CN112159864A

CN112159864A - 葡萄的qRT-PCR内参基因及其应用

Info

Publication number: CN112159864A
Application number: CN202011062074.XA
Authority: CN
Inventors: 郭大龙; 韦同路; 余义和; 裴茂松; 刘海楠; 郑玉萍; 陈苏丹
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2021-01-01

Abstract

本发明公开了葡萄的qRT‑PCR内参基因及其应用。本发明根据前期的转录组数据通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个分析软件对十个候选内参基因(Actin、18s‑rRNA、GAPDH、VvEF1‑γ、VvEF1‑α、EF1‑α、Ubiquitin、RRM1、PPR2和MRE11)在七个不同的葡萄品种的果实、叶、卷须以及九个不同发育阶段的‘巨峰’果实样品中的稳定性进行了分析。结果表明，针对上述葡萄样品最佳内参基因数目为两个，不同的样品最优内参基因的选择不同，果实中的最佳内参基因组合为VvEF1‑γ和18s‑rRNA，卷须为EF1‑α和Actin，果实发育阶段为EF1‑α和VvEF1‑α。本发明可为相关研究者在葡萄中开展qRT‑PCR工作时提供重要的参考。

Description

葡萄的qRT-PCR内参基因及其应用

技术领域

本发明涉及葡萄的qRT-PCR内参基因及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

葡萄是世界范围内广泛种植的最重要的果树之一。葡萄的果实既可以鲜食，也可以用于制作葡萄酒和葡萄干，因此具有很高的营养价值和经济价值。目前，相关研究者已经发现和培育了大量葡萄新品种，并利用这些种质资源开展了大量科研工作。关于葡萄重要农艺性状分子机理及相关功能基因的研究极大地促进了葡萄产业的发展。

在开展葡萄基础研究的过程中，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术发挥了重要作用，其具有反应时间短，重复性好和灵敏度高等诸多优点。但是，qRT-PCR结果也会受到多种因素的影响，例如：RNA质量，样品差异，设备误差，重复性，操作误差等。因此，在进行qRT-PCR时必须用内参基因来标准化和校准实验结果，内参基因的好坏直接影响qRT-PCR结果。一个好的内参基因必须能够持续稳定表达，并且不受样品和其他环境因素的影响。

目前，已经被鉴定并广泛应用于植物中的内参基因主要是管家基因(house-keeping genes)，例如：Actin，Ubiquitin，18s-rRNA(18s ribosomal RNA)，GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)，EF1-α/γ(elongation factor 1-α/γ)等。然而，最近的研究表明，这些广泛应用的内参基因在某些特定的条件下表达并不稳定。因此，在开展一些特定的实验时，有必要选择特定的内参基因；在检测不同样品时，内参基因的选择也不尽相同。在一些果树品种(如：桃、苹果、草莓、火龙果等)中已经开始了一些相关的工作，结果均证明在检测不同的样品(如：不同的品种、组织或发育阶段)时，最优内参基因的选择也是有差异的。但是在葡萄中，关于内参基因的研究还较为匮乏，且葡萄的品种繁多，近年来也有大量的新品种被选育出来，这些都导致葡萄中内参基因的选择存在一定的盲目性，目前还没有绝对理想的内参基因可供选择。因此，在葡萄中评价常用的内参基因的稳定性，发掘和筛选更理想的内参基因尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一系列在葡萄不同组织中进行qRT-PCR时的最佳内参基因：当qRT-PCR检测葡萄果实组织基因转录表达水平时，所述内参基因为VvEF1-γ基因和18s-rRNA基因；当qRT-PCR检测葡萄卷须组织基因转录表达水平时，所述内参基因为EF1-α基因和Actin基因；当qRT-PCR检测葡萄果实发育阶段组织基因转录表达水平时，所述内参基因为EF1-α基因和VvEF1-α基因。

其次，本发明的目的是提供VvEF1-γ基因和18s-rRNA基因、EF1-α基因和Actin基因、EF1-α基因和VvEF1-α基因作为内参基因，分别在qRT-PCR检测葡萄果实、卷须、果实发育阶段组织基因转录表达水平中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了葡萄qRT-PCR内参基因，当qRT-PCR检测葡萄果实组织基因转录表达水平时，所述内参基因为VvEF1-γ基因和18s-rRNA基因；当qRT-PCR检测葡萄卷须组织基因转录表达水平时，所述内参基因为EF1-α基因和Actin基因；当qRT-PCR检测葡萄果实发育阶段组织基因转录表达水平时，所述内参基因为EF1-α基因和VvEF1-α基因；所述VvEF1-γ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；所述18s-rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述EF1-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；所述Actin基因的核苷酸序列如SEQID NO.31所示；所述VvEF1-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

本发明提供了VvEF1-γ基因和18s-rRNA基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄果实组织基因转录表达水平中的应用；

优选的，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示的反向引物对VvEF1-γ基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的反向引物对18s-rRNA基因进行特异性扩增。

本发明提供了EF1-α基因和Actin基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄卷须组织基因转录表达水平中的应用；

优选的，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示的反向引物对EF1-α基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的反向引物对Actin基因进行特异性扩增。

本发明提供了EF1-α基因和VvEF1-α基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄果实发育阶段基因转录表达水平中的应用；

优选的，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示的反向引物对EF1-α基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的反向引物对VvEF1-α基因进行特异性扩增。

本发明的有益效果在于：

本发明根据前期的转录组数据，并通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个分析软件对十个候选内参基因(Actin、18s-rRNA、GAPDH、VvEF1-γ、VvEF1-α、EF1-α、Ubiquitin、RRM1、PPR2和MRE11)在七个不同的葡萄品种的果实、叶、卷须以及九个不同发育阶段的‘巨峰’果实样品中的稳定性进行了分析。结果表明本实验中所用样品最佳内参基因数目为两个，不同的样品最优内参基因的选择也是不同的，果实中的最佳内参基因组合为VvEF1-γ和18s-rRNA，叶为RRM1和EF1-α，卷须为EF1-α和Actin，果实发育阶段为EF1-α和VvEF1-α，当包含葡萄所有组织样品时最佳内参基因组合为RRM1和Ubiquitin。本研究可为相关研究者在葡萄中开展qRT-PCR工作时提供重要的参考。

附图说明

图1是十个候选内参基因在所有样品中的Ct值盒形图；

图中，部横线代表中位数，上下竖线表示最大值和最小值，黑色圆点表示异常值。

图2是五个样品组合Pairwise variation(V)分析结果；

图中，V值可表示样品的最佳内参基因数目，若Vn/n+1<0.15，则最佳内参基因数目为n个。

图3.是十个候选内参基因geNorm分析结果；

图中，A-E：各内参基因在果实(A)、叶(B)、卷须(C)、不同发育阶段(D)和总样品(E)中的平均表达稳定性(M)，M值越小表示稳定性越高。

图4是十个候选内参基因NormFinder分析结果；

Stability value值越低，表示该基因稳定性越高。

图5是十个候选内参基因BestKeeper分析结果；

图中表示内参基因在不同样品中的标准偏差(standard deviation，SD)，SD值越小表示稳定性越高。

图6是用不同的内参基因检测基因VIT_16s0098g00410在三个葡萄品种果实中的表达量；

图中，V1，V2，V3表示三个不同的葡萄品种。

图7是用不同的内参基因检测基因VIT_16s0098g00410在三个葡萄品种卷须中的表达量；

图中，V1，V2，V3表示三个不同的葡萄品种。

图8是用不同的内参基因检测基因VIT_16s0098g00160在果实四个发育阶段的表达量。

图中，S1-S4表示葡萄四个发育阶段。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。本发明中，七个葡萄品种的果实、叶和卷须(玫瑰香，刺葡萄，京亚，美人指，郑州早红，蛇龙珠，赤霞珠)，以及‘巨峰’葡萄九个不同发育阶段的果实，材料均采集于中国科学院郑州果树研究所。‘巨峰’和‘峰早’(‘巨峰’的早熟芽变品种)不同发育阶段的果实采集于河南科技大学实验基地，‘巨峰’共采集五个发育阶段，分别用K1-K5表示；‘峰早’共采集四个发育阶段，分别用F1-F4表示。所有采集的样品用锡纸包好后立即置于液氮中速冻，最后保存于-80℃冰箱中。

实施例1：候选内参基因

根据前期转录组数据，本研究共分析和鉴定了十个候选内参基因(表1)，分别为：Actin，18s-rRNA，GAPDH，VvEF1-α，VvEF1-γ，EF1-α，Ubiquitin以及三个新发现的候选内参基因RRM1(VIT_07s0005g03980)，PPR2(VIT_11s0065g00380)和MRE11(VIT_19s0014g03680)，其核苷酸序列见序列表。RRM1包含RNA识别motif，编码不均一核糖核蛋白；PPR2编码一个包含重复三角状五肽的蛋白；MRE11编码双链断裂修复蛋白。RRM1和PPR2的功能未知，在葡萄和其他物种中均未得到鉴定。MRE11在拟南芥中的同源基因参与细胞周期的激活以及双链DNA的修复。

其中，VvEF1-γ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；18s-rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；EF1-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；Actin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；VvEF1-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

实施例2：候选内参基因引物设计

用Primer 5软件设计qRT-PCR引物，引物核苷酸序列见表1。

其中，用于特异性扩增VvEF1-γ基因的引物如下：

F:CAAGAGAAACCATCCCTAGCTG(SEQ ID NO.16)

R:TCAATCTGTCTAGGAAAGGAAG(SEQ ID NO.17)

用于特异性扩增18s-rRNA基因的引物如下：

F:CATAAACGATGCCGACCAG(SEQ ID NO.12)

R:TTCAGCCTTGCGACCATACT(SEQ ID NO.13)

用于特异性扩增EF1-α基因的引物如下：

F:GAACTGGGTGCTTGATAGGC(SEQ ID NO.20)

R:AACCAAAATATCCGGAGTAAAAGA(SEQ ID NO.21)

用于特异性扩增Actin基因的引物如下：

F:CATTGTGAGCAACTGGGATG(SEQ ID NO.10)

R:GATTAGCCTTCGGGTTGAGA(SEQ ID NO.11)

用于特异性扩增VvEF1-α基因的引物如下：

F:GAACGTTGCTGTGAAGGATCTC(SEQ ID NO.18)

R:CGCCTGTCAACCTTGGTCATGA(SEQ ID NO.19)

表1.十个候选内参基因及其引物序列

实施例3：候选内参基因稳定性分析

1、总RNA提取和cDNA合成

采集的样品(葡萄的果实、叶片、卷须)用液氮研磨成粉末状。总RNA的提取采用多糖多酚总RNA提取试剂盒(TIANGEN，北京)，具体方法参考说明书。提取的RNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测质量和完整性。以提取的总RNA为模板，用

第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme，南京)合成cDNA，具体方法参照说明书，合成的cDNA保存于-20℃冰箱中。

2、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

qRT-PCR反应总体系为10μL，包含5μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix(全式金生物，北京)，1μL cDNA，0.3μL正向和反向引物(十个候选内参基因及其引物见表1)和3.4μL ddH₂O，每个样品三个技术重复。qRT-PCR反应在CFX96 Touch real-time PCR仪器(Bio-Rad，美国)上进行，程序包括94℃反应30s(一个循环)，94℃反应5s然后60℃反应30s(40个循环)。Ct值在反应结束后由仪器自动获得。

3、候选内参基因稳定性分析

本研究采用三个分析软件分析内参基因的稳定性，分别是geNorm、NormFinder和BestKeeper。首先基于qRT-PCR获得的各个样品的Ct值计算出2^-ΔCt值，该值直接作为geNorm和NormFinder的输入数据。geNorm可计算每个基因的平均表达稳定性(M值)，M值越低表示该基因的稳定性越高。此外，geNorm还能够计算pairwise variation(V)值，该值可表示理想的参考基因的数目，若Vn/Vn+1<0.15，则该样品理想的参考基因数目为n。NormFinder也能够计算各个参考基因的稳定性值(stability value)，stability value值越低，表示该基因稳定性越高。对于BestKeeper，平均Ct值直接作为输入数据，软件可计算出各个参考基因的标准偏差(SD)，变异系数(CV)和相关系数(r)，SD值越低表示该内参基因越稳定。

ComprFinder可将不同分析软件的分析结果进行整合，计算出每个基因的综合分值(score)，并将score值从低到高进行排名即为最佳内参基因的稳定性综合排名。本研究采用ComprFinder对三个分析软件的分析结果进行整合，最终得出十个内参基因在不同样品中的稳定性综合排名，排名前两位的作为该样品的最佳内参基因组合。

结果如下：

用qRT-PCR检测十个候选内参基因在不同样品中的表达情况，用盒形图统计Ct值，结果表明18s-rRNA的Ct值最低，PPR2和Actin的Ct值较高，各基因在不同样品中的Ct值也存在较大变化(图1)。

分别用三个不同的分析软件对这十个候选内参基因在不同样品中的稳定性进行分析。通过geNorm分析计算pairwise variation(V)值，所有样品的V2/3值均小于0.15，表明本研究中所用样品的最优内参基因数目均为两个(图2)。

geNorm、NormFinder和BestKeeper均对这十个基因在不同样品中的稳定性进行了分析和排名(图3，图4，图5)，不同的软件分析结果存在一定差异。因此，为综合三个软件的分析结果，我们用ComprFinder对分析结果进行整合，得出了十个候选内参基因在不同样品中的综合稳定性排名(表2)。结果表明，在葡萄不同样品中开展qRT-PCR时所用的最佳内参基因也是不同的，果实中为VvEF1-γ和18s-rRNA，叶中为RRM1和EF1-α，卷须中为EF1-α和Actin，果实发育阶段为EF1-α和VvEF1-α，当检测所有样品时为RRM1和Ubiquitin。今后在葡萄中开展qRT-PCR实验时可借鉴该结论选择最佳的内参基因，从而获得更理想的qRT-PCR结果。本发明新鉴定的内参基因RRM1在葡萄不同样品中具有较好的稳定性，可作为一个新的内参基因应用于葡萄基础研究中。

表2.十个候选内参基因综合排名ComprFinder分析结果.

试验例1：VvEF1-γ基因和18s-rRNA基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄果实组织基因表达水平中的应用

本试验例检测基因VIT_16s0098g00410在三种不同葡萄品种的果实组织中的表达量。样品选用三种不同葡萄品种(玫瑰香，刺葡萄，美人指)的果实组织(V1，V2，V3)，用市售试剂盒提取RNA并反转录为cDNA，作为qRT-PCR反应的模板。VIT_16s0098g00410基因引物序列为F：AAGAATCAGACCATGCTACACC，R：GTGTTAGACGGCAATCATCTTG，引物由公司合成。qRT-PCR方法与试验例1相同。

qRT-PCR反应总体系为10μL，包含5μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix(全式金生物，北京)，1μL cDNA，0.3μL正向和反向引物和3.4μL ddH₂O，每个样品三个重复。

qRT-PCR反应在CFX96 Touch real-time PCR仪器(Bio-Rad，美国)上进行，程序包括94℃反应30s(一个循环)，94℃反应5s然后60℃反应30s(40个循环)。

Ct值在反应结束后由仪器自动获得。相对表达量的计算采用2^-△△Ct法。分别用VvEF1-α和18s-rRNA两个基因作为内参基因计算相对表达量，并计算两个基因同时作为内参基因时的表达量。

结果如图6所示，在果实中，VIT_16s0098g00410基因在葡萄品种V3中的表达量最高，在V1和V2中的表达量较低。当分别以VvEF1-γ和18s-rRNA作为内参基因计算表达量时，结果差异不大，整体趋势与VvEF1-γ+18s-rRNA作为内参基因的结果一致，表明VvEF1-γ和18s-rRNA可作为内参基因检测葡萄果实组织基因表达水平。

试验例2：试验例4：Actin基因和EF1-α基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄卷须组织基因表达水平中的应用。

本试验例检测基因VIT_16s0098g00410在三种不同葡萄品种的卷须组织中的表达量。样品选用三种不同葡萄品种(玫瑰香，刺葡萄，美人指)的卷须组织(V1，V2，V3)，用市售试剂盒提取RNA并反转录为cDNA，作为qRT-PCR反应的模板。VIT_16s0098g00410基因引物序列为F：AAGAATCAGACCATGCTACACC，R：GTGTTAGACGGCAATCATCTTG，引物由公司合成。qRT-PCR方法与试验例1相同。

Ct值在反应结束后由仪器自动获得。相对表达量的计算采用2^-△△Ct法。分别用Actin和EF1-α两个基因作为内参基因计算相对表达量，并计算两个基因同时作为内参基因时的表达量。

结果如图7所示，在卷须中，VIT_16s0098g00410基因在葡萄品种V1中的表达量最高，在V2和V3中的表达量较低。当分别以Actin和EF1-α作为内参基因计算表达量时，结果差异不大，整体趋势与Actin+EF1-α作为内参基因的结果一致，表明Actin和EF1-α可作为内参基因检测葡萄卷须组织基因表达水平。

试验例3：EF1-α基因和VvEF1-α基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄果实发育阶段基因表达水平中的应用

本试验例检测基因VIT_16s0098g00160在果实四个发育阶段的表达量。样品选用‘巨峰’葡萄四个发育阶段的果实(S1，S2，S3，S4)，用市售试剂盒提取RNA并反转录为cDNA，作为qRT-PCR反应的模板。基因VIT_16s0098g00160引物序列(F：ACCATGCTAGAGTTGCCAGT，R：TTTCGAAGCTGTCTCGCAAG)由公司合成。

Ct值在反应结束后由仪器自动获得。相对表达量的计算采用2^-△△Ct法。分别用EF1-α和VvEF1-α两个基因作为内参基因计算相对表达量，并计算两个基因同时作为内参基因时的表达量。

结果如图8所示，VIT_16s0098g00160基因在葡萄果实S1，S2，S3三个发育阶段的表达量逐渐升高，在S4阶段显著下降。当分别以EF1-α和VvEF1-α作为内参基因计算表达量时，结果差异不大，整体趋势与EF1-α+VvEF1-α作为内参基因的结果一致，表明EF1-α和VvEF1-α可作为内参基因检测葡萄果实发育相关基因表达水平。

<110> 河南科技大学

<120> 葡萄的qRT-PCR内参基因及其应用

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<221> RRM1

<400> 1

atggactcag acgaaggaaa gctatttgta ggaggcatac catgggacac tacagaggag 60

aagctcaaag agtactttaa ccagtacggg gacgtcacgc agacagttat tatgcgggac 120

aagaccactg gtcgacccag aggctttggc tttgtggtat tcgcagatcc ttccgttctc 180

gatgcagttc ttcaggagaa gcacaccatt gatgggagaa cggtggaggc taaaagggct 240

ttatcaagag aagaacagca cacctccaga cctggaaatt ctaatactgg cagaagctca 300

tcaggcatgg gaggaaattt taaaaccaaa aagatatttg ttggagggtt gccttccacc 360

cttactgagg aaggatttcg tcagtacttt gagacttatg gtcatgtaac ggatgtagta 420

gtaatgtatg accaaaatac tcaacgtccc cgtgggtttg gattcatatc ctttgacact 480

gaagatgcag ttgatcgagt tttacataag accttccatg atttgaatgg taagcttgta 540

gaggtgaaac gagccctccc taaagatgca aatcctggtg gtggtggccg tagtggaggc 600

taccaaggct atggtgcttc tggtgctaat acaagtgcat atgaaggtag aatggatggt 660

aatagattca tgccacctca gaccactggt ggtggtttcc caccatattc tggctatggt 720

gcaccaggtt atggctatgg agcagcaaat agtgctgttg gttatggtgg ttatgggagt 780

tatggtgttg gtggttatgg aagtgccaat actggatttg gcggtcctgc tggggcgtat 840

ggaaacccga atgctcctaa tgctggttat gtaagtggcc cacctggtgc tatgaaaagc 900

caatggaaca accaaactcc ttctggatat ggtgcttcag gctatggttc aaatgcagcc 960

tatggagcta caggtccttg gaatgctccg ggtggtgctg gtgtttctgg accaatgggt 1020

caatctccaa gtggcgcttc tggatatgga agtcaaggtt ttggatatgg taactatggt 1080

gggagtgatg gttcttattc tgggggatat ggggctgctg gtggccgtgc tggaagtgca 1140

cctagttctg gtggtagtgc tagcggagaa caggggacag gtggtggcta catggggagt 1200

ggctatggtg atgccaatgg aaatcaaggg tattcaaatg ctggctggag gtctgaccct 1260

tcacaaggtg ctgctggtta tggtggtggc tatggtggtc agtga 1305

<210> 2

<211> 1272

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<221> PPR2

<400> 2

atggaagctc tccctctcat cactcctctc tgcctcattg ggagccacaa aacgcagcgt 60

tttagggttt ctctccatca aaactactcc ccaaataggg ctttagctcg caagttattc 120

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<210> 3

<211> 2196

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<221> MRE11

<400> 3

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caaaggtttg ggcaaaagta tgtgggcaag gttgcaaatc cccaagatat tcttattttc 1200

acaaaggctt caagaaaagg tcgtagtgaa gccaaaattg atgactctga gcggcttcgc 1260

ccagaagaat tgaatcaaca aaatatagaa gccttagttg ctgagaataa tctgaaaatg 1320

gagatccttc cagtcaatga tttggatgtt gcattgcaca attttgtcaa caaagatgac 1380

aaaatggctt tctattcttg tgttcaatat aatctggaag agacacgtag taaaattgct 1440

cgtgattcag atcctttaaa gtttgaagag gaagatttaa ttcttaaagt tggagagtgc 1500

ttggaggaac gggtcaagga aaggtcagtg cactcaaagg aaaccccaca gttcatgtca 1560

agtgctcggt cattggagaa tatcagaagt aaaggtactg ctgaaactgg aagtgcagtt 1620

tcctttagtg atgatgaaga ccccacccag ttatctgggt caaaatctgc cactaggggc 1680

agaaaagggt catcagcaac ctttaagtcc tcccatgatg cttctgaaca aggtaaaggt 1740

aaatcttcta caagaggaag gggcaggggc aggggcaggg ggaggagctc cagtaccttg 1800

aagcagatga cacttgattc aagtctggga ttccgccatt ctgaaagatc tgcatcagtt 1860

gctgcgacag ctgctgttcg aaaccttgct gatgatgagg acaatgtgga gtccagttca 1920

agcgatgaag cagggaaata tggaattaat gaggttgatg acagctcgga aaatgatgag 1980

aatctccaag gcaaaggacg caaaagagct gctccaaggg gaaggggtag aggtgctact 2040

acatcctcta agcgaggaag gaaatcagat tccacttcaa ttcagagaat gcttatgaac 2100

aaagatgatg atgatgatga tgaggatgac atgtcaaaga gattaaataa gcctcagcct 2160

cgggtaacaa ggaattatgg tgctctaaga aggtaa 2196

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RRM1上游引物F

<400> 4

atggactcag acgaaggaaa gc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RRM1下游引物R

<400> 5

cgaataccac aaagccaaag c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> PPR2上游引物F

<400> 6

ttctgaggga tgttggtctt g 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> PPR2下游引物R

<400> 7

gagcccggat gttaaatgta gt 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> MRE11上游引物F

<400> 8

gcttgttgct acggattgcc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> MRE11下游引物R

<400> 9

ttgagggtat aacgacggag g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Actin上游引物F

<400> 10

cattgtgagc aactgggatg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Actin下游引物R

<400> 11

gattagcctt cgggttgaga 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 18s-rRNA上游引物F

<400> 12

cataaacgat gccgaccag 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 18s-rRNA下游引物R

<400> 13

ttcagccttg cgaccatact 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> GAPDH上游引物F

<400> 14

tggctttccg tgttcctact 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> GAPDH下游引物R

<400> 15

tccctctgac tcctccttga 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvEF1-γ上游引物F

<400> 16

caagagaaac catccctagc tg 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvEF1-γ下游引物R

<400> 17

tcaatctgtc taggaaagga ag 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvEF1-α上游引物F

<400> 18

gaacgttgct gtgaaggatc tc 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvEF1-α下游引物R

<400> 19

cgcctgtcaa ccttggtcat ga 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> EF1-α上游引物F

<400> 20

gaactgggtg cttgataggc 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> EF1-α下游引物R

<400> 21

aaccaaaata tccggagtaa aaga 24

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Ubiquitin上游引物F

<400> 22

gtggtattat tgagccatcc tt 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Ubiquitin下游引物R

<400> 23

aacctccaat ccagtcatct ac 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 基因VIT_16s0098g00410上游引物F

<400> 24

aagaatcaga ccatgctaca cc 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 基因VIT_16s0098g00410下游引物R

<400> 25

gtgttagacg gcaatcatct tg 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 基因VIT_16s0098g00160上游引物F

<400> 26

accatgctag agttgccagt 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 基因VIT_16s0098g00160下游引物R

<400> 27

tttcgaagct gtctcgcaag 20

<210> 28

<211> 1302

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<221> VvEF1-γ

<400> 28

atggctctgg tcttgcatgc agggaaaacg aacaaaaatg cttacaagac actcattgct 60

gcggagtaca gcggtatcaa agttgaactg gttcagaact ttgagatggg cgtctccaac 120

aagactcccg agttccttaa gatgaaccct atcgggaagg ttcccgtgtt ggaaacacct 180

gatggtcctg tatttgagag caatgccata gcgcgttacg tcactcgatt gaaggctgac 240

aacccccttt atggctcttc tccaattgaa tatggccaca ttgagcagtg gattgatttt 300

gcatcattgg agattgatgc taatattggg cattggttta gaccaaggat tggacgtgct 360

gtataccttc caccgtttga ggaggctgca attgctgcat tgaagagagc attaggtgct 420

ttgaacacac atcttgcttc aaacactttc ctggtggggc attctgtcac cctggctgac 480

attgtcatga catgcaattt gtatatggga ttcagtaagc tcatgactaa gagctttacc 540

tcggagttcc ctcatgttga gagatacttc tggaccatgg ttaatcaacc aaatttcagc 600

aagatcttgg gtgaggtaaa gcaaactgca tcagtcccac ctgtttcgtc tgcaaagaag 660

cctgccctgc caaaagaaca tgccaaacca aagcacaagg atgaaccaaa gaaagaagtc 720

aagaaggagc cagcaaagcc caaagaggct cctgttgggg aagaggaaga agcaccaaaa 780

cccaaaccta agaatcctct tgatctgctg cccccaagta agatgattct ggatgaatgg 840

aagagactct actcaaatac caagaccaat ttccgtgagg ttgcaattaa aggattctgg 900

gacatgtacg atcccgaggg atactctctt tggttctgtg attacaaata caatgacgag 960

aataccgtct cattcgtaac tctgaacaag gttggtggat tccttcagcg gatggatctg 1020

gcacgcaagt atgcttttgg gaagatgctt gtaatcggct cagaggcccc attcaaggtg 1080

aaggggctgt ggcttttccg cgggcaagag atacctcaat ttataattga tgagtgctat 1140

gacatggaac tctatgagtg gaagaaggtt gacatctcgg atgaggccca aaaggagcgt 1200

gtgaatcaga tgatagaaga tcaggagcct tttgagggag aggctcttct ggatgccaag 1260

tgcttcaaaa aatgggggaa aaatgtgaga aaaagaaaat ag 1302

<210> 29

<211> 234

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<221> 18s-rRNA

<400> 29

atgaacaaga aggaaaatgg aactattgga ttttttgact cgcccccggc tacgtgtcct 60

ttggaccctt cgcccgcccg ccaccagtgg aagcaagcta gccccctatg tttgttggtt 120

gggggaagag ggcatttcca tcgcgaagga ttcaatccag ccacaggttc ccctacggct 180

accttgttac gacttcaccc cagtcgaaga ccccaccgtg gtatgcgcca ataa 234

<210> 30

<211> 1557

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<221> EF1-α

<400> 30

atggatcctc tacttaatgt caagatggag gataaaggtt tgaggaatat gacagaacca 60

ccttttgttc caagagagaa gctccttgag aagcaacgat ttttccagca ggtccataaa 120

cacacgtacc tgaaaggacg aatggacaag atcacctcgg ttgccattcc tgctgctctg 180

gcggctgctt ctgtagctct tattgaatcc acaatgggta aagagaaggt tcacatcaac 240

attgtcgtca ttggccatgt cgactctggc aagtcgacta ccactggtca cttgatctac 300

aagcttggag gtattgacaa gcgtgtgatt gagaggtttg aaaaggaagc ggctgagatg 360

aacaagaggt cattcaagta tgcttgggtg ttggacaagc tgaaggctga gcgtgaacgt 420

ggtatcacca ttgatattgc cttgtggaag tttgaaacca ccaggtacta ctgcactgtt 480

attgatgctc ctggccatcg ggacttcatc aagaacatga ttactggtac ctcacaggca 540

gattgtgctg tcctcattat tgactccacc actggtggtt ttgaagctgg tatctccaag 600

gatggacaaa cccgtgagca tgcactactt gctttcaccc ttggtgtgaa gcagatgatt 660

tgctgctgta acaagatgga tgccacaaca cccaagtact ccaaggcaag gtacgatgaa 720

atcgtgaagg aagtttcttc ctacctgaag aaggttggat acaaccctga taagattcca 780

tttgtcccca tctctggctt tgagggtgac aatatgatag agaggtctac caaccttgac 840

tggtacaagg gcccaactct tcttgaggcc ctggacatga tcaatgagcc caagaggccc 900

acagacaagc cactgcgact ccctcttcag gacgtgtaca agattggtgg gattggaact 960

gtcccagtgg gacgtgtgga gactggtgtc ctgaagcccg gtatggtggt gacctttggc 1020

ccctctggac tgacaactga agtcaagtct gttgagatgc accatgagtc tctcccagag 1080

gctttgcctg gtgacaatgt tggcttcaat gtgaagaacg ttgctgtgaa ggatctcaag 1140

cgtgggtttg ttgcctccaa ctccaaggat gaccctgcta aggaggcagc caacttcacc 1200

tcccaggtca tcatcatgaa ccacccgggt cagatcggaa atggctatgc ccctgttctg 1260

gactgccaca cctcccacat tgctgttaag tttgctgaga tactgaccaa gattgacagg 1320

cgatctggca aggagcttga gaaggagccc aagttcttga agaatggtga tgcagggttt 1380

gttaagatga ttccaaccaa gcccatggtg gtggagactt tctccgagta tcccccactt 1440

ggtcgatttg ctgttcgtga catgcgtcag actgttgctg ttggagtcat caagagcgtg 1500

gagaagaagg atccatctgg agccaaggtc accaagtctg cagccaagaa gaagtga 1557

<210> 31

<211> 1131

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<221> Actin

<400> 31

atggcagaag aagatattca gccacttgtc tgcgataatg gtaccggaat ggttaaggcc 60

ggatttgcag gagatgatgc tccaagggct gtgtttccta gtattgtggg tcgtccacgg 120

cacactggtg tgatggttgg gatgggccag aaagatgcat atgtggggga tgaggctcag 180

tccaagcgtg gtatattaac tctgaaatac ccaattgagc atggcattgt gagcaactgg 240

gatgacatgg agaagatatg gcatcatacc ttctacaatg aactcagagt ggctccggaa 300

gaacacccag ttctacttac tgaagctcct ctcaacccaa aggctaatcg tgaaaaaatg 360

acccaaatca tgtttgaaac cttcaatgcc cctgctatgt atgttgccat ccaggctgtt 420

ctttccctct atgccagtgg acgtacaact ggtattgttc tggactctgg agatggtgtc 480

agtcacactg tccccatcta tgagggatat gctcttccac atgctatcct acgtcttgac 540

ctggctggtc gtgatctcac tgatgcactt atgaaaatcc tgactgagcg tggctactcc 600

ttcaccacca cagctgagcg cgaaattgtg agggacgtaa aggagaagtt ggcatacatt 660

gcccttgact acgaacagga gctggagaca gccaaaacta gttcctctgt tgagaagagc 720

tatgagttgc ctgatggaca gatgatcacc attggtgctg agcgtttccg atgcccagaa 780

gtcctgttcc aaccatccat gattggaatg gaggctgcag gcattcatga aactacttac 840

aactccatca tgaagtgtga tgttgatatc agaaaagatc tatatggaaa cattgtcctc 900

agtggtggat caaccatgtt cccaggcatt gcagacagga tgagcaagga aatcactgca 960

ttagccccaa gcagcatgaa gatcaaggtg gtggctcctc ctgagaggaa gtatagcgta 1020

tggattggag gctccatctt agcatcactc agcactttcc agcagatgtg gatagcaaag 1080

gcagagtatg atgaatctgg gccatctatt gtgcatagga aatgcttcta a 1131

<210> 32

<211> 1344

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<221> VvEF1-α

<400> 32

atgggtaagg agaaggttca catcaacatt gtcgtcattg gccatgtcga ctctggcaag 60

tcgaccacca ctggtcactt gatctacaag cttggaggta ttgacaagcg tgttatcgag 120

aggtttgaaa aggaggcagc tgaaatgaac aagcggtcct tcaagtatgc ctgggtgttg 180

gacaaactga aggctgagcg tgaacgtggt atcaccattg atattgcctt gtggaagttt 240

gagaccacca ggtactactg cactgttatt gatgctcctg gtcatcggga cttcatcaag 300

aacatgatta ctggtacctc acaggcagac tgtgctgttc tcattattga ttccaccact 360

ggtggttttg aagccggtat ctccaaggat ggacaaaccc gtgagcatgc actgcttgct 420

ttcacccttg gtgtgaagca gatgatttgc tgctgtaaca agatggatgc cacaacacca 480

aagtactcca aggcaaggta cgatgaaatc gtgaaggaag tttcttccta cctgaagaag 540

gttggataca accctgataa gattccattt gtccccatct ccggctttga gggcgacaat 600

atgatagaga ggtctaccaa ccttgactgg tacaagggcc caactcttct tgaggccctg 660

gacatgatca atgagcccaa gaggcccaca gacaagccac tgcgactccc tcttcaggac 720

gtgtacaaga ttggtgggat tggaactgtc ccagtgggac gtgtggagac tggtgtcctg 780

aagcccggta tggtggtgac ctttggcccc tctggactga caactgaagt caagtctgtt 840

gagatgcacc atgagtctct cccagaggct ttgcctggtg acaatgttgg cttcaacgtg 900

aagaacgttg ctgtgaagga tctcaagcgt gggtttgttg cctcaaactc caaggatgac 960

cctgctaagg aggcagccaa cttcacctcc caggtcatca tcatgaacca cccgggtcag 1020

atcggaaatg gctatgcccc tgttctggac tgccacacct cccacattgc tgttaagttt 1080

gctgagatac tgaccaagat tgacaggcga tctggcaagg agcttgagaa agagcccaag 1140

ttcttgaaga atggtgatgc agggtttgtt aagatgattc ccaccaagcc catggtggtg 1200

gagactttct ccgagtatcc cccacttggt cgttttgctg ttcgtgacat gcgtcaaact 1260

gttgctgttg gagtcatcaa gagcgtggag aagaaggatc catctggagc caaggtcacc 1320

aagtctgcag caaagaagaa gtga 1344

Claims

1.葡萄qRT-PCR内参基因，其特征在于，当qRT-PCR检测葡萄果实组织基因转录表达水平时，所述内参基因为VvEF1-γ基因和18s-rRNA基因；当qRT-PCR检测葡萄卷须组织基因转录表达水平时，所述内参基因为EF1-α基因和Actin基因；当qRT-PCR检测葡萄果实发育阶段组织基因转录表达水平时，所述内参基因为EF1-α基因和VvEF1-α基因；所述VvEF1-γ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；所述18s-rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述EF1-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；所述Actin基因的核苷酸序列如SEQID NO.31所示；所述VvEF1-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

2.VvEF1-γ基因和18s-rRNA基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄果实组织基因转录表达水平中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的反向引物对VvEF1-γ基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的反向引物对18s-rRNA基因进行特异性扩增。

4.EF1-α基因和Actin基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄卷须组织基因转录表达水平中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的反向引物对EF1-α基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的反向引物对Actin基因进行特异性扩增。

6.EF1-α基因和VvEF1-α基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄果实发育阶段基因转录表达水平中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的反向引物对EF1-α基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的反向引物对VvEF1-α基因进行特异性扩增。