于检测内参基因适用性的三个目标基因PePYL1、PeSCOF-1和PeSCL7，对每个所述目标基因用Primer6软件设计特异性引物，对16个候选内参基因进行实时荧光定量分析，20ul的反应体系含有10ul SuperReal PreMix Plus，1ul的sscDNA，对应约9ng的RNA，2ul的ROXreference Dye，上下游各0.3uM的引物，反应条件为95℃5min，95℃15s60℃60s共40个循环，然后温度由40℃到100℃升温，每个温度下记录荧光值来获得溶解曲线，其中重复数为3，得到CT值。
6.根据权利要求5所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：所述前处理包括如下步骤：
在每年的四月份取来自新疆维吾尔族自治区的胡杨仔苗，四月上旬种植于直径60cm高50cm的圆盆内，每盆3-5棵，土壤以沙土为主，含有少量蛭石和花卉营养土，每周浇两次水，待小苗生长3-4个月，即七月初或月末，苗高60～80cm的时候进行环境胁迫处理，所述环境胁迫处理方法为以下方法中的一种或几种：
A、脱落酸处理：对胡杨小苗叶面喷洒200mM ABA溶液，溶液由ABA固体粉末配制而成，处理时间为12个小时，未喷洒ABA溶液的植株作为对照；
B、冷处理，将胡杨小苗连盆放在4-6℃的环境下，室温约25℃度下的植株作为对照，保持对照和处理的光照一致，处理时间12h；
C、脱水处理，从土壤中避免损伤根的前提下取出小苗，洗尽根部泥土直接裸露放置于湿度70%、温度25℃的环境下，正常生长的植株作为对照，处理时间12h；
D、干旱处理；通过浇水量控制相对土壤水分(RSMC)含量75%-10%，呈六个梯度，一直充分浇水的植株RSMC约75%-70%的作为对照，处理时间为一个月；
E、短期盐处理，将土壤中移出未伤根的胡杨苗洗尽根部泥土后水培于含有350mM NaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作为对照，每隔6h换一次水避免根部缺氧，处理时间12h；
F、长期盐胁迫，对长有胡杨苗的盆浇200mM NaCl水溶液2L，之后维持正常不含盐溶液的水25d；
其中，每种处理6个梯度，每个梯度三盆植物材料；在ABA、冷、脱水、短期盐胁迫处理1、3、6、9、12小时的时候，在长期盐胁迫5、10、15、20、25天的时候，干旱胁迫控制RSMC一个月后，取20-30片同一位置的叶子速冻于液氮中，然后再放置于-80℃保存材料。
7.根据权利要求6所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：在提提取胡杨叶片的总RNA操作过程的最后一步用DNA酶消化，用Thermo NanoDrop2000测RNA的浓度，通过测OD260/OD280以及OD260/OD230两个值来检测RNA的纯度，用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA的质量，Agilent2100微流控芯片检测RNA是否降解，每个处理每个梯度取1.8μg的RNA逆转录为cDNA，将得到的cDNA稀释8-10倍，保持终浓度的一致。
8.根据权利要求7所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：所述步骤（2）具体包括如下步骤：先将CT值的平均值对数转换后输入geNorm软件，通过M值的大小对16个基因的稳定性进行排序，将对数转换未经过平均的三组CT值输入NormFinder分析stab值，并根据stab值的由小到大对对16个基因的稳定性进行1-16的排序，BestKeeper通过CV值得出稳定性排名并通过r2算出关联性排名，将得到的四组排名用R软件的RankAggreg程序包进行加权平均聚合，得到16个基因的最终稳定性排序，其中需要使用的内参基因的数目由geNorm软件算出的PV值进行确定。
9.根据权利要求5所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：16个候选的内参基因，18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF-5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQID NO:32所示，三个用于检测内参基因适用性的三个目标基因PePYL1、PeSCOF-1和PeSCL7的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:38所示。
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