CN113046367B - 慈姑球茎发育过程中内参基因筛选及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及慈姑球茎发育过程中内参基因筛选及其应用，本发明本发明根据RNA‑Seq测序数据分析，利用软件评估并分析各个候选内参基因在球茎的整个发育阶段中的表达稳定性，并利用目的基因验证，最终筛选出比常用的管家基因更为稳定的内参基因C44587，最大程度地减小了由于内参基因的选择造成样品之间和样品内部的差异，为后期利用q RT‑PCR探索慈姑球茎发育相关关键基因奠定了坚实的基础。

Description

慈姑球茎发育过程中内参基因筛选及其应用
【技术领域】
本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及慈姑球茎发育过程中内参基因筛选及其应用。
【背景技术】
慈姑是我国特色水生蔬菜之一，是泽泻科(Alismaceae)慈姑属(Sagittaria.L)水生植物，目前对于该水生植物的研究并不多，其属于泽泻科慈姑属宿根性水生草本，营养器官为地下球茎，含有大量碳水化合物、蛋白质和多种矿质元素，具有很高营养价值。中医认为慈姑性味甘平，生津润肺，补中益气，所以慈姑不但营养价值丰富，还能够败火消炎，辅助治疗痨伤咳喘。慈姑药食兼用，具有很大的应用市场和开发潜力。目前主要产品出口销往东南亚、美国、加拿大等国家，是重要的出口创汇产品。
近年来，慈姑分子生物学的研究不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示慈姑功能基因表达和调控的机理，准确评估基因表达量对研究其生物学功能具有重要意义。常见的内参基因有actin、EF-1α、TUA、TUB等。在不同的试验条件下，表达分析的结果经常受样品RNA提取质量、反转录效率等影响，常用的看家基因表达稳定性会有所变化。因此，为消除这些偏差，有必要筛选合适的内参基因。目前鲜见有关慈姑内参基因的研究报道，这严重制约了慈姑重要功能性状基因等研究进程。因此，在慈姑中挖掘稳定表达的内参基因十分必要。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要挖掘慈姑的内参基因，可以很好的对慈姑的表达分析提供重要参考。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
慈姑内参基因C44587，所述内参基因C44587的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明还包括检测所述慈姑内参基因C44587的引物对，所述引物对其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
本发明还包括所述的慈姑内参基因C44587在慈姑球茎发育不同时期进行荧光定量表达分析的应用。
进一步的，所述荧光定量表达分析优选的引物对其上游序列如序列表SEQ IDNO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述荧光定量表达分析的PCR反应体系为：2X SYBR Green Master Mix10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、ddH2O 7.2μl、cDNA 2μl；反应程序为95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火1min，总共45个循环；采集荧光信号。
本发明的慈姑内参基因C44587，筛选方法为：1、选择不同时期的慈姑球茎为材料，提取慈姑球茎RNA；2、合成相应的慈姑球茎cDNA；3、根据不同基因设计不同引物并在荧光定量PCR仪上进行反应，绘制溶解曲线，进行稳定性分析，获得稳定性好、表达效果好的内参基因。
本发明具有如下有益效果：
本发明根据RNA-Seq测序数据分析，利用软件评估并分析各个候选内参基因在球茎的整个发育阶段中的表达稳定性，并利用目的基因验证，最终筛选出比常用的管家基因更为稳定的内参基因C44587，最大程度地减小了由于内参基因的选择造成样品之间和样品内部的差异，为后期利用q RT-PCR探索慈姑球茎发育相关关键基因奠定了坚实的基础。
【附图说明】
图1是本发明实施例各个样品的RNA凝胶电泳图，图中泳道1为球茎发育初期、泳道2为球茎发育中期、泳道3为球茎发育中后期、泳道4为球茎发育后期；
图2为C62443基因的qPCR溶解曲线图；
图3为C44587基因的qPCR溶解曲线图；
图4为C28245基因的qPCR溶解曲线图；
图5为C57540基因的qPCR溶解曲线图；
图6为C24615基因的qPCR溶解曲线图；
图7为分析目的基因在慈姑球茎发育的4个时期结果图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
本实施例为内参基因C44587的获得，其通过如下方法得到：
一、本实施例的试验材料
选择生长健壮且无病虫害的慈姑球茎为本研究材料，采集膨大初期，膨大中期、中后期和膨大后期共4个时期的球茎，取每个样品等量混合，清水冲洗干净，液氮速冻后放于-80℃超低温保存备用。
二、总RNA提取、检测与c DNA合成
以TRNzol Universal总RNA提取试剂盒为基础，提取不同发育时期慈姑球茎RNA，用TaKaRa生物科技有限公司无rnas DNaseI处理去除残留的DNA。检测检测总RNA样品的完整性，纯度，并于-80℃保存备用。选用Promega公司的Go Script TM ReverseTranscriptionSystem试剂盒，参照试剂盒说明合成cDNA第一链。用紫外分光光度计检测cDNA纯度，获得高质量cDNA后，-20℃冰箱冻存备用。
三、内参基因的选择与特异性引物的设计
1)根据慈姑转录组测序RNA-Seq表达谱数据库，挑选表达量值相对稳定，使用变异系数(CV)进行评估，选择CV值小于0.1，作为候选内参基因。
2)在候选基因中，选择5个较高表达基因，C62443、C44587、C24615，C28245和C57540。基因表达量见表1。
表1 5个基因的表达量
Figure BDA0003031083160000031
从表1可见，上述几个基因在慈姑球茎的不同发育时期都表达出了较高的表达量。
四、内参基因的qPCR：
将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。定量PCR实验，采用的仪器为：AceQ_qPCR_SYBR Green_Master_Mix定量PCR仪：德国AnalytikJena qTOWERE2.2。
PCR反应体系为：2X SYBR Green Master Mix 10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM上游引物0.4μl、ddH2O 7.2μl、cDNA 2μl；
PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火1min，总共45个循环；采集荧光信号。
上述PCR反应过程中各基因所用到的引物如表2所示：
表2
Figure BDA0003031083160000041
将表2的引物针对性分别放入上述的PCR反应体系，按照PCR反应程序放入96孔板放在AnalytikJena qTOWERE2.2荧光定量PCR仪中进行反应，反应结束后进行内参基因表达的稳定性分析。
五、内参基因表达稳定性分析：
选用内参基因稳定性评价软件ge Norm、Normfinder和Best Keeper软件，根据候选内参基因的相对表达量及Ct值对候选内参基因进行稳定性综合评价；选出慈姑球茎发育过程中最佳的内参基因。
六、结果与分析
总RNA样品与引物特异性检测
分别使用Bio Spec-nano紫外可见分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性。结果如图1所示，图1为各个样品的RNA凝胶电泳图；图中从左到右的泳道依次为1、为球茎发育初期；2、为球茎发育中期；3、为球茎发育中后期；4、为球茎发育后期。从图可见，上述5个条带均表现出图谱清晰，条带亮度高，总RNA完整性好，符合试验要求。
图2为C62443基因的qPCR溶解曲线图、图3为C44587基因的qPCR溶解曲线图、图4为C28245基因的qPCR溶解曲线图、图5为C57540基因的qPCR溶解曲线图、为C24615基因的qPCR溶解曲线图。
从图2-图6可见，上述5个候选内参基因均有明显的单一溶解峰，表明无引物二聚体，扩增条带单一，特异性强，检测引物均具有较好的特异性，可用于慈姑荧光定量PCR的内参引物试验。qPCR结果表明，所选择的5个候选内参基因的Ct值范围为5.44～30.36，其中C62443的Ct值最低，平均值为7.52，C57540的Ct值最高，其平均值为28.01，表明各候选内参在不同样品中的表达丰度均存在差异。
荧光定量PCR仪进行Ct计算，通过ge Norm软件评估平均稳定指数M值、NormFinder及Best Keepeer软件比对各个候选内参基因的标准差(SD)、变异系数(CV)对候选内参基因的稳定性进行综合分析。综合几种软件计算结果，
稳定性由高到低排序分别为C44587>C57540>C24615>C28245>C62443，选出最佳的慈姑内参基因C44587。
实施例2：
根据实施例1筛选出来的稳定性最佳的基因C44587进行进一步的验证，保证得出真实可靠的定量数据。以C44587作为内参基因，选择球茎发育过程中蔗糖合成关键酶基因SuSy1,SuSy2，SuSy3，3个基因作为目的基因，分析目的基因在慈姑球茎发育的4个时期表达，具体如下：
分别提取不同时期：即慈姑球茎膨大初期，膨大中期、中后期和膨大后期的4个时期cDNA为作为定量PCR的模板，以C44587基因为内参基因，分别根据SuSy1,SuSy2，SuSy3基因设计引物，引物见表3：
表3
Figure BDA0003031083160000061
在实时荧光定量PCR检测仪上进行荧光定量反应，反应的
PCR反应体系为：2X SYBR Green Master Mix 10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM上游引物0.4μl、ddH2O 7.2μl、cDNA 2μl；
PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火1min，总共45个循环；采集荧光信号。
反应结束后使用2-ΔΔCT法所有的数据均表示为平均值±标准偏差。实时荧光定量PCR数据分析用SPSS 17.0和Microsoft Office Excel 2007进行统计分析，采用SPSS17.0软件方差分析，采用Excel 2010软件制图。
得到的反应结果如图7所示，表明：内参基因C44587在慈姑球茎发育的初期、中期、中后期、后期都能稳定的表达。
综上所述，基因C44587可在慈姑球茎发育过程中进行稳定表达，能做为慈姑球茎发育不同时期荧光定量的内参基因，能为今后对慈姑重要功能性状基因的研究奠定基础。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 福建农林大学
广西壮族自治区农业科学院
<120> 慈姑球茎发育过程中内参基因筛选及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1816
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggggggag ccacggacac cacaagttta gtccccccac ccacccactt cttgcctcat 60
ttctctcctc tcgtcgcgcg actgtcgcca gcaccttcca gcacaccact ccctttttgc 120
cctttcgtcg ctcgctcgcc cgctcgcccc tcctcctcat ccgcaggcgg aggataccga 180
cccagcgacc agccgccgcc gccttccacg actaaaaatt caaaatggcg gatgaggaca 240
ttcagcctct tgtctgtgac aatggtactg gaatggtcaa ggctggattc gctggggatg 300
atgctccaag ggctgttttc ccaagtatag tgggtcgacc ccgccacacc ggtgtcatgg 360
ttggcatggg gcagaaggat gcctacgttg gtgatgaggc acagtccaag agaggtattc 420
tcaccctcaa gtaccctatt gagcatggta tcgtcagcaa ctgggatgac atggagaaga 480
tctggcatca caccttctac aatgagctcc gtgtggctcc ggaagaacac cctgttcttc 540
ttacagaggc tcctctcaac cccaaggcca acagggagaa gatgacacag attatgttcg 600
agacattcaa tgtccctgcc atgtatgtgg ctattcaggc cgtgctatct ctctatgcta 660
gtggacgtac cacaggtatt gtgctggatt ccggtgacgg tgtgagccac actgtgccaa 720
tctatgaagg ttatgctctt cctcatgcca tcctccgtct agatcttgcc ggaagggatc 780
tcactgatta cctgatgaag atccttactg aaaggggtta ctccttcaca accaccgccg 840
aacgggaaat tgtccgtgac atgaaggaga agcttgcgta cgttgcgctt gactttgatc 900
aggaacttga gactgcaaag agcagctcaa ctgttgagaa aaactatgaa ttacccgatg 960
gacaagttat caccattggt gcagagcgct tccgttgccc agaagtcctc ttccagccct 1020
cgctcattgg tatggaagct gctggtatcc acgaaaccac atacaattcg atcatgaagt 1080
gtgatgtgga tattaggaag gacctatacg gtaacattgt gctcagtggt ggaacgacca 1140
tgttccctgg gatcgccgac aggatgagca aggagatcac cgccttggca ccaagcagca 1200
tgaagatcaa ggtggtggct ccaccggaga ggaaatatag tgtctggatt ggagggtcca 1260
tcttggcttc actcagtact ttccagcaga tgtggatatc aaaggcagag tacgaggagt 1320
caggaccagc tattgtccac agaaagtgtt tctaagtata ttttgcagag tctatgcttt 1380
gttatcctat atttgtgcgt tgccattggc cgttgtggtc taggatcatc agtccccaaa 1440
catcctaaaa ctctacttta attctgctct tttcctatta ccttataaaa tggtattttt 1500
tccctagtaa ttaagtatga ggtaatgagg cttgtttgta gtctggattg tatgtactct 1560
tgtgtagtct ggattgaaaa ggttgaagaa agtggttgtc attgttcact ggtgcttttt 1620
tcttctattt tcctcctagc aattgcttcc atcttatgct atatacggta tctctcacga 1680
aagtgaactt gttattttta cttcaagatg atactgttac cgctaacggt cctgtagttg 1740
cttctgtttg ttagcagtat atgtgaatct gatttccgtc tcgaggcagc tgttgatctg 1800
tttcccttca atgctt 1816
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaatggcag agtacgag 18
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caagcaacgc acaaat 16

Claims (5)

1.慈姑内参基因C44587，其特征在于，所述内参基因C44587的核苷酸序列如序列表SEQID NO.1所示。
2.检测如权利要求1所述慈姑内参基因C44587的引物对，其特征在于，所述引物对其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1所述的慈姑内参基因C44587在慈姑球茎发育不同时期进行荧光定量表达分析的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述荧光定量表达分析引物对其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述荧光定量表达分析的PCR反应体系为：2X SYBR Green Master Mix 10µl、10µM 上游引物 0.4µl、10µM 下游引物 0.4µl、ddH2O7.2µl、cDNA 2µl；反应程序为95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火1min，总共45个循环；采集荧光信号。
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