CN110484652A - 一种鲜榨苹果汁的鉴伪方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鲜榨苹果汁的鉴伪方法，首先将待测样品用组织裂解液与RNase裂解后，再用纳米硅基磁珠吸附DNA，用洗脱液洗脱吸附的DNA；然后将提取的DNA加入设计的特异性引物进行常规PCR扩增；扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析；观察电泳结果是否出现164bp条带；出现条带后将PCR扩增结果测序，测序结果输入NCBI查询与苹果的18SrRNA(登录号：DQ341382.1)的重复率，判断是否掺假；将提取的DNA加入设计的特异性进行实时荧光PCR扩增，扩增结果的Ct值代入掺假的线性回归方程，得出掺假量。本发明利用纳米硅基磁珠提取高浓度果汁DNA，样品无需前处理，操作方便，易于控制，且可以实现准确、高效的定性和定量的确定鲜榨苹果汁的掺假问题。

Description

一种鲜榨苹果汁的鉴伪方法
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种鲜榨苹果汁的鉴伪方法。
背景技术
鲜榨苹果汁是由新鲜苹果经过直接榨汁和高温杀菌后制成的果汁，具有天然的抗氧化性，在一定程度上起到预防冠心病、免疫系统缺失、哮喘病及糖尿病等疾病的作用。鲜榨苹果汁的市场需求量大并且价格高，一些不法商贩为谋取高额利润使得鲜榨苹果汁市场出现假冒伪劣产品。市场上的一些“鲜苹果汁”只是用浓缩果汁加糖、水、香料调配成不同配比的“苹果汁饮料”。随着科技的发展，果汁的掺假手段现已经发展到根据各种果汁的组成而进行非常精细的添加，甚至将食品鉴伪专家建立的果汁组成数据库作为掺假的“配方”，令果汁的鉴伪检测变得越来越困难，因此急需合适的鉴伪方法以保护消费者的利益。
近年来DNA为基础的分子学方法也开始出现在果汁掺伪鉴别和质量控制中。分子学方法由于不受地理、理化复杂性和原料多样性等因素的影响，相比于其他的鉴伪技术具有高稳定性、高效率的特点。分子学方法要应用于鲜榨苹果汁的掺伪鉴别中需要解决这三个方面的问题：果汁中DNA提取；目的基因的选择；鉴伪标准的建立。
首先，由于鲜榨苹果汁直接来源于新鲜苹果，果汁中含有苹果的DNA，可以作为鲜榨苹果汁鉴定的重要依据。然而苹果汁中DNA含量较少，提取DNA浓度低，难以进行后续检测。因此，要从分子的角度鉴别鲜榨苹果汁掺假，研究的首要重点正是苹果汁中DNA的提取方法。目前，从植物材料中提取DNA的主要方法为CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法。由于该法简便易行便于实验操作，因此改良CTAB法对植物材料进行DNA提取的专利有很多报道。CN107043765A、CN109452161A、CN107699561A、CN109880822A等专利先后报道了改良CTAB法用于提取植物DNA，在专利CN107699561A中将传统CTAB法进行改良，利用重新设计的试剂洗脱RNA，以解决现有的DNA提取技术步骤繁琐，且RNA去除耗时长的技术问题。结果显示该法能够达到高收率、低成本和高效率的效果。但是，现有专利所报道的均为DNA含量高的固体植物组织，尚未有报道能够显示单纯通过此法就能获得果汁的高浓度DNA。由于果汁样品本身DNA含量很低，因此很难单纯通过CTAB法达到提取鲜榨苹果汁中高浓度DNA的效果。CTAB法只能作为一种基础的手段。
实时荧光PCR技术不断发展，采用实时荧光定量PCR技术来进行食品掺假鉴别的方法也被科学家们采用。在CN 107604093A中利用琼脂糖凝胶电泳法和实时荧光PCR法去进行定量和定性鉴伪。在CN19943650A中利用实时荧光定量技术可以辨别药材的真假，但未做定量的分析。CN074699561中提到对饮品中杏仁的成分进行实时荧光PCR鉴别，但也只是报道是否掺假，但对掺假的量无法确定。目的基因的选择是进行实时荧光PCR的基础。目的基因可以稳定表达且具有特异性是利用PCR技术进行掺假鉴别的先决条件。而鲜榨苹果汁在高温加热的过程中DNA会出现一定程度的损伤，大多数的苹果的管家基因在加热后无法稳定表达。且在果汁DNA提取的过程中有水、酚类、色素类杂质的存在，对鲜榨苹果汁的掺伪鉴别也会产生影响。
发明内容
本发明的目的是解决鲜榨苹果汁中DNA提取浓度低，掺假鉴伪存在效率低、步骤多、结果不准确等问题，提供一种能够有效提取鲜榨苹果汁DNA，并能够高效、稳定、准确的确定否掺假以及鲜榨苹果汁掺假量的方法。
针对上述目的，本发明所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、提取DNA
将待测样品用组织裂解液与RNase裂解后，除去杂质，再用纳米硅基磁珠吸附DNA，最后用洗脱液洗脱磁珠吸附的DNA。
2、掺假鉴别
以步骤1提取的DNA为模板，加入特异性引物进行常规PCR扩增，其中特异性引物的上游引物为：5’-AACGGCTACCACATCCAAGG-3’，下游引物为：5’-ACCAGACTTGCCCTCCAATG-3’；扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析，观察电泳结果是否出现164bp的条带；若电泳结果未出现该条带，说明样品不含苹果成分，为掺假样品；若电泳结果出现该条带，将测序结果输入NCBI查询与登录号为DQ341382.1的苹果18SrRNA的重复率，当重复率小于90％，说明样品不含苹果成分，为掺假样品，当重复率为90％以上，说明样品含有苹果成分。
3、确定掺假量
i.建立鲜榨苹果汁掺假线性回归方程
将鲜榨苹果汁进行0.5％～70％的掺假，然后按照步骤1的方法提取各个掺假样品的DNA，分别以提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，建立掺假量与Ct值的线性回归方程。
ii.待测样品中鲜榨苹果汁含量测定
对步骤2中经过琼脂糖凝胶电泳分析确认含有苹果成分的样品，以该样品提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值代入上述掺假量与Ct值的线性回归方程中，经计算得到鲜榨苹果汁含量。
上述步骤1中，所述的组织裂解液为Plantzol或CTAB裂解液。
上述步骤1中，优选纳米硅基磁珠的添加量为待测样品体积的1.5％～2.5％。
上述步骤1中，进一步优选用纳米硅基磁珠吸附DNA的时间为1～3min。
上述步骤2中，优选所述常规PCR扩增反应体系为：12.5μL 2×EasyTaq PCRSuperMix(+Dye)，lμL10μM上游引物水溶液，1μL 10μM下游引物水溶液，lμL DAN模板，9.5μL无菌双蒸水；优选常规PCR扩增反应程序为：预变性：95℃，5min；变性：94℃，30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；共35个循环；72℃延伸5min。
上述步骤3中，优选所述荧光定量PCR扩增反应体系为：10μL 2×TransStart TopGreen Qpcr superMix(+Dye)，1μL上游引物水溶液，1μL下游引物水溶液，lμL DAN模板，7μLRNase-free water；优选荧光定量PCR扩增反应程序为：预变性：94℃，30s；变性：94℃，5s；55℃退火10s；72℃延伸15s；共40个循环。
本发明先采用CTAB法或改良CTAB法和磁珠吸附提取DNA，然后采用设计的特异性引物对提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳和实时荧光PCR技术进行掺假鉴别，并根据实时荧光PCR技术为基础建立鉴伪的标准曲线，从而确定是否掺假和掺假的量。本发明的有益效果如下：
1、本发明利用纳米硅基磁珠提取高浓度果汁DNA，果汁样品无需前处理，方便操作，易于控制。
2、本发明对苹果的基因序列进行大量分析，获得了具有稳定性和特异性的苹果鲜榨汁的目的基因，为后续鲜榨苹果汁的鉴伪试剂盒的研发提供技术基础。
3、本发明可以定性和定量的确定鲜榨苹果汁的掺假问题，相比传统方法更准确、高效。
4、本发明是基于DNA分析的分子生物学方法，根据鲜榨苹果汁特有的基因型进行鉴定，有效避免了传统理化方法带来的困扰。
附图说明
图1是提取果汁中DNA的操作流程图。
图2是实施例1中通过分析掺假样品的DNA获得的标准曲线。
图3是五种候选引物对不同加热温度的鲜榨苹果汁中DNA进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，其中1代表Actin、2代表GAPDH、3代表UBQ、4代表nad5、5代表18SrRNA。
图4是通过分析鲜榨苹果汁提取的DNA经连续稀释后获得的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
下述实施例中，实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到；所有定量实验均设置三次重复实验，结果取平均值；各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物水溶液中的初始浓度均为10μM；其中：2×EasyTaq PCR SuperMix(+Dye)购自北京全式金公司，产品目录号：AS111；2×TransStart Top Green Qpcr superMix(+Dye)购自北京全式金公司，产品目录号：AQ132。
实施例1
1、提取DNA
如图1所示，取1mL样品，12000r/min离心10min后弃上清液，然后加入400μLPlantzol，振荡混匀，使样品完全悬浮，再加入7.5μL RNaseA，充分混匀，55℃金属浴温育15min；加入400μL酚-氯仿，振荡混匀，12000r/min离心10min，小心吸取上层水相于干燥离心管中，加入400μL异丙醇，再加入振荡混匀的20μL纳米硅基磁珠，颠倒混匀2min，将离心管置于磁力架上，静置3min，吸弃上清液；加入800μL体积浓度为70％的乙醇水溶液，振荡混匀，将离心管置于磁力架上，静置3min，吸弃上清液，再加入800μL体积浓度为70％的乙醇水溶液，重复操作2次；65℃金属浴干燥8min，挥发表面乙醇；移去磁力架，加入50μL TE液，用移液枪吹打使分布均匀，65℃金属浴温育10min，温育期间每隔2～3min轻摇离心管混匀；将离心管置于磁力架上，静置3min使磁珠吸附在离心管壁上。吸取上清液至一新的离心管，得到DNA。其中鲜榨苹果汁提取后得到的DNA浓度≥40ng/μL。
2、掺假鉴别
以步骤1提取的DNA为模板进行常规PCR扩增，PCR扩增反应体系(25μL)为：12.5μL2×EasyTaq PCR SuperMix(+Dye)，lμL上游引物水溶液(碱基序列为5’-AACGGCTACCACATCCAAGG-3’)，1μL下游引物水溶液(碱基序列为：5’-ACCAGACTTGCCCTCCAATG-3’)，lμL DAN模板，9.5μL无菌双蒸水。PCR扩增反应程序：预变性：95℃，5min；变性：94℃，30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；共35个循环；72℃延伸5min。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析，观察电泳结果是否出现164bp的条带。若电泳结果未出现该条带，说明样品不含苹果成分，为掺假样品；若电泳结果出现该条带，将测序结果输入NCBI查询与苹果的18SrRNA(登录号：DQ341382.1)的重复率，当重复率小于90％，说明样品不含苹果成分，为掺假样品；当重复率90％以上，说明样品含有苹果成分，需要进一步确定是否为鲜榨苹果汁。
其中鲜榨苹果汁样品的PCR扩增产物测序结果对比如下所示：
Query 4AACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACGGGG63
Sbjct 327AACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACGGGG386
Query 64AGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCTACGAGTCTGCGTAATTGTGAATGAGTA123
Sbjct 387AGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCTATGAGTCTG-GTAATTG-GAATGAGTA444
Query 124CAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGT 168
Sbjct 445CAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGT 489
由上述鲜榨苹果汁样品提取出DNA进行常规PCR扩增的产物测序可知，引物扩增的序列长度为164bp，与苹果的18SrRNA基因序列进行对比的重复率为98％。
3、确定掺假量
i.建立鲜榨苹果汁掺假线性回归方程
将鲜榨苹果汁中加入纯净水分别进行0.5％、10％、20％、30％、40％、50％、70％的掺假，并用蔗糖调节其可溶性固形物含量使其与鲜榨苹果汁相同。然后按照步骤1的方法提取各个掺假样品的DNA，分别以提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，得到对应的循环阈值(Ct值)，建立掺假量与Ct值的线性回归方程，结果见图2。荧光定量PCR扩增反应体系(20μL)为：10μL 2×TransStart Top Green Qpcr superMix(+Dye)，1μL上游引物水溶液，1μL下游引物水溶液，lμL DAN模板，7μL RNase-free water。荧光定量PCR扩增反应程序为：预变性：94℃，30s；变性：94℃，5s；55℃退火10s；72℃延伸15s；共40个循环。
ii.待测样品中鲜榨苹果汁含量测定
对步骤2中经过琼脂糖凝胶电泳分析确认含有苹果成分的样品，以该样品提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值代入上述掺假量与Ct值的线性回归方程中，经计算得到鲜榨苹果汁含量。
为了确定本发明的特异性引物，发明人进行了大量的筛选试验，具体试验如下：采用SYB Green I实时荧光定量RT-PCR技术，对Actin、GAPDH、18SrRNA、UBQ、nad等5个苹果持家基因在不同加热温度的鲜榨苹果汁中的表达量进行了检测。根据5种基因的序列设计的引物序列和片段长度如表1所示，检测结果见图3。
表1 五种引物序列
由于受到高温的影响，苹果汁中提取的DNA序列会出现大量的缺失和断裂，大部分引物的片段在进行常规PCR的扩增后并不能扩增出对应的基因片段，由图3可知，在果汁加热温度为20℃时，1、2、3和5号引物都可以在电泳图产生亮的条带。在果汁温度加热到30℃时，3号(UBQ)的电泳条带消失。直至果汁加热到50℃，1号(Actin)的电泳条带也消失了。即1号和3号引物在鲜榨果汁经过高温杀菌后难以有效的稳定扩增。2号引物(GAPDH)和5号引物(18SrRNA)在果汁经过高温杀菌后提取出的DNA进行常规PCR过程中可以稳定扩增。在图3的电泳图像中，使用DNA Marker(M)来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近条带较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。由图3可知2号引物扩增出来的条带远高于标记150bp Maker基因的电泳条带，即2号引物对应的片段(145bp)条带并没有扩增出来，2号引物无法作为鲜榨苹果汁鉴伪的特异性引物。5号引物的PCR扩增出的基因条带符合其片段长度(164bp)并且扩增产物测序结果与苹果的18SrRNA(DQ341382.1)的基因序列进行对比，相似度达98％。通过一系列的筛选，则可确定5号引物为本发明的特异性引物。
发明人对本发明鉴伪方法进行了验证，具体如下：
1、真实性和精确度
通过上述确定的特异性引物对鲜榨苹果汁提取的DNA溶液稀释不同倍数(1:1至1:10000，相当于50ng/μL至5pg/μL的DNA)后进行实时PCR扩增，每次稀释的三次重复。通过实时荧光定量PCR的循环阈值(Ct值)相对于DNA的对数构建标准曲线，结果见图4。标准曲线为：y＝-2.095x+30.714，线性相关系数(R2)0.9991和检出限(LOD)5pg证明了该方法的真实性和精确度。
2、重复性
以鲜榨苹果汁提取的DNA(50ng/μL)进行不同程度的稀释后，每天进行荧光定量PCR扩增分析，连续进行3天，结果见表2。
表2 实时PCR检测的可重复性检测结果
由表3可见，RSD从未高于2％，可重复性的稀释因子高达1:5000。证明该方法具有高度的重复性，在样品的DNA浓度为10pg/μL检测也具有重复性。
3、可靠性
实时PCR方法的可靠性通过重复(n＝10)分析来自掺假苹果汁的DNA来评估。通过反复(n＝10)分析5％、15％、20％掺假样品的DNA提取物来研究实时PCR方法的可靠性，结果见表3。
表3 实时PCR方法的可靠性检测结果
表3的在3个掺假苹果汁分析结果中发现估计值和实际值的百分比之间存在良好可比性。通过估计平均值表明，掺假程度为5％的果汁的结果偏差最大，这由于掺假量过小对DNA扩增产生比较小的影响所导致的。变异系数在11.8％和29.8％之间变化，较低掺假量的果汁样品通常表现出较差的可靠性和存在较大偏差。在15％和20％的掺假程度中可靠性得到了很大改善。根据我们的测试结果，15％和20％掺假的苹果汁的估计百分比没有显着差异(P>0.05)，并且实际值与估计值之间差异较小。5％掺假的苹果汁P<0.05，意味着对5％掺假果汁中掺假含量的估计不准确。综上，这种鲜榨苹果汁的鉴伪方法可以有效的应用于鲜榨果汁的鉴伪过程中，准确高效的识别掺假。

Claims (6)

1.一种鲜榨苹果汁的鉴伪方法，其特征在于所述方法由下述步骤组成：
(1)提取DNA
将待测样品用组织裂解液与RNase裂解后，除去杂质，再用纳米硅基磁珠吸附DNA，最后用洗脱液洗脱磁珠吸附的DNA；
(2)掺假鉴别
以步骤(1)提取的DNA为模板，加入特异性引物进行常规PCR扩增，其中特异性引物的上游引物为：5’-AACGGCTACCACATCCAAGG-3’，下游引物为：5’-ACCAGACTTGCCCTCCAATG-3’；扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析，观察电泳结果是否出现164bp的条带；若电泳结果未出现该条带，说明样品不含苹果成分，为掺假样品；若电泳结果出现该条带，将测序结果输入NCBI查询与登录号为DQ341382.1的苹果18SrRNA的重复率，当重复率小于90％，说明样品不含苹果成分，为掺假样品，当重复率为90％以上，说明样品含有苹果成分；
(3)确定掺假量
(i)建立鲜榨苹果汁掺假线性回归方程
将鲜榨苹果汁进行0.5％～70％的掺假，然后按照步骤(1)的方法提取各个掺假样品的DNA，分别以提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，建立掺假量与Ct值的线性回归方程；
(ii)待测样品中鲜榨苹果汁含量测定
对步骤(2)中经过琼脂糖凝胶电泳分析确认含有苹果成分的样品，以该样品提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值代入上述掺假量与Ct值的线性回归方程中，经计算得到鲜榨苹果汁含量。
2.根据权利要求1所述的鲜榨苹果汁的鉴伪方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的组织裂解液为Plantzol或CTAB裂解液。
3.根据权利要求1所述的鲜榨苹果汁的鉴伪方法，其特征在于：步骤(1)中，所述纳米硅基磁珠的添加量为待测样品体积的1.5％～2.5％。
4.根据权利要求1所述的鲜榨苹果汁的鉴伪方法，其特征在于：步骤(1)中，用纳米硅基磁珠吸附DNA的时间为1～3min。
5.根据权利要求1所述的鲜榨苹果汁的鉴伪方法，其特征在于：步骤(2)中，常规PCR扩增反应体系为：12.5μL 2×EasyTaq PCR SuperMix(+Dye)，lμL 10μM上游引物水溶液，1μL10μM下游引物水溶液，lμL DAN模板，9.5μL无菌双蒸水；常规PCR扩增反应程序为：预变性：95℃，5min；变性：94℃，30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；共35个循环；72℃延伸5min。
6.根据权利要求1所述的鲜榨苹果汁的鉴伪方法，其特征在于：步骤(3)中，荧光定量PCR扩增反应体系为：10μL 2×TransStart Top Green Qpcr superMix(+Dye)，1μL上游引物水溶液，1μL下游引物水溶液，lμL DAN模板，7μL RNase-free water；荧光定量PCR扩增反应程序为：预变性：94℃，30s；变性：94℃，5s；55℃退火10s；72℃延伸15s；共40个循环。
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